TWI809494B - 新穎MdtH變異體及藉由使用其生產O-磷絲胺酸及半胱胺酸及半胱胺酸之衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明是有關一種新穎MdtH變異體及藉由使用其生產O-磷絲胺酸及半胱胺酸及半胱胺酸衍生物的方法。
Description
本發明係有關一種新穎MdtH變異體及藉由使用其生產O-磷絲胺酸及半胱胺酸及半胱胺酸衍生物的方法。
左旋半胱胺酸(L-Cysteine)係在所有活體生物中之硫代謝(sulfur metabolism)扮演重要角色的胺基酸,不僅用於生物蛋白諸如頭髮角蛋白、麩胱甘肽(glutathione)、生物素、甲硫胺酸及其他含硫代謝物的合成中,亦使用作為輔酶A之生物合成的前驅物。
對於使用微生物生產左旋半胱胺酸的方法,已被揭露者為:1)使用微生物將D,L-2-胺基噻唑啉-4-羧酸(D,L-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid,D,L-ATC)生物性地(biologically)轉化的方法、2)藉由使用大腸桿菌(E.coli)生產左旋半胱胺酸的直接發酵方法(歐洲發明專利EP 0885962 B;及Wada M and Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006);及3)使用微生物藉由發酵作用生產O-磷絲胺酸(O-phosphoserine,此後稱為「OPS」),且接著藉由使
O-磷絲胺酸與硫化物在O-磷絲胺酸巰基化酶(O-phosphoserine sulfhydrylase,此後稱為「OPSS」)之催化作用下反應而將O-磷絲胺酸轉化成左旋半胱胺酸的方法(歐洲發明專利公開EP2444481)。
然而,由於對於左旋半胱胺酸的需求增加,仍需要對有效之左旋胺基酸生產方法進行研究。特別是,為了在高產率下藉由方法3)生產半胱胺酸,需過量(excess amount)生產該前驅物OPS。
本發明的一個態樣是提供一種MdtH變異體,其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以另一胺基酸取代。
本發明的另一個態樣是提供編碼本發明之變異體的多核苷酸。
本發明的再另一態樣是提供包含本發明之該多核苷酸的載體。
本發明的再另一態樣是提供包含一MdtH變異體或編碼該變異體之多核苷酸的大腸桿菌(Escherichia)屬之重組微生物,該變異體中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以另一胺基酸取代。
本發明的再另一態樣是提供用以生產O-磷絲胺酸的方法,該方法包括在一培養基(medium)中培養包含一MdtH變異體或編碼該變異體之一多核苷酸的微生物,該變異體中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以另一胺基酸取代。
本發明的再另一態樣是提供一種用於生產半胱胺酸或其衍生物的方法,該方法包括:a)在一培養基中培養包含一MdtH變異體或編碼該變異體
之一多核苷酸的一微生物,該MdtH變異體中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以另一胺基酸取代,藉此生產O-磷絲胺酸或包含該O-磷絲胺酸的培養基;以及b)將一硫化物與O-磷絲胺酸巰基化酶(OPSS)或表現OPSS之微生物,以及步驟a)中生產之O-磷絲胺酸或包含O-磷絲胺酸之培養基反應。
以下將進行詳細敘述。本揭露內容中所揭露的各說明及實施例亦可被應用於其他說明及實施例。即,本揭露內容中所揭示的各種元件的所有組合落於本發明的範圍內。再者,本發明的範圍不受限於下列具體說明。再者,在整篇說明書中係參考許多文獻及專利文件,且其等的引用文獻被提供。被引用之文獻及專利文件的揭露內容藉由參考被整體併入本說明書中,且本發明所落入之所屬技術領域的程度與本發明的細節被更為清楚地解釋。
根據本發明的一個態樣,提供有一種MdtH變異體,其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以另一胺基酸取代。
在一實施例中,該另一胺基酸為異白胺酸。
本發明之變異體可為其中作為母序列(parent sequence)之SEQ ID NO:1所敘述之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸,纈胺酸,是以異白胺酸所取代,且其具有與SEQ ID NO:1所敘述之胺基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%,或至少99.7%,且少於100%的同源性(homology)或相等性(identity)。舉例而言,本發明的變異體可具有異白胺酸作為SEQ ID NO:1所敘述之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸,且可具有或包含具有與SEQ ID NO:1所敘述之
胺基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%,或至少99.7%,且少於100%的同源性或相等性之胺基酸序列,或可由該胺基酸序列所組成,或可實質上由該胺基酸序列所組成。顯見的是,即使一變異體中具有其一部分有刪除、修飾、取代、保留取代或添加的胺基酸序列,只要該胺基酸序列具有此同源性或相等性且展現對應於本發明之該變異體的活性,其亦可落於本發明的範圍內。
舉例而言,在該胺基酸序列的N端、C端,及/或內部可有不改變本發明之變異體的功能之序列添加或刪除、自然發生突變、沉默突變(silent mutation),或保守取代(conservative substitution)。
該「保留取代(conservative substitution)」是指以具有相似結構及/或化學特性之另一胺基酸對一胺基酸進行取代。此胺基酸取代可通常基於殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性,及/或兩性本質之相似度而發生。通常,保留取代對於蛋白質或多肽之活性可具有很少影響或不具有影響。
此處所使用之用語「變異體」是指由於母序列中之至少一胺基酸之保留取代及/或修飾而具有與母序列不同之序列,但不改變功能或特性的特定蛋白質。一變異體與以數個胺基酸取代、刪除或添加而被辨識之序列不同。此變異體一般可藉由修飾該特定蛋白之胺基酸序列中之至少一胺基酸,並評估經修飾之蛋白的特性而辨識。即,與其原始(native)蛋白相比,變異體之能力可被增加、不變或減低。另外,一些變異體可包括其中至少一部分,諸如N端前導序列(N-terminal leader sequence)或一跨膜區域(transmembrane)被移除的變異體。其他變異體可包括其中成熟蛋白之N端及/或C端之一部分被移除的變異體。該用語「變異體」亦可與「修飾」、「經修飾之蛋白」、「經修飾之多肽」、「變
異體」、「突變形成的蛋白質(mutein)」、「發散體(divergent)」或類似者互換使用,且用於表示被修飾的任何用語可不受限制地被使用。為了本發明的目的,該變異體可指相比於自然發生之野生種或未經修飾之蛋白,其中一經修飾之蛋白的活性被增強之變異體,但該變異體不限於此。
該變異體亦可包含對於一多肽之特性及二級結構(secondary structure)具有最小影響之胺基酸的刪除或添加。舉例而言,涉及共轉譯(co-translational)或後轉譯(co-translational)蛋白轉位(translocation)中的訊號(或前導)序列可被合併(conjugated)至該變異體的N端。另外,該變異體亦可被合併至另一序列或連結子(linker)以進行其之辨識、純化或合成。
此處所使用之用語「母序列」是指一參考序列,其通過導入修飾而成為經修飾之多肽。即,該母序列,其為一起始序列,可為諸如取代、插入及/或刪除的修飾被導入的目標。該母序列可呈自然發生之形式或為野生種,且可為具有在自然發生之形式或野生種中發生之至少一取代、插入或刪除的變異體,或一人工合成之序列。
此處所使用之用語「同源性」或「相等性」是指兩個給定胺基酸序列或核甘酸序列之間的相似度的程度,且可以百分比表示。同源性及相等性等用語通常可互換使用。
保留多核苷酸或多肽之序列同源性或相等性可使用標準對位演算法而決定,且由一程式確立之預設空位罰分(default gap penalty)可被組合而使用。實質上,同源或相等序列可通常在中等或高度嚴密條件下,以整個序列或各序列之全長的至少約50%、60%、70%、80%或90%雜交。顯見的是,該雜交亦包括以包含典型密碼子或考量密碼子缺陷而選擇之密碼子的多核苷酸雜交。
任何兩個多核苷酸序列或多肽序列是否具有同源性、相似性或相等性可藉由使用已知電腦演算法,諸如「FASTA」程式,通過使用預設參數,如Pearson et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中者而決定。或者是,該同源性、相似性或相等性可使用Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453),如應用於歐洲分子生物學開放軟體套組(EMBOSS)組件的Needleman程式(5.0.0或其後的版本)(Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)(包括GCC程式套組(Devereux,J.et al.,Nucleic Acids Research 12:387(1984))),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,S.F.et al.,J MOLEC BIOL 215:403(1990);Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,and CARILLO et al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)中者所決定。舉例而言,該同源性、相似性或相等性可使用國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的BLAST或ClustalW來決定。
多核苷酸或多肽之該同源性、相似性或相等性可藉由使用GAP電腦程式,例如,Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443,如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中已知者,比對序列資訊而決定。簡言之,該GAP程式將同源性、相似性或相等性界定為相似的經對齊之符號(即,核苷酸或胺基酸)之數量除以兩個序列之較短者中的符號之總數所獲得之值。該GAP程式的預設參數可包括:(1)二進位比較矩陣(包含表示相同的數值1及表示不同的數值0)以及Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中所揭露的Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745之加權比較矩陣(或EDNAFULL取代矩陣(NCBI
NUC4.4之EMBOSS版本));(2)對各空位(gap)之3.0的罰分(penalty)以及各空位中每個符號額外0.10的罰分(或是一個空位開啟10罰分,且一空位延伸0.5罰分);以及(3)對於終端空位無罰分。
此處所使用的用語「對應於」是指在敘述於多肽中一位置處的胺基酸殘基,或與敘述於該多肽中之殘基相似、相同或同源的胺基酸殘基。辨認位於對應位置之胺基酸可為決定參考至特定序列之一序列的特定胺基酸。此處所使用之用語「對應區域」一般是指在相關之蛋白或參考蛋白中的相似或對應位置。
舉例而言,任何胺基酸序列是與SEQ ID NO:1對齊(aligned),且基於此,該胺基酸序列的各胺基酸殘基可以參考於對應於SEQ ID NO:1中之胺基酸殘基的胺基酸殘基編號位置而編號。舉例而言,本發明中所述之序列對齊演算法可辨識相較於一欲尋找之序列(query sequence,亦稱為「參考序列」),胺基酸的位置或修飾,諸如取代、插入或刪除發生之位置。
舉例而言,Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453),EMBOSS套組之Needle程式(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277),或類似者可被用於此對齊,但不限於此,本技術領域中已知之一序列對齊程式、一雙序列比較演算法(pairwise sequence comparison algorithm)或類似者,可被適當地使用。
此處所使用之用語「MdtH」是指主要協助轉運蛋白超家族(Major facilitator superfamily,MFS)的一種轉運蛋白(transporter),MFS是膜轉運蛋白的超家族,其回應化學滲透梯度(chemiosmotic gradients)促進小溶質穿越細胞
膜的移動,且已知為自大腸桿菌(E.Coli)展現OPS輸出活性之蛋白,其在過量的OPS存在下,生長抑制(growth inhibition)被釋放。此處的MdtH可表示具有將O-磷絲胺酸(OPS)自細胞輸出之活性的膜蛋白。MdtH之序列可自已知資料庫,NCBI之GenBank獲得。舉例而言,MdtH可為具有OPS輸出活性的多肽,由mdtH基因編碼,但不限於此。
本發明之變異體可具有與野生種多肽相比增加OPS輸出能力的活性。
此處所使用之用語「O-磷絲胺酸(此後稱為「OPS」)」是指絲胺酸的磷酸酯,其為數種蛋白的建構組分。OPS,其為左旋半胱胺酸的前驅物,可藉由與硫化物在OPS巰基化酶(OPSS)之催化作用下反應而轉化成半胱胺酸,但不限於此(美國發明專利申請公開案US2012-0190081)。
本發明之變異體可為其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置60、180及398之胺基酸的至少一者進一步以另一胺基酸所取代者。舉例而言,本發明之變異體可為其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125之胺基酸以另一胺基酸所取代,且對應於位置60、130及398之胺基酸的至少一、至少二,或至少三個胺基酸進一步以其他胺基酸取代者,但不限於此。
具體而言,本發明之該變異體可為展現OPS輸出活性的經修飾之多肽,其中,自SEQ ID NO:1之胺基酸序列的N端起,i)纈胺酸,對應於位置125之胺基酸殘基是以纈胺酸之外的一胺基酸殘基所取代;或進一步地,ii)麩醯胺酸,對應於位置60之胺基酸殘基、iii)苯丙胺酸,對應於位置180之胺基酸殘基,及/或iv)白胺酸,對應於位置398之胺基酸殘基,各自以另外的胺基酸殘基所取代。
自SEQ ID NO:1之胺基酸序列的N端起,對應於位置125之胺基酸殘基的i)纈胺酸之外的胺基酸,可包括甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸;對應於位置60之胺基酸殘基的ii)麩醯胺酸之外的胺基酸,可包括甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、纈胺酸、離胺酸、組胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸;對應於位置180之胺基酸殘基的iii)苯丙胺酸之外的胺基酸,可包括甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、脯胺酸、纈胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸;及/或對應於位置398之胺基酸殘基的iv)白胺酸之外的胺基酸,可包括甘胺酸、丙胺酸、異白胺酸、絲胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸,但不限於此。
更具體而言,在本發明的變異體中,自SEQ ID NO:1之胺基酸序列的N端起,對應於位置125的胺基酸殘基之i)纈胺酸可以異白胺酸取代;或進一步地,ii)對應於位置60之胺基酸殘基可為麩醯胺酸或精胺酸,iii)對應於位置180之胺基酸殘基可為苯丙胺酸或白胺酸,且iv)對應於位置398之胺基酸殘基可為白胺酸或脯胺酸。
再更具體而言,在本發明的變異體中,自SEQ ID NO:1之胺基酸序列的N端起,對應於位置125的胺基酸殘基之i)纈胺酸可以異白胺酸取代;或進一步地,對應於位置60之胺基酸殘基之ii)麩醯胺酸可以精胺酸取代,對應於位置
180之胺基酸殘基之iii)苯丙胺酸可以白胺酸取代,及/或對應於位置398之胺基酸殘基之iv)白胺酸可以脯胺酸取代。
在一實施例中,本發明的變異體可為由具有與選自於SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之至少任一胺基酸序列至少99%之序列相等性的胺基酸序列所組成的變異體。
或者是,本發明之變異體可具有、包含選自於SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之至少任一胺基酸序列,或由選自於SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之至少任一胺基酸序列所組成,或實質上由選自於SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之至少任一胺基酸序列所組成;但不限於此。
根據本發明的另一個態樣,提供有編碼本發明之變異體的多核苷酸。
該變異體是如上所述。
此處所使用的用語「多核苷酸」是指經由共價鏈接(covalent linkage)連接於一長鏈形式中之核苷酸單元的聚合物,以及指具有預定長度或更長的DNA或RNA股。更具體而言,該用語是指編碼該變異體的多核苷酸片段。
編碼本發明之變異體的多核苷酸可包含編碼SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所敘述之胺基酸序列的核苷酸序列。作為本發明的實例,本發明之多核苷酸可具有或包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之核酸核苷酸序列。另外,本發明之該多核苷酸可由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之核酸核苷酸序列所組成,或實質上由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之核酸核苷酸序列所組成。
本發明之該多核苷酸可在其編碼區內,在本發明之變異體的胺基酸序列不被改變的範圍內,考量到密碼子簡併,或本發明之該變異體將被表現之生物體所偏好的密碼子而以各種方式修飾。具體而言,本發明之該多核苷酸可具
有或包含具有與SEQ ID NO:4或5之核酸核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%,或至少99%,且少於100%之同源性或相等性的核苷酸序列,或可(實質上)由具有與SEQ ID NO:4或5之核酸核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%,或至少99%,且少於100%之同源性或相等性的核苷酸序列所組成,但不限於此。在具有上述同源性或相等性的序列中,編碼SEQ ID NO:1之對應於位置125的胺基酸之密碼子可為編碼異白胺酸之密碼子之一。
另外,本發明之多核苷酸可包括,但不限於,可以在嚴密條件下與可以自已知基因序列,例如,對本發明之多核苷酸序列的一部分或整體為互補性的序列所製備之探針雜交的序列。該「嚴密條件」是指能使多核苷酸之間特定雜交發生的條件。此等條件具體敘述於文獻中(見J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989;F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)。舉例而言,此等條件可包括其中具有高同源性或相等性,諸如具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%之同源性或相等性的多核苷酸可與彼此雜交的條件,但具有較低之同源性或相等性之多核苷酸不彼此雜交的條件;或用於典型的南方雜交法之清洗條件,其中在對應於60℃、1×SSC、0.1% SDS,具體而言,60℃、0.1×SSC,及0.1% SDS;及更具體而言68℃、0.1×SSC,及0.1% SDS之溫度及鹽濃度下進行一次清洗,具體而言進行兩次或三次清洗的條件。
雜交需要包含互補序列之兩個核酸,雖然依據該雜交的嚴密性,鹼基(bases)之間的錯位(mismatches)是可容許的。該用語「互補」是用於敘
述可彼此雜交之核苷酸鹼基之間的關係。舉例而言,對於DNA,腺嘌呤(adenine)是與胸腺嘧碇互補,而胞嘧啶是與鳥糞嘌呤互補。因此,本發明之多核苷酸亦可包括不只實質上相似的核酸序列,還可包括對整個序列互補的獨立核酸片段。
具體而言,具有與本發明之多核苷酸之同源性或相等性的多核苷酸可使用上述條件及使用包括在55℃之Tm值之雜交步驟的雜交條件加以偵測。另外,該Tm值可為60℃、63℃,或65℃,但不限於此,且可由所屬技術領域具有通常知識者依據其目的而適當地控制。
用於雜交多核苷酸的適當嚴密性係視該多核苷酸之長度及其等之間互補性的等級而定,且其參數在所屬技術領域中為已知的(例如Sambrook et al.,supra)。
根據本發明的再另一態樣,提供包含本發明之該多核苷酸的載體。該載體可為用以於一宿主細胞中表現該多核苷酸的表現載體,但不限於此。
該多核苷酸是如上所述。
本發明之該載體可包括含有編碼可操作地連結至適當表現控制區域(expression control region,或表現控制序列)之目標多肽之多核苷酸的核苷酸序列,使得其能夠於適當宿主中表現該目標多肽之DNA建構。該表現控制區域可包括能夠起始轉錄之啟動子、用以控制此轉錄的任何操作子序列,用以編碼合適mRNA核醣體結合位置的序列,以及用以控制轉錄及轉譯之終止的序列。一旦轉化成合適的宿主,該載體可進行複製或獨立於宿主基因組發揮功能,或本身可被整合至該基因組中。
使用於本發明之該載體不特別限制,且所屬技術領域中任何所熟知的載體可被使用。一般使用之載體的實例可包括天然發生或重組質體、黏接質體(cosmids)、病毒,及噬菌體(bacteriophages)。舉例而言,pWE15、M13、
MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A及類似者可被使用作為噬菌體載體或黏接質體載體;且基於pBR(pBR-based)、基於pUC、基於pBluescriptII、基於pGEM、基於pTZ、基於pCL、基於pSK、基於pSKH,及基於pET之載體可被使用作為質體載體。具體而言,pCL、pDC、pDCM2、pSK、pSKH130、pDZ、pACYC177、pACYC184、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC及其他載體可被使用。
舉例而言,編碼該目標多肽之該多核苷酸可通過用以進行細胞中之染色體插入的載體而被插入至染色體中。將該多核苷酸插入至染色體中可藉由所屬技術領域中任何已知方法而進行,舉例而言,同源重組,但不限於此。該載體可進一步包括一選擇標記(selection marker)用於確認染色體中的插入。選擇標記係用以選擇以該載體轉化之細胞,即,用以確認該目標核酸分子是否已被插入,且給予可選擇之表型(phenotype),諸如抗藥性、營養缺陷性(auxotrophy)、對細胞毒劑的抗性,或表面多肽之表現的標記可被使用。在經選擇性試劑處理的環境下,只有表現該選擇標記的細胞可存活或表現不同表型,藉此得以選擇經轉化的細胞。
如此處所使用的,「轉化作用(transformation)」之用語是表示包括編碼目標多肽之多核苷酸的載體被導入至宿主細胞或微生物中,藉此允許由該多核苷酸所編碼的多肽被表現於該宿主細胞中。只要經轉化的多核苷酸可於該宿主細胞中表現,其可包括任何一種多核苷酸,無論該多核苷酸是否被插入且位於該宿主細胞的染色體中或位於該染色體外。另外,該多核苷酸包括編碼該目標蛋白之DNA及/或RNA。只要可被導入至宿主細胞中並在其中被表現,該多核苷酸可以任何形式導入。舉例而言,該多核苷酸可以表現匣(expression cassette)的形式被導入至宿主細胞中,該表現匣係包括對於自我表現(self-expression)為必須的所有元素的基因建構(gene construct)。該表現匣一般可包
括可操作地連結至該多核苷酸的啟動子、轉錄終止訊號、核醣體結合位置,及轉譯終止訊號。該表現匣可呈得以自我複製之表現載體的形式。另外,該多核苷酸可以其自身的形式被導入至宿主細胞,以可操作地連結至對於在宿主細胞中之表現所需的序列,但不限於此。
如以上所使用的,該用語「可操作地連結(operably linked)」是指該多肽序列及一啟動子序列之間的功能性連結(functional linkage),用以起始及調解(mediating)編碼本發明之目標蛋白之該多核苷酸的轉錄。
根據本發明的再另一態樣,提供包含一MdtH變異體或編碼該變異體的多核苷酸之大腸桿菌(Escherichia)屬之微生物,該變異體中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以另一胺基酸取代。
本發明之該菌株可包括本發明之經修飾的多肽、編碼該多肽的多核苷酸,及/或包括本發明之該多核苷酸的載體。
該變異體、多核苷酸,及載體是如上所述。
此處所使用的用語「微生物(或菌株)」涵蓋所有的野生種微生物,或具有自然發生或人工基因修飾的微生物,且是指其中由於外源基因(exogenous gene)之插入或一內生基因的活性被增強或去活化,而特定機制被弱化或增強的微生物,其中該微生物可具有用於生產目標多肽、蛋白或產物的基因修飾。
本發明之菌株可為:包含本發明之該變異體、本發明之該多核苷酸,及包括本發明之該多核苷酸的載體之至少一者的菌株;被修飾以表現本發明之變異體或本發明之多核苷酸的菌株;表現本發明之變異體或本發明之多核苷酸的菌株(例如,重組菌株);或具有本發明之變異體活性的菌株(例如,重組菌株),但不限於此。
本發明之該菌株可為具有OPS輸出能力的菌株。
本發明之該菌株可為原先具有MdtH或OPS輸出能力的微生物,或藉由將本發明之該變異體或編碼該變異體之多核苷酸(或包括該多核苷酸之載體)導入不具有MdtH或OPS輸出能力之母株而獲得的微生物,及/或被賦予OPS輸出能力的微生物,但不限於此。
舉例而言,本發明的菌株為細胞或微生物,其是以包含本發明之多核苷酸或編碼本發明之變異體之多核苷酸的載體轉化以表現本發明之該變異體,且為了本發明之目的,本發明之菌株可包括能夠輸出OPS的所有微生物,包括本發明之變異體。舉例而言,本發明之菌株可為藉由導入編碼本發明之變異體的多核苷酸至自然存在之野生種微生物或輸出OPS之微生物,通過表現該MdtH變異體而具有經增加之OPS輸出能力的重組菌株。具有經增加之OPS輸出能力的重組菌株可為其中相較於自然存在之野生種微生物或一非MdtH修飾之微生物(即,表現野生種MdtH(SEQ ID NO:1)之微生物或不表現該經修飾之蛋白(SEQ ID NO:2或3)之微生物),OPS輸出能力經增加之微生物,但不限於此。舉例而言,該非MdtH修飾微生物,其為用於比較OPS輸出能力之增加的目標菌株,可為CA07-0012(KCCM11121P,歐洲發明專利公告案第EP2444481號或美國發明專利申請公開案第2012-0190081號),其為具有對磷絲胺酸磷酸化酶(serB)之內生活性經弱化的菌株,但不限於此。
舉例而言,由於增加之OPS輸出能力而具有增加之OPS生產能力的重組菌株可具有與修飾前之母株或未經修飾之微生物的OPS生產能力相比,經增加至少約1%、具體而言至少約1%、至少約2.5%、至少約5%、至少約7.5%、至少約10%、至少約12.5%、至少約15%、至少約17.5%、至少約20%、至少約22.5%、至少約25%、至少約27.5%、至少約30%、至少約32.5%、至少約35%、至少約37.5%、至少約40%、至少約42.5%、至少約45%、至少約47.5%、至少約50%、至少約52.5%、
至少約55%、至少約57.5%、至少約60%、至少約62.5%、至少約65%、至少約67.5%;至少約70%、至少約72.5%、至少約75%、至少約77.5%、至少約80%、至少約82.5%、至少約90%、至少約92.5%、至少約95%、至少約97.5%、至少約100%、至少約102.5%、至少約105%、至少約107.5%、至少約110%、至少約112.5%、至少約115%、至少約117.5%、至少約120%、至少約122.5%、至少約125%、至少約127.5%、至少約130%、至少約132.5%、至少約135%、至少約137%(上限並未特別限制,且該上限可為,舉例而言,最高約300%、最高約200%、最高約150%、最高約100%、最高約50%、最高約40%、或最高約30%)之OPS生產能力,但該OPS生能產力並未限制於此,只要與修飾前之母株或未經修飾之微生物之生產能力相比,其增加為正值。在另一實施例中,由於經增加之OPS輸出能力而具有經增加之OPS生產能力的重組菌株可具有與修飾前之母株或未經修飾之微生物的OPS生產能力相比,經增加至少約1.01倍、至少約1.025倍、至少約1.05倍、至少約1.075倍、至少約1.10倍、至少約1.125倍、至少約1.15倍、至少約1.175倍、至少約1.20倍、至少約1.225倍、至少約1.25倍、至少約1.275倍、至少約1.30倍、至少約1.352倍、至少約1.35倍、至少約1.375倍、至少約1.50倍、至少約1.525倍、至少約1.55倍、至少約1.60倍、至少約1.625倍、至少約1.65倍、至少約1.675倍、至少約1.70倍、至少約1.725倍、至少約1.75倍、至少約1.775倍、至少約1.8倍、至少約1.825倍、至少約1.85倍、至少約1.875倍、至少約1.90倍、至少約1.925倍、至少約1.95倍、至少約1.975倍、至少約2.0倍、至少約2.025倍、至少約2.05倍、至少約2.075倍、至少約2.10倍、至少約2.125倍、至少約2.15倍、至少約2.175倍、至少約2.20倍、至少約2.225倍、至少約2.25倍、至少約2.275倍、至少約2.30倍、至少約2.325倍、至少約2.35倍,或至少約2.37倍(上限並不特別受限,且該上限可為,舉例而言,最多約10倍、最多約5倍、最多約3倍,獲最多約2倍)之OPS生產能力,但不限於此。此處所使用之用語「約」是指包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1
之範圍,及類似者,且因此包括此用語後所敘述者的相同或相似範圍中的所有數值,但不限於此。
此處所使用之用語「未經修飾之微生物」可指野生種菌株或本身自然存在之菌株,或在由於由自然或人工原因導致之基因修飾而改變特徵前的菌株,不排除包含微生物中自然發生突變的菌株。舉例而言,該未經修飾之微生物可指其中此處所述之MdtH變異體未被導入或在該MdtH變異體被導入之前的菌株。該「未修飾之微生物」可與「修飾前之菌株」、「修飾前之微生物」、「未突變菌株」、「未經修飾之菌株」、「未修飾之微生物」或「參考微生物」互換使用。
作為本發明再另一實例,只要其可生產OPS,本發明之微生物並未特別受限於其種類,且本發明之微生物可為原核細胞(prokaryotic cell)或真核細胞(eukaryotic cell),且特別是原核細胞。原核細胞的實例可包括屬於大腸桿菌屬、伊文氏桿菌(Erwinia)屬、鋸桿菌(Serratia)屬、普羅威登斯(Providencia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬及短桿菌(Brevibacterium)屬的微生物菌株,且原核細胞可具體而言為屬於大腸桿菌屬的微生物,更具體而言為大腸桿菌,但不限於此。
特別是,本發明之大腸桿菌屬之微生物可通過SerA、SerC及SerB生產OPS及左旋絲胺酸,SerA、SerC及SerB為左旋絲胺酸之生物合成途徑的酵素(Ahmed Zahoor,Computational and structural biotechnology journal,Vol.3,2012 October;Wendisch V.F.et al.,Curr Opin Microbiol.2006 Jun;9(3):268-74;及Peters-Wendisch P.et al.,Appl Environ Microbiol.2005 Nov;71(11):7139-44)。SerB為磷絲胺酸磷酸酶,具有將OPS轉化成左旋絲胺酸的活性,因此被修飾以具有SerB之弱化活性的微生物具有累積OPS的特性且因此使用在OPS的生產中為有益的。舉
例而言,本發明的微生物可為與其內生活性相比,除了導入本發明之該變異體,具有進一步弱化之SerB活性的重組微生物。
本發明之SerB可為具有或包含敘述於NCBI存取碼AAC77341.1之胺基酸序列的蛋白,或(實質上)由敘述於AAC77341.1之胺基酸序列所組成的蛋白,但不限於此。另外,本發明之SerB可具有或包含與敘述於AAC77341.1中之胺基酸序列至少70%、80%、90%、95%或99%之同源性或相等性的胺基酸序列,只要本發明之SerB展現將OPS轉化成左旋絲胺酸的活性。另外,本發明之SerB可(實質上)由與敘述於AAC77341.1中之胺基酸序列至少70%、80%、90%、95%或99%之同源性或相等性的胺基酸序列所組成,但不限於此。
再者,編碼本發明之SerB之多核苷酸可具有或包含敘述於NCBI NP_415583.4中之胺基酸序列。編碼本發明之SerB的多核苷酸可具有或包含與NP_415583.4之核苷酸序列至少70%、80%、90%、95%或99%,及少於100%的同源性或相等性的胺基酸序列。另外,編碼本發明之SerB之多核苷酸可(實質上)由與NP_415583.4之核苷酸序列至少70%、80%、90%、95%或99%,及少於100%的同源性或相等性的胺基酸序列所組成,但不限於此。
如此處所使用的一多肽之活性的「增強」之該用語是指與其內生活性(endogenous activity)相比,多肽之活性的增加。該增強可與活化(activation)、上調(up-regulation)、過度表現(overexpression)、增加(increase)及類似者互換使用。該活化、增強、上調、過度表現及增加可包括下列所有者:表現原先並未擁有的活性,或表現與內生活性或修飾前之活性相比,經改善的活性。該「內生活性」是指特定多肽之母株在其特徵改變前所原先擁有的活性,或當由於自然或人工因素而導致之基因修飾而特徵改變的未經修飾之微生物。此用語可與「修飾前活性」互換使用。與多肽之內生活性相比,多肽之活性之該「增強」、「上
調」、「過度表現」,或「增加」係表示特定多肽之由母株在其特徵改變前原先所擁有,或未經修飾之微生物原先所擁有的該活性及/或濃度(表現等級)的改善。
該增強可藉由導入外源多肽或通過該多肽之固有活性及/或其濃度(表現等級)之增強而達成。該多肽之活性的增強可藉由對應之多肽的活性程度或表現等級之增加,或自對應之多肽所生產之產物的量而辨認。
該多肽之活性的增強可藉由應用本技術領域中所熟知的各種方法達成,且與修飾前之微生物相比,只要該方法可增強目標多肽之活性,其並未受限制。具體而言,所屬技術領域中具有通常知識者所熟知為分子生物學之例行方法的基因工程及/或蛋白工程可被使用,但不限於此(例如,Sitnicka et al.,Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16,Sambrook et al.,Molecular Cloning 2012,等)。
具體而言,本發明之多肽的活性之增強可為:1)增加編碼該多肽之多核苷酸的細胞內複製數(intracellular copy number);2)對編碼該多肽之染色體上的基因表現控制區域進行修飾;3)對編碼該起始密碼子之核苷酸序列或編碼該多肽之基因轉錄的5'-UTR區的修飾;4)對該多肽之胺基酸序列的修飾,以增強該多肽之活性;5)對編碼該多肽之該多核苷酸序列的修飾,以增強該多肽之活性(例如,對該多肽基因之該多核苷酸序列的修飾,以編碼一多肽使被修飾以增強該多肽之活性);6)導入表現該多肽之活性之一外源多肽或編碼其之一外源多肽;
7)編碼該多肽之該多核苷酸的密碼子最佳化(codon optimization);8)由該多肽之三級結構分析而選擇之一暴露位置的修飾或化學修飾;或9)選自第1)至8)項之二或多者之組合,但不特別限於此。
更具體而言,這些項目是如下所述。
第1)項中增加編碼多肽之多核苷酸的細胞內複製數可藉由將一載體(vector)導入至宿主細胞而達成,其中編碼該對應之多肽的多核苷酸被可操作地連結至該載體,且該載體可獨立於宿主複製及運作。或者是,第1)項的增加可藉由導入編碼對應之多肽的多核苷酸的一份複製或二或更多份複製至宿主細胞中的染色體中而達成。染色體中的導入可藉由將能夠把該多核苷酸插入至宿主細胞中之該染色體中的載體導入宿主細胞中而進行,但不限於此。該載體是如上所述。
第2)項中之對編碼該多肽之染色體上的基因表現控制區域(或基因控制序列)進行之修飾可為,例如,通過刪除、插入、非保留或保留取代,或其等之組合而在序列中發生之修飾,或以具有較強活性之序列進行取代或插入,用以進一步增強該表現控制區域的活性。該表現控制區域可包括,但不特別限於,一啟動子(promoter)、一操作子序列、編碼一核醣體結合位置(ribosome binding site)之序列、控制轉錄及轉譯之終止的序列,及類似者。舉例而言,該取代可為以較強啟動子取代原始啟動子,但不限於此。
較強啟動子之已知實例可為CJ1至CJ7啟動子(美國發明專利第7662943 B2號)、乳糖啟動子(lac promoter)、色胺酸啟動子(trp promoter)、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體PR啟動子(lambda phage PR promoter)、PL啟動子、tet啟動子、gapA啟動子、SPL7啟動子、SPL13(sm3)啟動子(美國發明專
利第10584338 B2號)、O2啟動子(美國發明專利第10273491 B2號)、tkt啟動子、yccA啟動子,及類似者,但不限於此。
第3)項中之編碼該起始密碼子之核苷酸序列或編碼多肽之基因轉錄的5’-UTR區域的修飾可為,例如,以編碼另一具有多肽之較高表現率的起始密碼子而非內生起始密碼子之核苷酸序列進行取代,但不限於此。
第4)及5)項中之胺基酸序列或多核苷酸序列之修飾可為通過該多肽之胺基酸序列或編碼該多肽之該多核苷酸序列中之刪除、插入、非保留或保留取代,或其等之組合而發生在該序列之修飾,或以被修飾以具有較強活性之胺基酸序列或多核苷酸序列,或被修飾以具有經增加之活性的胺基酸序列或多核苷酸序列進行取代,使得該多肽的活性增強,但不限於此。具體而言,該取代可藉由通過同源重組將多核苷酸插入至染色體而進行,但不限於此。此處所使用之載體可進一步包括一選擇標記用於確認染色體中的插入。該選擇標記是如上所述。
第6)項中之表現該多肽之活性的外源多肽之導入可為將編碼表現與該多肽相等/相似活性之多肽的外源多核苷酸導入宿主細胞。該外源多核苷酸並不限於其起源或序列,只要該外源多核苷酸表現與該多核苷酸相等/相似之活性。該導入可藉由由所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇的已知轉化方法而進行,且通過該經導入之多核苷酸在宿主細胞中的表現,該多肽可被生產,且其活性可被增強。
第7)項中的編碼該多肽之該多核苷酸的密碼子最佳化可為一內源多核苷酸(endogenous polynucleotide)的密碼子最佳化,用以增加其在一宿主細胞中的轉錄或轉譯,或一外源多核苷酸(exogenous polynucleotide)的密碼子最佳化,用以在一宿主細胞中達到其最佳化的轉錄或轉譯。
第8)項中之由該多肽之三級結構分析而選擇之暴露位置的修飾或化學修飾可為,例如,將欲加以分析之多肽的序列資訊與已儲存基底蛋白之序列
資訊的資料庫比對以根據序列相似性之等級而決定模板蛋白候選者,接著辨識該等候選者之基礎上的結構藉以選擇將被修飾或化學修飾之暴露位置,然後該暴露位置被進行修飾或被進行化學修飾。
該多肽之活性的增強可表示與表現於野生種微生物菌株或修飾前之微生物中之多肽的活性或濃度相比,對應之多肽的活性、濃度或表現等級之增加,或自所對應之多肽而生產之產物量的增加,但不限於此。
此處所使用之多肽活性的「弱化」之用語具有包括所有與該內生活性相比之降低或不存在(absence)之活性的概念。該弱化可與去活化(inactivation)、缺少(deficiency)、下調(down-regulation)、減低、減少、衰減(attenuation)或類似者互換使用。
該弱化亦可包括:其中與由微生物所原始具有之多肽的活性相比,由於編碼該多肽之多核苷酸之修飾或類似者所致之多肽本身之活性降低或去除的情形;其中與原生菌株相比,由於抑制編碼該多肽之多核苷酸的基因表現,或抑制轉譯成多肽所致之細胞中之該整個多肽的活性及/或濃度(表現等級)較低的情形;其中該多核苷酸的表現並未進行的情形;及/或其中即使該多核苷酸的表現,該多肽不具有活性的情形。該「內生活性」是指當由於自然或人工因素而導致之基因修飾而造成其特徵改變前的母株或野生種或未經修飾之微生物所原先擁有的特定多肽之活性。此用語可與「修飾前活性」互換使用。與該內生活性相比,多肽之活性的該「去活化」、「缺陷」、「減少」、「下調」、「減低」或「衰減」是指與在其特徵改變前之母株或未經修飾之微生物原始具有的特定多肽之活性相比,該多肽之活性被降低。
該多肽之活性的弱化可藉由本領域中所熟知的任何方法達成,但不限於此,且可藉由應用本領域中已知的各種方法(例如,Nakashima N et al.,
Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014;15(2):2773-2793,Sambrook et al.,Molecular Cloning 2012等)達成。
具體而言,本發明之多肽的弱化可為:
1)編碼該多肽之基因的部分或整體之刪除;
2)對表現控制區域(或表現控制序列)之修飾,以降低編碼該多肽之基因的表現;
3)對構成該多肽之胺基酸序列的修飾,以消除或弱化該多肽之活性(例如,在該胺基酸序列上的至少一胺基酸之刪除/取代/添加)。
4)對編碼該多核苷酸之基因序列的修飾,以消除或弱化該多肽之活性(例如,該多肽基因之核酸核苷酸序列上的至少一核酸核苷酸之刪除/取代/添加以編碼該多肽使被修飾以消除或弱化該多肽之活性);
5)對編碼該起始密碼子的核苷酸序列或編碼該多肽之基因轉譯的5’-UTR區域之修飾;
6)互補地結合至編碼該多肽之基因轉錄之反股寡核苷酸(antisense oligonucleotide,例如,反股RNA)的導入;
7)與編碼該多肽之基因的夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno sequence)互補之序列在該夏因-達爾加諾序列上游的添加,以形成使核醣體之附接(attachment)無法達成的二級結構;
8)反轉錄啟動子在編碼該多肽之基因序列的該開讀框(open reading frame,ORF)之3’端的添加(反轉錄工程,RTE);或
9)選自第1)至8)項之二或多者之組合,但不特別限於此。
舉例而言,這些項目是如下所述。
第1)項中之編碼該多肽之基因的部分或整體刪除可為編碼該染色體中之內生目標蛋白的多核苷酸之整體的消除、以刪除一些核苷酸之多核苷酸進行取代,或以標記基因進行取代。
第2)項中之對表現控制區域(或表現控制序列)的修飾可為在表現控制區域(或表現控制序列)上通過刪除、插入、非保留取代或保留取代或其等之組合而發生的修飾,或以具有較弱活性之序列進行取代。該表現控制區域包括啟動子、操作子序列、用於編碼核醣體結合位置的序列,及用以控制轉錄及轉譯之終止的序列,但不限於此。
第5)項中之編碼該起始密碼子之核苷酸序列或編碼多肽之基因轉錄的5’-UTR區域的修飾可為,例如,以編碼另一具有多肽之較低表現率的起始密碼子而非內生起始密碼子之核苷酸序列進行取代,但不限於此。
第3)及4)項中之對胺基酸序列或多核苷酸序列的修飾可為通過該多肽之胺基酸序列或編碼該多肽之該多核苷酸序列中之刪除、插入、非保留或保留取代,或其等之組合而在該序列上進行修飾,或以被修飾以具有較弱活性之胺基酸序列或多核苷酸序列或被修飾以不具有活性之胺基酸序列或多核苷酸序列進行取代,以弱化該多肽之活性,但不限於此。舉例而言,該基因之表現可藉由導入修飾至該多核苷酸序列中以形成一終止密碼子而被抑制或弱化。
第6)項中之導入互補地結合至編碼該多肽之基因轉錄的反股寡核苷酸(例如,反股RNA)可參照參考文獻,例如,Weintraub,H.et al.,Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986。
第7)項中之與編碼該多肽之基因的夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno sequence)互補之序列在該夏因-達爾加諾序列上游的添加,以形成使核醣體之附接無法達成的二級結構可使mRNA轉譯無法進行或減低其速率。
第8)項中之反轉錄啟動子在編碼該多肽之基因序列的該開讀框(ORF)之3’端的添加(反轉錄工程,RTE)可為與編碼該多肽之基因的轉錄互補之一反股核苷酸的製備,藉此弱化該多肽的活性。
本發明之微生物中的該多核苷酸之部分或整體的修飾可由下列誘發:(a)使用用於將染色體插入微生物中之載體,採用同源重組或工程化基因酶(engineered nuclease,例如CRISPR-Cas9)的基因編輯,及/或(b)以光,諸如紫外光及輻射,及/或化學品處理,但不限於此。修飾該基因之部分或整體的方法可包括藉由DNA重組技術而進行之方法。舉例而言,核苷酸序列或包含對目標基因同源之核苷酸序列的載體可被注入微生物中以實現同源重組,造成該基因之部分或整體的刪除。將被注入之該核苷酸序列或載體包括一優勢選擇標記(dominant selection marker),但不限於此。
另外,該微生物可為進一步具有將OPS導入細胞或降解OPS之能力的降低之微生物。
對於上述生產OPS之微生物,歐洲發明專利公告案第EP2444481號或美國發明專利申請公開案第2012-0190081號之揭露內容可用作本發明的參考材料,但不限於此。
在本發明之微生物中,該變異體、多核苷酸、OPS及類似者是如於其他態樣中所敘述者。
根據本發明的再另一態樣,提供用以生產O-磷絲胺酸的方法,該方法包括在一培養基中培養包含一MdtH變異體或編碼該變異體之一多核苷酸的微生物,該變異體中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以另一胺基酸取代。
本發明之該OPS生產方法可包括於一培養基中培養包含本發明之變異體、本發明之多核苷酸,或本發明之載體的微生物。
此處所使用的用語「培養」是指在經過適當調整的環境條件中使本發明之該微生物生長。本發明之該培養程序可根據本技術領域中所知的適當之培養基或培養條件而進行。此培養程序可由所屬技術領域中具有通常知識者依據所選擇之菌株輕易調整及使用。具體而言,該培養可為批次型式、連續型式,及/或進料-批次型式(fed-batch)之培養,但不限於此。
如此處所使用之用語「培養基」是指包含用於本發明之該微生物之培養為必須的營養物質做為主要成分之混合物,其中該培養基供應營養物質、生長因子及類似者,包括對於存活及生長為必要的水。具體而言,做為用於培養本發明之微生物的培養基及其它培養條件,任何用於常見的微生物培養之培養基可被使用而不特別限制。然而,本發明之該等微生物可在包含適當碳源、氮源、磷源、無機化合物、胺基酸,及/或維他命的一般培養基中,在好氧條件下,於經調整之溫度、pH值及類似者下被培養。
被包含於培養基中的碳源之實例可包括:醣類及碳水化合物,諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉及纖維素;油類及脂肪諸如大豆油、葵花油、蓖麻油,及椰子油;脂肪酸諸如棕櫚酸、硬酯酸,及亞麻油酸;醇類諸如甘油及乙醇;及有機酸諸如醋酸。這些材料可被單獨使用或以其組合使用,但不限於此。
被包含於培養基中之氮源的實例可包括:有機氮源諸如蛋白腖(peptone)、酵母萃取、肉汁(gravy)、麥芽精(malt extract)、玉米浸液(corn steep liquor)及大豆粉(bean flour);及無機氮源諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸胺、碳酸胺及硝酸銨。這些氮源可被單獨使用或以其組合使用,但不限於此。
作為被包含於培養基中的磷源可包括磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate)、磷酸氫二鉀(dipotassium hydrogen phosphate),及對應其等的含鈉之鹽類,但不限於此。
培養基可包括金屬鹽,諸如硫酸鎂或硫酸鐵,且可進一步包含胺基酸、維生素,及適當的前驅物。該等培養基或前驅物可被以批次培養或連續培養的形式添加至培養物(cultures),但不限於此。
該培養物之pH值可藉由在培養期間以合適方式添加化合物,諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸及硫酸至該培養物而調整。另外,諸如脂肪酸聚乙二醇酯(fatty acid polyglycol ester)的消泡劑(antifoaming agent)可被添加以抑制泡沫形成。另外,氧氣或含氧氣體可被注入該培養基以維持該培養基的好氧狀態(aerobic state),或是,為了維持該培養基的厭氧(anaerobic)或非好氧(non-aerobic)狀態,可不注入氣體,或注入氮氣、氫氣或二氧化碳,但不限於此。
在本發明的培養中,培養溫度可被維持於自20℃至45℃,且具體而言自30℃至35℃,且培養期間可持續進行直到所欲之有用物質的生產可被獲得,且具體而言可為10小時至100小時。然而,該培養溫度及培養期間不限於此。
由本發明之培養所生產的OPS可被釋放至培養基中。
本發明之OPS生產方法可進一步包括,舉例而言,在培養步驟之前或之後,製備本發明之微生物、製備用以培養該微生物之培養基,或其等之組合(無論其順序,以任何順序進行)。
本發明之OPS生產方法可進一步包括自藉由培養所得之培養基(於其中已進行培養之培養基)或本發明之微生物回收OPS。該方法可進一步包括在該培養步驟後的回收步驟。
回收OPS的方法可為藉由使用所屬技術領域中已知的適當方法、根據本發明之培養微生物的方法收集所欲的OPS,例如,以批次、連續或進料批次培養方法進行。舉例而言,離心、過濾、以結晶蛋白沉澱劑處理(鹽析,salting-out)、萃取、超音波破碎(ultrasonic disruption)、超音波過濾、透析、各種類型之管柱層析,諸如分子篩管柱層析(膠體過濾)、吸附管柱層析、離子交換管柱層析,親和力層析術、HPLC,及此等方法的組合可被使用,且所欲的OPS可自該培養基或微生物藉由使用本領域中已知的合適方法回收。
本發明之OPS生產方法可進一步包括純化步驟。該純化可藉由使用所屬技術領域中已知的適當方法進行。於一實例中,當本發明之OPS生產方法同時包括回收步驟及純化步驟,該回收步驟及該純化步驟可不論順序地連續或不連續進行,或可同步或整合於一步驟中進行,但不限於此。
於本發明的方法中,該變異體、多核苷酸、載體、菌株,及類似者係如於其他態樣中敘述者。
根據本發明的再另一態樣,提供用於生產半胱胺酸或其衍生物的方法。
具體而言,該方法可包括:a)在一培養基中培養包含一MdtH變異體或編碼該變異體之一多核苷酸的一微生物,該MdtH變異體中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以另一胺基酸取代,藉此生產O-磷絲胺酸或包含該O-磷絲胺酸的培養基;以及b)將一硫化物與O-磷絲胺酸巰基化酶(OPSS)或表現OPSS之微生物,以及步驟a)中生產之O-磷絲胺酸或包含O-磷絲胺酸之培養基反應。
此處所使用的用語「衍生物」是指由化學修飾特定化合物之一部分而獲得的相似化合物,且通常該用語是指其中氫原子或特定原子團被以另一氫原子或原子團所取代的化合物。
如此處所使用的,用語「半胱胺酸衍生物」是指半胱胺酸中之氫原子或特定原子團被以另一原子或原子團取代的化合物。舉例而言,半胱胺酸衍生物可具有半胱胺酸中之胺基(-NH2)之氮原子或硫醇基(thiol group,-SH)之硫原子具有連接於其的另一原子或原子團的形式。半胱胺酸衍生物的實例包括NAC(N-acetylcysteine,N-乙醯基半胱胺酸)、S-羧甲基半胱氨酸(S-carboxymethylcysteine,SCMC)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-胺基-2-羧乙基)-L-同半胱胺酸((R)-S-(2-amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine)、(R)-2-胺基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4-(乙硫基)丁酸、3-亞硫基-L-丙胺酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-半胱胺酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱胺酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱胺酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱胺酸等,但不限於此。
只要半胱胺酸根據本發明之方法生產,成為各種半胱胺酸衍生物之轉化可藉由所屬技術領域中熟知的方法輕易達成。
具體而言,生產半胱胺酸衍生物的方法可進一步包括將步驟b)中所生產之半胱胺酸轉化成半胱胺酸衍生物。舉例而言,半胱胺酸可與乙醯化劑(acetylation agent)進行反應而合成為N-乙醯半胱胺酸(NAC),或半胱胺酸可與鹵化乙酸在鹼性條件下進行反應而合成為S-羧甲基半胱氨酸(SCMC),但不限於此。
這些半胱胺酸衍生物主要使用作為鎮咳劑(antitussive agents)、止咳劑(cough-relieving agents)及對於氣管炎(bronchitis)、支氣管性氣喘
(bronchial asthma)、咽喉炎(laryngopharyngitis)及類似者等之治療劑的藥學原料。
如此處所使用的,該用語「O-磷絲胺酸巰基化酶(OPSS)」是指催化將一硫醇基(SH基)提供給OPS而將OPS轉化成半胱胺酸之反應的酵素。該酵素可為已首先於Aeropymm pernix,Mycobacterium tuberculosis,Mycobacterium megmatics,Trichomonas vaginalis(Mino,K.and Ishikawa,K.,FEBSletters,551:133-138,2003;及Burns,K.E.et al.,J.Am.Chem Soc.,127:11602-11603,2005)中發現者。另外,該OPSS不僅包括野生種OPSS蛋白,亦包括包含編碼該OPSS之多核苷酸序列中的一部分之刪除、取代,或添加的變異體蛋白,並顯示與野生種OPSS蛋白之生物活性相等或更高之活性,且可包括揭露於歐洲發明專利公告案第2444481號及美國發明專利申請公開案第9127324號中之所有OPSS蛋白及其等之變異體蛋白。
該硫化物可為任何硫化物,其不僅是以本技術領域中通常使用的固體形式提供,基於不同的pH值、壓力及溶解度,亦可以液體或氣體形式提供,且因此可被轉化成呈例如硫化物(S2-)或硫代硫化物(S2O3 2-)之形式的巰基(SH)基團。具體而言,可將巰基基團提供至OPS之Na2S、NaSH、H2S、(NH4)2S、NaSH及Na2S2O3可被使用,但不限於此。在反應中,單一巰基基團被提供至單一反應性OPS基團以生產單一半胱胺酸或其衍生物。於此反應中,被添加之硫化物的量可為OPS之莫耳濃度的0.1至3倍,具體而言1至2倍,但不限於此。
另外,本發明可進一步包括回收通過反應步驟所生產之半胱胺酸。所欲的半胱胺酸可藉由使用本技術領域中合適之已知反應自反應溶液分離及純化而回收。
根據本發明的再另一態樣,提供用以生產OPS的組成物,該組成物包括:包含其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125之胺基酸被以另一胺基酸所取代之MdtH變異體,或編碼該變異體之多核苷酸的微生物;用於培養該微生物的培養基;或其等之二或多者的組合。
本發明之該組成物可進一步包含一般用於用以生產OPS之組成物中的合適之賦形劑,且賦形劑的實例可為一防腐劑、一濕潤劑、一分散劑、一懸浮劑、一緩衝劑、一穩定劑,或一等滲劑(isotonic agent),但不限於此。
在本發明的組成物中,變異體、多核苷酸、載體、菌株、培養基、OPS及類似者是如其他態樣中所述者。
根據本發明的再另一態樣,提供展現本發明之OPS輸出活性的經修飾之多肽用於生產OPS、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物的用途。
根據本發明的再另一態樣,提供具有展現本發明之OPS輸出活性之經修飾之多肽的多肽用於自微生物輸出OPS的用途。
在本發明的該等用途中,變異體、多核苷酸、載體、菌株、培養基、OPS及類似者是如其他態樣中所述者。
藉由使用本發明之具有OPS輸出活性的新穎變異體多肽而具有OPS生產能力的微生物之培養物與現有之未修飾或變異體蛋白的使用相比,可在高產率下生產OPS。
此後,本發明將參考實例詳細敘述。然而,這些實例僅為用於說明本發明的較佳實施例,且因此並非意欲限制本發明的權利範圍。同時,此處未述及之技術內容可由本發明所屬技術領域或相似技術領域中具有通常知識者充分了解且輕易實施。
為了選擇具有增加之OPS輸出活性的MdtH變異體,一mdtH基因變異體質體庫被建構。具體程序是如下所述。
任一種誘變(mutagenesis)PCR使用SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10(引子3及8)之引子對進行,同時E.coli K12 W3110(Genbank:NC_007779.1)之基因DNA被用作模版(Takara Diversify PCR random mutagenesis kit,Cat.No.630703)。
PCR是以94℃下5分鐘之變性作用、94℃下30秒之變性作用的20個循環、55℃下30秒之退火,及72℃下1分鐘之延伸作用(extending),且接著72℃下5分鐘之延伸作用而進行。
為了導入通過此程序所製備之突變基因片段至具有該trc啟動子的該pCL1920載體(GenBank No.AB236930),pCL_Ptrc被首先製備。為了確保trc啟動子片段,PCR使用SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8(引子1及2)之引子對進行。PCR是以94℃下5分鐘之變性作用、94℃下30秒之變性作用的30個循環、55℃下30秒之退火,及72℃下1分鐘之延伸作用,且接著72℃下5分鐘之延伸作用而進行。
此處使用之引子序列如下表1所示。
該trc啟動子片段被複製至該pCL1920載體中,以EcoRI及SalI消化,藉由使用注入複製套組(in-fusion cloning kit,Clontech Laboratories,Inc.),且pCL_Ptrc被確保。被確保之載體pCL_Ptrc被以PstI及EcoRV消化,且接著通過PCR獲得的突變基因片段使用注入複製套組而複製。複製在50℃下進行60分鐘,且通過複製,該pCL_Ptrc-mdtH基因變異體質體庫被建構。
經建構之pCL_Ptrc-mdtH基因突變體質體庫藉由電穿孔法(electroporation)被轉化成CA07-0012(KCCM11121P,歐洲發明專利公告案第EP2444481號或美國發明專利申請公開案第2012-0190081號)。在其等中,兩種包含變異體的菌株被選擇,且質體是自其等獲得,且其等之核苷酸序列經由篩選被分析。
基於核苷酸序列分析的結果,兩種經選擇的變異體被辨識為其中野生種MdtH之胺基酸序列中第125個胺基酸殘基纈胺酸被以異白胺酸取代之變異體[mdtH(V125I)];以及其中第60個胺基酸殘基麩醯胺酸是以精胺酸所取代、第125個胺基酸殘基纈胺酸是以異白胺酸所取代、第180個胺基酸殘基苯丙胺酸是以白胺酸所取代,且第398個胺基酸殘基白胺酸是以脯胺酸取代之變異體[mdtH(Q60R,V125I,F180L,L398P)]。CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(V125I),其為以變異體mdtH(V125I)所轉化之菌株,被命名為E.coli CA07-0379,且CA07-
0012/mdtH(Q60R,V125I,F180L,L398P),其為以變異體mdtH(Q60R,V125I,F180L,L398P)轉化的菌株,被命名為E.coli CA07-0380。
導入MdtH變異體之菌株的OPS生產能力使用下列培養基(表2)評估。
具體而言,對於培養,各菌株被放置在LB固態培養基上,隨著在33℃下於培養器中隔夜培養。在LB固態培養基上隔夜培養的菌株被種於表2之25mL效價培養基(titer medium)中,且在33℃下於培養器中在200rpm下培養48小時。OPS生產能力被評估,且結果顯示於表3中。
結果,CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(V125I),其為導入mdtH(V125I)的菌株,顯示與導入野生種mdtH之菌株的CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH相比,約180%之生產能力。另外,CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(Q60R,V125I,F180L,L398P),其為導入mdtH(Q60R,V125I,F180L,L398P)的菌株,顯示與CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH菌株相比,約237%之生產能力。
CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(V125I)被命名為CA07-0379,而CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(Q60R,V125I,F180L,L398P)被命名為CA07-0380。
從以上說明中,本發明所屬技術領域中具有通常知識者將能夠理解本發明可在不悖離本發明之技術精神或必要特徵下於其他具體形式中實施。因此,以上所述之實施例應被解釋為例示性地而非限制本發明。本發明的範圍應被了解為包括衍生自該等申請專利範圍及其等效範圍之定義及範圍的所有改變或修飾。
<110> CJ第一製糖股份有限公司(CJ CheilJedang Corporation)
<120> 新穎MdtH變異體及藉由使用其生產O-磷絲胺酸及半胱胺酸及半胱胺酸之衍生物的
方法
<130> OPA21270
<150> KR 10-2021-0075859
<151> 2021-06-11
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 402
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> MdtH WT
<210> 2
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MdtH(V125I)
<210> 3
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MdtH(Q60R,V125I,F180L,L398P)
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mdtH(V125I)
<210> 5
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mdtH(Q60R,V125I,F180L,L398P)
<210> 6
<211> 1209
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> mdtH WT
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子1
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子2
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子3
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子4
Claims (19)
- 一種MdtH變異體,其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以異白胺酸取代。
- 如請求項1所述之MdtH變異體,其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置60的胺基酸為精胺酸;SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置180的胺基酸為白胺酸;以及SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置398的胺基酸為脯胺酸。
- 如請求項1所述之MdtH變異體,其中,作為母序列之SEQ ID NO:1所敘述之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸之纈胺酸係以異白胺酸取代。
- 如請求項1所述之MdtH變異體,其中該變異體具有一O-磷絲胺酸輸出活性。
- 如請求項1所述之MdtH變異體,其中該變異體具有與SEQ ID NO:1之胺基酸序列不少於80%且少於100%的序列相等性。
- 如請求項1所述之MdtH變異體,其中該變異體是由敘述於SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之胺基酸序列中的一多肽所構成。
- 如請求項1所述之MdtH變異體,其中該變異體是由經SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之核苷酸序列編碼的一多肽所構成。
- 一種多核苷酸,其編碼請求項1-7中任一項所述之該變異體。
- 一種大腸桿菌之重組微生物,其包含一MdtH變異體,其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以異白胺酸取代,或包含編碼該變異體的一多核苷酸。
- 如請求項9所述之重組微生物,其中在該MdtH變異體中,SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置60的胺基酸為精胺酸;SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置180的胺基酸為白胺酸;以及SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置398的胺基酸為脯胺酸。
- 如請求項9所述之重組微生物,其中該重組微生物進一步具有與其內生活性相比經弱化之磷絲胺酸磷酸酶(SerB)活性。
- 一種用於生產O-磷絲胺酸的方法,該方法包含在一培養基中培養包含一MdtH變異體或編碼該變異體之一多核苷酸的一大腸桿菌之微生物,該MdtH變異體中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以異白胺酸取代。
- 如請求項12所述之方法,其中在該MdtH變異體中,SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置60的胺基酸為精胺酸;SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置180的胺基酸為白胺酸;以及SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置398的胺基酸為脯胺酸。
- 一種用於生產半胱胺酸或其衍生物的方法,該方法包含:a)在一培養基中培養包含一MdtH變異體或編碼該變異體之一多核苷酸的一大腸桿菌之微生物,該MdtH變異體中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以異白胺酸取代,藉此生產O-磷絲胺酸或一包含O-磷絲胺酸的培養基;以及b)將一硫化物與O-磷絲胺酸巰基化酶(OPSS)或表現OPSS之一大腸桿菌之微生物及步驟a)中所生產之O-磷絲胺酸或該包含O-磷絲胺酸的培養基反應。
- 如請求項14所述之方法,其中在該MdtH變異體中,SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置60的胺基酸為精胺酸;SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置180的胺基酸為白胺酸;以及SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置398的胺基酸為脯胺酸。
- 一種MdtH變異體用於生產O-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸之衍生物的用途,其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以異白胺酸取代。
- 如請求項16所述之用途,其中在該MdtH變異體中,SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置60的胺基酸為精胺酸;SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置180的胺基酸為白胺酸;以及SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置398的胺基酸為脯胺酸。
- 一種MdtH變異體用於自一大腸桿菌之微生物分泌O-磷絲胺酸的用途,其中SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置125的胺基酸係以異白胺酸取代。
- 如請求項18所述之用途,其中在該MdtH變異體中,SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置60的胺基酸為精胺酸;SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置180的胺基酸為白胺酸;以及SEQ ID NO:1之胺基酸序列中對應於位置398的胺基酸為脯胺酸。
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