CN117940561A - 液态转谷氨酰胺酶酶制剂 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种转谷氨酰胺酶的新的稳定化方法。转谷氨酰胺酶通过在pH6.5以下的条件下与碳酸钠和/或硫酸钠共存而稳定化。

Description

液态转谷氨酰胺酶酶制剂

技术领域

本发明涉及液态转谷氨酰胺酶酶制剂和交联蛋白质的制造方法。更详细而言，本发明涉及热稳定性提高的液态转谷氨酰胺酶酶制剂和转谷氨酰胺酶的热稳定性提高的反应体系中的交联蛋白质的制造方法。

背景技术

转谷氨酰胺酶是分配EC 2.3.2.13作为EC编号的酰基转移酶，通过催化蛋白质中的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰基转移反应而使蛋白质交联。根据该特性，转谷氨酰胺酶是在食品蛋白质等的改性中利用性高的酶。

含有转谷氨酰胺酶作为有效成分的酶制剂期望通过以稳定性高的配方进行制剂化，从而能够在食品蛋白质等的改性中以高的酶利用效率使用。

例如，专利文献1中记载了通过使转谷氨酰胺酶等乳蛋白质交联和/或修饰酶包含于多元醇-水悬浮液中而稳定化的液态酶制剂，所述多元醇-水悬浮液包含25％～100％(w/w)的多元醇且具有4.4～5.1的范围内的pH值；专利文献2中记载了通过使转谷氨酰胺酶同时包含5重量％以上的选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸盐、天冬氨酸盐和有机酸盐中的1种或2种以上而稳定化的液态酶制剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/064736号

专利文献2：国际公开第2019/182123号

发明内容

发明所要解决的技术问题

迄今为止报道的转谷氨酰胺酶的液态酶制剂的配方限制严格，或者通过使用氨基酸、有机酸等有机化合物作为稳定剂而将酶制剂的用途限制为仅食品用，因此期望新的稳定化方法。

因此，本发明的目的在于提供一种转谷氨酰胺酶的新的稳定化方法。

用于解决技术问题的技术方案

本发明人为了解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现，转谷氨酰胺酶在碳酸钠和/或硫酸钠的存在下且在pH6.5以下的条件下呈现优异的稳定性。本发明是基于该见解进一步反复研究而完成的。即，本发明提供下述揭示的方式的发明。

项1.一种液态转谷氨酰胺酶酶制剂，其包含(a)转谷氨酰胺酶和(b)碳酸钠和/或硫酸钠，25℃的条件下的pH为6.5以下。

项2.根据项1所述的酶制剂，其中，相对于所述(a)成分1U，包含0.001～1mmol所述(b)成分。

项3.根据项1或2所述的酶制剂，其用作蛋白质交联化剂。

项4.一种交联蛋白质的制造方法，其包括在(b)碳酸钠和/或硫酸钠的存在下且25℃的pH为6.5以下的条件下使(a)转谷氨酰胺酶作用于蛋白质的工序。

项5.根据项4所述的制造方法，其中，相对于所述(a)成分1U，使用0.001～1mmol所述(b)成分。

项6.根据项4或5所述的制造方法，其中，在45℃以上的温度下进行所述工序。

附图说明

图1是表示在本发明的交联蛋白质的制造方法中，由转谷氨酰胺酶产生的蛋白质交联效果因硫酸钠而提高的结果。

具体实施方式

1.液态转谷氨酰胺酶酶制剂

本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂的特征在于，包含(a)转谷氨酰胺酶(以下也记载为“(a)成分”)和(b)碳酸钠和/或硫酸钠(以下也记载为“(b)成分”)，25℃的pH为6.5以下。以下，对本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂进行详述。

(a)转谷氨酰胺酶

本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂包含转谷氨酰胺酶作为(a)成分。转谷氨酰胺酶是具有通过催化蛋白质中的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰基转移反应而使蛋白质交联的活性的酶。

作为本发明中使用的转谷氨酰胺酶的具体例，没有特别限定。具体而言，作为转谷氨酰胺酶，可举出源自微生物的转谷氨酰胺酶，具体而言，可举出拉达卡链霉菌(Streptomyces ladakanum)、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、灰肉色链霉菌(Streptomyces griseocarneus)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)或利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)等源自链霉菌(Streptomyces)属的转谷氨酰胺酶(例如，参照日本特开昭64-27471号公报)、白色库茨涅尔氏菌(Kutzneria albida)等源自库茨涅尔氏菌(Kutzneria)的转谷氨酰胺酶(例如，参照日本特开2020-195397号公报)、吐鲁番长丝菌(Longimycelium tulufanense)等源自长丝菌(Longimycelium)属的转谷氨酰胺酶；源自哺乳类的转谷氨酰胺酶(例如，参照日本特公平1-50382号公报)；源自鱼类的转谷氨酰胺酶(例如，参照日本特开平06-113844号公报)；利用重组DNA技术得到的重组体(重组型)转谷氨酰胺酶(例如，参照日本特开平5-199883号公报、日本特开2004-97099号公报)；具有转谷氨酰胺酶的前序列肽与成熟型转谷氨酰胺酶结合的结构的转谷氨酰胺酶(例如，参照国际公开第2009/101762号)等。这些转谷氨酰胺酶可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。

这些转谷氨酰胺酶中，从更进一步提高稳定化效果的观点出发，可优选举出源自微生物的转谷氨酰胺酶，可更优选举出源自链霉菌(Streptomyces)属的转谷氨酰胺酶，可进一步优选举出源自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)种的转谷氨酰胺酶。

作为液态转谷氨酰胺酶酶制剂中的(a)成分的含量(总量)，只要是在所述酶制剂的使用中能够发挥由(a)成分带来的效果的程度，就没有特别限定，例如，在液态转谷氨酰胺酶酶制剂100ml中，可举出1～100000U，优选为10～50000U，更优选为100～10000U，进一步优选为250～5000U，更进一步优选为500～1500U。

需要说明的是，对于转谷氨酰胺酶的活性值，在使用苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸和羟胺作为底物的情况下，将1分钟生成1μ摩尔异羟肟酸的酶活性设为1单位(U)。

(b)碳酸钠和/或硫酸钠

本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂包含碳酸钠和/或硫酸钠作为(b)成分。(b)成分在pH调节至6.5以下的液态转谷氨酰胺酶酶制剂中，提高转谷氨酰胺酶的稳定性。

这些碳酸钠和硫酸钠中，从更进一步提高稳定化效果的观点出发，优选举出硫酸钠。

作为液态转谷氨酰胺酶酶制剂中的(b)成分的含量(总量)，只要可得到转谷氨酰胺酶的稳定化效果，就没有特别限定，根据要求所述稳定化效果的程度适当设定即可。

作为液态转谷氨酰胺酶酶制剂中的(b)成分的含量(总量)的具体例，例如作为(a)成分的每1U的量，可举出0.001～1mmol，从更进一步提高稳定化效果的观点出发，可举出优选为0.005～0.5mmol，更优选为0.01～0.1mmol，进一步优选为0.03～0.07mmol。

作为液态转谷氨酰胺酶酶制剂中的(b)成分的含量(总量)的另一具体例，例如可举出0.01～10M，从进一步提高稳定化效果的观点出发，可举出优选为0.05～5M，更优选为0.1～1M，进一步优选为0.3～0.7M。

其他成分

本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂可以根据制剂形态和/或用途等适当地进一步包含基剂和添加剂中的至少任一者，具体而言为以下举出的成分中的1种或多种。

本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂典型地含有水作为基剂。作为水，没有特别限定，可举出纯化水、去离子水、自来水等。

作为添加剂，可举出稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、保存剂、防腐剂等。

作为稳定剂，允许配合丙二醇、抗坏血酸及其他公知的转谷氨酰胺酶的稳定剂(具体而言，选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸盐、天冬氨酸盐和有机酸盐中的1种或2种以上(更具体而言，以它们的总量计，以5重量％以上的量配合)、以及多元醇(更具体而言，以25重量％以上的量配合))等，但在本发明中，在规定的pH条件下共存的(b)成分对转谷氨酰胺酶的稳定化效果优异，因此在优选的方式中，不包含这些稳定剂。

作为缓冲剂，只要能够将液态转谷氨酰胺酶酶制剂的pH单独调节至6.5以下或与pH调节剂组合调节至6.5以下，就没有特别限定，例如可举出磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、邻苯二甲酸缓冲剂、马来酸缓冲剂、甘氨酸-HCl缓冲剂、碳酸缓冲剂、Good缓冲剂等，优选举出Good缓冲剂。作为Good缓冲剂，可举出N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、2-吗啉乙磺酸(MES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基甲磺酸(TES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)、2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、2-羟基-3-吗啉代丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)等，优选举出MES。

作为pH调节剂，只要能够将液态转谷氨酰胺酶酶制剂的pH调节至6.5以下就没有特别限定，例如可举出盐酸、磷酸、乙酸、硫酸等酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水等碱。

作为保存剂，可举出苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可举出苯甲酸盐(钾盐、钠盐等碱金属盐)、山梨酸盐(钾盐、钠盐等碱金属盐)、乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

pH

本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂在25℃的pH为6.5以下。从更进一步提高稳定化效果的观点出发，作为所述pH，可举出优选为6.3以下，更优选为6.2以下，进一步优选为6.1以下。作为所述pH范围的下限，可举出例如4.0以上，从更进一步提高稳定化效果的观点出发，可举出优选为4.8以上、更优选为5.3以上、进一步优选为5.8以上。

用途

本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂可用于得到转谷氨酰胺酶的效果的任意用途。优选地，本发明的液态转谷氨酰胺酶酶制剂用作蛋白质的交联化剂，在更具体的例子中，用作用于得到基于蛋白质的交联的蛋白质材料的特性变化的蛋白质材料改性剂。作为蛋白质交联化剂的使用方法的优选例，可举出以下的“2.交联蛋白质的制造方法”。

2.交联蛋白质的制造方法

如上所述，转谷氨酰胺酶通过在pH6.5以下的条件下与碳酸钠和/或硫酸钠共存而稳定化。因此，在使用转谷氨酰胺酶进行使蛋白质交联的反应时，通过使反应体系为pH6.5以下的条件且使反应体系中包含碳酸钠和/或硫酸钠，可以得到优异的转谷氨酰胺酶利用效率。

因此，本发明还提供交联蛋白质的制造方法，其包括(b)在碳酸钠和/或硫酸钠的存在下且在25℃的pH为6.5以下的条件下使(a)转谷氨酰胺酶作用于蛋白质的工序。

所述工序中，具体而言，将包含蛋白质、(a)成分、(b)成分和水、且25℃的条件下的pH被调节为6.5以下的反应混合液供于转谷氨酰胺酶进行蛋白质的交联反应的反应条件。

作为底物的蛋白质只要能够受到转谷氨酰胺酶的交联作用，则其起源和性状等没有特别限制。作为所述蛋白质的具体例，可举出动物性蛋白质、源自昆虫的蛋白质、植物性蛋白质、源自菌类的蛋白质、源自藻类的蛋白质等天然蛋白质；以及人工蛋白质等。

作为动物性蛋白质，没有特别限定，可举出源自脊椎动物的蛋白质。作为源自脊椎动物的蛋白质，没有特别限定，可优选举出源自哺乳动物的蛋白质，更具体而言，可举出酪蛋白、β-乳球蛋白等乳蛋白质；卵白蛋白等卵蛋白质；肌球蛋白、肌动蛋白等肉蛋白质；血清白蛋白等血液蛋白质；明胶、胶原蛋白等肌腱蛋白质等。

作为源自昆虫的蛋白质，没有特别限定，例如可举出源自蟋蟀的蛋白质、源自蚕的蛋白质等。

作为植物性蛋白质，例如可举出大豆(Soy beans)、青豆(Green peas)、小扁豆(Lentils)、鹰嘴豆(Chickpeas)、黑豆(Black beans)、蚕豆(Fava bean)等源自谷类的蛋白质、小麦、大麦、燕麦(Oat)、黑麦、米等源自禾谷类的蛋白质；杏仁、花生、大麻种子(Hempseed：是指所谓的产业用大麻，具体而言，是指不含引起知觉歪曲的THC(四氢大麻酚)或THC浓度低的品种。产业用大麻由于不含有THC或其浓度低，因此没有作为知觉歪曲药的有效性，不会导致滥用。)、芡欧鼠尾草种子(Chia)、藜麦(Quinoa)、苋菜籽(Amaranthus)等源自种子的蛋白质等。

作为源自菌类的蛋白质，例如可举出源自酵母的蛋白质、源自丝状菌的蛋白质、源自真菌类的蛋白质(源自蘑菇的菌蛋白等)等。

作为人工蛋白质，可举出通过化学、酶学或基因工程学合成的蛋白质。

在本发明中，作为交联反应的底物的上述蛋白质可以是经纯化的状态的蛋白质，也可以是在通常应用转谷氨酰胺酶的公知的蛋白质材料中包含的状态的蛋白质。因此，在反应混合液中可以包含成为蛋白质源的所述蛋白质原材料本身。作为蛋白质原材料，可举出饮食品原材料(包括饲料原材料)、纤维原材料、化学产品原材料(可举出照片胶片、鞣制皮革等)、化妆品原材料、医药原材料等。

关于反应混合液中包含的(a)成分的详细情况和(b)成分相对于(a)成分的使用量的使用量，分别如上述“1.液态转谷氨酰胺酶酶制剂”的(a)成分的详细情况和(a)成分的每1U的(b)成分的含量所述。

另外，反应混合液在25℃的条件下的pH为6.5以下。从更进一步提高转谷氨酰胺酶的稳定化效果的观点出发，作为所述pH，可举出优选为6.3以下，更优选为6.2以下，进一步优选为6.1以下。作为所述pH范围的下限，例如可举出4.0以上，从更进一步提高转谷氨酰胺酶的稳定化效果的观点出发，可举出优选为4.8以上，更优选为5.3以上，进一步优选为5.8以上。

反应混合液可以分别准备蛋白质(或包含该蛋白质的蛋白质原材料)、(a)成分、(b)成分、根据需要的适当的溶剂(典型的是水)以及用于将反应混合液调节至pH6.5以下的缓冲剂和/或pH调节剂中的至少任一种来制备，也可以分别准备蛋白质(或包含该蛋白质的蛋白质原材料)、上述“1.液态转谷氨酰胺酶酶制剂”中记载的酶制剂、根据需要的适当的溶剂(典型的是水)以及用于将反应混合液调节至pH6.5以下的缓冲剂和/或pH调节剂中的至少任一种来制备。

反应混合液只要以在25℃的pH为6.5以下的条件且与(b)成分共存的状态下蛋白质与(a)成分接触的方式构建即可，可以为均匀体系，也可以为不均匀体系。

作为供给反应混合液的温度条件，没有特别限定，根据(a)成分的最适温度等适当确定即可，本发明的制造方法中，为了在交联反应中能够良好地维持转谷氨酰胺酶的热稳定性，优选为加热条件。作为具体的温度条件，可举出例如45℃以上，优选48℃以上。作为所述温度条件的上限，没有特别限定，例如可举出65℃以下，优选60℃以下，更优选55℃以下，进一步优选52℃以下。

进行上述工序的时间(作用时间)并无特别限定，例如可举出10～600分钟、20～300分钟、30～180分钟，优选为40～120分钟，更优选为50～70分钟。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行具体地说明，但本发明并不受实施例的限定。

<试剂材料>

[表1]

<转谷氨酰胺酶活性测定方法>

转谷氨酰胺酶的酶活性测定以苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸和羟胺作为底物，通过以下记载的方法进行。

通过将2.42g的2-氨基-2-羟甲基-1.3-丙二醇、0.70g的盐酸羟铵、0.31g的还原型谷胱甘肽和1.01g的Z-Gln-Gly(苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸)溶解于蒸馏水中，使总量为100mL(pH6.0)来制备底物溶液。

通过将30mL的3M盐酸溶液、30mL的12重量％三氯乙酸溶液和30mL的5重量％氯化铁(III)溶液混合来制备显色溶液。

用200mM的MES缓冲液(pH6.0)将酶稀释至适当的浓度(具体而言，盐类的浓度为1mM左右的浓度)来制备样品溶液。

在10μL样品溶液中添加并混合100μL底物溶液后，在37℃反应10分钟。加入100μL显色溶液使反应停止并且形成Fe络合物后，测定在525nm处的吸光度。作为对照，使用预热失活的样品溶液同样进行反应，测定吸光度，求出与非失活的样品溶液的吸光度差。另外，使用L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸代替样品溶液制作标准曲线，求出由所述吸光度差生成的异羟肟酸量。将1分钟内生成1μ摩尔的异羟肟酸的酶活性定义为1单位(1U)。

<试验例1>

(1)液态转谷氨酰胺酶酶制剂的制备

制备表2所示成分的液态转谷氨酰胺酶酶制剂。在制备时，使用200mM的MES缓冲液，以25℃的pH(最终pH)成为6.0的方式，使用NaOH进行pH调节。因此，表2所示成分的液态转谷氨酰胺酶酶制剂除了表2所示成分以外，还包含水作为溶剂，MES作为缓冲剂，NaOH作为pH调节剂。

(2)热稳定性试验

将制备的液态转谷氨酰胺酶酶制剂在50℃下保存80分钟。然后，冰冷却，测定转谷氨酰胺酶活性。算出将保存前的转谷氨酰胺酶活性设为100％时的保存后的转谷氨酰胺酶活性残存率(％)。该活性残存率越高，可以评价为热稳定性越高。

(3)结果

将结果示于表2。如表2所示，在使用碳酸钠和硫酸钠时能够确认热稳定性提高效果。

[表2]

<试验例2>

在200mM的MES缓冲液中溶解硫酸钠，将25℃的pH调节至6.0，在其中溶解乳酪蛋白，将25℃的pH调节至6.0，添加转谷氨酰胺酶，由此制备包含乳酪蛋白(5重量％)、转谷氨酰胺酶(1000U/100ml)和硫酸钠(0.5M，每1U转谷氨酰胺酶为0.05mmol)且25℃的条件下的pH为6.0的反应混合液。

将反应混合液供于50℃、60分钟的条件，进行使蛋白质交联的反应工序(实施例3)。另一方面，除了不使用硫酸钠以外，进行与实施例3同样的操作(比较例7)。应予说明，在反应前和反应开始后经过1、2、10、30、60分钟时，对反应混合液进行取样，与SDS-PAGE样品缓冲液混合，煮沸后冰冷却。将这样得到的取样试样供于SDS-PAGE，评价交联活性。

结果示于图1。电泳图中条带的位置越接近原点，表示在进行蛋白质交联反应。如图1所示，在pH6.0的条件下使硫酸钠共存的情况下(实施例3)，基于转谷氨酰胺酶的蛋白质交联效果显著提高。

Claims (6)

1.一种液态转谷氨酰胺酶酶制剂，其特征在于，包含(a)转谷氨酰胺酶和(b)碳酸钠和/或硫酸钠，25℃的pH为6.5以下。

2.根据权利要求1所述的酶制剂，其中，所述酶制剂中，相对于所述(a)成分1U，包含0.001～1mmol所述(b)成分。

3.根据权利要求1所述的酶制剂，其中，所述酶制剂用作蛋白质交联化剂。

4.一种交联蛋白质的制造方法，其特征在于，包含在(b)碳酸钠和/或硫酸钠的存在下且25℃的pH为6.5以下的条件下使(a)转谷氨酰胺酶作用于蛋白质的工序。

5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，相对于所述(a)成分1U，使用0.001～1mmol所述(b)成分。

6.根据权利要求4所述的制造方法，其中，在45℃以上的温度下进行所述工序。