JP2001238678A - 変異型チロシンリプレッサー遺伝子とその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を
正に調節する活性が上昇した変異型チロシンリプレッサ
ー及びそれをコードする遺伝子を提供する。 【解決手段】 エルビニア・ヘルビコーラのチロシンリ
プレッサー遺伝子に変異を導入し、変異が導入された同
遺伝子をエルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンフェ
ノールリアーゼ遺伝子のプロモーター・エンハンサー支
配下にラクトースオペロンを発現するエシェリヒア・コ
リに導入し、β−ガラクトシダーゼ活性が上昇した形質
転換株を選択することによって、チロシンフェノールリ
アーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性が、前記変異を
有しないチロシンリプレッサーに比べて上昇した変異型
チロシンリプレッサーをコードする遺伝子を取得する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、チロシンフェノー
ルリアーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性が上昇した
変異型チロシンリプレッサー、それをコードする遺伝子
及びそれらの利用に関する。これらは、チロシンフェノ
ールリアーゼ又はＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニン（以下、「Ｌ−ドーパ」ともいう）の製造等、醗
酵工学分野において有用である。

【０００２】

【従来の技術】チロシンリプレッサーはチロシンなどの
芳香族アミノ酸の生合成を負に制御することが知られて
おり、さらに、チロシンリプレッサー遺伝子の構造は既
にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）では明らか
になっている（E. C. Cornishet al., J. Biol. Chem.,
261, 403-410 (1986)）。

【０００３】Ｌ−ドーパは、神経伝達物質であるドーパ
ミンの前駆体であり、パーキンソン病の治療薬等として
有用である。Ｌ−ドーパは、従来化学合成法により製造
されていたが、近年ではチロシンフェノールリアーゼを
用いて、ピロカテコール及びセリン、又はピロカテコー
ル、ピルビン酸及びアンモニアから酵素的に合成されて
いる。

【０００４】チロシンフェノールリアーゼは、エシェリ
ヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バ
チルス属、セラチア属、キサントモナス属、アグロバク
テリウム属、アクロモバクター属、エアロバクター属、
エルビニア属、プロテウス属、サルモネラ属、シトロバ
クター属、エンテロバクター属など広範な微生物によっ
て生産されることが知られており（特許第２５２１９４
５号公報、特公平６−９８００３号公報）、酵素学的諸
性質についても明らかにされている（Biochem.Biophys.
Res. Commun.,33,10(1963))。

【０００５】また、チロシンフェノールリアーゼを高発
現することが知られているエルビニア（Erwinia）属細
菌においては、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の構
造遺伝子と上流域の塩基配列が報告されている（H.Suzu
ki et al., J, Ferment. Bioeng., 75, No.2, 145-148
(1993)）。さらに、本発明者等は、同細菌のチロシンリ
プレッサーをコードする遺伝子を単離することに成功
し、チロシンリプレッサーがチロシンフェノールリアー
ゼ遺伝子の発現を正に調節する活性を有することを開示
している（特開平１１−３１３６７２号公報）。尚、エ
シェリヒア・コリtyrRにおいて、９７位のアスパラギン
酸残基からグリシン残基への変異、１１７位のアスパラ
ギン酸残基からフェニルアラニン残基への変異により、
mtrおよびtyrP+4のプロモーターが２倍程度活性化され
ることが報告されている（J. Bacteriol., 178, 1120-1
125 (1996)）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記チロシ
ンリプレッサー遺伝子を利用した新規な技術を開発する
こと、具体的にはチロシンフェノールリアーゼ遺伝子の
発現を正に調節する活性が上昇した変異型チロシンリプ
レッサー及びそれをコードする遺伝子、並びにそれらの
利用法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記チロ
シンリプレッサー遺伝子に種々の変異を導入し、得られ
た変異型チロシンリプレッサーについて活性を解析した
ところ、野生型チロシンリプレッサーに比べてチロシン
フェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性が
上昇した変異型チロシンリプレッサーをコードする遺伝
子を取得することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００８】すなわち本発明は、６７位のバリン残基を
バリン以外のアミノ酸に置換する変異、７２位のチロシ
ン残基をチロシン以外のアミノ酸基に置換する変異、９
７位のアスパラギン酸残基をアスパラギン酸以外のアミ
ノ酸残基に置換する変異、及び４０２位のイソロイシン
残基をイソロイシン以外のアミノ酸残基に置換する変異
から選ばれる１又は２以上の変異を少なくとも有し、か
つ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調
節する活性が、前記変異を有しないチロシンリプレッサ
ーに比べて上昇した変異型チロシンリプレッサーであ
る。

【０００９】本発明はまた、前記変異型チロシンリプレ
ッサーをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさら
に、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーター
に発現可能に連結された構造遺伝子を保持し、同構造遺
伝子産物を産生する能力を有するエシェリヒア属細菌又
はエルビニア属細菌であって、さらに前記変異型チロシ
ンリプレッサーをコードするＤＮＡを保持し、同ＤＮＡ
により産生する変異型チロシンリプレッサーにより前記
構造遺伝子の発現が正に調節されるエシェリヒア属細菌
又はエルビニア属細菌を提供する。

【００１０】また本発明は、前記エシェリヒア属細菌又
はエルビニア属細菌を培地に培養し、チロシンフェノー
ルリアーゼを産生させることを特徴とする、チロシンフ
ェノールリアーゼの製造法を提供する。

【００１１】さらに本発明は、前記エシェリヒア属細菌
又はエルビニア属細菌を培地に培養し、チロシンフェノ
ールリアーゼを産生させる工程と、産生したチロシンフ
ェノールリアーゼを、ピロカテコール及びセリン、又は
ピロカテコール、ピルビン酸及びアンモニアに作用させ
てＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを生成さ
せる工程を含む、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニンの製造法を提供する。

【００１２】本明細書において、前記変異を有するチロ
シンリプレッサーを変異型チロシンリプレッサー、変異
型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡを変異型チ
ロシンリプレッサー遺伝子ということがある。また、前
記変異を有しないチロシンリプレッサーを野生型チロシ
ンリプレッサーということがある。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の変異型チロシンリプレッサーは、６７位のバリ
ン残基をバリン以外のアミノ酸に置換する変異、７２位
のチロシン残基をチロシン以外のアミノ酸基に置換する
変異、９７位のアスパラギン酸残基をアスパラギン酸以
外のアミノ酸残基に置換する変異、及び４０２位のイソ
ロイシン残基をイソロイシン以外のアミノ酸残基に置換
する変異から選ばれる１又は２以上の変異を少なくとも
有し、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現
を正に調節する活性が、前記変異を有しないチロシンリ
プレッサーに比べて上昇した変異型チロシンリプレッサ
ーである。

【００１４】前記バリン以外のアミノ酸残基としてはア
ラニンが、チロシン以外のアミノ酸残基としてはシステ
インが、アスパラギン酸以外のアミノ酸残基としてはグ
リシンが、イソロイシン以外のアミノ酸残基としてはバ
リンが挙げられる。

【００１５】本発明の変異型チロシンリプレッサーとし
て具体的には、（イ）６７位のバリン残基をアラニン残
基に置換する変異（V67A）、（ロ）７２位のチロシン残
基をシステイン残基に置換する変異（Y72C）、（ハ）６
７位のバリン残基をアラニン残基に置換する変異及び７
２位のチロシン残基をシステイン残基に置換する変異
（V67A, Y72C）、又は（ニ）６７位のバリン残基をアラ
ニン残基に置換する変異及び７２位のチロシン残基をシ
ステイン残基に置換する変異並びに２０１位のグルタミ
ン酸残基グリシン残基に置換する変異（V67A, Y72C, E2
01G）のいずれかを有する変異型チロシンリプレッサー
が挙げられる。

【００１６】本発明の変異型チロシンリプレッサーは、
上記変異を除いては、チロシンリプレッサー、例えばエ
ルビニア・ヘルビコーラ由来の野生型チロシンリプレッ
サーと同じアミノ酸配列を有していてよい。野生型チロ
シンリプレッサーのアミノ酸配列としては、配列番号２
に示すアミノ酸配列が挙げられる。尚、上記変異以外に
加えて、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正
に調節する活性を上昇させる他の変異を有していてもよ
い。

【００１７】本発明の変異型チロシンリプレッサーは、
野生型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡに、同
ＤＮＡによってコードされるチロシンリプレッサーのチ
ロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調節する
活性が上昇するような変異を導入することによって、取
得することができる。野生型チロシンリプレッサーとし
ては、エルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンリプレ
ッサーが挙げられる。また、エルビニア・ヘルビコーラ
由来の野生型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡ
としては、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡが
挙げられる。変異は、部位特異的変異法等によって計画
的に導入することができる。

【００１８】また、本発明の変異型チロシンリプレッサ
ーは、前記変異以外の位置において、１若しくは数個の
アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、
かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に
調節する活性が、前記変異を有しないチロシンリプレッ
サーに比べて上昇した変異型チロシンリプレッサーであ
ってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタ
ンパク質の立体構造における位置や種類によっても異な
る。それは、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ
酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質
の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従
って、チロシンリプレッサーを構成する５２１アミノ酸
残基全体に対し、３０〜５０％以上、好ましくは５０〜
７０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有
し、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調
節する活性を有するものであってもよい。

【００１９】尚、本発明において、６７位のバリン残
基、７２位のチロシン残基、９７位のアスパラギン酸残
基、及び４０２位のイソロイシン残基とは、配列番号２
に示す野生型チロシンリプレッサーのアミノ酸配列にお
ける位置である。上記のような活性に影響を与えないア
ミノ酸の欠失、挿入、付加、又は逆位によって位置が前
後することがある。例えば、Ｎ末端部に１つのアミノ酸
残基が挿入されれば本来６７位のバリン残基は６８位と
なるが、そのような６７位のバリン残基に相当するバリ
ン残基を、本発明においては６７位のバリン残基と呼ぶ
こととする。

【００２０】上記のような変異型チロシンリプレッサー
と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例
えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸
残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように
塩基配列を改変することによって得られる。また、上記
のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処
理によっても取得され得る。変異処理としては、チロシ
ンリプレッサーをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミ
ン等でインビトロ処理する方法、及びチロシンリプレッ
サーをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエル
ビニア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等
の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理す
る方法が挙げられる。

【００２１】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、チロシンリプレッサーを保
持する微生物の属、種、又は菌株の個体差に基づく場合
などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含ま
れる。

【００２２】上記のような変異を有するＤＮＡを適当な
細胞で発現させ、発現産物のチロシンリプレッサー活性
（チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調節
する活性）を調べることにより、変異型チロシンリプレ
ッサーと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ
が得られる。また、変異を有するチロシンリプレッサー
をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例
えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基
番号４４２〜２００４からなる塩基配列を有するＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つ、チロシンリプレッサー活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡを単離することによっても、変異型チロ
シンリプレッサーと実質的に同一のタンパク質をコード
するＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェント
な条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成さ
れ、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をい
う。この条件を明確に数値化することは困難であるが、
一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％
以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、
それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしな
い条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーション
の洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤ
Ｓ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相
当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【００２３】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性が低下又は消失したものも含ま
れるが、それらについては、市販の発現ベクターにつな
ぎチロシンリプレッサー活性を調べることによって容易
に取り除くことができる。

【００２４】エルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシン
リプレッサー遺伝子は、特開平１１−３１３６７２号公
報に記載の方法にしたがって、自身のチロシンリプレッ
サー遺伝子を欠失し、さらにエルビニア・ヘルビコーラ
由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモータ
ー・エンハンサー支配下にラクトースオペロンを発現す
るエシェリヒア・コリを宿主に用いることにより、エル
ビニア・ヘルビコーラの染色体遺伝子ライブラリーから
選択することができる。

【００２５】また、エルビニア・ヘルビコーラのチロシ
ンリプレッサー遺伝子の構造はすでに明らかであるので
（配列番号１）、その配列に基づいてオリゴヌクレオチ
ドを作製し、それを用いたＰＣＲ法又はハイブリダイゼ
ーションによって、エルビニア・ヘルビコーラの染色体
ＤＮＡ又は染色体遺伝子ライブラリーからチロシンリプ
レッサー遺伝子を取得することもできる。

【００２６】尚、エルビニア・ヘルビコーラに分類され
ていた微生物は、現在ではパントエア・アグロメランス
（Pantoea agglomerans）に分類されている。エルビニ
ア属及びパントエア属は非常に近縁であり、チロシンリ
プレッサー遺伝子は、エルビニア属及びパントエア属の
いずれに属する微生物からも取得され得る。また、エル
ビニア属及びパントエア属以外の細菌、例えばエシェリ
ヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌からも、上記と同様
にしてチロシンリプレッサー遺伝子を取得することがで
きる。エシェリヒア・コリのチロシンリプレッサーは、
エルビニア・ヘルビコーラのチロシンリプレッサーと約
７２％のホモロジーを有している。特に、６７位のバリ
ン残基は、エシェリヒア・コリとエルビニア・ヘルビコ
ーラのチロシンリプレッサーで共通して保存されてお
り、エシェリヒア・コリのチロシンリプレッサーの６７
位に変異を導入することによってチロシンフェノールリ
アーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性が上昇する可能
性が高い。エルビニア・ヘルビコーラのチロシンリプレ
ッサーとこのようなホモロジー、好ましくは７０％以
上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するチ
ロシンリプレッサーは、本発明を適用し得る。

【００２７】後記実施例に記載の変異型チロシンリプレ
ッサー遺伝子は、上記のようにして取得されたエルビニ
ア・ヘルビコーラのチロシンリプレッサー遺伝子にエラ
ープローン（error-prone）PCRによりランダムに変異を
導入し、変異が導入された遺伝子をエルビニア・ヘルビ
コーラ由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロ
モーター・エンハンサー支配下にラクトースオペロンを
発現するエシェリヒア・コリに導入し、X-gal（5-ブロ
モ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド）を含
み、チロシンを含まない培地で培養し、他のコロニーに
比べて濃い青色を呈するコロニーを選択することによっ
て取得されたものである。

【００２８】本発明の変異型チロシンリプレッサー及び
それをコードする遺伝子は、目的遺伝子の発現調節に利
用することができる。例えば、チロシンフェノールリア
ーゼ遺伝子のプロモーターに目的のタンパク質をコード
する構造遺伝子を発現可能に連結し、得られる融合遺伝
子を微生物に導入し、さらに、本発明の変異型チロシン
リプレッサー遺伝子を同微生物に導入すると、変異型チ
ロシンリプレッサーにより前記タンパク質の発現が正に
制御される。

【００２９】したがって、チロシンフェノールリアーゼ
遺伝子のプロモーターと目的のタンパク質の構造遺伝子
との融合遺伝子と、変異型チロシンリプレッサー遺伝子
が導入された微生物を培地に培養することにより、目的
のタンパク質を効率よく産生させることができる。目的
のタンパク質の構造遺伝子として、チロシンフェノール
リアーゼをコードするＤＮＡを用いると、チロシンフェ
ノールリアーゼを産生させることができる。チロシンフ
ェノールリアーゼは、酵素法によるＬ−ドーパの生産に
利用することができる。すなわち、前記微生物を培地に
培養し、チロシンフェノールリアーゼを産生させる工程
と、産生したチロシンフェノールリアーゼを、ピロカテ
コール及びセリン、又はピロカテコール、ピルビン酸及
びアンモニアに作用させてＬ−３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニンを生成させる工程により、Ｌ−ドーパを
製造することができる。

【００３０】前記微生物としては、エシェリヒア属細菌
又はエルビニア属細菌が挙げられる。また、エシェリヒ
ア属細菌としてはエシェリヒア・コリが、エルビニア属
細菌としてはエルビニア・ヘルビコーラが挙げられる。

【００３１】エシェリヒア属細菌及びエルビニア属細菌
においては、通常、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子
の発現のインデューサーとしてチロシンが必要である
が、本発明の変異型チロシンリプレッサー遺伝子を保持
するエシェリヒア属細菌又はエルビニア属細菌は、チロ
シンを培地に添加しなくても、あるいは添加量が少なく
てもチロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現が誘導さ
れるので、チロシンの使用量を低減させることができ
る。

【００３２】前記融合遺伝子又は変異型チロシンリプレ
ッサー遺伝子をエシェリヒア属細菌又はエルビニア属細
菌等の微生物に導入するには、通常、これらの遺伝子を
適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作製する。ベ
クターとしては、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHS
G399、pHSG398、RSF1010、pACYC177、pACYC184、pMW21
9、pMW118等が挙げられる。

【００３３】上記のように調製した組換えＤＮＡをエシ
ェリヒア属細菌又はエルビニア属細菌に導入するには、
これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよ
い。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報
告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,
A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス
・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階
の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入す
る方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Ge
ne, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズ
ブチリス、放線菌類及び酵母について知られているよう
な、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り
込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にし
て組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,
S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (197
9);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 27
4, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用で
きる。また、エレクトロポレーション法（Methods for
general and molecular bacteriology, 1994, Philipp
Gerhardt ed., ASM Press, 14.1.3.3 Electroporation
procedure）も利用することができる。

【００３４】前記融合遺伝子及び変異型チロシンリプレ
ッサー遺伝子の導入は、別々のベクターを用いて行って
もよく、単一のベクターを用いて同一ベクター上に両遺
伝子を保持させてもよい。また、遺伝子の導入の順序は
特に制限されない。

【００３５】また、前記融合遺伝子及び／又は変異型チ
ロシンリプレッサー遺伝子は、宿主微生物のプラスミド
上に存在させてもよく、相同組換え等によって宿主微生
物の染色体ＤＮＡ上に存在させてもよい。

【００３６】導入される変異型チロシンリプレッサー遺
伝子は、チロシンリプレッサー遺伝子固有のプロモータ
ーによって発現制御されてもよく、プロモーターをｌａ
ｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモー
ター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰ_Rプロ
モーター、Ｐ_Lプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａ
ｍｙＥプロモーター等の強力なプロモーターと置換し、
これらのプロモーターによって発現制御されてもよい。

【００３７】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,F
ritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されてい
る。

【００３８】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００３９】

【実施例１】エルビニア・ヘルビコーラのチロシンリプ
レッサー遺伝子の取得 ＜１＞エルビニア・ヘルビコーラ由来の染色体遺伝子ラ
イブラリーの調製 Current protocols in molecular biology 2.4.1(A.M.F
rederick et al., Massachusetts General Hospital, H
arvard Medical School, John Wiley & Sons,Inc., 199
4)の方法に従って、エルビニア・ヘルビコーラ AJ2985
株(ATCC21434)より染色体ＤＮＡ 1.45mgを抽出した。得
られたＤＮＡの43.5μgを50μlの反応系でSau3AI 6 uni
tsで１０分間および１５分間部分分解した後、アガロー
ス電気泳動を行い、約４〜８kbのＤＮＡ断片5.1μgを回
収した。

【００４０】また、pBR322（東洋紡(株)）の５μgをBam
HI 10 unitsで２時間消化し、アガロース電気泳動解析
で完全に切断されているのを確認した後、アルカリフォ
スファターゼ（東洋紡(株)）2 unitsで37℃、１時間処
理で5'末端の脱リン酸化を行い、約3μgのpBR322のBamH
I切断DNAを得た。

【００４１】上記のように調製したpBR322 DNA 1.4μg
と約４〜８kbのDNA断片の1.7μgをＤＮＡ連結キット（T
AKARA ligation kit Ver.2（宝酒造(株))）を用いて80
μlの反応系で、16℃で１時間ライゲーションし、エル
ビニア・ヘルビコーラ由来の染色体遺伝子ライブラリー
とした。

【００４２】＜２＞スクリーニング用宿主(E. coli TK4
53)の作製 チロシンリプレッサー遺伝子（tyrR）を含むプラスミド
クローンを選択するためのスクリーニング用宿主とし
て、自身のチロシンリプレッサー遺伝子を欠失し、さら
にエルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンフェノール
リアーゼ遺伝子（tpl）のプロモーター・エンハンサー
支配下にラクトースオペロンを発現する遺伝子を染色体
上に保持するエシェリヒア・コリを作製した。

【００４３】ラクトースオペロンは、pRS552(R.W.Simon
s et al., Gene, 53,85-96(1987))から調製した。pRS55
2は、ラクトースオペロン中のlacZのＮ末端が一部欠失
している不完全なlacオペロンを保持するプラスミドで
ある。これにチロシンフェノールリアーゼ遺伝子（tp
l）のＮ末端及び上流域を含む遺伝子断片をフレームを
合わせて連結することで、tplの制御下でチロシンフェ
ノールリアーゼのＮ末端部分（tpl'）とβ−ガラクトシ
ダーゼの一部のＮ末端を欠いたＣ末端部分（'lacZ）と
の融合タンパク質（tpl'-'lac 融合タンパク質）を発現
する融合遺伝子が形成される。これによって、tplの転
写調節をエシェリヒア・コリ内でβ−ガラクトシダーゼ
活性を指標として検討することが可能である。

【００４４】tplのプロモーター・エンハンサー領域
は、これを含むプラスミドpSH768(H.Suzuki et al., J.
Ferment. Biol., 75, 145-148(1993))から調製した。は
じめに、上記融合遺伝子をエシェリヒア・コリに導入す
るためのプラスミドを構築した（図１〜３）。まず、pS
H768中のtplのＮ末端にあたるatgaactatcc配列（配列番
号３）を部位特異的変異によってatgaaggatcc（BamHIサ
イト導入）（配列番号４）とし、またＮ末端より約480b
p上流にあたるttaacattcgc配列（配列番号５）をttagaa
ttcgc（EcoRIサイト導入）（配列番号６）とした。具体
的には次のようにして行った。pSH768をSmaIとPstIで切
断し、SmaI-PstIの2.2Kb断片を調製し、この断片をpTZ1
9R(Pharmacia社)のSmaIとPstIサイトの間に挿入した
（図１）。そして、Kunkelの方法(Kunkel,T.A.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA, 82, 488-492(1985)、Kunkel,T.A., M
ethods in Enzymology, 154, 367-382(1987))により、
部位特異的変異導入キット（Muta-gene phagemid in vi
tro mutagenesis kit instruction manual(Bio-Rad
社））を用いて、部位特異的変異を導入した（図１及び
図２上部）。BamHIサイト、及びEcoRIサイトの導入に使
用したオリゴヌクレオチド配列はそれぞれ5'-tcggcagga
tccttcatgttta-3'（配列番号７）と5'-agcggcgaattctaa
tgacgtg-3'（配列番号８）である。

【００４５】この後、EcoRI、BamHIで切り出される約48
0bpの遺伝子断片をpUC18のEcoRIとBamHI部位に挿入し(p
TK311)、挿入断片部分の塩基配列を決定し、正しく目的
の位置にEcoRIやBamHIが造成されていることを確認した
（図２）。確認後、このEcoRI、BamHIで切り出される約
480bpの遺伝子断片をpRS552のEcoRI、BamHIサイトに挿
入し、tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝子を
搭載したプラスミド(pTK312)を作製した（図３）。

【００４６】次に、このtpl'-'lac 融合遺伝子を搭載し
たpTK312でE. coli TE2680(T.Elliott, J.Bacteriol.,
174, 245-253(1992))を形質転換した。形質転換法及び
それに用いたコンピテントセルの作製法は、井上浩明、
野島博「遺伝子ライブラリーの作製法」、p19-26, 1995
（羊土社）に従って行った。pTK312(由来はpRS552)とTE
2680の染色体上には相同な領域（カナマイシン耐性遺伝
子とlac遺伝子）が存在するために、ある頻度で相同組
換えを起こし、結果として染色体上にtpl'-'lac 融合タ
ンパク質をコードする遺伝子がシングルコピーとして組
み込まれた菌株を作製できる。このようにして得られた
菌株をTK314とした。

【００４７】上記TK314は、recD（エクソヌクレアーゼ
Vのエクソヌクレアーゼ活性を欠失しており、細胞内で
直鎖状のＤＮＡは切断を免れる）を保持しており、この
ような菌株内ではプラスミドが安定に複製されないた
め、これをエルビニア・ヘルビコーラ由来の染色体遺伝
子ライブラリーの宿主として使用することは困難であ
る。そこで、TK314中のtpl'-'lac 融合タンパク質をコ
ードする遺伝子を含む周辺の遺伝子をP1トランスダクシ
ョン(A Short Course in Bacterial Genetics, J.H.Mil
ler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spr
ing Harbor N.Y. 1992)により、E. coli JM107に形質導
入した。

【００４８】また、tpl'-'lac 融合タンパク質をコード
する遺伝子がE. coliのチロシンリプレッサー（TyrR）
によって活性化されることが示唆された(H.Suzuki et a
l.,Biosci.Biotech.Biochem.,59,2339-2341(1995), H.
Q.Smith et al.,J.Bacteriol.,179,5914-5921(1997))た
め、E. coli JM107の染色体tyrRの機能を不活化するた
めに、P1トランスダクションによりtyrR366(H.Camakari
s et al.,J.Bacteriol.,115,1135-1144(1973))を導入し
た。そして最後に、recA^-とするために、MV1184（Metho
ds in Enzymology,153,3-11(1987)）よりΔ(srl-recA)3
06::Tn10を導入し、これをTK453とした。このTK453でコ
ンピテントセルを作製し、エルビニア・ヘルビコーラ(E
rwinia herbicola)由来の染色体遺伝子ライブラリーの
スクリーニング用の宿主として用いた。

【００４９】＜３＞tpl'-'lac 融合タンパク質遺伝子の
発現を活性化する染色体遺伝子ライブラリーのスクリー
ニング 上記のように作製したライブラリー8μlを用いて、TK45
3を形質転換した後、5mMＬ−チロシンを含むMacConkey-
Lactose(Difco社)培地にプレーティングし、約20,000個
のコロニーを得た。この中で23個のコロニーがβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子（lacZ）の発現の指標である赤色の
表現型を示した。この表現型からは、これらのコロニー
細胞に導入されたプラスミドに挿入された染色体ＤＮＡ
断片に、目的とするtyrRか、又はβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子が含まれていると考えられるが、あるいはその他
不明のものが含まれている可能性もある。

【００５０】そこで、さらに確認のために、tplのプロ
モーターの上流域のTyrRなどの調節タンパク質が結合す
ると考えられる調節領域（regulatory region）を除去
した、tpl'-'lac 融合タンパク質遺伝子を持つ菌株(TK4
81)を作製した。すなわち、プラスミドpTK311をBssHII
処理した後、末端を平滑末端化し、さらにBamHIで消化
し、BssHII-BamHI 180bp断片を切り出した。この断片
を、pUC18のSmaIとBamHI部位に挿入し、得られたプラス
ミドをEcoRIとBamHIで消化し、約190bpの断片を調製し
た。この断片と、EcoRIとBamHI消化を行ったpRS552を連
結した(pTK475)（図４）。次に、こうして得られたpTK4
75でE. coli TE2680を形質転換し、先に述べたのと同じ
方法で、染色体相同組換えを行い、TK481を得た。

【００５１】TK481は、上流の調節領域（regulatory re
gion）が除去されているために、tplの発現調節に関与
するタンパク質は作用できず、その結果としてtpl'-'la
c 融合タンパク質遺伝子の発現がほとんど起こらないも
のと考えられる。そこで、一次スクリーニングで赤色の
表現型を示した株よりプラスミドを調製し、該プラスミ
ドでTK481を形質転換し、今度は白色の表現型を示すも
のを選択した。この二次スクリーニングにより20株が得
られた。これらの株のプラスミドはすべてEcoRI処理で
約1.6KbのＤＮＡ断片が検出された。またこれらの形質
転換体はすべて３−フルオロチロシン（3-fluorotyrosi
ne）に感受性を示し（E. coliでtyrR^-は３−フルオロチ
ロシン耐性となる。H. Camakaris et al., J. Bacterio
l., 115, 1135-1144(1973)）、E. coliでのtyrR⁺の表現
型と同一の性質を示した。これらの結果から、これらの
クローンはある同一のＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を有
し、エルビニア・ヘルビコーラ由来のtyrRを含むことが
強く示唆された。

【００５２】上記の候補株の中で、tyrRを有する一つの
プラスミドをpTK-#20と命名し、以降の操作に使用し
た。tyrRを含むＤＮＡ断片をさらに短くするために種々
の制限酵素（EcoRI, BssHII, EcoRV, HpaI, SalI, Sph
I, NruI等）で処理して得られた約2 kb以上の遺伝子断
片をpBR322にサブクローニングして、TK453を形質転換
し、上記と同じ要領で5 mMＬ−チロシンを含むMacConke
y-Lactose(Difco社)培地で赤くなるものを選択した。そ
の結果、選択された株が保持するＤＮＡ断片として、Sa
lIおよびSphIで消化した各々3.5Kbの断片を得ることが
できた。この中で、SalI 3.5 kb断片をpUC18に乗せ換え
て、該断片の塩基配列を塩基配列決定装置(Shimadzu DS
Q-1000L)を用いて決定した（配列番号１）。このＤＮＡ
断片中にはオープン・リーディング・フレームが存在し
（塩基番号４４２〜２００４）、これから予想されるア
ミノ酸配列（配列番号２）は、E. coliのTyrRと約72%の
ホモロジー（相同性）を有していた。

【００５３】

【実施例２】変異型チロシンリプレッサー遺伝子の取得 ＜１＞チロシンリプレッサー活性測定用宿主(E. coli T
K747)の作製 チロシンリプレッサーの活性を調べるための宿主とし
て、tyrR遺伝子を欠失し、tpl'-'lac融合遺伝子を染色
体上に保持するE. coli菌株を構築した。

【００５４】（１）tyrR欠失株の作製 E. coli由来tyrRを含むプラスミドpMU400（C. Edwina e
t al., J. Bacteriol., 152, 1276-1279 (1982)）をMlu
IとMfeIで切断して得られる3.9kbの断片を、Takara blu
nting kit（宝酒造(株)）を用いて平滑末端化し、tyrR
の内部領域を欠失させた。一方、pACYC184（J. Bacteri
ol, 134, 1141(1978)）をAccI及びHincIIで切断した
後、AccI末端を平滑化し、クロラムフェニコール耐性遺
伝子（cat）を含む断片を得た。これらの断片を連結
し、pTK689を得た。pTK689は、ColE1由来の複製制御領
域、アンピシリン耐性遺伝子（bla）、及び内部領域がc
atで置換されたtyrR遺伝子（ΔtyrR::cat）を保持して
いる。

【００５５】pTK689をHindIII及びNdeIで切断し、Δtyr
R::catを含む3.5kbの断片を回収した。この断片を用い
て、E. coli FS1576（国立遺伝学研究所（ME9019）より
入手）を形質転換した。FS1576株は、recDが導入されて
いるため、相同組換えを起こしやすい株である。

【００５６】0.2mMフルオロチロシン耐性、クロラムフ
ェニコール耐性の表現型を有する形質転換株を選択し、
さらに、得られた形質転換株の染色体ＤＮＡを鋳型とす
るPCRにより、tyrR遺伝子が破壊されたことを確認し
た。こうして、TK699株（recD1009, thi-1, thr-1, leu
B6, lacY1, tonA21, supE44, ΔtyrR::cat）を得た。

【００５７】（２）宿主菌株へのΔtyrR::cat及びtpl'
-'lac融合遺伝子の導入 E. coli CSH26（国立遺伝学研究所ME 8116)[F^-, ara,Δ
(lac-pro), thi］に、Ｐ１トランスダクションにより、
前記のtpl'-'lac融合遺伝子が染色体上に組み込まれた
菌株TK314が保持するtrpDC700::putPA1303::[kan, tpl'
-'lac]を導入した。次に、Ｐ１トランスダクションによ
りTK699株よりΔtyrR::catを導入し、続いて、E. coli
MV1184（Methods in Enzymology,153,3-11(1987)）より
Δ(srl-recA)306::Tn10を導入し、TK747[F^-, ara,Δ(la
c-pro), thi, ΔtyrR::cat, trpDC700::putPA1303::[ka
n, tpl'-'lac], Δ(srl-recA)306::Tn10]を得た。

【００５８】上記のようにして得られたTK747株は、染
色体上のtyrR遺伝子及びlacオペロンを欠失し、tpl'-'l
ac融合遺伝子を保持している。

【００５９】＜２＞変異型tyrR遺伝子の作製 エラープローン（error-prone）PCRにより、エルビニア
・ヘルビコーラのtyrR遺伝子のコード領域に変異を導入
した。プロモーター領域に変異が導入されないように、
tyrRの翻訳開始点にNdeIサイトを導入し、PCRで増幅し
た構造遺伝子をその下流に連結するようにした。そうす
ることにより、変異型tyrRを野生型tyrRと同レベルで発
現させることができると考えられる。

【００６０】pTK#-20から、tyrRのプロモーター領域及
び翻訳開始点を含む0.6kbのSalI-EcoRI断片を切り出
し、SalI及びEcoRIで切断したpTZ19R(Pharmacia社)と連
結した。そして、Kunkelの方法により、部位特異的変異
導入キット（Muta-gene phagemidin vitro mutagenesis
kit instruction manual(Bio-Rad社））を用いた部位
特異的変異法により、tyrRの翻訳開始点にNdeIサイトを
導入し、pTK619とした（図５）。変異導入プライマーと
しては、5'-gattaaggcccaccatatgcgtttagaag-3'（配列
番号９）を用いた。

【００６１】エラープローンPCRは、次のようにして行
った。10mM Tris-HCl(25℃でpH8.3)、50mM KCl、0.1% T
riton X-100、1.5mM MgCl₂、0.2mM dNTPs（dATP, dGTP,
dCTP, dTTPを各0.2mM含む混合物）、0.1mM dITP、pTK#
-20 100ng、プライマー各20pmole、及びrTaqポリメラー
ゼ2.5Uを含む反応液を用いて、95℃ 30秒、55℃ 30秒、
72℃ 120秒の反応を25サイクル又は30サイクル繰り返し
た。プライマーとしては、5'-gattaaggcccaccatatgcgtt
tagaag-3'（配列番号１０）、5'-tgagcatgacaaaaagcttt
acagccag-3'（配列番号１１）を用いた。

【００６２】pTK619をEcoRIで切断し、平滑末端化した
後、SalIで切断し、SalI-EcoRI断片（0.6kb）を切り出
し、シングルコピープラスミドpACYC177のXhoI、SmaIサ
イトに挿入した。得られたプラスミドをNdeI、HindIII
で切断して得た3.9kbの断片と、PCRで増幅した変異型ty
rR遺伝子をNdeI、HindIIIで消化した断片を連結し、変
異型tyrR発現プラスミドを構築した（図５）。

【００６３】一方、コントロールとして、野生型tyrR発
現プラスミドの構築を行った。pTK-#20をSspIおよびSal
I処理して得られる約2.4kbの断片を平滑末端化し、pBR3
22のEcoRV部位に挿入し、pTK561を作製した。

【００６４】＜３＞tpl転写活性の増加した株のスクリ
ーニング 上記のようにして得られた変異型tyrR遺伝子発現プラス
ミドを用いてTK747株を形質転換し、X-gal（5-ブロモ-4
-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド）を含み、チ
ロシンを含まない基本培地（0.5%ペプトン、0.5%イース
トエキストラクト、0.5%ミートエキストラクト、0.2% K
H₂PO₄, pH8.0）プレートにまき、３７℃で培養した。

【００６５】出現した約９万個のコロニーの中から、他
のコロニーに比べて濃い青色を呈した１００コロニーを
選択した。さらに、それらのコロニーを前記と同じプレ
ート上で培養し、最も濃い青色を呈すると認められた５
個のコロニーを選択した。それらの株についてβ−ガラ
クトシダーゼ比活性を、公知の方法（Miller, J.H.,A s
hort course in bacterial genetics, A laboratory ma
nual and handbook for Escherichia coli and related
bacteria. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Col
d Spring Harbor, N.Y. (1992)）により測定した。タン
パク質の定量は、ウシ血清アルブミンを標準として、ロ
ーリー法（Lowry, O.H.et al., J. Biol. Chem. 193, 2
65 (1951)により行った。尚、各菌株の培養は基本培地
で行った。

【００６６】結果を表１に示す。表中、tyrR2、tyrR3及
びtyrR4は25サイクルのPCR反応により、他は30サイクル
のPCR反応により得られた変異型tyrR遺伝子である。そ
の結果、変異型tyrR遺伝子導入株は、野生型tyrR遺伝子
導入に比べて高いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。
また、野生型導入株を含め、各tyrR導入株は、プラスミ
ド非導入株に比べて高いβ−ガラクトシダーゼ活性を示
した。

【００６７】各変異型tyrR遺伝子の変異点、及び各変異
から推定されるアミノ酸置換を表１に示した。表１中、
カッコ内は、配列番号１中のアミノ酸番号と、その左側
に変異前のアミノ酸残基と、変異後のアミノ酸残基を示
す。尚、tyrR5及びtyrR6は、同一の変異を有していた。

【００６８】

【表１】 表１ ─────────────────────────────────── tyrRアレル β-カ゛ラクトシタ゛ーセ゛比活性 ヌクレオチト゛変異及び推定されるアミノ酸置換 （Miller U） ─────────────────────────────────── なし 27.4 野生型tyrR 100 ─────────────────────────────────── tyrR2 389 GTC ⁶⁷Val → GCC Ala (V67A) GTT ⁴⁹⁹Val → ATT Ile (V499I) ─────────────────────────────────── tyrR3 393 GTC ⁶⁷Val → GCC Ala (V67A) ─────────────────────────────────── tyrR4 231 GAT ⁹⁷Asp → GGT Gly (D97G) ATT ⁴⁰²Ile → GTT Val (I402V) ─────────────────────────────────── ───────────────────────────────────

【００６９】＜４＞重複変異を有するtyrR遺伝子の変異
の分離及びtplプロモーター発現調節活性の評価tyrR5は
最も高いtplプロモーター誘導活性を示したが、３つの
変異（V67A, Y72C, E201G）が導入されていたので、各
変異を単独で又は２つ組み合わせて保持する変異型tyrR
を作製し、それぞれの活性を評価した。tyrRへの変異の
導入は、部位特異的変異法によって行った。得られた変
異型tyrRをTK747株に導入し、形質転換株を最少培地（M
M）又はＬ−フェニルアラニン（Phe）、Ｌ−トリプトフ
ァン（Trp）又はＬ−チロシン（Tyr）を終濃度で1mM含
む最少培地で培養し、前記Millerの方法によりβ−ガラ
クトシダーゼ比活性を測定した。結果を表２に示す。表
中、カッコ内の数字は、培地に添加したPhe、Trp又はTy
rによるβ−ガラクトシダーゼ比活性の活性化率を示
す。

【００７０】この結果から、特にV67A変異、Y72C変異、
V67A, Y72C変異、及びV67A, Y72C,E201G変異が、tplプ
ロモーター誘導活性を高めることがわかる。また、tyr
非存在下でのβ−ガラクトシダーゼ活性に対するtyr存
在下での活性の比は、V67A変異及びY72Cにおいて高く、
特にV67A変異では野生型tyrRに比べて２倍であった。

【００７１】

【表２】 表２ ─────────────────────────────────── β-カ゛ラクトシタ゛ーセ゛比活性（Miller U） tyrRアレル ──────────────────────────── MM MM+Phe MM+Trp MM+Tyr ─────────────────────────────────── なし 85.3 84.6(1) 85.6(1) 83.8(1) 野生型tyrR 98.0 259(2.6) 113(1.2) 2930 (30) tyrR V67A 160 1030(6.4) 208(1.3) 9330 (58) tyrR Y72C 139 344 (2.5) 188(1.4) 5060 (36) tyrR E201G 100 259 (2.6) 112(1.1) 3210 (32) tyrR V67A, Y72C 381 1160 (3.0) 607(1.6) 12000 (31) tyrR V67A, Y72C, E201G 395 1210 (3.1) 647(1.6) 12500 (32) ───────────────────────────────────

【００７２】

【実施例３】変異型TyrRのリプレッサー活性の評価 TyrRは、チロシンなどの芳香族アミノ酸の生合成に関す
るaroF（DAHPシンターゼ遺伝子）及びはtyrP（チロシン
特異的トランスポーター遺伝子）等の遺伝子の発現を負
に制御することが知られている。そこで、実施例２で得
られた変異型Tyrについて、aroF及びtyrPに対するリプ
レッサー活性を調べた。

【００７３】aroF及びtyrPを、E. coli MG1655株（E. c
oli Genetic Stock Center (Yale University, Dept. B
iology, Osborn Memorial Labs., 06511-7444 New Have
n, Connecticut, U.S.A., P.O. Box 6666)から入手）染
色体ＤＮＡを鋳型し、KODポリメラーゼ（東洋紡社）を
用いたPCRによって、それぞれ増幅した。プライマー
は、aroFには、5'-ccgaattcgctaaatgcatcgtcatcttttatg
-3'（配列番号１２）及び5'-ccggatccttttgcatgatggcga
tcctgttta（配列番号１３）を、tyrPには、5'-ccgaattc
cagactggcatgcgtatattgc-3'（配列番号１４）及び5'-cc
ggatccttcacgctttcttctgtcctgacga-3'（配列番号１５）
を用いた。各増幅断片は、それぞれの遺伝子のうち、Ty
rRによる調節を受ける領域から開始コドンの少し下流ま
でを含む。

【００７４】各増幅断片をEcoRI及びBamHIで消化し、pU
C19のEcoRI、BamHIサイトにクローニングした。クロー
ン化断片を、塩基配列を確認した後にpRS552に移し換え
た。得られたプラスミドから、aroF'-'lac又はtyrP'-'l
acを含む断片をHindIII及びSalIで切り出し、低コピー
ベクターpMW219（ニッポンジーン）のHindIII、SalIサ
イトに挿入し、pTK588[pSC101ori, kan, aroF'-'lac]、
及びpTK589[pSC101ori,kan, tyrP'-'lac]を構築した。

【００７５】一方、E. coli由来tyrRの発現プラスミド
を、以下のようにして構築した。E.coli由来tyrRを含む
プラスミドpMU400（C.Edwina et al., J.Bacteriol., 1
52,1276-1279(1982)）から、NdeIおよびHindIII処理に
より約2.6kbの断片を得、T4 DNAポリメラーゼで平滑末
端化した後にpBR322（東洋紡(株)）の EcoRV部位に挿入
し、pTK559を作製した。

【００７６】pTK588又はpTK589を、変異型tyrR発現プラ
スミド又はpTK559（E. coli tyrR）もしくはpTK561（E.
herbicola野生型tyrR）とともに、E. coli TK809[F^-,
ara,Δ(lac-pro), thi, ΔtyrR::cat,Δ(srl-recA)30
6::Tn10]（E. coli CSH26株にP1トランスダクションに
よりTK699株よりΔtyrR::catを導入し、続いてMV1184株
よりΔ(srl-recA)306::Tn10を導入して作製した）に共
形質転換した。得られた形質転換株について、実施例２
＜４＞と同様にしてβ−ガラクトシダーゼ比活性を調べ
た。結果を表３（aroF）、表４（tyrP）に示す。

【００７７】この結果から、各変異型TyrRは、aroF遺伝
子及びtyrP遺伝子の発現を抑制する活性が野生型TyrRに
比べて低下しており、リプレッサー活性が低下している
ことが明らかとなった。

【００７８】

【表３】 表３ aroF'-'lacの発現 ─────────────────────────────── β-カ゛ラクトシタ゛ーセ゛比活性（Miller U） tyrRアレル ──────────────────────── MM MM+Phe MM+Trp MM+Tyr ─────────────────────────────── なし 900 910 909 908 野生型tyrR（E. coli） 546 230 540 28.6 野生型tyrR（E. herbicola） 534 279 486 31.4 tyrR V67A 651 281 726 42.9 tyrR Y72C 842 332 898 42.3 tyrR E201G 558 363 529 32.7 tyrR V67A, Y72C, E201G 903 388 982 61.9 ───────────────────────────────

【００７９】

【表４】 表４ tyrP'-'lacの発現 ─────────────────────────────── β-カ゛ラクトシタ゛ーセ゛比活性（Miller U） tyrRアレル ──────────────────────── MM MM+Phe MM+Trp MM+Tyr ─────────────────────────────── なし 44.0 43.9 44.0 43.6 野生型tyrR（E. coli） − − − − 野生型tyrR（E. herbicola） 19.0 22.6 21.2 <1 tyrR V67A 46.9 31.0 55.2 <2 tyrR Y72C 28.0 30.9 41.4 <1 tyrR E201G 19.1 31.3 23.4 <1 tyrR V67A, Y72C, E201G 69.1 51.2 78.6 <3 ───────────────────────────────

【００８０】

【実施例４】エルビニア・ヘルビコーラへの変異型tyrR
の導入 ＜１＞エルビニア・ヘルビコーラtyrR欠失株の作製 実施例１＜３＞で得られたtyrR遺伝子を保持する候補株
のプラスミドの中で、最も長い挿入断片を有するプラス
ミドをpTK#-13と命名した。pTK#-13をEcoRIで切断し、
5.5kbと6.5kbの断片を回収し、pUC4K（Pharmacia biote
ch）をEcoRIで切断して生じるカナマイシン耐性遺伝子
（kan）を含む1.3kbの断片と連結し、pTK766[ColEIori,
bla, ΔtyrR::kan]を得た。同プラスミドは、tyrR遺伝
子のほぼ全領域がカナマイシン耐性遺伝子で入れ換えら
れている。このプラスミドは、FspIで消化すると、ベク
ター側で４個所、挿入断片内で１個所切断され、kan遺
伝子の両側に4kb又は2.2kbの相同領域を持つ断片が生じ
る。この断片を回収し、エレクトロポレーション法（Me
thods for general and molecular bacteriology, 199
4, Philipp Gerhardt ed., ASM Press, 14.1.3.3 Elect
roporation procedure）により、エルビニア・ヘルビコ
ーラ AJ2985株(ATCC21434)に導入した。エレクトロポレ
ーションは、0.2cmキュベットに細胞0.25μlを入れ、25
μF、2.5kV、200Ωでパルスを印加することにより行っ
た。

【００８１】形質転換処理した細胞を一時間培養し、カ
ナマイシン30μg/mlを含むLBプレートにまき、生育して
きた菌株について、プラスミドの有無を調べ、プラスミ
ドを保持をしていない株を３株得た。

【００８２】上記で得られた３株について、抗チロシン
フェノールリアーゼ抗体を用いたウエスタン・ブロッテ
ィングを行ったところ、いずれの株もチロシンフェノー
ルリアーゼが発現していなかった。その中の１株につい
て、ゲノミックサザンを行い、tyrRがΔtyrR::kanで置
き換えられていることが確認され、同株をYG17と命名し
た。前記抗チロシンフェノールリアーゼ抗体は、次のよ
うにして作製した。チロシンフェノールリアーゼ（TP
L）をエルビニア・ヘルビコーラの無細胞抽出液から精
製した。フロイント完全アジュバントに乳化させたTPL
1mgを用いて、雌のニュージーランドホワイトラビット
を免疫した。フロイント不完全アジュバントに乳化させ
たTPL 1mgを用いて、追加免疫を２週間空けて２回行
い、それぞれ追加免疫後に少量の血液を採取して抗TPL
活性を調べた。全血を採取し、37℃で１時間静置した
後、遠心分離して血餅を除去し、粗抗血清を得た。この
粗抗血清から、プロテイン−ＡセファロースCL-6B（Pha
rmacia社）カラムクロマトグラフィーを用いて、使用説
明書に推奨されている方法により、イムノグロブリンＧ
画分を精製した。

【００８３】＜２＞変異型tyrR導入用プラスミドの構築 pMW118（ニッポンジーン）をPvuIIで切断後、セルフラ
イゲーションし、lacZ遺伝子を除去した。得られたプラ
スミドをScaIで切断し、pBR322をSspI及びPpuMIで切断
することにより切り出したテトラサイクリン耐性遺伝子
（tet）を平滑末端化後挿入して、pTK631を得た。次
に、pTK631をPvuIIで切断し、pTK#-20をSalIで切断、平
滑末端化後、SspIで切断することにより切り出したtyrR
遺伝子断片を挿入し、pTK919を得た。さらに、pTK919を
SacII、MscIで切断して6.3kbの断片を回収し、V67A, Y7
2C, E201G変異を有する変異型tyrR（tyrR5）断片が挿入
されたpACYC177をSacII、MscIで切断して得られる断片
を挿入して、pTK922を得た（図６）。

【００８４】＜３＞変異型tyrR導入株のチロシンフェノ
ールリアーゼ活性の評価 上記のようにして得られたプラスミドpTK919[pSC101 or
i, bla::tet, tyrR]、及びpTK922[pSC101 ori, bla::te
t, tyrR V67A, Y72C, E201G]を、前記YG17株に導入し、
YG38株及びYG40株を得た。これらの株を0.1%チロシンを
含む基本培地100mlで、30℃で一夜培養した。菌体を10m
Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、0.2mM PLP（ピリド
キサール5'リン酸）、5mM 2-メルカプトエタノール、4m
M EDTA(pH7.0)に懸濁し、超音波処理により破砕した。
菌体破砕液を、前記緩衝液に対して一夜透析した。こう
して得られた粗酵素液について、タンパク質定量及びチ
ロシンフェノールリアーゼの活性測定を行った。

【００８５】タンパク質の定量は、ウシ血清アルブミン
を標準として、ローリー法（Lowry,O.H.et al., J. Bio
l. Chem. 193, 265 (1951)により行った。チロシンフェ
ノールリアーゼ活性は、次のようにして測定した。1mM
チロシン、0.1 mM PLP、0.078mM NADH、0.1mM 2-メルカ
プトエタノール、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ウサギ
筋由来、1.3国際単位/ml）、100mMリン酸カリウム緩衝
液（pH8.0）からなる反応液を30℃でプレインキュベー
ションした後、サンプル10〜100μlを加えて、NADHの酸
化を340nmでの吸収により追跡した。NADHの消費は、1:1
でチロシンの消費に相当する。１分間に1μMのチロシン
を消費する酵素量を１ユニットとした。結果を表５に示
す。

【００８６】この結果から、変異型tyrRが導入されたエ
ルビニア・ヘルビコーラの菌株は、野生型tyrRが導入さ
れた株よりも高いチロシンフェノールリアーゼ活性を示
した。また、変異型tyrRが導入されたエルビニア・ヘル
ビコーラは、培地にチロシンを添加しなくても、高いチ
ロシンフェノールリアーゼ活性を示した。

【００８７】

【表５】

【００８８】

【発明の効果】本発明により、チロシンフェノールリア
ーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性が、前記変異を有
しないチロシンリプレッサーに比べて上昇した変異型チ
ロシンリプレッサー、及びそれをコードするＤＮＡが提
供される。

【００８９】本発明の変異型チロシンリプレッサー遺伝
子は、チロシンフェノールリアーゼ等のタンパク質をコ
ードする遺伝子の発現制御に利用することができる。ま
た、本発明により製造されるチロシンフェノールリアー
ゼは、Ｌ−ドーパの製造に利用することができる。

【００９０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 変異型チロシンリプレッサー遺伝子とその利用 <130> P-7239 <140> <141> 2000-03-01 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００９１】 <210> 1 <211> 3363 <212> DNA <213> Erwinia herbicola <220> <221> CDS <222> (442)..(2004) <400> 1 gtcgacgcgt gccgcagggc attggtgcgg ggctgctcac cgcccggctg ggtatcaaag 60 cgatggagct gtgtcggcct ttaccctggc tggaaaatga taaacctcgt ctcggcgatt 120 accgcgggag ctgttagggc agttgaaaga cgcgctacaa aagggcggga ataaacatcc 180 acaaaactga ctttagatgg ggccgttatt taacgtcccc tgtttagcgc gccaaatctg 240 cgggggaccg ttccgggata ctgggaagat taactgcgaa agacgtcgaa aactcaaggt 300 gttatggcgc gctgcgcgcg acggacgttt aaaaaaaacg cgcttgcgtt aacgctgtca 360 acttttcctg acagccccct ttctgcggac gggctgttta gcgtattatc gcgacatatc 420 aaacggatta aggcccacgc a atg cgt tta gaa gtg ttt tgt cag gac cgt 471 Met Arg Leu Glu Val Phe Cys Gln Asp Arg 1 5 10 atc gga ctg gcg cgt gaa ttg ctc gac ctg ttg gtg gcg cgc agt atc 519 Ile Gly Leu Ala Arg Glu Leu Leu Asp Leu Leu Val Ala Arg Ser Ile 15 20 25 gat ctc cgc ggc att gaa gtc gcc gcc tca ggc cgt atc tat ctt aat 567 Asp Leu Arg Gly Ile Glu Val Ala Ala Ser Gly Arg Ile Tyr Leu Asn 30 35 40 ttc tcc acg ctt gaa ttc gaa cag ttc agt aat ctg atg gcg gaa atc 615 Phe Ser Thr Leu Glu Phe Glu Gln Phe Ser Asn Leu Met Ala Glu Ile 45 50 55 cgt cgt aca ccc ggc gtc acc gat gtc cgc acg gtc ccc tat atg ccg 663 Arg Arg Thr Pro Gly Val Thr Asp Val Arg Thr Val Pro Tyr Met Pro 60 65 70 tct gaa cgt gaa cat cgg gta ctc agc gcc ttg ctg gtt gcc atg cca 711 Ser Glu Arg Glu His Arg Val Leu Ser Ala Leu Leu Val Ala Met Pro 75 80 85 90 gag ccg gta ttt tcg gtt gat ttg aga acg aag gtt gag ctg gcg aac 759 Glu Pro Val Phe Ser Val Asp Leu Arg Thr Lys Val Glu Leu Ala Asn 95 100 105 ccg gcg gcg caa aac ctg ttt aat ctt gat gaa aac aag atc cgc aat 807 Pro Ala Ala Gln Asn Leu Phe Asn Leu Asp Glu Asn Lys Ile Arg Asn 110 115 120 ttt acc gcc gac cac ctg att aac ggt ttt aat ttt gcg cgc tgg ctg 855 Phe Thr Ala Asp His Leu Ile Asn Gly Phe Asn Phe Ala Arg Trp Leu 125 130 135 gag agc gaa cgc gtt cag gcg cag gcg caa cat gtg gtg ata gaa ggg 903 Glu Ser Glu Arg Val Gln Ala Gln Ala Gln His Val Val Ile Glu Gly 140 145 150 cgc gac ttc ctg atg gaa gca cac ccg att tac ctg tca gag gac aac 951 Arg Asp Phe Leu Met Glu Ala His Pro Ile Tyr Leu Ser Glu Asp Asn 155 160 165 170 gac cag gcc gac cag ctc gtc ggc gca atg gtg atg ctg aag tct act 999 Asp Gln Ala Asp Gln Leu Val Gly Ala Met Val Met Leu Lys Ser Thr 175 180 185 gcc cgt atg ggg cga caa ctg cag aac ctg gtg gtg acc gat gaa acc 1047 Ala Arg Met Gly Arg Gln Leu Gln Asn Leu Val Val Thr Asp Glu Thr 190 195 200 gag ttc gat cat att gtc gcc gtt acg ccc agg atg cgg cag gtc gtg 1095 Glu Phe Asp His Ile Val Ala Val Thr Pro Arg Met Arg Gln Val Val 205 210 215 gaa cag gcg cgc aag ctc gcg atg cac gat gca ccg ctg ctg att atc 1143 Glu Gln Ala Arg Lys Leu Ala Met His Asp Ala Pro Leu Leu Ile Ile 220 225 230 ggc gac acc ggc acg ggc aaa gac atg ctg gcg cgg gcc tgt cat tta 1191 Gly Asp Thr Gly Thr Gly Lys Asp Met Leu Ala Arg Ala Cys His Leu 235 240 245 250 cgc agc gca cgc gga aag atg cct ttt ctg gcg ctt aac tgt gca tcg 1239 Arg Ser Ala Arg Gly Lys Met Pro Phe Leu Ala Leu Asn Cys Ala Ser 255 260 265 ctg ccg gat gac gta gcg gaa agt gag ctt ttt ggt cac gca gcc ggg 1287 Leu Pro Asp Asp Val Ala Glu Ser Glu Leu Phe Gly His Ala Ala Gly 270 275 280 gcc tat ccc aat gcg ctg gag ggc aaa aaa ggc ttt ttc gaa cag gca 1335 Ala Tyr Pro Asn Ala Leu Glu Gly Lys Lys Gly Phe Phe Glu Gln Ala 285 290 295 aac ggt ggc tcg gtg ctg ctg gat gaa att ggc gag atg tca ccc act 1383 Asn Gly Gly Ser Val Leu Leu Asp Glu Ile Gly Glu Met Ser Pro Thr 300 305 310 atg cag acg aag ctg ctg cgt ttt ctg aac gat ggc act ttc cgc cgc 1431 Met Gln Thr Lys Leu Leu Arg Phe Leu Asn Asp Gly Thr Phe Arg Arg 315 320 325 330 gtc ggt gag gag cat gag gta cac gtg aat gtc cgc gtg atc tgc gcc 1479 Val Gly Glu Glu His Glu Val His Val Asn Val Arg Val Ile Cys Ala 335 340 345 acc cag aag aac ctg ttt gag ctg gtt cag cgc ggc gag ttc agg gaa 1527 Thr Gln Lys Asn Leu Phe Glu Leu Val Gln Arg Gly Glu Phe Arg Glu 350 355 360 gac ctt ttc tat cgc ctg aat gtg ctt acg ctg aat ctg ccg ccg ctg 1575 Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Asn Val Leu Thr Leu Asn Leu Pro Pro Leu 365 370 375 cgc gag cgc gtt cag gac att atg ccg ctg acg gaa att ttc gtg gcg 1623 Arg Glu Arg Val Gln Asp Ile Met Pro Leu Thr Glu Ile Phe Val Ala 380 385 390 cgt ttc gcc gat gaa cag ggc att cct cgg ccg cgt ctt tcc tca cag 1671 Arg Phe Ala Asp Glu Gln Gly Ile Pro Arg Pro Arg Leu Ser Ser Gln 395 400 405 410 ctg aat gct ttt ctg atg cgc tat aac tgg ccc gga aac gtg cgg cag 1719 Leu Asn Ala Phe Leu Met Arg Tyr Asn Trp Pro Gly Asn Val Arg Gln 415 420 425 ctt aaa aat gcc ttg tat cgt gca tta acc cag ttg gaa ggc cat gag 1767 Leu Lys Asn Ala Leu Tyr Arg Ala Leu Thr Gln Leu Glu Gly His Glu 430 435 440 tta cgg ccg cag gat atc gtc ttg ccg gaa cag gcg ctg gat gtg tca 1815 Leu Arg Pro Gln Asp Ile Val Leu Pro Glu Gln Ala Leu Asp Val Ser 445 450 455 ctg ggg gaa gaa gcg atg gaa ggc acg ctg gat cag atc acc agc cgc 1863 Leu Gly Glu Glu Ala Met Glu Gly Thr Leu Asp Gln Ile Thr Ser Arg 460 465 470 ttt gaa cga tct att ttg acg cgg tta tat ttg tct tat ccg agc acg 1911 Phe Glu Arg Ser Ile Leu Thr Arg Leu Tyr Leu Ser Tyr Pro Ser Thr 475 480 485 490 cgc aaa ctg gca aaa cga ctg ggg gtt tcc cat acc gcc att gcc aat 1959 Arg Lys Leu Ala Lys Arg Leu Gly Val Ser His Thr Ala Ile Ala Asn 495 500 505 aaa ctg cgt gag tac ggt ctg ggg cag aag cgc ggc gac aac gaa 2004 Lys Leu Arg Glu Tyr Gly Leu Gly Gln Lys Arg Gly Asp Asn Glu 510 515 520 taaaacgcag cggataagtc tggcttatcc gctgtggcca ttatttcagc gcagcgagtg 2064 cggcatcata atcgggttca gtggtgatct cattcaccag ctggctgtaa agcactttgt 2124 catgctcatc cagtacgata acggcacggg ccgtcagacc ctgaagggca ccatcagcaa 2184 tttccacgcc aaaatctttt ttgaattccc cgccgcgcag cgttgacagc gtaaccacgt 2244 tgttgaggtt gtctgcgcca caaaaacgcg attgagcaaa gggcaggtcg gcggaaatac 2304 ataacaccac cgtgttattc agttcgcccg ctaactggtt aaacttgcgc accgaagagg 2364 cgcacacgcc ggtatcgacg ctgggaaaaa tattcagaat cttgcgtttt cctgcatact 2424 cagagagtga aacgttagac aggtttttcg ccacgagggt aaaagcgtta acgctatcgc 2484 ccggctgcgg gaactgacct gcaaccgcta cagggttgcc ctgaaagtga acagtctgag 2544 acataagaat tccttctaat gatgttatct gacagaaaag aaagcgtcag tacaggtata 2604 gccattgttt atgacataaa ttttaagggt ttacgagagc atttgttgcc taaagttaaa 2664 tggcgatgat gaatcccaga gaaaaggaga ggtaatgaga acggtaaaat gttatcccga 2724 agcatggccg ctgcatacgc cgtttgtcat tgctcgtggc agtcgcaccg aagccaaggt 2784 cgttgtcgtc gaaatcgaag aagagggcgt gaaagggatc ggcgaggcca cgccttacac 2844 gcgctacggc gaaagcgaag ccctggtgct ggaacaaatt gcgaccgtta tgcctcaact 2904 gcagcaaggg ctgtcgcgtg aagccttgca gagcctgttg cctgccggtg cggcaagaaa 2964 cgccatcgac agtgctctct gggaccttgc cgctcgccag cagcatgtga cgctggagca 3024 gttagtgggc gcggaaccga cccagtctgt tgtgactgca cacacggtga gcattgatac 3084 gccggaagcg atggccagca gcgcgcaggc gttgtggcaa catggcgcaa cactgctcaa 3144 aatcaaaatg gacaataact ttattaccga gcgcctgatg gcgattcgcg ctgctgttcc 3204 cgacgcgaca ttacttgtgg atgcgaatga atcctggcat gccgaaggct ggcagcccgt 3264 tgccagctgt tagccgatct ggaggtggcc atgctggaac agccgttacc ggcaggtgaa 3324 gacgcggcgc tggcgaactt tatccatcct cttccgatc 3363

【００９２】 <210> 2 <211> 521 <212> PRT <213> Erwinia herbicola <400> 2 Met Arg Leu Glu Val Phe Cys Gln Asp Arg Ile Gly Leu Ala Arg Glu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Leu Val Ala Arg Ser Ile Asp Leu Arg Gly Ile Glu 20 25 30 Val Ala Ala Ser Gly Arg Ile Tyr Leu Asn Phe Ser Thr Leu Glu Phe 35 40 45 Glu Gln Phe Ser Asn Leu Met Ala Glu Ile Arg Arg Thr Pro Gly Val 50 55 60 Thr Asp Val Arg Thr Val Pro Tyr Met Pro Ser Glu Arg Glu His Arg 65 70 75 80 Val Leu Ser Ala Leu Leu Val Ala Met Pro Glu Pro Val Phe Ser Val 85 90 95 Asp Leu Arg Thr Lys Val Glu Leu Ala Asn Pro Ala Ala Gln Asn Leu 100 105 110 Phe Asn Leu Asp Glu Asn Lys Ile Arg Asn Phe Thr Ala Asp His Leu 115 120 125 Ile Asn Gly Phe Asn Phe Ala Arg Trp Leu Glu Ser Glu Arg Val Gln 130 135 140 Ala Gln Ala Gln His Val Val Ile Glu Gly Arg Asp Phe Leu Met Glu 145 150 155 160 Ala His Pro Ile Tyr Leu Ser Glu Asp Asn Asp Gln Ala Asp Gln Leu 165 170 175 Val Gly Ala Met Val Met Leu Lys Ser Thr Ala Arg Met Gly Arg Gln 180 185 190 Leu Gln Asn Leu Val Val Thr Asp Glu Thr Glu Phe Asp His Ile Val 195 200 205 Ala Val Thr Pro Arg Met Arg Gln Val Val Glu Gln Ala Arg Lys Leu 210 215 220 Ala Met His Asp Ala Pro Leu Leu Ile Ile Gly Asp Thr Gly Thr Gly 225 230 235 240 Lys Asp Met Leu Ala Arg Ala Cys His Leu Arg Ser Ala Arg Gly Lys 245 250 255 Met Pro Phe Leu Ala Leu Asn Cys Ala Ser Leu Pro Asp Asp Val Ala 260 265 270 Glu Ser Glu Leu Phe Gly His Ala Ala Gly Ala Tyr Pro Asn Ala Leu 275 280 285 Glu Gly Lys Lys Gly Phe Phe Glu Gln Ala Asn Gly Gly Ser Val Leu 290 295 300 Leu Asp Glu Ile Gly Glu Met Ser Pro Thr Met Gln Thr Lys Leu Leu 305 310 315 320 Arg Phe Leu Asn Asp Gly Thr Phe Arg Arg Val Gly Glu Glu His Glu 325 330 335 Val His Val Asn Val Arg Val Ile Cys Ala Thr Gln Lys Asn Leu Phe 340 345 350 Glu Leu Val Gln Arg Gly Glu Phe Arg Glu Asp Leu Phe Tyr Arg Leu 355 360 365 Asn Val Leu Thr Leu Asn Leu Pro Pro Leu Arg Glu Arg Val Gln Asp 370 375 380 Ile Met Pro Leu Thr Glu Ile Phe Val Ala Arg Phe Ala Asp Glu Gln 385 390 395 400 Gly Ile Pro Arg Pro Arg Leu Ser Ser Gln Leu Asn Ala Phe Leu Met 405 410 415 Arg Tyr Asn Trp Pro Gly Asn Val Arg Gln Leu Lys Asn Ala Leu Tyr 420 425 430 Arg Ala Leu Thr Gln Leu Glu Gly His Glu Leu Arg Pro Gln Asp Ile 435 440 445 Val Leu Pro Glu Gln Ala Leu Asp Val Ser Leu Gly Glu Glu Ala Met 450 455 460 Glu Gly Thr Leu Asp Gln Ile Thr Ser Arg Phe Glu Arg Ser Ile Leu 465 470 475 480 Thr Arg Leu Tyr Leu Ser Tyr Pro Ser Thr Arg Lys Leu Ala Lys Arg 485 490 495 Leu Gly Val Ser His Thr Ala Ile Ala Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Gly 500 505 510 Leu Gly Gln Lys Arg Gly Asp Asn Glu 515 520

【００９３】 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Erwinia herbicola <400> 3 atgaactatc c 11

【００９４】 <210> 4 <211> 11 <212> DNA <213> Erwinia herbicola <400> 4 atggaggatc c 11

【００９５】 <210> 5 <211> 11 <212> DNA <213> Erwinia herbicola <400> 5 ttaacattcg c 11

【００９６】 <210> 6 <211> 11 <212> DNA <213> Erwinia herbicola <400> 6 ttagaattcg c 11

【００９７】 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Erwinia herbicola <400> 7 tcggcaggat ccttcatgtt ta 22

【００９８】 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Erwinia herbicola <400> 8 agcggcgaat tctaatgacg tg 22

【００９９】 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 9 gattaaggcc caccatatgc gtttagaag 29

【０１００】 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 10 gattaaggcc caccatatgc gtttagaag 29

【０１０１】 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 11 tgagcatgac aaaaagcttt acagccag 28

【０１０２】 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 12 ccgaattcgc taaatgcatc gtcatctttt atg 33

【０１０３】 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 13 ccggatcctt ttgcatgatg gcgatcctgt tta 33

【０１０４】 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 14 ccgaattcca gactggcatg cgtatattgc 30

【０１０５】 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 15 ccggatcctt cacgctttct tctgtcctga cga 33

【図面の簡単な説明】

【図１】 tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝
子を搭載したプラスミド(pTK312)の構築過程の一部を示
す図。

【図２】 tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝
子を搭載したプラスミド(pTK312)の構築過程の一部を示
す図。

【図３】 tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝
子を搭載したプラスミド(pTK312)の構築過程の一部を示
す図。

【図４】 調節領域（regulatory region）が除去され
たtpl'-'lac 融合タンパク質遺伝子を含むプラスミド(p
TK475)の構築を示す図。

【図５】 変異型tyrR発現プラスミドの構築を示す図。

【図６】 エルビニア・ヘルビコーラに変異型tyrRを導
入するためのプラスミドpTK922の構築を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｄ //(Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 BA71 BA80 CA02 DA05 DA06 EA04 FA02 GA11 4B050 CC03 DD02 EE10 LL05 4B064 AE03 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA25X AA26X AA26Y AB01 AC14 BA02 BA16 CA17 CA24 CA27 CA44 4H045 AA10 BA10 CA11 DA89 EA01 EA50 FA72 FA74

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ６７位のバリン残基をバリン以外のアミ
   ノ酸に置換する変異、７２位のチロシン残基をチロシン
   以外のアミノ酸基に置換する変異、９７位のアスパラギ
   ン酸残基をアスパラギン酸以外のアミノ酸残基に置換す
   る変異、及び４０２位のイソロイシン残基をイソロイシ
   ン以外のアミノ酸残基に置換する変異から選ばれる１又
   は２以上の変異を少なくとも有し、かつ、チロシンフェ
   ノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性が、前
   記変異を有しないチロシンリプレッサーに比べて上昇し
   た変異型チロシンリプレッサー。
2. 【請求項２】 前記バリン以外のアミノ酸残基がアラニ
   ン、チロシン以外のアミノ酸残基がシステイン、アスパ
   ラギン酸以外のアミノ酸残基がグリシン、及びイソロイ
   シン以外のアミノ酸残基がバリンである請求項１記載の
   変異型チロシンリプレッサー。
3. 【請求項３】 前記変異が、（イ）６７位のバリン残基
   をアラニン残基に置換する変異、（ロ）７２位のチロシ
   ン残基をシステイン残基に置換する変異、（ハ）６７位
   のバリン残基をアラニン残基に置換する変異及び７２位
   のチロシン残基をシステイン残基に置換する変異、又は
   （ニ）６７位のバリン残基をアラニン残基に置換する変
   異及び７２位のチロシン残基をシステイン残基に置換す
   る変異並びに２０１位のグルタミン酸残基グリシン残基
   に置換する変異のいずれかである請求項２記載の変異型
   チロシンリプレッサー。
4. 【請求項４】 変異を有しないチロシンリプレッサーが
   配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１〜３の
   いずれか一項に記載の変異型チロシンリプレッサー。
5. 【請求項５】 前記変異以外の位置において、１若しく
   は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位
   を含み、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発
   現を正に調節する活性が、前記変異を有しないチロシン
   リプレッサーに比べて上昇した請求項４記載の変異型チ
   ロシンリプレッサー。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の変
   異型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 チロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプ
   ロモーターに発現可能に連結された構造遺伝子を保持
   し、同構造遺伝子産物を産生する能力を有するエシェリ
   ヒア属細菌又はエルビニア属細菌であって、さらに請求
   項５記載のＤＮＡを保持し、同ＤＮＡにより産生する変
   異型チロシンリプレッサーにより前記構造遺伝子の発現
   が正に調節されるエシェリヒア属細菌又はエルビニア属
   細菌。
8. 【請求項８】 前記構造遺伝子が、チロシンフェノール
   リアーゼをコードする遺伝子である請求項７記載のエシ
   ェリヒア属細菌又はエルビニア属細菌。
9. 【請求項９】 請求項８記載のエシェリヒア属細菌又は
   エルビニア属細菌を培地に培養し、チロシンフェノール
   リアーゼを産生させることを特徴とする、チロシンフェ
   ノールリアーゼの製造法。
10. 【請求項１０】 前記培地に含まれるチロシンの量が、
    エシェリヒア属細菌又はエルビニア属細菌の野生株にお
    いてチロシンフェノールリアーゼの誘導に必要な量より
    も少ないことを特徴とする請求項９記載のチロシンフェ
    ノールリアーゼの製造法。
11. 【請求項１１】 請求項８記載のエシェリヒア属細菌又
    はエルビニア属細菌を培地に培養し、チロシンフェノー
    ルリアーゼを産生させる工程と、産生したチロシンフェ
    ノールリアーゼを、ピロカテコール及びセリン、又はピ
    ロカテコール、ピルビン酸及びアンモニアに作用させて
    Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを生成させ
    る工程を含む、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラ
    ニンの製造法。
12. 【請求項１２】 前記培地に含まれるチロシンの量が、
    エシェリヒア属細菌又はエルビニア属細菌の野生株にお
    いてチロシンフェノールリアーゼの誘導に必要な量より
    も少ないことを特徴とする請求項１１記載のＬ−３，４
    −ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。