TWI654305B

TWI654305B - 生產ｏ－磷絲胺酸之微生物及使用該微生物生產ｏ－磷絲胺酸或ｌ－半胱胺酸之方法

Info

Publication number: TWI654305B
Application number: TW104126219A
Authority: TW
Inventors: 金率; Sol Kim; 柳寅和; In Hwa YOO; 張眞淑; Jin Sook Chang; 金蕙園; Hye Won Kim
Original assignee: Ｃｊ第一製糖股份有限公司; Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2015-08-12
Publication date: 2019-03-21
Also published as: JP6807976B2; KR101677328B1; RU2663726C1; AR102049A1; UA119985C2; JP2017528126A; KR20160020050A; CN106795485A; US10323262B2; JP2019150038A; WO2016024771A1; EP3181685A1; CN106795485B; ES2753413T3; EP3181685B1; EP3181685A4; TW201612319A; JP6570617B2; US20170260556A1

Abstract

本發明係關於一種微生物，其中，能夠輸出O-磷絲胺酸(OPS)之多肽的活性被提升；以及一種使用該微生物生產O-磷絲胺酸、半胱胺酸、或半胱胺酸衍生物之方法。

Description

生產O-磷絲胺酸之微生物及使用該微生物生產O-磷絲胺酸或L-半胱胺酸之方法

本發明係關於能夠生產O-磷絲胺酸之微生物，以及使用該微生物生產O-磷絲胺酸、半胱胺酸、或半胱胺酸衍生物之方法。

L-半胱胺酸係為在所有活體生物中於硫的代謝扮演重要角色之胺基酸，不僅用於諸如毛髮角質、麩胱甘肽、生物素、甲硫胺酸、及其他含硫代謝物之生物性蛋白質的合成，亦用作輔酶A的生物合成之前驅物。

使用微生物生產L-半胱胺酸之已知方法包含：1)使用微生物將D,L-ATC生物性地轉換為L-半胱胺酸之方法；2)使用大腸桿菌(E.coli)藉由直接發酵而生產L-半胱胺酸之方法(EP0885962B；Wada M and Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73：48-54,2006)；以及3)使用微生物藉由發酵而生產O-磷絲胺酸(以下，"OPS")，並於O-磷絲胺酸硫化氫解酶(O-phosphoserine sulfhydrylase)(以下，"OPSS") 之催化作用下藉由使OPS與硫化物進行反應而將OPS轉換成L-半胱胺酸之方法(韓國專利第1381048號)。特定而言，為了藉由方法3)以高產率生產半胱胺酸，應過量生產前驅物OPS。就此而言，本發明者等人付出巨大的努力以尋找能夠將生產OPS之微生物中所生產之O-磷絲胺酸自細胞中順利地輸出之適當輸出因子。在此等情況下，本發明者等人發現二種新穎的生產OPS之多肽，YhhS及MdtD，並確認可藉由活化該二種多肽而自生產OPS之微生物中有效地輸出OPS，從而完成本發明。

因此，本發明之目的係提供一種生產OPS之微生物，其中，能夠輸出OPS之多肽的活性相較於其內生活性而言被提升。

本發明之另一目的係提供一種生產OPS之方法，其包含：在培養基中培養生產OPS之微生物，並自該生產OPS之微生物或其培養物中分離出OPS。

本發明之又另一目的係提供藉由該多肽而生產或輸出OPS之用途。

本發明之又另一目的係提供一種生產半胱胺酸或其衍生物之方法，其包含：a)在培養基中藉由培養生產OPS之微生物生產OPS，其中能夠輸出OPS之多肽的活性相較於其內生活性而言被提升；以及b)於OPS硫化氫解酶或能夠表現OPS硫化氫解酶之微生物之存在下，使a) 中所生產之OPS或含有其之培養物與硫化物進行反應。

在一態樣中，本發明係提供一種生產OPS之微生物，其中，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列且能夠輸出O-磷絲胺酸之多肽的活性相較於其內生活性而言被提升。

在本文中使用時，術語"O-磷絲胺酸"(以下，"OPS")係指絲胺酸及磷酸之酯，其係許多蛋白質之成分。特定而言，OPS係L-半胱胺酸之前驅物且可於OPS硫化氫解酶(以下記載為"OPSS")之催化作用下藉由與硫化物進行反應而轉換為半胱胺酸(韓國專利第1381048號)。因此，在半胱胺酸生產中增進OPS生產係屬重要因子，因而需要開發能夠自生產OPS之菌種中有效地分泌出細胞內OPS之轉運子。

在本文中使用時，術語"具有輸出O-磷絲胺酸的活性之多肽"係指具有將細胞中之OPS輸出至該細胞外部的活性之膜蛋白，且具體而言可為衍生自大腸桿菌之膜蛋白。於存在過量的OPS之條件下自去除生長抑制之大腸桿菌中鑑定出二種膜蛋白。具體而言，如此所鑑定出有OPS輸出能力之膜蛋白為具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列之YhhS MFS(主要促進子超家族)轉運子、及具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列之YegB MFS轉運子。在本發明中，YegB MFS轉運子可與MdtD交換使用。該蛋白之OPS輸出能力直至在本發明中被首次證實為止並未為人所知。

此外，該多肽可為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列，且可包含但不限於對以上序列具有至少70%，具體而言至少80%，更具體而言至少90%，再更具體而言至少95%的序列同源性之膜蛋白，只要其具有實質上與該多肽相同或相等之OPS輸出能力即可。再者，顯然地該多肽變體，其中，該序列之部分被刪除、修飾、取代、或插入，均應含括在本發明之範疇中，只要其具有此等同源性及OPS輸出能力之胺基酸序列即可。

此外，該顯現出OPS輸出能力之多肽的多核苷酸序列可包含編碼SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示之胺基酸的多核苷酸序列。此外，考慮到基於遺傳密碼簡併性表現該多肽之生物所優選的密碼子，可在不會改變該多肽的胺基酸序列之範疇內對編碼區實行各種修飾。該多核苷酸序列可為SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列，且可包含對此等序列具有至少70%的序列同源性之核苷酸序列，但不限於此。

在本文中使用時，術語"同源性"係指與指定多肽序列或多核苷酸序列一致之程度，並可以百分率表示。在本文中使用時，與指定多肽序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性之同源序列可依據"%同源性"表示。%同源性可使用用於計算諸如評分、一致性、及相似性之參數的標準軟體，即，BLAST 2.0，或藉由透過南方雜交(southern hybridization)實驗比對序列而加以確認，而所限定之適當雜交條件可藉由熟習本技術領域者所知的方法加以決定 (例如，Sambrook et al.,1989，見下文)。

在本發明之例示性具體例中，確認當在能夠生產OPS之微生物中YhhS蛋白(SEQ ID NO：1)或MdtD蛋白(SEQ ID NO：2)的活性被提升時，該微生物顯示出具有優於RhtB蛋白被提升之菌種(韓國專利申請公開案第10-2012-0041115號)(陽性對照組)、或EmrD或YcaD之MFS轉運子的活性被提升之菌種(實驗組)之OPS輸出能力。"RhtB"係由rhtB基因所編碼之膜蛋白，其可輸出高絲胺酸/高絲胺酸內酯。由於已確認在生產OPS之菌種中使RhtB活性提升會增進該菌種中之OPS輸出能力(韓國專利第138104號)，故將其用作陽性對照組。當在生產OPS之菌種中分別使RhtB蛋白之活性以及本發明之YhhS及MdtD蛋白的活性提升時，RhtB蛋白以及本發明之YhhS及MdtD蛋白顯現出優異於RhtB蛋白之OPS輸出能力。此外，術語"EmrD"及"YcaD"係指大腸桿菌之MFS轉運子蛋白，其分別由emrD基因及ycaD基因所編碼。將如同YhhS及MdtD蛋白般屬於MFS轉運子之蛋白的EmrD及YcaD用作實驗組，以便檢驗其他屬於MFS轉運子之蛋白是否亦可顯現出OPS輸出能力。結果，確認了不同於YhhS及MdtD蛋白，EmrD及YcaD蛋白並未顯現出OPS輸出能力。

同時，本發明之多肽具有OPS輸出能力，因而當在具有OPS生產能力之微生物中使該多肽的活性相較於其內生活性而言提升時，便可有效地生產OPS。

在本文中使用時，術語"生產OPS"係不僅指在菌種內生產OPS，亦指將細胞中之OPS輸出至細胞外部，例如至培養基，具體而言，將OPS自細胞內部輸出至外部。

在本文中使用時，術語"內生活性"係指於自然狀態下，即，於未經修飾之狀態下在微生物中多肽的活性狀態。

在本文中使用時，術語"相較於其內生活性而言提升"係指與其保持在自然狀態者相比時，在微生物中多肽的活性增進，且含括在未保持特定多肽的活性之微生物中給予特定多肽的活性之概念。

在本文中使用時，術語"活性提升"，儘管並未特別限定，但不僅指因多肽本身的活性之增進所造成之獲取較原本的功能更高的功效，亦指因內生基因活性之增進、藉由內部或外部因子之內生基因增幅、啟動子之置換、修飾、或突變等所造成之蛋白質的活性之增進。具體而言，活性提升可藉由諸如在細胞中增加編碼該多肽之基因的套數之方法、對編碼該多肽之基因的調控序列進行修飾之方法、以經突變之基因取代染色體上編碼該多肽之基因而增進該多肽的活性之方法、在染色體上編碼該多肽之基因中引入修飾而提升該多肽的活性之方法等方法而施行，但不限於此。可依同樣之方式參照此等提升活性之方法來提升本發明之其他多肽的活性。

在上述中，基因套數的增加，儘管並未特別限定，但可於可操作地連結至載體之狀態、或藉由插入宿主細胞內之染色體中而施行。具體而言，該方法可藉由下列方式實行：將載體引入宿主之細胞中，藉由將編碼本發明之蛋白質之多核苷酸被可操作地連結至宿主細胞，且可與宿主無關地進行複製並作用；或將載體引入宿主細胞中，該多核苷酸被可操作地連結至該載體，其能夠將該多核苷酸插入宿主細胞之染色體中。將該多核苷酸插入染色體中可使用本技術領域中已知的方法施行，例如，藉由同源重組。由於本發明之載體可透過同源重組插入染色體中，故可進一步包含用以確認插入染色體中之選擇標記。選擇標記係用於選擇經轉形之細胞，即，為了確認標的多核苷酸是否已插入，並可使用能夠提供諸如抗藥性、營養需求、對胞毒劑之抗性、及表面蛋白的表現之可選擇性表型之標記，但不限於此。在以選擇劑處理之情況下，僅有能夠表現該選擇標記之細胞可存活或表現其他表型性狀，因而可輕易地選擇經轉形之細胞。

該載體可為包含編碼標的蛋白之多核苷酸的多核苷酸序列之DNA構築體，其被可操作地連結至適宜的調控序列，使得該標的蛋白可在適當的宿主中表現。該調控序列包含能夠起始轉錄作用之啟動子、用於調控轉錄作用之隨機操縱子序列、編碼適宜的mRNA核糖體結合域之序列、以及用於調控轉錄作用及轉譯作用之序列。該載體在轉形至適宜的宿主細胞後，可與宿主基因體無關地進行複製並作用，或可併入宿主基因體本身。

本發明中所使用之載體可不受特別限定，只要該載體在宿主細胞中能夠複製即可，且可使用本技術領域中所知的任何載體。載體之實例可包含天然或重組質體、黏質體、病毒、及噬菌體。舉例而言，可使用pWE15、M13、λ MBL3、λ MBL4、λ IXII、λ ASHII、λ APII、λ t10、λ t11、Charon4A、Charon21A等作為噬菌體載體或黏質體載體；而可使用以pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等為基礎者作為質體載體。具體而言，可使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC載體等。

在本文中使用時，術語“轉形”係指將包含編碼標的蛋白之多核苷酸之載體引入宿主細胞中，從而使該蛋白質所編碼之多核苷酸能夠在宿主細胞中表現之過程。對經轉形之多核苷酸而言，無論其係插入宿主細胞之染色體中以及位於其中或位於染色體外部皆無關緊要，只要其可在宿主細胞中表現即可。此外，該多核苷酸包含編碼該標的蛋白之DNA及RNA。在其可引入宿主細胞中並於其中表現之前提下，該多核苷酸可以任何形式插入。舉例而言，該多核苷酸可以表現卡匣(expression cassette)之形式引入宿主細胞中，其係包含自行表現所需之所有必要元素之基因構築體，但不限於此。表現卡匣習知上可包含可操作地連結至該多核苷酸之啟動子、轉錄作用終止信號、核糖體結合域、以及轉譯作用終止信號。表現卡匣可呈能夠自行複製之表現載體之形式。此外，可將該多核苷酸依原樣引入宿主細胞中，並可操作地連結至其在宿主細胞中表現所必要之序列。

此外，在本文中使用時，術語“可操作地連結”係指在起始及調解該編碼本發明之標的蛋白之多核苷酸的轉錄作用之啟動子序列、與上述基因序列間之功能性連結。

然後，用以增進該多核苷酸的表現之表現調控序列的修飾，儘管並未特別限定，但可藉由透過刪除、插入、保留性取代、非保留性取代、或其組合而在該多核苷酸序列中誘發變異以便進一步提升該表現調控序列的活性；或藉由以具更強烈活性的多核苷酸序列置換該多核苷酸序列而施行。該表現調控序列，儘管並未特別限定，但可包含啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合域之序列、以及用於調控轉錄作用及轉譯作用的終止之序列等。

代替原本的啟動子之強啟動子可連結至該多核苷酸之表現單元的上部末端，但不限於此。已知的強啟動子之實例可包含cj1啟動子(韓國專利第0620092號)、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體PR啟動子、PL啟動子、及tet啟動子。

再者，在染色體上之該多核苷酸序列的修飾，儘管並未特別限定，但可藉由透過刪除、插入、保留性取代、非保留性取代、或其組合而在該多核苷酸序列之表現調控序列上誘發變異以便進一步提升該多核苷酸序列的活性；或藉由以具更強烈活性的經提升之多核苷酸序列置換該多核苷酸序列而施行。

一般而言，該引入及蛋白質活性的提升可使對應蛋白質的活性或濃度相對於野生型蛋白質或其在微生物菌種中的活性或濃度而言增加至少1%、10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%、或500%，最高至1000%或2000%，但不限於此。

在本文中使用時，術語"生產OPS之微生物"係指能夠於其中生產OPS之原核或真核微生物菌種，具體而言，係指藉由遺傳工程能夠於其中聚積OPS之微生物。

在本發明之例示性具體例中，該微生物並不受特別限定，但可為當SEQ ID NO：1或2之多肽的活性提升時可生產OPS之任何原核或真核微生物，具體而言，原核微生物。該微生物之實例可包含屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterrium)及短桿菌屬(Brevibacterium)之微生物菌種。具體而言，該微生物可為大腸桿菌屬之微生物。更具體而言，其可為大腸桿菌。特定而言，大腸桿菌屬或棒狀桿菌屬之微生物可產生OPS及L-絲胺酸，因為其含有SerA、SerC及SerB蛋白，該等蛋白為L-絲胺酸的生物合成路徑之酶(Ahmed Zahoor,Computational and Structural Biotechnology Journal,vol.3,2012 October；Wendisch VF et al.,Curr Opin Microbiol.2006 Jun；9(3)：268-74；Peters-Wendisch P et al.,Appl Environ Microbiol.2005 Nov；71(11)：7139-44)。

此外，在生產OPS之微生物中，磷絲胺酸磷酸酶(phosphoserine phosphatase，SerB)的活性相較於其內生活性而言可進一步減弱。

SerB具有將OPS轉換為L-絲胺酸的活性，因而經修飾成降低SerB活性之微生物具有聚積OPS於其中的特性，因此有用於生產OPS。SerB可為具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列的蛋白質，但不限於此。此外，SerB可包含具有80%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，再更具體而言99%或更高的序列一致性之胺基酸序列，只要其顯示出SerB活性即可，但不限於此。此外，編碼SerB之多核苷酸序列可具有編碼SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示之胺基酸的多核苷酸序列。

考慮到基於遺傳密碼簡併性表現該多肽之生物所優選的密碼子，可在不會改變該多肽的胺基酸序列之範疇內對編碼區實行該多核苷酸上之各種修飾。該多核苷酸序列可為SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列，且可包含對此等序列具有80%，具體而言至少90%的序列同源性之核苷酸序列，但不限於此。

在本文中使用時，術語"相較於其內生活性而言衰減"係指與保持在自然狀態者相比時，蛋白質活性降低，且亦包含去除其活性時。

衰減係指下列情形之概念：當蛋白質的活性因編碼該蛋白質之基因中的修飾等而造成相較於微生物原本所維持者而言降低時之情形；當總體蛋白質表現水平因編碼該蛋白質之基因的表現抑制或轉譯抑制而低於該微生物之天然型菌種時之情形；或當該基因完全不表現時之情形；以及當基因表現但並未顯現出活性時之情形。

蛋白質活性的衰減或失活可藉由本技術領域中廣知的各種方法達成。該方法之實例可包含：以經突變之基因取代染色體上編碼該蛋白質之基因而使得酶活性降低(包括當去除該蛋白質活性時之情形)之方法；對編碼該蛋白質之基因的表現調控序列進行修飾之方法；刪除染色體上編碼該蛋白質之基因的一部分或整體之方法；引入會透過互補結合至染色體上該基因之轉錄物而抑制自mRNA轉譯為蛋白質之反義寡核苷酸(例如，反義RNA)之方法；藉由人為添加夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno，SD)序列及其互補序列至編碼該蛋白質之基因的SD序列前端上而形成二級結構以使核糖體不可能附著之方法；添加啟動子以便在對應序列之開放閱讀框(open reading frame，ORF)的3’端進行反轉錄之反轉錄工程(RTE)之方法等，且亦包含其組合，但不限於此。

具體而言，刪除編碼該蛋白質之基因的一部分或整體之方法可藉由使用用於將染色體插入細菌中之載體，以具有經部分刪除之核酸序列的多核苷酸或標記基因置換染色體內編碼內生標的蛋白之多核苷酸而實行。在例示性具體例中，該基因可藉由同源重組予以刪除。此外，在本文中使用時，術語"部份"，儘管其可因多核苷酸的種類而異，但具體而言可指1個核苷酸至300個核苷酸，更具體而言1個核苷酸至100個核苷酸，再更具體而言1個核苷酸至50個核苷酸，但不限於此。

此外，對表現調控序列進行修飾之方法可藉由透過刪除、插入、保留性取代、非保留性取代、或其組合而在該表現調控序列中誘發變異以便進一步減弱該表現調控序列的活性；或藉由以具有較弱的活性之核酸序列置換該序列而施行。該表現調控序列包含啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合域之序列、以及用於調控轉錄作用及轉譯作用之序列。

此外，對基因序列進行修飾之方法可藉由透過刪除、插入、保留性取代、非保留性取代、或其組合而在該基因序列中誘發變異以便進一步減弱該蛋白質的活性；或以經改良而具有較弱的活性之基因序列或經改良而完全不具有活性之基因序列置換該序列而施行。

此外，生產OPS之微生物可為其中磷酸甘油酸去氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase,SerA)或磷絲胺酸胺基轉移酶(phosphoserine aminotransferase,SerC)的活性相較於其內生活性而言進一步提升者。

SerA係能夠將3-磷酸甘油酸轉換成3-磷酸-羥基丙酮酸鹽之蛋白質，就SerA而言，可使用野生型或經去除對絲胺酸的回饋之變體。此外，SerC係能夠將3-磷酸-羥基丙酮酸鹽轉換為OPS之蛋白質。因此，有經提升的SerA及/或SerC活性之任何微生物皆可有效地用作生產 OPS之微生物。

SerA可具有選自SEQ ID NO：21至26所組成之群組之胺基酸序列，儘管不限於此。SEQ ID NO：21係野生型SerA的序列，而SEQ ID NO：21至26係經去除對絲胺酸的回饋之變體的序列。此外，可包含對上述胺基酸具有至少80%，具體而言至少90%，更具體而言至少95%，再更具體而言至少99%的序列一致性之胺基酸序列，只要其顯現出野生型SerA或經去除對絲胺酸的回饋之SerA變體的活性即可，但不限於此。經去除回饋之變體表示其中藉由插入、取代等而將修飾引入編碼SerA之基因上，從而使能夠經由絲胺酸或甘胺酸之回饋抑制而仍維持活性，或具有其經提升的活性之蛋白質，且該等經去除回饋之變體已為人所廣知(Grant GA et al.,J.Biol.Chem.,39：57-5361,1999；Grant GA et al.,Biochem.,39：7316-7319,2000；Grant GA et al.,J.Biol.Chem.,276：17844-17850,2001；Peters-Wendisch P et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,60：437-441,2002；歐洲專利第EP0943687B號)。

此外，編碼野生型SerA或經去除對絲胺酸的回饋之變體之多核苷酸序列可為編碼SEQ ID NO：21至26所示之任一胺基酸序列的多核苷酸序列，但不限於此。因遺傳密碼簡併性或考慮到表現該多肽之生物所優選的密碼子，可在不會改變該多肽的胺基酸序列之範疇內對編碼區實行該多核苷酸上之各種修飾。該多核苷酸序列可例如為SEQ ID NO：27至32所示之多核苷酸序列之任一者，且可具有對該多核苷酸序列具有至少80%，具體而言至少90%的同源性之核苷酸序列，但不限於此。

SerC可為具有例如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列的蛋白質，但不限於此。此外該胺基酸序列，只要其顯現出SerC的活性，亦可包含對上述胺基酸序列具有至少80%，具體而言至少90%，更具體而言至少95%，再更具體而言至少99%的序列一致性之胺基酸序列，但不限於此。

此外，編碼SerC之多核苷酸序列可為編碼SEQ ID NO：33所示之胺基酸的多核苷酸序列。因遺傳密碼簡併性或考慮到表現該多肽之生物所優選的密碼子，可在不會改變該多肽的胺基酸序列之範疇內對編碼區實行該多核苷酸上之各種修飾。該多核苷酸序列可例如為SEQ ID NO：34所示者，且可具有對該多核苷酸序列具有至少80%，具體而言至少90%的同源性之核苷酸序列，但不限於此。

此外，該微生物可為其中將OPS引入或分解於細胞中之能力被進一步減弱者。

關於生產OPS之微生物的內含物，除了上述者以外，尚可使用韓國專利第1381048號或美國專利申請公開案第2012-0190081號所揭示之內容作為本發明之參考。

在另一態樣中，本發明係提供一種生產OPS之方法，其包含在培養基中培養能夠生產O-磷絲胺酸之微生物，於該微生物中，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列且能夠輸出O-磷絲胺酸之多肽的活性被提升；以及自該能夠生產O-磷絲胺酸之微生物、或用於該微生物之培養基中分離O-磷絲胺酸。

在本文中使用時，術語"培養"係指使微生物在經適當調整之環境中生長。培養過程可根據本技術領域中已知的用於培養之適當培養基及條件而施行。培養過程可由熟習本技術領域者根據所選擇之菌種而輕易地調整以便於使用。具體而言，該培養可為批次培養、連續培養、及補料培養(fetch culture)，但不限於此。

在培養相較於其內生活性而言具有降低的SerB活性之重組微生物時，該培養基可進一步含有甘胺酸或絲胺酸，因為該重組微生物之絲胺酸需求受到誘發。甘胺酸可以經純化之甘胺酸、含甘胺酸之酵母萃取物、或胰化腖(tryptone)之形式提供。甘胺酸在培養基中的濃度一般為0.1g/L至10g/L，具體而言為0.5g/L至3g/L。此外，絲胺酸可以經純化之絲胺酸、含有絲胺酸之酵母萃取物、或胰化蛋白之形式提供。絲胺酸在培養基中的濃度一般為0.1g/L至5g/L，具體而言為0.1g/L至1g/L。

被含納於培養基中之碳源之實例可包含碳水化合物及醣類，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、及纖維素；油及脂肪，諸如大豆油、葵花油、蓖麻油、及椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸、及亞麻油酸；醇，諸如甘油及乙醇；以及有機酸，諸如醋酸。此等碳源可單獨或組合使用，但不限於此。

被含納於培養基中之氮源之實例可包含有機氮源，諸如蛋白腖(peptone)、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米浸液(corn steep liquor，CSL)、及豆粉；以及無機氮源，諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、及硝酸銨。此等氮源可單獨或組合使用，但不限於此。作為磷源，培養可進一步包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、及對應的含鈉鹽類，但不限於此。培養基可包含金屬，諸如硫酸鎂及硫酸鐵。此外，可包含胺基酸、維生素及適當的前驅物。此等培養基或前驅物可以批次培養或連續培養之形式添加至培養物中，但不限於此。

此外，培養物的pH值可藉由在培殖期間以適當方式添加諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸、及硫酸之化合物而調整。此外，可在培殖期間使用諸如脂肪酸聚乙二醇酯之消泡劑來防止氣泡形成。此外，為了在培養液中維持好氧條件而可將氧氣或含有氧氣之氣體添加至培養物中；可不添加氣體以維持厭氧條件或微好氧條件；或可注入氮氣、氫氣、或二氧化碳。培養溫度可為27℃至37℃，具體而言30℃至35℃。培殖可持續進行至所欲物質之生產可被取得，具體而言，持續10小時至100小時。

在本發明中，在培殖期間所生產之OPS可進一步分離及純化。可根據培養方法，例如，批次培養、連續培養、及補料培養，而使用本技術領域中所知的適當方法自培養物中回收所預期的OPS，但不限於此。

在另一態樣中，本發明係提供藉由該具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列之多肽而生產OPS及輸出OPS之用途。

在又另一態樣中，本發明係提供一種生產半胱胺酸或其衍生物之方法，其包含：a)在培養基中藉由培養微生物生產O-磷絲胺酸(OPS)，於該微生物中，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列且能夠輸出O-磷絲胺酸之多肽的活性相較於其內生活性而言被提升；以及b)在O-磷絲胺酸硫化氫解酶(OPSS)或能夠表現該O-磷絲胺酸硫化氫解酶(OPSS)之微生物之存在下，使a)中所生產之O-磷絲胺酸(OPS)或含有其之培養物與硫化物進行反應。

在本文中使用時，術語"O-磷絲胺酸硫化氫解酶"(以下，"OPSS")係指催化對OPS提供硫醇(SH)基而將OPS轉換成半胱胺酸的反應之多肽。該酶最早在敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatics)、及陰道滴蟲(Trichomonas vaginalis)中被發現(Mino K and Ishikawa K,FEBS Letters,551：133-138,2003；Burns KE et al.,J.Am.Chem.Soc.,127：11602-11603,2005)。此外，OPSS之範疇不僅含括野生型OPSS蛋白，亦含括變體，包含在編碼OPSS之多核苷酸序列之部分中之刪除、取代、或添加，其顯示出活性係等於或高於野生型OPSS蛋白的生物活性，例如，含括韓國專利第1381048及1208267號所揭示之OPSS蛋白及其變體。

本發明中所使用之硫化物可任何硫化物，其不僅以一般在本技術領域中所使用之固體形式提供，亦因pH值、壓力、及溶解度之差異而以液體或氣體形式提供，因而可以例如硫化物(S^2-)或硫代硫酸鹽(S₂O₃ ^2-)之形式轉換為硫醇(SH)基。具體而言，本發明中所使用之硫化物可為Na₂S、NaSH、H₂S、(NH₄)₂S、或Na₂S₂O₃，其可對OPS提供硫醇基。在該反應中，對單一反應性OPS基供應單一硫醇基以生產單一半胱胺酸或其衍生物。在此反應中，具體而言，添加硫化物的量係每1莫耳的OPS為0.1莫耳至3莫耳，具體而言1莫耳至2莫耳。

此外，本發明之方法進一步包含將步驟b)之反應中所生產之半胱胺酸分離及純化。本文中，所需半胱胺酸可藉由本技術領域中所知的適宜反應將其自反應溶液中予以單離及純化而回收。

此外，本發明係關於藉由在生產OPS之微生物中提升SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之多肽的活性而獲得高產率OPS之生產，接著使如此所生產之OPS與OPSS進行反應，從而有效地生產半胱胺酸。如此所製備之半胱胺酸可透過本技術領域中所知的化學合成反應藉由修飾氫原子或特定原子基團而合成各種半胱胺酸衍生物。

在本文中使用時，術語"衍生物"係指藉由化學性修飾任何化合物之一部分而獲得之類似化合物。通常，該術語係指化合物其中之氫原子或原子基團係經另一氫原子或原子基團取代。

在本文中使用時，術語"半胱胺酸衍生物"係指其中半胱胺酸中之氫原子或原子基團係經另一原子或原子基團取代之化合物。舉例而言，半胱胺酸衍生物可具有形式，其中半胱胺酸中之胺基(-NH₂)的氮原子或硫醇基(-SH)的硫原子具有另一原子或原子基團附接於其上。半胱胺酸衍生物之實例包含N-乙醯基半胱胺酸(NAC)、S-羧甲基半胱胺酸(SCMC)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-胺基-2-羧乙基)-L-高半胱胺酸、(R)-2-胺基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4-(乙硫基)丁酸、3-亞磺基-L-丙胺酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒代-L-半胱胺酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱胺酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱胺酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱胺酸，但不限於此。半胱胺酸可藉由在鹼性條件下與乙醯化劑進行反應而輕易地合成N-乙醯基半胱胺酸(NAC)，其可藉由與鹵代醋酸進行反應而合成S-羧甲基半胱胺酸(SCMC)。此等半胱胺酸衍生物主要用作鎮咳劑，咳嗽緩解劑，以及支氣管炎、支氣管性氣喘、咽喉炎等之治療劑之醫藥原料。

本發明之具SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列之新穎的多肽具有優異的OPS輸出能力。因此，當將本發明之新穎的多肽應用於能夠生產OPS之微生物時，其可導致OPS生產的高產率，且亦可有效地用於L-半胱胺酸的合成等。

第1圖顯示圖解說明自本發明中YhhS及MdtD蛋白的功能被提升之重組微生物的培養物中去除所輸出之所有OPS後，藉由高效液相層析法(HPLC)測定OPS細胞內水平的結果之圖。

以下，參照下列實施例更詳細說明本發明。然而，此等實施例僅用於例示性目的，本發明並未意圖受限於此等實施例。

實施例1：YhhS MFS轉運子及YegB MFS轉運子的鑑定

為了鑑定出涉及OPS的輸出之大腸桿菌膜蛋白，對大腸桿菌K12_W3110(ATCC27325)的基因體DNA庫進行篩選。

具體而言，為了設定其中大腸桿菌的生長受OPS所抑制之條件，係構築生產OPS之平台菌種(platform strain)。該用於篩選之平台菌種係在野生型大腸桿菌菌種W3110中修飾成降低內生磷絲胺酸磷酸酶(SerB)的活性之重組微生物，且標示為"KCCM11212P"(亦稱為"CA07-0012"；韓國專利第10-1381048號；美國專利申請公開案第2012-0190081號)。使用該生產OPS之菌種KCCM11212P，藉由在含有OPS之培養基中培養作為生產OPS之菌種的KCCM11212P而建立顯示出生長抑制之最適篩選條件。

然後，藉由電穿孔將W3110的基因體庫質體轉形至CA07-0012(van der Rest et al.1999)，並在含有過量的OPS之培養基條件下選擇顯示出去除生長抑制之菌落。自所選之菌落中獲得質體，並藉由定序技術分析其核苷酸序列。結果，鑑定出在含有過量的OPS之培養基條件下涉及去除生長抑制之二種大腸桿菌膜蛋白。

該二種大腸桿菌膜蛋白被鑑定為yhhS及mdtD，其係分別編碼YhhS主要促進子超家族(MFS)轉運子(SEQ ID NO：1的胺基酸序列及SEQ ID NO：3的核苷酸序列)及YegB MFS轉運子(SEQ ID NO：2的胺基酸序列及SEQ ID NO：4的核苷酸序列)(Pao SS,Paulsen IT,Saier MH(1998)."Major facilitator superfamily." Microbiol Mol Biol Rev 1998；62(1)；1-34.PMID：9529885)。

實施例2：過量表現yhhS及mdtD之載體的構築

為了檢驗當在生產OPS之菌種中提升涉及去除經由OPS的生長抑制之YhhS MFS轉運子及YegB MFS轉運子時是否會提升OPS輸出能力，係構築過量表現各基因之載體。

此外，由於本發明者等人已確認當在生產OPS之菌種中提升高絲胺酸/高絲胺酸內酯轉運子RhtB時，OPS的濃度會增加(韓國專利第138104號)，故將經提升RhtB之菌種用作陽性對照組。此外，亦評估屬於MacB所屬之主要促進子超家族(MFS)之多重藥物排出轉運子EmrD及YcaD MFS。

以與如同用於YhhS及MdtD相同之方式，亦評估屬於主要促進子超家族(MFS)之大腸桿菌膜蛋白的多重藥物排出轉運子EmrD及YcaD MFS轉運子。在此實施例中，藉由使用W3110的基因體DNA作為模板之PCR而獲得編碼YhhS MFS轉運子之基因yhhS的片段(SEQ ID NO：3，登錄號：b3473)及編碼出YegB MFS轉運子之基因mdtD的片段(SEQ ID NO：4，登錄號：b2077)。

用於構築該些膜蛋白之各基因的過量表現載體之引子序列顯示於下表1。

具體而言，用於yhhS之PCR反應使用SEQ ID NO：5及6的引子施行，而用於mdtD之PCR反應使用SEQ ID NO：7及8的引子施行。該PCR反應中所使用之引子係基於寄存於NIH GenBank之K12 W3110基因(GenBank登錄號AP 003471)及周圍核苷酸序列的資訊進行構築。此外，rhtB、emrD、及ycaD基因的片段透過使用顯示於表1之個別引子對之PCT反應進行增幅。

將所增幅之基因片段各自以限制酶EcoRV及HindIII處理，並選殖入pCL-PrhtB載體的EcoRV及HindIII限制酶切位，該pCL-PrhtB載體包含插入至pCL1920載體(GenBank編號AB236930)之大腸桿菌rhtB基因的啟動子(PrhtB)，從而分別構築pCL-PrhtB-rhtB、pCL-PrhtB-yhhS、pCL-PrhtB-mdtD、pCL-PrhtB-emrD、及pCL-PrhtB-ycaD。

實施例3：具經提升的YhhS MFS轉運子及YegB MFS轉運子之菌種的構築以及OPS生產能力的評估〈實施例3-1：使用CA07-0012之具經提升的YhhS MFS轉運子及YegB MFS轉運子之菌種的構築以及OPS生產能力的評估〉

將實施例2中所構築之五種質體各自引入生產OPS之菌種CA07-0012中，然後評估所得菌種的OPS生產能力。

具體而言，將各菌種平塗於LB固體培養基並在恒溫培養器中於33℃培養整夜。將於LB固體培養基上培養整夜之各菌種接種至下表2所顯示之25mL力價培養基中，然後在恒溫培養器中於34.5℃及200rpm培養40小時。結果顯示於表3。

如上表3所顯示，在分別將該大腸桿菌膜蛋白基因進一步引入大腸桿菌CA07-0012菌種之情形之中，具有經提升的rhtB、emrD、或ycaD之菌種相較於CA07-0012菌種而言在OPS生產上顯示出顯著的增加，尤其，具有經提升的YhhS及MdtD之菌種在OPS濃度上顯示出至少150%增加。相反地，被使用作為實驗組之具有經提升的EmrD及YcaD之菌種在OPS濃度上並未顯示出任何增加。

將標示為"CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS"之菌種命名為"大腸桿菌CA07-0266(CA07-0266)"並在2013年12月9日以登錄號KCCM11495P寄存於依布達佩斯條約(Budapest Treaty)認證為國際寄存機構之韓國微生物培養中心。

此外，將標示為"CA07-0012/pCL-PrhtB-mdtD"之菌種命名為"大腸桿菌CA07-0267(CA07-0267)"並在2013年12月9日以登錄號KCCM11496P寄存於依布達佩斯條約認證為國際寄存機構之韓國微生物培養中心。

〈實施例3-2：使用具經提升的SerA及SerC之菌種之具經提升的YhhS MFS轉運子及YegB MFS轉運子之菌種的構築以及OPS生產能力的評估〉

此外，該大腸桿菌膜蛋白基因之功效係使用生產OPS之菌種CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(韓國專利申請公開案第10-2012-004111號)檢驗，於該菌種中，作為OPS生物合成途徑之D-3-磷酸甘油酸去氫酶(SerA)及3-磷絲胺酸胺基轉移酶(SerC)的活性被提升。

如上表4所顯示，再次確認在將該大腸桿菌膜蛋白基因進一步引入CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC菌種之菌種之中，本發明之具有經提升的YhhS及MdtD之菌種以及具有經提升的RhtB之菌種(陽性對照組)相較於大腸桿菌所衍生之CA07-0012菌種而言在OPS生產上顯示出增加。尤其，本發明之具有經提升的YhhS及MdtD之菌種在OPS濃度上顯示出至少145%增加，類似於上表3所顯示之結果。相反地，具有經提升的ErmD及YcaD之菌種相對於對照組而言在OPS濃度上顯示出減少。

〈實施例3-3：根據啟動子強度之具經提升的YhhS MFS轉運子及YegB MFS轉運子之菌種的構築以及OPS生產能力的評估〉

此外，為了檢驗提升啟動子強度是否可增進輸出能力，藉由使用相較於rhtB啟動子(PrhtB)而言更強的啟動子之trc啟動子(Ptrc)進一步將yhhS及mdtD基因引入CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC中，而將具增加的OPS濃度之膜蛋白YhhS及MdtD與對照組比較。

將yhhS及mdtD基因的片段各自以限制酶EcoRV及HindIII處理，並選殖入pCL-Ptrc-GFP載體的EcoRV及HindIII限制酶切位，該pCL-Ptrc-GFP載體包含插入至pCL1920載體之trc啟動子，從而分別構築pCL-Ptrc-yhhS及pCL-Ptrc-mdtD。然後，使用各質體作為模板連同SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16的引子對施行PCR反應，並將所得物以HindIII處理，然後選殖入pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC的HindIII限制酶切位。

結果，如上表5所顯示，當大腸桿菌膜蛋白的表現藉由提升啟動子而增進時，相較於對照組而言在產率上有至少150%增加，且相較於使用rhtB啟動子時，有至少120%增加。

〈實施例3-4：根據染色體上之啟動子強度之具經提升的YhhS MFS轉運子及YegB MFS轉運子之菌種的構築以及OPS生產能力的評估〉

此外，為了檢驗在染色體上以更強的啟動子置換yhhS及mdtD基因之啟動子是否可提升輸出能力，藉由構築以cj1啟動子(韓國專利第0620092號)置換自啟動子(self-promoter)之菌種來評估OPS生產能力。將cj1啟動子引入大腸桿菌染色體係藉由如下述之習知方法實行。為了在染色體上置換yhhS及mdtD之自啟動子，將所構築之重組載體轉形至生產OPS之菌種CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(韓國專利第138104號)，並透過同源重組使載體上之上述啟動子序列與自啟動子序列置換，從而將cj1啟動子序列插入至染色體。

將各菌種平塗於LB固體培養基並在恒溫培養器中於33℃培養隔夜。將於LB固體培養基培養整夜之各菌種接種至上表2所顯示之25mL力價培養基中，然後在恒溫培養器中於34.5℃及200rpm培養40小時。結果顯示於下表6。

如上表6所顯示，當染色體之各膜蛋白的表現增進時，相對於對照組而言產率增加高達130%。

實施例4：YhhS MFS轉運子及YegB MFS轉運子之OPS輸出功能的確認

在實施例3中確認OPS生產之燒瓶樣品中，在去除培養基中所輸出之所有OPS後使用CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(其係該膜蛋白並未提升之陰性對照組)、以及使用CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC-Ptrc-yhhS及CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC-Ptrc-mdtD(其中，膜蛋白YhhS及MdtD被提升)之樣品，僅收集細胞，並將細胞壓碎。藉由高效液相層析法(HPLC)測定細胞內的OPS濃度，結果顯示於第1圖。

結果，如第1圖所顯示，本發明之具經提升的YhhS及MdtD之菌種相較於對照組而言顯示出胞內OPS濃度減少30%至40%，因而確認Yhhs及MdtD蛋白在將OPS輸出至細胞外部上扮演某一角色。因此，確認提升Yhhs及MdtD蛋白可順利地將細胞中之OPS輸出至外部，從而提升OPS生產能力。

基於上述說明，熟習本發明所屬之技術領域者將能夠瞭解，在不會變更本發明之技術概念或必要特徵之下，可以其他特定形式具體例示本發明。就此而言，本文中所揭示之例示性具體例僅用於例示性目的，不應解釋為限制本發明之範疇。相對地，本發明不僅意圖涵蓋例示性具體例，亦涵蓋如所附申請專利範圍所界定之可含括於本發明之精神及範疇中之各種替代物、修改物、等價物及其他具體例。

【生物材料寄存】 國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1.大韓民國、韓國微生物培養中心、2013年12月9日、KCCM11495P；(2014年11月30日於財團法人食品工業發展研究所進行專利生物材料寄存，並於2015年12月8日進試驗並確認試驗當時存活)。

2.大韓民國、韓國微生物培養中心、2013年12月9日、KCCM11496P；(2014年11月30日於財團法人食品工業發展研究所進行專利生物材料寄存，並於2015年12月8日進試驗並確認試驗當時存活)。

<110> CJ第一製糖股份有限公司

<120> 生產O-磷絲胺酸之微生物及使用該微生物生產O-磷絲胺酸或L-半胱胺酸之方法

<130> OPA15193

<150> KR 10-2014-0104670

<151> 2014-08-12

<160> 34

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 405

<212> PRT

<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(405)

<223> YhhS MFS轉運子，YhhS

<400> 1

<210> 2

<211> 471

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(471)

<223> YegB MFS轉運子，MdtD

<400> 2

<210> 3

<211> 1218

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1218)

<223> yhhS

<400> 3

<210> 4

<211> 1416

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1416)

<223> mdtD

<400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於yhhS之增幅以構築pCL-PrhtB-yhhS之引子

<400> 5

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於yhhS之增幅以構築pCL-PrhtB-yhhS之引子

<400> 6

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於mdtD之增幅以構築pCL-PrhtB-mdtD之引子

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於mdtD之增幅以構築pCL-PrhtB-mdtD之引子

<400> 8

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於rhtB之增幅以構築pCL-PrhtB-rhtB之引子

<400> 9

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於rhtB之增幅以構築pCL-PrhtB-rhtB之引子

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於emrD之增幅以構築pCL-PrhtB-emrD之引子

<400> 11

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於emrD之增幅以構築pCL-PrhtB-emrD之引子

<400> 12

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於ycaD之增幅以構築pCL-PrhtB-ycaD之引子

<400> 13

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於ycaD之增幅以構築pCL-PrhtB-ycaD之引子

<400> 14

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於pCL-PrhtB-基因之增幅以構築 pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-基因之引子

<400> 15

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 16

<210> 17

<211> 446

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(446)

<223> 磷絲胺酸磷酸酶，SerB

<400> 17

<210> 18

<211> 322

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(322)

<223> 磷絲胺酸磷酸酶，SerB

<400> 18

<210> 19

<211> 1341

<212> DNA

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1341)

<223> 磷絲胺酸磷酸酶，SerB

<400> 19

<210> 20

<211> 969

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(969)

<223> 磷絲胺酸磷酸酶，SerB

<400> 20

<210> 21

<211> 410

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(410)

<223> SerA

<400> 21

<210> 22

<211> 530

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸去氫酶(E235K)，SerA(E235K)

<400> 22

<210> 23

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸去氫酶(197 delta)，SerA(197 delta)

<400> 23

<210> 24

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸去氫酶(G336V)，SerA(G336V)

<400> 24

<210> 25

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸去氫酶(G336V,G337V)，SerA(G336V,G337V)

<400> 25

<210> 26

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸去氫酶(G336V,R338G)，SerA(G336V,R338G)

<400> 26

<210> 27

<211> 1233

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1233)

<223> SerA

<400> 27

<210> 28

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸去氫酶(E235K)，SerA(E235K)

<400> 28

<210> 29

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸去氫酶(197 delta)，SerA(197 delta)

<400> 29

<210> 30

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸去氫酶(G336V)，SerA(G336V)

<400> 30

<210> 31

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*(G336V,G337V)

<400> 31

<210> 32

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*(G336V,R338G)

<400> 32

<210> 33

<211> 362

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(362)

<223> 3-磷絲胺酸/磷羥基蘇胺酸胺基轉移酶，SerC

<400> 33

<210> 34

<211> 1089

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1089)

<223> 3-磷絲胺酸/磷羥基蘇胺酸胺基轉移酶，SerC

<400> 34

Claims

一種能夠生產O-磷絲胺酸(OPS)之微生物，其中(a)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列且能夠輸出O-磷絲胺酸之多肽的活性相較於其內生活性而言被提升；及(b-1)磷絲胺酸磷酸酶(phosphoserine phosphatase，SerB)的活性相較於其內生活性而言被進一步減弱，及/或(b-2)磷酸甘油酸去氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase，SerA)或磷絲胺酸胺基轉移酶(phosphoserine aminotransferase，SerC)的活性相較於其內生活性而言被進一步提升。
如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中該微生物屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。
如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中該微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)。
一種微生物用於生產O-磷絲胺酸(OPS)之用途，其中具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列之多肽的活性相較於其內生活性而言被提升。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中在該微生物中，磷絲胺酸磷酸酶(SerB)的活性相較於其內生活性而言被進一步減弱，及/或磷酸甘油酸去氫酶(SerA)或磷絲胺酸胺基轉移酶(SerC)的活性相較於其內生活性而言被進一步提升。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該微生物屬於大腸桿菌屬、伊文氏桿菌屬、鋸桿菌屬、普羅威登斯菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該微生物為大腸桿菌。
一種生產O-磷絲胺酸(OPS)之方法，其包含：在培養基中培養能夠生產O-磷絲胺酸之微生物，於該微生物中，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列且能夠輸出O-磷絲胺酸之多肽的活性被提升；以及自該能夠生產O-磷絲胺酸之微生物、或用於該微生物之培養基中分離O-磷絲胺酸。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中於該能夠生產O-磷絲胺酸之微生物中，磷絲胺酸磷酸酶(SerB)的活性相較於其內生活性而言被進一步減弱，及/或磷酸甘油酸去氫酶(SerA)或磷絲胺酸胺基轉移酶(SerC)的活性相較於其內生活性而言被進一步提升。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該微生物屬於大腸桿菌屬、伊文氏桿菌屬、鋸桿菌屬、普羅威登斯菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該微生物為大腸桿菌。
一種生產半胱胺酸或其衍生物之方法，其包含：a)藉由在培養基中培養能夠生產O-磷絲胺酸(OPS)之微生物而生產O-磷絲胺酸(OPS)，其中具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的胺基酸序列且能夠輸出O-磷絲胺酸之多肽的活性被提升；以及b)在O-磷絲胺酸硫化氫解酶(OPSS)或能夠表現該O-磷絲胺酸硫化氫解酶(OPSS)之微生物之存在下，使a)中所生產之O-磷絲胺酸(OPS)或含有該O-磷絲胺酸(OPS)之培養物與硫化物進行反應，其中該半胱胺酸衍生物係選自由該N-乙醯基半胱胺酸(NAC)、S-羧甲基半胱胺酸(SCMC)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-胺基-2-羧乙基)-L-高半胱胺酸、(R)-2-胺基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4-(乙硫基)丁酸、3-亞磺基-L-丙胺酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒代-L-半胱胺酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱胺酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱胺酸以及S-(4-甲苯基)-L-半胱胺酸所組成群組。
如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該硫化物係選自Na₂S、NaSH、(NH₄)₂S、H₂S、及Na₂S₂O₃所組成之群組之至少一者。
如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該微生物能生產O-磷絲胺酸，磷絲胺酸磷酸酶(SerB)的活性相較於其內生活性而言被進一步減弱，及/或磷酸甘油酸去氫酶(SerA)或磷絲胺酸胺基轉移酶(SerC)的活性相較於其內生活性而言被進一步提升。
如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該微生物為大腸桿菌。