JP4513377B2 - 変異型チロシンリプレッサー遺伝子とその利用 - Google Patents
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Description
(1) チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサー。
(2) 野生型チロシンリプレッサーのアミノ酸配列において、以下の(イ)〜(ハ)のうちの2群又は3群のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、
(イ)67位のバリン、72位のチロシン及び201位のグルタミン酸、
(ロ)324位のアスパラギン
(ハ)503位のアラニン
(3) (イ)67位のバリンを置換するアミノ酸がアラニンであり、72位のチロシンを置換するアミノ酸がシステインであり、201位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がグリシンであり、(ロ)324位のアスパラギンを置換するアミノ酸がアスパラギン酸であり、(ハ)503位のアラニンを置換するアミノ酸がスレオニンである、(2)の変異型チロシンリプレッサー。
(4) 前記変異以外の位置において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない(2)又は(3)の変異型チロシンリプレッサー。
(5) 野生型チロシンリプレッサーがパントエア・アグロメランスの野生型チロシンリプレッサーである、(1)〜(4)のいずれかの変異型チロシンリプレッサー。
(6) パントエア・アグロメランスの野生型チロシンリプレッサーが配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質である、(5)の変異型チロシンリプレッサー。
(7) (1)〜(6)のいずれかの変異型チロシンリプレッサーをコードするDNA。
(8) (7)のDNAで形質転換されたエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌。
(9) さらにチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーターに発現可能に連結された構造遺伝子を保持する(8)のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌。
(10) (8)又は(9)のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌を培地中で培養してチロシンフェノールリアーゼを生成させる工程、及び該チロシンフェノールリアーゼを精製する工程を含む、チロシンフェノールリアーゼの製造法。
(11) チロシン非存在下で前記微生物を培養することを特徴とする、(10)のチ
ロシンフェノールリアーゼの製造法。
(12) (8)又は(9)のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌をカテコール、ピルビン酸及びアンモニア、又はカテコール及びセリンに作用させてL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンを生成させる工程、及び該L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンを採取する工程を含む、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。
(13) 前記微生物がチロシン非存在下で増殖させた微生物である、(12)のL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。
本発明の変異型チロシンリプレッサー(TyrR)は、野生型チロシンリプレッサーのアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換された配列を有する変異型チロシンリプレッサーであって、チロシンフェノールリアーゼ(TPL)遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサーである。ここで、「数個」とは、2〜20個が好ましく、2〜10個がより好ましく、2〜5個が特に好ましい。また、「チロシンフェノールリアーゼ(TPL)遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない」とは、例えば、チロシン濃度が0又は極小値のときのTPL遺伝子発現を誘導する活性が、チロシン濃度がTPL遺伝子発現誘導に通常要求される濃度(例えば、0.2%)のときの活性と同等以上であることを意味する。ここで、「極小値」とは、例えば、0.01%以下、好ましくは3.0×10−3%以下を意味する。また、「同等以上」とは、好ましくは60%以上、より好ましくは80%以上、特に好ましくは100%以上を意味する。TPL遺伝子発現を誘導する活性は、例えば、TPL遺伝子を発現する細胞において、変異型チロシンリプレッサー遺伝子を発現させ、チロシン濃度が0もしくは極小値のとき、又はチロシン濃度が通常濃度のときのTPLのmRNAを定量することによって調べることができる。また、TPL活性を測定することによって間接的に調べることもできる。TPL活性測定は、例えば、実施例に示すような合成基質を用いて370nmでの吸光度を測定する方法によって行うことができる。
(イ)67位のバリン、72位のチロシン及び201位のグルタミン酸、
(ロ)324位のアスパラギン
(ハ)503位のアラニン
アミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、(3)(イ)67位のバリン、72位のチロシン及び201位のグルタミン酸、(ロ)324位のアスパラギン、並びに(ハ)503位のアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、(4)(ロ)324位のアスパラギン、及び(ハ)503位のアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサーを挙げることができる。
"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
とにより、L−ドーパを製造することができる。L−ドーパ生成反応は、例えば、上記化合物を含有する反応液にTPLを添加することによって行うことができる。TPLは粗酵素液として添加してもよい。また、ピルビン酸、アンモニア等は、ピルビン酸塩やアンモニウム塩などのように塩として反応液に含有させることもできる。
(i)pAH175(N324D)
図1にしたがって、N324D変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH175を作製した。pMW118(ニッポンジーン社)の3.9 kb PvuIIの断片と、pTK#20(特開2001-238678号公報)の2.4 kb SalI(blunt)-SspIの断片(パントエア・アグロメランスATCC21434株由来野生型TyrR遺伝子)を連結してpTK672を作製した。また、パントエア・アグロメランスATCC21434株由来野生型TyrR遺伝子を含むpTK775(Appl. Environ. Microbiol., 66, 4764-4771 (2000))に、Stratagene社のQuikChange kitを用いた部位特異的変異によってN324D変異を導入し、pTK1108を作製した。次に、上記pTK672を EcoRI で切断した4.7 kbの断片と、上記pTK1108を EcoRI で切断した 1.6 kbの断片を連結し、pAH160とした。パントエア・アグロメランスはアンピシリン耐性であるため、選択マーカーとしてアンピシリンを利用できない。そこで、pAH160のScaIサイトにpBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子 ( 1.6 kb SspI-PpuMI断片を平滑末端化処理したもの)を挿入し、pAH175とした。
図2にしたがって、V67A,Y72C,E201G及びN324D変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH176を作製した。pTK775のPstI-EcoRI断片(2.3 kb)と、同じくpTK775 のPstI-EcoRV断片(2.6 kb)と、pYG5(特開2001-238678号公報に開示されているtyrR5(V67A,Y72C,E201G)を含むpACYC177)のEcoRI-EcoRV断片(1.1 kb)の3つの断片をligationし、pTK856を作製した。次に、(i)で得たpAH160をNruIで切断した 5.6 kbの断片と、上記pTK856をNruIで切断した 0.7 kbの断片を連結し、pAH163とした。さらに、(i)と同様にテトラサイクリン耐性遺伝子を挿入し、pAH176とした。
図3にしたがって、V67A,Y72C,E201G,N324D及びA503T変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH178を作製した。pTK775にsite-directed mutagenesisでE275Q変異を導入しpTK815を作製した。これをtemplateとしてエラー・プローン(error-prone)PCRにより増幅したtyrR遺伝子断片をpTK774に挿入し、その中からTPL活性化能の高いクローンを選択した。得られたものの一つが、A503T変異を有するpTK1060であった。なお、pTK774では、error-prone PCRで増幅させた断片を挿入するため、tyrR遺伝子の開始コドンがNdeIになっている。pTK774を使用したライブラリーの作製法は、前述のAppl. Environ. Microbiol., 66, 4764-4771 (2000)のMaterials and Methodsのrandom mutagenesis of the tyrR
gene using error-prone PCRの項に記載されている。また、error-prone PCRの方法については特開2001−238678号公報に開示されている。次に、上記(ii)で得たpAH163をPvuIIで切断した 5.9 kbの断片と、pTK1060をPvuIIで切断した 0.4 kbの断片を連結し、pAH164とした。さらに、(i)と同様にテトラサイクリン耐性遺伝子を挿入し、pAH178とした。
図4にしたがって、A503T変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH170を作製した。pTK919(特開2001−238678号公報)をPvuIIで切断した 7.3 kbの断片と、上記(iii)で得たpTK1060をPvuIIで切断した 0.4 kbの断片を連結し、pAH170とした。
図5にしたがって、V67A,Y72C,E201G及びA503T変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH172を作製した。pTK922(特開2001−238678号公報)をPvuIIで切断した 7.3 kbの断片と、上記(iii)で得たpTK1060をPvuIIで切断した 0.4 kbの断片を連結し、pAH172とした。
図6にしたがって、N324D及びA503T変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH177を作製した。上記(i)で得たpAH160をPvuIIで切断した 7.3 kbの断片と、上記(iii)で得たpTK1060をPvuIIで切断した 0.4 kbの断片を連結し、pAH177とした。
上記(i)〜(vi)のプラスミド及びV67A,Y72C,E201G 変異を有するtyrR遺伝子を含むpTK922、野生型tyrR遺伝子を含むpTK919を、それぞれ熱ショック法により、tyrR欠失株パントエア・アグロメランス(エルビニア・ヘルビコーラ) YG17株(特開2001-238678)に導入した。すなわち、別途調製したコンピテントセル200μLに上記プラスミドを含む溶液20μLを加え、氷上に30分置いた後、42℃で30秒間熱ショックを与えた。800μLのSOB培地を加えて37℃で1時間インキュベートした後、菌体をプレートに塗布し、30℃で一晩培養した。これによって得られた株を表1に示す。なお、表1の略記号は、V67A,Y72C,E201G 変異をNT、N324DをCen、A503T変異をCTとしている。
これらの株及び野生株AJ2985(ATCC21434)を0.2%チロシン含有又は非含有TPL高発現培地100mlで、28℃で28、32、36時間振とう培養した。用いたTPL高発現培地の組成を表2に示す。
(1)10 mM システイン100 ml (in water) と 10 mM o-DNB 100 ml (in EtOH) を混合。
(2)28%アンモニア水を 3 滴加え、50℃で一晩インキュベートした。
(3)50℃でエバポレーションを行い、o-DNBの結晶を得た。
(4)室温において、3,500 rpmで 3 分間遠心分離を行い、結晶を取り除いた。
(5)ペーパークロマトグラフィーを一晩行った。(展開溶液は、1 -ブタノール:水:酢酸=4:1:1)
(6)紙を乾かした後、UV吸収が見られた部分のみ細かく切り、水に浸して一晩抽出を行った。
(7)その溶液をニトロセルロースのフィルター (pore size 5.0 μm) を用いてろ過した。
(8)再び50℃でエバポレーションを行った。
(9)凍結乾燥によって粉状のSOPCを得た。
評価菌株としては、以下の5株を用いた。
control株(pTK631/AJ2985ΔtyrR::kan+)
YG38株(tyrR+/AJ2985ΔtyrR::kan+)
YG40株(tyrR+NT/AJ2985ΔtyrR::kan+)
AH181株(tyrR+NT+Cen/AJ2985ΔtyrR::kan+)
AH184株(tyrR+NT+Cen+CT/AJ2985ΔtyrR::kan+)
Control株に使用したベクターpTK631は、Applied and Environmental Microbiologyの第66巻、p4764−4771(2000年)に記載されている。
TPL活性測定用基質溶液
ヒ゜ルヒ゛ン酸Na 1.55g/dl、カテコール 1.0g/dl、塩化アンモニウム 4.7g/dl
硝酸アンモニウム 0.13g/dl、亜硫酸ソータ゛ 0.27g/dl、EDTA-2Na 0.4g/dl
pH 8.0(反応直前にアンモニア水で調整)
本発明の変異型チロシンリプレッサー(TyrR)がエシェリヒア・コリ内においてもパントエア・アグロメランスのTPL遺伝子プロモーターを活性化できるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。まず、変異型TyrR の転写活性化能を観察するために β- ga
lactosidase 活性を指標にしようと考え、パントエア・アグロメランスのtpl プロモーターにβ- galactosidase をコードする lacZ 遺伝子をつないだ遺伝子(Φ(tpl ’-‘lacZ) 遺伝子)を有するレポータープラスミドの構築を行った。Φ(tpl ’-‘lacZ) 遺伝子を保持するプラスミドについては、kan+ および bla+ 遺伝子を保持したpTK1004より HindIII - SalI 断片 5.9 kb を切り出し、これを同じく HindIII, SalI で処理した pBR322 の断片とライゲーションさせて図8に示すΦ(tpl ’-‘lacZ) 遺伝子を保持するプラスミド pAH276 を作製した。
なお、上記pTK1004の作製法は以下のとおりである。すなわち、まず、pTK312(特開2001-238678)から切り出した8.6 kb のSacI-SacII(blunt-ended)断片と、pMC1871 (Pharmacia)から切り出した1.1 kb のSacI-BamHI(blunt-ended)断片を連結し、pTK1003を得た。次に、pTrc99A (Pharmacia)から切り出した0.5 kb のXmnI断片を pTK1003のNcoI (blunt-ended)に挿入して、pTK1004とした。
培地、1 mM チロシンを添加した LB 培地、1 mM フェニルアラニンを添加した LB 培地、それぞれにおいて 37℃ で一晩前培養したのち、本培養培地の100 分の 1 量に相当する量を採取し、新たな各培地において 37℃ で本培養を行い、OD600 = 0.5 になった時点で b - galactosidase 活性の測定を行った。
Claims (9)
- 配列番号2に示すパントエア・アグロメランスの野生型チロシンリプレッサーのアミノ酸配列において、以下の(イ)〜(ハ)のうちの2群又は3群のアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、
(イ)67位のバリンからアラニンへの置換、72位のチロシンからシステインへの置換、及び201位のグルタミン酸からグリシンへの置換、
(ロ)324位のアスパラギンからアスパラギン酸への置換、
(ハ)503位のアラニンからスレオニンへの置換。 - 前記変異以外の位置において、1〜5個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない、請求項1に記載の変異型チロシンリプレッサー。
- 請求項1又は2に記載の変異型チロシンリプレッサーをコードするDNA。
- 請求項3に記載のDNAで形質転換されたエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌。
- さらにチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーターに発現可能に連結された構造遺伝子を保持する請求項4に記載のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌。
- 請求項4又は5に記載のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌を培地中で培養してチロシンフェノールリアーゼを生成させる工程、及び該チロシンフェノールリアーゼを精製する工程を含む、チロシンフェノールリアーゼの製造法。
- チロシン非存在下で前記微生物を培養することを特徴とする、請求項6に記載のチロシンフェノールリアーゼの製造法。
- 請求項4又は5に記載のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌をカテコール、ピルビン酸及びアンモニア、又はカテコール及びセリンに作用させてL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンを生成させる工程、及び該L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンを採取する工程を含む、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。
- 前記微生物がチロシン非存在下で増殖させた微生物である、請求項8に記載のL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。
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