CN101945995A - 稳定型转谷氨酰胺酶及其制造法 - Google Patents

稳定型转谷氨酰胺酶及其制造法 Download PDF

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Abstract

本发明以提供具有优良的稳定性的转谷氨酰胺酶及其制造法为课题。提供一种稳定型转谷氨酰胺酶，其由转谷氨酰胺酶的Pro序列肽与成熟型转谷氨酰胺酶结合了的结构所构成。还提供一种稳定型转谷氨酰胺酶的制造法，其包含：在产生转谷氨酰胺酶的条件下培养具有转谷氨酰胺酶产生能力的微生物的步骤；从培养液分离、回收结合了Pro序列肽的成熟型转谷氨酰胺酶的步骤。

Description

稳定型转谷氨酰胺酶及其制造法
技术领域
本发明涉及转谷氨酰胺酶。更详细为涉及具有优良的氧化稳定性、温度稳定性等的稳定型转谷氨酰胺酶。
背景技术
转谷氨酰胺酶是催化存在于肽链内的谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基的酰基转移反应的酶，蛋白质中的赖氨酸残基ε-氨基作为酰基受体起作用时，在蛋白质分子的分子内或者分子间形成ε-(γ-Gln)-Lys交联键。所以，如果利用转谷氨酰胺酶的作用就能进行蛋白质或肽的改性，因此，使用了源自链霉菌属微生物酶的转谷氨酰胺酶(参照专利文献1)被使用于粘结肉、香肠、豆腐、面包、面类的制造中。
转谷氨酰胺酶是以发酵过程中经Pro体转换为成熟型的半胱氨酸为活性中心残基的硫醇酶，所以稳定性差，为抑制制造工序中或者制品的保存中发生失活而需要添加稳定剂。
作为用于改善转谷氨酰胺酶保存中的稳定性的方法，已提出添加有机酸、无机酸、多酚、硫醇、糖醇等的技术(专利文献1)。另外，还开发出添加蛋白质(小麦蛋白质、大豆蛋白质等)、蛋白质部分水解物而提高稳定性的方法(专利文献2)。而且，也开发了利用海藻糖进行稳定化的技术(专利文献3)。
专利文献1：特开平4-207194号公报
专利文献2：专利第3651003号公报
专利文献3：特开2004-305010号公报
发明内容
到目前为止虽然已提出各种稳定化技术，但对转谷氨酰胺酶进行稳定化的需求仍然很高。如上所述，在食品领域中广泛利用转谷氨酰胺酶。所以，为了避免意外事态，要求尽量不添加多余成分。
在以上的背景下，本发明以提供具有优良的稳定性的转谷氨酰胺酶、其制造法、及其用途为课题。
本发明人等鉴于以上的课题进行了锐意的研究。其结果，确认转谷氨酰胺酶生产菌的培养液中存在转谷氨酰胺酶中间体，并成功地对其进行了回收。继续探讨的结果发现，回收的中间体是Pro序列肽与成熟型转谷氨酰胺酶(成熟型TGase)相结合的物质。另一方面，对中间体的稳定性进行评价的结果，发现pH稳定性、温度稳定性、氧化稳定性以及保存稳定性均超出成熟型TGase。
本发明是基于以上的认识下完成的，其内容如下。
[1]一种稳定型转谷氨酰胺酶，由转谷氨酰胺酶的Pro序列肽与成熟型转谷氨酰胺酶结合了的结构构成。
[2]根据[1]所述的稳定型转谷氨酰胺酶，成熟型转谷氨酰胺酶为源自微生物。
[3]根据[2]所述的稳定型转谷氨酰胺酶，微生物为链霉菌(streptomyces)属微生物。
[4]根据[2]所述的稳定型转谷氨酰胺酶，微生物为茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)。
[5]根据[1]所述的稳定型转谷氨酰胺酶，成熟型转谷氨酰胺酶具有序列号6所示的氨基酸序列。
[6]根据[1]所述的稳定型转谷氨酰胺酶，Pro序列肽为源自微生物。
[7]根据[6]所述的稳定型转谷氨酰胺酶，微生物为链霉菌属微生物。
[8]根据[6]所述的稳定型转谷氨酰胺酶，微生物为茂原链霉菌。
[9]根据[1]所述的稳定型转谷氨酰胺酶，Pro序列肽具有以下(1)～(3)中的任一序列：
(1)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列号1)；
(2)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS(序列号2)；
(3)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS(序列号3)。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的稳定型转谷氨酰胺酶，与未结合转谷氨酰胺酶的Pro序列肽的成熟型转谷氨酰胺酶相比，选自pH稳定性、温度稳定性、氧化稳定性以及保存稳定性中的一个以上的稳定性高。
[11]一种酶制剂，含有[1]～[10]中任一项所述的稳定型转谷氨酰胺酶。
[12]一种稳定型转谷氨酰胺酶的制造法，包含：
在产生转谷氨酰胺酶的条件下培养具有转谷氨酰胺酶产生能力的微生物的步骤；
从培养液分离、回收结合了Pro序列肽的成熟型转谷氨酰胺酶的步骤。
[13]根据[12]所述的稳定型转谷氨酰胺酶的制造法，微生物为链霉菌属微生物。
[14]根据[12]所述的稳定型转谷氨酰胺酶的制造法，微生物为茂原链霉菌。
附图说明
图1为稳定型TGase(P-TGase)与成熟型TGase(M-TGase)的pH稳定性的对比。横轴为pH、纵轴为残存活性(％)。
图2为稳定型TGase(P-TGase)与成熟型TGase(M-TGase)的温度稳定性的对比。横轴为处理时间(分)、纵轴为残存活性(％)。
图3为稳定型TGase(P-TGase)与成熟型TGase(M-TGase)的氧化稳定性的对比。横轴为过氧化氢浓度(％)、纵轴为残存活性(％)。
图4为稳定型TGase(P-TGase)与成熟型TGase(M-TGase)的保存稳定性的对比。横轴为保存期间(月)、纵轴为残存活性(％)。
图5为稳定型TGase(P-TGase)与成熟型TGase(M-TGase)的温度稳定性的对比。横轴为处理时间(分)、纵轴为残存活性(％)。
图6为稳定型TGase(P-TGase)与成熟型TGase(M-TGase)的氧化稳定性的对比。横轴为过氧化氢浓度(％)、纵轴为残存活性(％)。
图7为稳定型TGase(P-TGase)与成熟型TGase(M-TGase)的温度稳定性的对比。横轴为处理时间(分)、纵轴为残存活性(％)。
具体实施方式
(稳定型TGase)
本发明的稳定型转谷氨酰胺酶(稳定型TGase)具有转谷氨酰胺酶的Pro序列肽与成熟型TGase结合了的结构。即，必须的构成要素为转谷氨酰胺酶的Pro序列肽和成熟型TGase，以这些要素相结合为特征。由于该特征，本发明的稳定型TGase呈高于成熟型TGase的稳定性。本说明书中用语“稳定性”是作为包括了pH稳定性、温度稳定性、氧化稳定性、保存稳定性的表述而被使用。所以，本发明的稳定型TGase是其选自pH稳定性、温度稳定性、氧化稳定性以及保存稳定性中的一个以上的稳定性优于成熟型TGase。优选方式的稳定型TGase的pH稳定性、温度稳定性、氧化稳定性、以及保存稳定性均优于成熟型TGase。
然而，属于分泌型蛋白质的转谷氨酰胺酶，作为连接有信号序列(Pre序列)以及Pro序列的PrePro型转谷氨酰胺酶被翻译之后，信号序列被切断转换为Pro型转谷氨酰胺酶，接着Pro序列被切断，变为成熟型转谷氨酰胺酶(成熟型TGase)。如后述的实施例所示，本发明人等发现了在该一系列的过程中存在结构为被切断的Pro序列肽结合于成熟型转谷氨酰胺酶的中间体，并且明确了其具有优良的稳定性。本发明的稳定型TGase典型的是作为在上述的过程中生成的中间体而获得，但只要是具有Pro序列肽结合于成熟型TGase的结构、且稳定性高于成熟型TGase就对其制造法(获取法)没有特别的限定。所以，即使分别准备Pro序列肽和成熟型TGase，使两者结合的所得物，只要能确认稳定性的提高也属于本发明的稳定型TGase。
本说明书中“Pro序列肽”是指构成Pro序列(即，存在于Pre序列和成熟型蛋白质序列之间的序列)的肽的一部分或全部。以下作为Pro序列肽的例子示出了3种肽。
Pro序列肽的例1：
由DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列号1)序列构成的肽
Pro序列肽的例2：
由DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS(序列号2)序列构成的肽
Pro序列肽的例3：
由DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS(序列号3)序列构成的肽
对Pro序列肽的来源(起源)没有特别的限定。优选的是Pro序列肽为源自微生物。“源自微生物Pro序列肽”除了链霉菌属等的微生物产生的转谷氨酰胺酶(例如参照特开昭64-27471号公报)的Pro序列肽之外，还包括由该Pro序列肽(即，微生物产生的转谷氨酰胺酶的Pro序列的一部分或全长)同源的氨基酸序列构成的肽。在序列号4(茂原链霉菌)、序列号5(肉桂色链霉菌(Streptomyces cinnamoneus))中表示微生物产生的转谷氨酰胺酶的Pro序列全长氨基酸序列的例子。
对于本发明的稳定型TGase构成要素之一的成熟型TGase的来源(起源)也没有特别限定。例如，可以使用链霉菌属等的微生物产生的成熟型TGase(例如参照特开昭64-27471号公报)、哺乳动物产生的成熟型TGase(例如参照特公平1-50382号公报)、利用重组DNA技术所得的重组(Recombinant)成熟型TGase(例如特开平5-199883号公报、特开2004-97099号公报)等。优选成熟型TGase是源自微生物。“源自微生物的成熟型TGase”除了链霉菌属等的微生物产生的天然型成熟型TGase(例如参照特开昭64-27471号公报)之外还包含对导入了微生物产生的转谷氨酰胺酶基因的转化体进行培养而得到的重组成熟型TGase。序列号6(茂原链霉菌)、序列号7(肉桂色链霉菌)表示源自微生物的成熟型TGase的氨基酸序列的例子。
作为Pro序列肽和/或成熟型TGase的来源的微生物优选为属于链霉菌(Streptomyces)属的微生物。作为属于链霉菌属的微生物可举出茂原链霉菌(Streptomyces  mobaraensis)(旧茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense))No.140226株(特开2005-73628号公报)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)No.466(参照专利第2849773号说明书、专利文献1)、链霉菌(Streptomyces sp.)No.83(参照专利第2849773号说明书、专利文献1)等。另外，还可以使用通过紫外线照射、NTG(N-methyl-N’-nitrosoguanidine)等的一般法提高了生产率、或减少了蛋白酶、淀粉酶等的杂蛋白的生成、或抑制或缺失抗生素等生理活性物质的突变株，而且可以使用基因重组菌等。
利用重组DNA技术时(即，使用基因重组菌时)，可以得到Pro序列肽的来源和成熟型TGase的来源不同的稳定型TGase。但是优选Pro序列肽的来源和成熟型TGase的来源相同。这种方式的稳定型TGase，典型的是通过培养转谷氨酰胺酶生产菌(自身具有生产性的菌或导入了转谷氨酰胺酶基因的重组菌)而以中间体获得。下面，对该方式的稳定型TGase的制造法的一例进行说明。
(稳定型TGase的制造法)
首先，准备具有转谷氨酰胺酶产生能力的链霉菌属微生物(例如茂原链霉菌No.140226株)，在产生转谷氨酰胺酶的条件下进行培养。只要能产生转谷氨酰胺酶就对培养条件没有特别限定。培养条件的具体例示于后述的实施例。本领域技术人员可根据需要适当地改变培养条件。
培养基中可以使用淀粉、蔗糖、乳糖、甘油、葡萄糖等的碳源，胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵等的氮源，磷酸一钾、磷酸二钾、硫酸镁、硫酸锰、炭酸钙等的微量金属盐等通常使用的培养基原料。另外，为了抑制发泡可根据需要进行消泡剂的添加。培养温度通常为25℃～35℃。另外，使用各种发酵容器进行培养即可，通常进行2天～6天的通气搅拌。可根据所使用菌株的种类、发酵培养基进行，可不必依照该条件。例如，对培养基原料进行送料(フイ一ヂング)，或者含高浓度的培养基原料时，通常培养时间会变得更长。另外，可根据需要进行培养基的pH控制。
通过过滤或者离心分离，从培养结束后的发酵混合物去除菌体等。作为过滤优选添加硅藻土的加压过滤，并且优选在室温以下的条件下实施。根据需要冷却所得滤液，即转谷氨酰胺酶粗酶液。其中，如Eur，.J，Biochem.，257，570-576(1998)所记载，已知转谷氨酰胺酶是作为前体而被生产，为了变换成稳定型TGase而可以向发酵混合物添加蛋白酶或肽酶等的酶，进行一定时间的处理。另外，已知转谷氨酰胺酶的一部分也以不具有酶活性的氧化型存在，所以优选添加半胱氨酸、谷胱甘肽、或者含这些的物质，使其变换为活性型。其中，这些活化操作并非限定于纯化工序的阶段进行，但优选在纯化的早期阶段进行。
根据需要浓缩粗酶液。对浓缩方法没有特别限定，优选利用能够同时进行浓缩和纯化的超滤。通常可将浓缩进行至10倍～100倍左右。其中，只要能浓缩到可以进行接下来的工序的浓度就对浓缩的程度没有特别要求。其中，作为超滤膜，考虑到TGase的分子量(约38000)，优选使用具有其以下的膜，例如使用具有分子量13000的平均孔径的旭化成工业制ACP-13000等。不过，即使使用具有分子量50000的孔径的膜也基本不会漏掉酶，所以能够通过根据需要选择膜而提高纯化度。脱盐浓缩中有时生成沉淀，但可以通过添加适当的缓冲液或者盐类溶液等而使其溶解。另外，对浓缩时的温度没有特别的限定，优选10℃～30℃。虽然温度越高越能有效地实施浓缩，但其反面是有可能发生失活。
浓缩液中含有目标稳定型TGase(结合了Pro序列肽的成熟型TGase)和成熟型TGase。所以从浓缩液回收目标稳定型TGase。下面，对稳定型TGase的回收法的一例进行说明。首先，为了去除杂蛋白质等，通过使用了乙醇、聚乙二醇等的前处理而将浓缩液部分纯化。将经该前处理回收的沉淀溶解于适当的缓冲液之后，提供于透析。透析后，添加硫酸铵、氯化钠等的盐类进行盐析。由此沉淀成熟型TGase。回收上清之后，利用盐析、柱层析、离心分离等分离、纯化上清中的稳定型TGase。根据需要进行脱盐、浓缩等。
(含有稳定型TGase的酶制剂)
可以使用稳定型TGase构成酶制剂。本发明的酶制剂的形状没有特别的限定，例如为粉末状、颗粒状、液体状、胶囊状等。本发明的酶制剂含有稳定型TGase作为必须的有效成分。其他的成分为任意。作为本发明的酶制剂可以含有的成分可例示食品用赋形剂、各种蛋白质、各种蛋白质的分解物、各种提取物类、各种盐类、各种抗氧化剂、半胱氨酸、谷胱甘肽、谷氨酸钠、肌苷酸钠、鸟苷酸钠、贝壳煅烧钙、二氧化硅。其中，食品用赋形剂的例子有糊精、支化糊精、环糊精、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、多糖类、淀粉(马铃薯淀粉、玉米淀粉)、难消化性糊精、橡胶类、乳化剂(蔗糖脂肪酸酯、卵磷脂等)、胶质、油脂。蛋白质的例子为大豆蛋白质、小麦蛋白质、玉米蛋白质、乳蛋白质、动物来源蛋白质等。提取物类的例子有肉提取物、植物提取物、酵母提取物等。盐类的例子有氯化盐、磷酸盐、聚磷酸盐、焦磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、碳酸盐等。抗氧化剂的例子为L-抗坏血酸盐、亚硫酸氢钠等。
实施例
1.稳定型TGase的纯化
使用含2％的可溶性淀粉、5％的蔗糖、2％的聚胨、0.2％的酵母提取物、0.1％的硫酸镁、0.2％的磷酸二钾、0.05％的Adecanol的培养基，将作为转谷氨酰胺酶生产菌的茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)No.140226株(参照特开2005-73628号公报)在30℃下进行2天的振荡培养，得到了4000mL的粗酶液。其中，只要不是特别说明，％是指重量％(以下的各实施例中亦然)。
接着，以超滤膜(旭化成社制ACP1010)将粗酶液脱盐、浓缩，得到200mL的浓缩液。向浓缩液以最终成为1/10浓度的方式添加、混合McIlvaine缓冲液(pH6.0)之后，以冷乙醇50％进行了分馏。将回收的沉淀溶解于含0.1M氯化钠的1/10浓度的McIlvaine缓冲液(pH6.0)之后，提供于透析。接着，以达到饱和浓度的方式向透析液添加氯化钠，在低温下静置3天后，回收了上清。沉淀为成熟型TGase(M-TGase)的结晶，经利用饱和食盐溶液的重结晶化而获得M-TGase纯化酶。M-TGase纯化酶的比活性(u/Abs280nm)为19.1。其中，序列号6表示M-TGase的氨基酸序列。
另一方面，以达到饱和浓度的方式向回收的上清添加硫酸铵，回收了沉淀。将回收的沉淀溶解于20mM的磷酸缓冲液(KPB；pH7.2)中之后，以该缓冲液进行了透析。接着，以成为1.7M的方式向透析液添加硫酸铵，提供于以含1.7M硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(KPB；pH7.2)进行了平衡化的Phenyl-Sepharose 6Fast Flow。以硫酸铵浓度1.7M进行洗净后，以硫酸铵浓度1.0M进行了洗脱。本洗脱馏分中洗脱出了目标稳定型TGase(P-TGase)。如此得到的P-TGase的比活性(u/Abs280nm)为7.9。对添加了SDS(十二烷基硫酸钠)的情况和未添加的情况的凝胶过滤(Sephacryl S-100)洗脱图谱进行比较，结果判明了P-TGase具有在成熟型TGase上结合有Pro序列肽的结构。
转谷氨酰胺酶的活性的测定是根据特开昭64-27471号公报所记载的方法进行的。即，以苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羟基胺为底物在不存在Ca2+下进行反应，将生成的异羟肟酸在三氯乙酸共存条件下形成铁配合物，测定525nm的吸收，由标准曲线求出异羟肟酸的量，计算转谷氨酰胺酶活性。下面，详细说明测定法。首先，准备以下的试剂A以及B。
试剂A：0.2M TRIS-盐酸缓冲液(pH6.0)、0.1M羟基胺、0.01M还原型谷胱甘肽、0.03M苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸
试剂B：3N盐酸、12％三氯乙酸、5％FeCl3·6H2O(溶解于O.1N-HCl)的1∶1∶1的混合液
向酶液0.05mL添加0.5mL的试剂A混合后，37℃下反应10分钟。添加试剂B停止反应并形成Fe配合物之后测定525nm的吸光度。作为对照，使用预先热失活的酶液同样进行反应而测定其吸光度，求出与酶液的吸光度差。另行代替酶液使用L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸制作标准曲线，由上述吸光度差求出所生成的异羟肟酸的量。以1分钟生成1μ摩尔的异羟肟酸的酶活性作为1单位。只要没有特别说明，以下的各试验中也通过该测定法测定了转谷氨酰胺酶的活性。
2.Pro序列肽的纯化
向1.中得到的P-TGase溶液1.8mL添加、溶解5.0mg的碳酸钠之后，混合10％(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液0.2mL，37℃下处理30分钟。将2.0mL的处理液提供于以含0.1％SDS的20mM KPB(pH7.2)进行平衡化的Sephacryl S-100(柱体积160mL)。监测吸光度280nm，回收流动相量123mL附近观察到的峰。使用Amicon Ultra(Ultracel-5K)，在4℃的条件下对回收的溶液进行了离心浓缩。得到的浓缩液(样品)提供于N末端氨基酸测序以及质量分析。从N末端氨基酸分析的结果明确了肽的N末端为DNGAGEETKS。另一方面，质量分析的结果观测到了m/z(1)3623.938、(2)3640.903、(3)3710.780、(4)3727.845、(5)3813.735的5个峰。认为(1)和(3)分别为(2)和(4)的脱酰胺体。从N末端氨基酸测序的结果和质量分析的结果，将其他的3峰的氨基酸序列鉴定为，(1)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列号1)、(2)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS(序列号2)、(3)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS(序列号3)。而且，这些序列相当于Pro序列全长(序列号4)的一部分。
3.P-TGase的稳定性试验1
对比了P-TGase和M-TGase的pH稳定性。pH2～4时使用柠檬酸-盐酸缓冲液、pH4～11时使用伯瑞坦-罗比森(Britton-Robinson)缓冲液调制各酶稀释液，进行50℃、1小时的处理之后，测定了转谷氨酰胺酶活性。其结果，相对于P-TGase在pH4时也具有93％的残存活性，同条件下的M-TGase的残存活性为2％(图1)。这样，P-TGase在酸性区域中显示出高稳定性。
另一方面，也对比了P-TGase和M-TGase的温度稳定性。用0.2MTRIS-盐酸缓冲液(pH6.0)调制了各酶稀释液，各温度下热处理之后，测定了转谷氨酰胺酶活性。其结果，50℃下处理80分钟时的残存活性是相对于M-Tgase为33％，P-Tgase为64％(图2)。这样，P-TGase显示出高于M-TGase的热稳定性。
4.P-TGase的稳定性试验2
为了评价溶液中的对氧化的稳定性(氧化失活的难度)，实施了抑制试验(对过氧化氢)。将过氧化氢水(试剂、30％(w/v))以适宜的0.2M TRIS-盐酸缓冲液(pH6.0)稀释后添加到酶溶液，37℃下处理30分钟之后，测定了转谷氨酰胺酶活性。处理浓度0.03％(w/v)时的残存活性是相对于M-TGase为3％，P-TGase为54％(图3)。这样，P-TGase在溶液中显示出高氧化稳定性。
5.P-TGase的稳定性试验3
评价了粉末状态下的稳定性。通过冻结干燥分别对P-TGase和M-TGase进行了粉末化。对M-TGase粉末混合糊精，以使每重量当中的转谷氨酰胺酶活性与P-TGase粉末相同。保存温度为44℃。2个月后的残存活性是相对于M-TGase为79％，P-TGase为85％(图4)。这样，在粉末状态时P-TGase显示出高稳定性。
6.P-TGase的纯化(淡紫灰链霉菌No.466)
使用含2％的可溶性淀粉、5％的蔗糖、2％的聚胨、0.2％的酵母提取物、0.1％的硫酸镁、0.2％的磷酸二钾、0.05％的Adecanol的培养基，将作为转谷氨酰胺酶生产菌的淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)No.466(参照专利第2849773号公报、特开平4-207194号公报)，在30℃下进行3天的振荡培养，得到了粗酶液1500mL。
接着，利用超滤膜(旭化成社制ACP1010)浓缩粗酶液，得到了300mL的浓缩液。以80％饱和浓度硫酸铵盐析浓缩液，回收了沉淀。将回收的沉淀溶解于20mM的磷酸缓冲液(KPB；pH7.2)，并且在相同的缓冲液中进行了透析。从透析样品去除不溶物，同样将上清提供于以20mM磷酸缓冲液(KPB；pH7.2)进行平衡化的Blue-Sepharose 6Fast Flow。回收以该缓冲液进行洗净的馏分，用含1.7M硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(KPB；pH6.8)进行了透析。将透析样品提供于同样以含1.7M硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(KPB；pH6.8)进行了平衡化的Phenyl-Sepharose 6
Fast Flow。以同样的缓冲液洗净后，以硫酸铵浓度1.7M～0M的线性梯度进行洗脱，结果在洗脱液硫酸铵浓度1.0M附近洗脱出了P-TGase。并且，在洗脱液硫酸铵浓度0.8M附近洗脱出了M-TGase。
7.P-TGase(淡紫灰链霉菌No.466)的稳定性试验1
还对P-TGase和M-TGase的温度稳定性进行了对比。用0.2M TRIS-盐酸缓冲液(pH6.0)调制各酶稀释液，各温度下热处理之后，测定了转谷氨酰胺酶活性。其结果，50℃下处理20分时的残存活性是相对于M-TGase为12％，P-TGase为29％(图5)。这样，源自淡紫灰链霉菌No.466株的P-TGase显示出高于源自同株M-TGase的热稳定性。
8.P-TGase(淡紫灰链霉菌No.466)的稳定性试验2
为评价溶液中的对氧化的稳定性(氧化失活难度)，实施了抑制试验(对过氧化氢)。将过氧化氢水(试剂、30％(w/v))以适宜的0.2M TRIS-盐酸缓冲液(pH6.0)稀释后向酶溶液添加，37℃下处理15分钟之后，测定了转谷氨酰胺酶活性。处理浓度0.006％(w/v)时的残存活性是相对于M-TGase为35％，P-TGase为62％(图6)。这样，源自淡紫灰链霉菌No.466株的P-TGase在溶液中显示出高氧化稳定性。
9.Pro型转谷氨酰胺酶的调制
使用含2％的可溶性淀粉、5％的蔗糖、2％的聚胨、0.2％的酵母提取物、0.1％的硫酸镁、0.2％的磷酸二钾、0.05％的Adecanol的培养基，将作为转谷氨酰胺酶生产菌的茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)No.140226株(特开2005-73628)，在30℃下进行了2天的振荡培养，得到了粗酶液1500mL。将粗酶液利用超滤膜(旭化成社制ACP1010)进行浓缩，获得了150mL的浓缩液。将浓缩液以基于文献信息(Eur.J.Biochem.257，570-576(1998))的方法进行纯化，得到了Pro型转谷氨酰胺酶。
10.P-TGase的调制(利用蛋白酶处理的由Pro型转谷氨酰胺酶的转变)
将Pro型转谷氨酰胺酶溶液用含150mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH7.4)进行透析而得到了透析样品(Abs.280nm＝1.8)。向透析样品以处理液终浓度成为0.08u/mL的方式添加Dispase II(ROCHE制)之后，30℃下进行60分钟的处理调制了P-TGase。反应的停止是通过用含5mM EDTA的0.2M TRIS-盐酸缓冲液(pH6.0)稀释到下述“11.”的使用浓度为止而进行的。另一方面，下述“11.”中使用的M-TGase也是使用了与P-TGase同样地进行了DispaseII处理的样品。
11.P-TGase(蛋白酶处理品)的稳定性试验
还对P-TGase和M-TGase的温度稳定性进行了对比。用0.2M TRIS-盐酸缓冲液(pH6.0)调制了各酶稀释液，各温度下热处理之后，测定了转谷氨酰胺酶活性。其结果，50℃下处理60分钟时的残存活性是相对于M-TGase为41％，P-TGase为76％(图7)。这样，通过蛋白酶处理得到的P-TGase也显示出高于M-TGase的热稳定性。由此，认为经蛋白酶处理而得到的上述“10.”的P-TGase与上述“1.”的P-TGase属于相同的物质。
产业上的利用可能性
本发明的稳定型转谷氨酰胺酶与成熟型转谷氨酰胺酶相比，在pH稳定性、温度稳定性等方面优异。本发明的稳定型转谷氨酰胺酶的用途例子为粘结肉、香肠、豆腐、面包、面类的制造。
本发明并不受上述的发明的实施方式以及实施例的说明的任何限定。不脱离要求保护的范围所记载的、本领域技术人员能够容易想到的范围中的各种各样的变形方式也包括在本发明中。
本说明书中所示的论文、公开专利公报、以及专利公报等的内容是通过援用而引用了其全部内容。
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Figure IPA00001197176100031
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Claims (14)

1.一种稳定型转谷氨酰胺酶，由转谷氨酰胺酶的Pro序列肽与成熟型转谷氨酰胺酶结合了的结构构成。
2.根据权利要求1所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中，成熟型转谷氨酰胺酶为源自微生物。
3.根据权利要求2所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中，微生物为链霉菌属微生物。
4.根据权利要求2所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中，微生物为茂原链霉菌。
5.根据权利要求1所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中，成熟型转谷氨酰胺酶具有序列号6所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中，Pro序列肽为源自微生物。
7.根据权利要求6所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中，微生物为链霉菌属微生物。
8.根据权利要求6所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中，微生物为茂原链霉菌。
9.根据权利要求1所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中Pro序列肽具有以下的(1)～(3)中的任一个序列：
(1)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列号1)；
(2)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS(序列号2)；
(3)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS(序列号3)。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的稳定型转谷氨酰胺酶，其中，与未结合转谷氨酰胺酶的Pro序列肽的成熟型转谷氨酰胺酶相比，选自pH稳定性、温度稳定性、氧化稳定性和保存稳定性中的一个以上的稳定性高。
11.一种酶制剂，含有权利要求1～10中任一项所述的稳定型转谷氨酰胺酶。
12.一种稳定型转谷氨酰胺酶的制造法，包含：
在产生转谷氨酰胺酶的条件下，培养具有转谷氨酰胺酶产生能力的微生物的步骤；
从培养液分离、回收结合了Pro序列肽的成熟型转谷氨酰胺酶的步骤。
13.根据权利要求12所述的稳定型转谷氨酰胺酶的制造法，其中，微生物为链霉菌属微生物。
14.根据权利要求12所述的稳定型转谷氨酰胺酶的制造法，其中，微生物为茂原链霉菌。
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