CN105264064B - O-磷酸丝氨酸输出蛋白及使用其生产o-磷酸丝氨酸的方法 - Google Patents

O-磷酸丝氨酸输出蛋白及使用其生产o-磷酸丝氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新型分离的多肽，所述多肽具有输出O‑磷酸丝氨酸(OPS)的能力，所述O‑磷酸丝氨酸是L‑半胱氨酸的前体；包含该多核苷酸的载体；生产OPS的微生物，所述微生物具有增强的多肽活性；使用该微生物生产OPS的方法；以及制备半胱氨酸或其衍生物的方法，所述方法包括在O‑磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下，使由上述方法生产的OPS与硫化物进行反应。

Description

O-磷酸丝氨酸输出蛋白及使用其生产O-磷酸丝氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种新型分离的多肽，所述多肽具有输出O-磷酸丝氨酸(在下文中描述为“OPS”)的能力，所述OPS是L-半胱氨酸的前体；编码该多肽的多核苷酸；包含该多核苷酸的载体；生产OPS的微生物，所述微生物具有增强的多肽活性；使用该微生物生产OPS的方法；以及制备半胱氨酸或其衍生物的方法，所述方法包括在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下，使由上述生产OPS 的方法生产的OPS与硫化物进行反应。
背景技术
L-半胱氨酸——在所有活的有机体中的硫的代谢作用中起重要作用的氨基酸——不仅用于生物蛋白质诸如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、甲硫氨酸及其它含硫代谢物的合成，也用作辅酶A生物合成的前体。
利用微生物生产L-半胱氨酸的已知方法包括利用微生物将 D,L-ATC生物转化为L-半胱氨酸的方法(Ryu OH等人，Process Biochem.,32:201-209,1997)。另一个已知的方法是通过使用大肠杆菌直接发酵生产L-半胱氨酸的方法(EP 0885962B；Wada M andTakagi H, Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006)。同时，本发明人进行研究以开发新的生产L-半胱氨酸的方法，结果发现在某些微生物中从O-磷酸丝氨酸(OPS)合成L-半胱氨酸的酶(O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶 (OPSS))。基于该发现，本发明人开发了通过将OPS与OPSS酶反应、通过培养突变微生物以在其中积累OPS而生产半胱氨酸的方法(韩国专利公开号10-2012-004111)。为了以高产量生产半胱氨酸，仍需要生产过量的OPS。因此，本发明人已做出大量的努力以发现合适的输出物(exporter)，所述输出物使在生产OPS的菌株中生产的O-磷酸丝氨酸能被顺利地从细胞释放。此外，基于不同类型的已知转运蛋白，本发明人筛选出编码O-乙酰丝氨酸/半胱氨酸外排泵蛋白(efflux pump protein)的ydeD、编码O-乙酰丝氨酸/半胱氨酸外排通透酶的yfiK (Franke I,Resch A,Dassler T,Maier T andBock A,J.Bacteriology,185: 1161-166,2003)、编码高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排泵蛋白的rhtB (Zakataeva NP,Aleshin VV,Tokmakova IL,Troshin PV,Livshits VA FEBS Lett1999；452(3)；228-32)等，并具体发现生产OPS的菌株中RhtB 的增强导致OPS的浓度增加(韩国专利公开号10-2012-0041115)。然而，对于半胱氨酸更高产量的生产，仍需要开发具有更高输出OPS能力的转运蛋白。
发明内容
技术问题
本发明人已做出大量的努力发现具有OPS输出活性的蛋白质，以能够进一步增加OPS的生产，结果是，已鉴定出两种具有优异OPS输出活性的新型多肽，并发现该多肽可以更有效地从生产OPS的菌株中输出OPS，从而完成本发明。
解决方案
本发明的一个目的是提供生产O-磷酸丝氨酸(OPS)的方法，其包括培养生产O-磷酸丝氨酸的微生物，所述微生物具有增强的多肽活性，所述多肽具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，并且具有OPS输出活性。
本发明的另一个目的是提供一种新型分离的多肽，其具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，并且具有O-磷酸丝氨酸输出活性。
本发明的又一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸，以及包含该多核苷酸的载体。
本发明的又一个目的是提供一种具有增强的多肽活性的生产O-磷酸丝氨酸的微生物，所述多肽具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，并且具有O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性。
本发明的又一个目的是提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下，使由上述生产O-磷酸丝氨酸的方法所生产的O-磷酸丝氨酸与硫化物进行反应。
发明的有利效果
本发明的具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的新型多肽具有优异的OPS输出活性，因而将该多肽应用于生产O-磷酸丝氨酸的微生物时，在该微生物中可以高效率地生产O-磷酸丝氨酸。
附图简述
图1是显示在将OPS完全移除后通过高效液相色谱(HPLC)测量细胞内OPS的结果的图解图，所述OPS是从本发明的具有增强的YggT 蛋白和MacB蛋白活性的重组微生物的培养物中释放。
图2是显示通过从O-磷酸丝氨酸的生物合成和微生物发酵积累O- 磷酸丝氨酸并将所积累的O-磷酸丝氨酸酶促地转化成L-半胱氨酸而生产L-半胱氨酸的方法的示意图。
实施发明的最佳方式
本发明的方面包括生产O-磷酸丝氨酸(OPS)的方法，其包括培养具有增强的多肽活性的生产O-磷酸丝氨酸的微生物，所述多肽具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，并且具有O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性。
具体地，根据本发明的以上方面所述的方法可以包括以下步骤： a)通过培养具有增强的多肽活性的生产OPS的微生物来生产OPS，所述多肽具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，并且具有OPS输出活性；和b)从微生物的培养物中分离OPS，但不限于此。
本发明方法的步骤a)是培养具有增强的多肽活性的生产OPS的微生物的步骤，所述多肽具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，并且具有OPS输出活性。
如本文所使用的，术语“O-磷酸丝氨酸(在下文中描述为“OPS”)”是指丝氨酸和磷酸的酯，其是许多蛋白质的组分。OPS是L-半胱氨酸的前体，并且可以在OPS硫化氢解酶(在下文中描述为“OPSS”)的催化作用下通过与硫化物反应而转化成半胱氨酸。因此，其是半胱氨酸的生产中提高OPS生产率的重要因素，并因此需要开发出使细胞内 OPS能够从生产OPS的菌株中有效分泌的转运蛋白。
如本文所使用的，表述“具有O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的多肽”是指具有OPS输出活性的膜蛋白。具体地，该多肽是大肠杆菌(E.coli) 膜蛋白。本发明人已鉴定出两种大肠杆菌膜蛋白，该膜蛋白是能够将 OPS从细胞中输出并且衍生自可以在过量OPS存在的条件下生长的大肠杆菌的新型膜蛋白。具体地，具有OPS输出能力的新型大肠杆菌膜蛋白是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的、经鉴定的YggT——其为预测的内膜蛋白——和具有SEQID NO:2的氨基酸序列的、经鉴定的 MacB(MacAB-TolC大环内酯输出转运系统-膜亚单元)。已知的是， SEQ ID NO:1的YggT蛋白充当大肠杆菌内膜蛋白，而SEQ ID NO:2 的MacB蛋白充当大环内酯转运蛋白，但在本发明之前该蛋白的OPS 输出活性并非是已知的，并且是由本发明人首次鉴定。此外，本发明多肽的范围不仅涵盖具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的多肽，而且涵盖具有与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、甚至更具体地至少95％、甚至更具体地至少98％以及最具体地至少99％同源性的氨基酸序列，并且基本上具有与SEQ ID NO:1或2的多肽相同或相当的OPS输出活性的膜蛋白。此外，明显的是，只要具有上述同源性且基本上具有OPS输出活性，包含SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基的缺失、修饰、取代或添加的多肽变体都落在本发明的范围内。
如本文所使用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。从一种形式至另一种形式的序列间的对应关系可以通过本领域已知的技术确定。例如，同源性可以通过对两个多肽分子之间的序列信息进行直接比较而测定，所述比较通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序进行。可选地，同源性可以通过如下测定：在同源区域之间形成稳定双链体的条件下多核苷酸的杂交，然后用单链特异性核酸酶的消化以及消化片段的尺寸测定。
如本文所使用的，所有语法形式和拼写变型的术语“同源的”是指蛋白之间的关系，所述蛋白具有“共同的进化起源”，包括来自超家族的蛋白质以及不同物种的同源蛋白。这种蛋白(及其编码基因)具有由其高程度的序列相似性反映的序列同源性。然而，在通常使用和本发明中，当用形容词如“非常高”修饰时，术语“同源的”可以是指序列相似性，而不是共同的进化起源。
如本文所使用的，术语“序列相似性”是指可以或可以不共享共同的进化起源的蛋白质的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应关系的程度。在一个实施方式中，当多肽的至少约21％(具体地至少约50％，并且最具体地至少约75％、90％、95％、96％、97％或99％)在氨基酸序列的限定长度上匹配时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。基本上同源的序列可以通过使用序列数据库中可用的标准软件来比较序列而鉴定，或者例如在针对该具体系统所限定的严格条件下通过DNA杂交实验进行鉴定。限定适当的杂交条件是在本领域的技术范围内(例如，参见Sambrook等人，1989,infra)。
在本发明的实施例中，显示出，相比作为比较组的具有增强的 rhtB、emrD或ycaD的菌株(实施例3)，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的增强活性或具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的增强活性的菌株具有优异的OPS分泌活性。
如上所述，本发明的多肽具有优异的OPS输出活性，并因此当培养具有增强的多肽活性的微生物时，可以有效生产OPS。
只要是可以增强多肽的活性，增强多肽活性的方法并不受具体地限制。该方法的实例包括增加编码多肽的基因的细胞内复制数目的方法、将突变引入编码多肽的染色体基因的表达调控序列的方法、用具有强活性的序列置换编码多肽的染色体基因的表达调控序列的方法、用经突变以增加多肽活性的基因取代编码多肽的染色体基因的方法、以及将突变引入编码多肽的染色体基因以增加多肽活性的方法。增强多肽活性的方法同样可以应用于增强其它多肽的活性。在本发明的实施例中，其显示能够增强多肽活性的典型方法，具有SEQ ID NO:1或 SEQ ID NO:2的氨基酸序列的本发明多肽的活性是通过将载体引入到生产OPS的微生物中而增强，所述载体包含编码该多肽的多核苷酸。
如本文所使用的，术语“引入”是指将包含编码多肽的多核苷酸的载体转移到宿主细胞的方法。可利用本领域已知的任何传统方法容易地进行该引入。通常，引入方法的实例包括CaCl2沉淀法、Hanahan法 (一种改善的CaCl2法，其使用DMSO(二甲基亚砜)作为还原物质来增加效率)、电穿孔、磷酸钙沉淀、原生质体融合、使用碳化硅纤维的搅拌、农杆菌介导的转化、PEG介导的转化、硫酸葡聚糖介导的转化、脂质转染胺(lipofectamine)介导的转化以及干燥/抑制介导的转化。用于转化包含编码本发明多肽的多核苷酸的载体的方法并不限于上述实例，并且本领域已知的任何传统的转化或转染方法都可无限制地使用。
如本文所使用的，术语“生产OPS的微生物”是指能够在其中生产 OPS的原核或真核微生物菌株，具体地是能够通过基因工程在其中积累OPS的微生物。对于本发明的目的，微生物可以是具有增强的SEQ ID NO:1或2的多肽活性并因此可以生产OPS的任何原核或真核微生物。微生物的实例包括属于埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属 (Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)以及短杆菌属(Brevibacterium)的微生物菌株。具体地，微生物可以是埃希氏菌属的微生物。更具体地，其可以是大肠杆菌。具体地，埃希氏菌属或棒状杆菌属的微生物可以生产OPS和L-丝氨酸，因为其含有作为L-丝氨酸生物合成途径中的酶的SerA、SerC和SerB蛋白质(Ahmed Zahoor,Computational and structural biotechnology journal,vol 3,2012october；Wendisch VF等人, Curr Opin Microbiol.2006Jun；9(3):268-74；Peters-Wendisch P等人,Appl Environ Microbiol.2005Nov；71(11):7139-44)。在本发明的实施例中，大肠杆菌被用作生产OPS的微生物的代表性实例。
而且，生产OPS的微生物还可以是经修饰降低内源性磷酸丝氨酸磷酸酶(在下文中描述为“SerB”)活性的微生物。
SerB具有将OPS转化为L-丝氨酸的活性，并因此经修饰降低SerB 活性的微生物具有在其中积累OPS的性质，表明对于OPS的生产是有用的。SerB活性的降低意思是相比于未经突变的菌株，SerB活性降低，或被去除。SerB活性的降低可以使用本领域熟知的各种方法实现。降低SerB酶活性的方法的实例包括但不限于用经突变以降低或去除酶活性的基因置换编码该酶的染色体基因的方法、将突变引入编码该酶的染色体基因的表达调控序列的方法、用缺失编码该酶的染色体基因的具有弱活性的基因置换编码该酶的染色体基因的表达调控序列的方法、引入互补结合至染色体基因的转录体以抑制mRNA转化成蛋白的反义寡核苷酸的方法、在SD序列的前面人工添加与编码该酶的基因的 SD序列互补的序列以形成使核糖体无法附着的二级结构的方法，以及将启动子添加至对应序列的开放阅读框(ORF)的3’端以进行反转录的反转录工程(RTE)法。在本发明的实施例中，将包含编码SEQ ID NO:1或2的本发明多肽的多核苷酸的载体引入到微生物，在韩国专利公开号10-2012-004115和美国专利公开号2012-0190081中公开的 CA07-0012(登录号：KCCM11121P)，作为经突变以降低内源性SerB 活性的微生物中。
另外，生产OPS的微生物可以是具有增强的磷酸甘油酸脱氢酶(在下文中描述为“SerA”)或磷酸丝氨酸氨基转移酶(在下文中描述为“SerC”)活性的微生物。
SerA是具有将3-磷酸甘油酸转化为3-磷酸羟基丙酮酸的活性的蛋白质，并且SerA可以是野生型蛋白质或对丝氨酸反馈抑制抵抗的变体。此外，SerC是具有将3-磷酸甘油酸转化为O-磷酸丝氨酸的活性的蛋白质。因此，具有增强的SerA和/或SerC活性的微生物可被用作生产OPS的菌株。在本发明的实施例中，使用CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G 336V)-serC(登录号：KCCM11103P)——其是在韩国专利公开号10- 2012-004115中公开的具有增强的SerA(对丝氨酸反馈抑制抵抗)和SerC活性的微生物——作为生产OPS的微生物，将编码SEQ ID NO: 1或2的多肽的表达载体引入该微生物中以生产OPS。此外，作为具有增强的SEQ ID NO:1的yggT活性的代表性菌株的CA07-0022/pCL- Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-yggT是抵抗丝氨酸反馈抑制的具有增强的SerC和SerA活性的微生物菌株，并且具有引入其中的SEQ ID NO:1的yggT蛋白基因。该CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC -PrhtB-yggT被命名为“大肠杆菌CA07-0228，”并于2013年3月7日保藏于布达佩斯条约下所承认的国际保藏机构，韩国微生物保藏中心，登录号为KCCM11399P。此外，作为具有增强的SEQ ID NO:2的MacB活性的代表性菌株的CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-macB是抵抗丝氨酸反馈抑制的具有增强的SerC和SerA活性的微生物菌株，并且具有引入其中的SEQ ID NO:2的MacB蛋白基因。该CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-macB被命名为“大肠杆菌CA07-0229，”并于2013年3月7日保藏于布达佩斯条约下所承认的国际保藏机构，韩国微生物保藏中心，登录号为KCCM11400P(实施例2)。
此外，微生物可进一步具有降低的进行OPS的细胞内吸收或降解的能力。具体地，微生物可以是经突变的微生物，以降低PhnC/PhnD/ PhnE膦酸烷基酯ABC转运蛋白(PhnCDE操纵子，即，膦酸酯转运蛋白的ATP结合组分(PhnC；EG 10713)-Pn转运蛋白的周质结合蛋白组分(PhnD；EG 10714)-膦酸烷基酯ABC转运蛋白的整合膜组分(PhnE；EG 11283))、碱性磷酸酶(PhoA)或酸性磷酸酶(AphA)的活性。
此外，本发明的微生物可进一步具有增强的嘧啶核苷酸转氢酶(PntAB；EC1.6.1.1)的活性。如先前在Sauer U P等人，J Biol Chem. 20；279(8):6613-9.Epub 2003中所述的，PntAB参与NADPH的代谢以调节细胞内的氧化还原平衡。
如本文所使用的，术语“培养”意思是在人工控制条件下使微生物生长。可利用本领域熟知的合适的培养基和培养条件进行本发明中的培养过程。本领域中的任何技术人员可以根据所选菌株的类型容易地控制培养过程。具体地，培养可以是分批式培养、连续培养或补料分批式培养，但不限于此。
在培养具有降低的内源性SerB活性的重组微生物时，培养基还应包含甘氨酸或丝氨酸，因为丝氨酸营养缺陷型的重组微生物被诱导。甘氨酸可以以纯化的甘氨酸、含甘氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中甘氨酸的浓度通常为0.1-10g/L，具体地为0.5-3g/L。此外，丝氨酸可以以纯化的丝氨酸、含丝氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中丝氨酸的浓度通常为0.1-5g/L，具体地为0.1-1 g/L。
此外，培养基含有碳源。碳源的实例包括糖类和碳水化物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油和脂肪，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类，如丙三醇和乙醇，以及有机酸，如乙酸。这些碳源在培养基中可以被单独或组合使用。可包含在培养基中的氮源的实例包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆液、大豆和小麦蛋白，以及无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以被单独或组合使用。可包含在培养基中的磷源的实例包括磷酸二氢钾、磷酸钾以及相应的钠盐。此外，培养基可包含金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。另外，培养基还可包含氨基酸、维生素以及合适的前体。可以以分批或连续的方式将这些来源或前体添加至培养基。
在培养过程中，可以以合适的方式将化合物诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸添加至培养基，以调节培养基的pH。此外，在培养过程中，可使用消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制泡沫的形成。而且，为了将培养基维持在好氧状态下，可以将氧气或含氧气体注入到培养基中。对于厌氧或微好氧条件，可提供氮、氢或二氧化碳而无需充气。通常将培养基维持在27℃至37℃的温度范围，具体地30℃至35℃。关于培养周期，可以继续培养直到产生有用物质的所需数量。具体地，培养周期为10-100小时。
本发明方法的步骤b)是分离所生产的OPS的步骤。
在本发明中，在培养步骤中生产的OPS可进一步被分离和纯化。例如，根据培养方法，例如，分批式培养、连续培养或补料分批式培养，可以利用本领域已知的合适方法从培养物中收集所需OPS。
在本发明的实施例中，鉴定出具有OPS输出活性的新型多肽，所述多肽是由SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列定义(实施例1)。另外，通常同已知具有OPS输出活性的RhtB蛋白、属于本发明的MacB所属的主要易化子超家族(MFS)的大肠杆菌膜蛋白EmrD以及YcaD MFS转运蛋白一起在具有降低的SerB活性的生产OPS的菌株的 CA07-0012中考查OPS的生产率。结果显示，相比于显示出OPS生产率为1.1g/L的对照CA07-0012，表达由SEQ ID NO:1定义的本发明多肽的生产OPS的菌株显示出OPS生产率为1.6g/L，而表达由SEQ ID NO:2定义的本发明多肽的生产OPS的菌株显示出OPS生产率为1.5 g/L。另外，作为表达RhtB的比较组的生产OPS的菌株显示出OPS生产率为1.3g/L，其OPS生产率低于表达本发明肽的生产OPS的菌株的OPS生产率，而表达EmrD和YacD的生产OPS的菌株分别显示出OPS 生产率为1.2g/L和0.9g/L，其OPS生产率等同于或低于对照组的OPS 生产率(表3及实施例3)。此外，使用具有增强的SerA和SerC(其涉及OPS的生物合成途径)活性的生产OPS的菌株 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC验证了上述结果，结果证实，相比于对照组和表达EmrD或YcaD的比较组，表达本发明多肽的生产 OPS的菌株显示出高的OPS生产率(表4及实施例3)。此外，在本发明中，为了证实本发明多肽是否显示出OPS输出功能，将输出的OPS 从培养具有增强的YggT和MacB蛋白活性的菌株的培养基中移除，之后测量OPS的细胞内浓度。结果显示，相比于对照组，具有增强的YggT 和MacB活性的菌株显示出约30％OPS浓度的减少，表明本发明多肽起着OPS输出功能的作用(图1及实施例4)。
本发明的另一方面还包括具有O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的分离的多肽，所述多肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列定义；编码该多肽的多核苷酸；以及包含该多核苷酸的载体。
在此，O-磷酸丝氨酸和多肽如前所述。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”是指通过共价键彼此连接形成链的核苷酸单元聚合物。其通常是指具有任意长度的DNA或RNA链。
编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的本发明多肽的多核苷酸可具体地为具有SEQ ID NO:3的多核苷酸序列的多核苷酸，但不限于此。此外，本发明多肽的范围不仅可涵盖具有SEQ ID NO:3的多核苷酸序列的多核苷酸，而且可涵盖具有与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、甚至更具体地至少 90％、甚至更具体地至少95％以及最具体地至少98％的相似性的核甘酸序列并且可以编码基本上具有OPS输出活性的多肽的多核苷酸。另外，明显的是，在至少一个氨基酸残基中具有包含缺失、修饰、取代或添加的多核苷酸序列的变体也落在本发明的范围内。
而且，编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的本发明多肽的多核苷酸可具体地是具有SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的多核苷酸，但不限于此。此外，本发明多肽的范围不仅可涵盖具有SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的多核苷酸，而且可涵盖具有与SEQ ID NO:4的多核苷酸序列具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、甚至更具体地至少90％、甚至更具体地至少95％以及最具体地至少98％的相似性的核甘酸序列并且可以编码基本上具有OPS输出活性的多肽的多核苷酸。另外，明显的是，具有在至少一个氨基酸残基中包含缺失、修饰、取代或添加的多核苷酸序列的变体也落在本发明的范围内。
如本文所使用的，术语“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞中的任何运载体。载体可以是另一DNA区段可附着的复制子，以引起附着的区段的复制。“复制子”是指在体内起DNA复制的自主单元作用，即，能够在其自我控制下进行复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”可包括用于在体外、离体或体内将核酸引入宿主细胞中的病毒和非病毒运载体。术语“载体”还可包括微环DNA。例如，载体可以是无细菌DNA序列的质粒。在CpG区域中富含的细菌DNA序列的移除已被显示降低了转基因表达沉默，并且由质粒DNA载体产生更多的持续表达(例如，Ehrhardt, A等人.(2003)HumGene Ther 10:215-25；Yet,N.S.(2002)MoI Ther 5: 731-38；Chen,Z.Y.等人.(2004)Gene Ther 11:856-64)。术语“载体”还可包括转座子(Annu Rev Genet.2003；37:3-29)或人工染色体。具体地，在本发明中使用的载体可以是pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322或pMW118载体。在本发明的实施例中，使用pCL1920载体。
本发明的另一方面还包括具有增强的多肽活性的生产O-磷酸丝氨酸的微生物，所述多肽具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列并且具有 O-磷酸丝氨酸输出活性。
在此，O-磷酸丝氨酸、多肽和生产O-磷酸丝氨酸的微生物如前所述。
本发明的另一个方面还包括生产半胱氨酸或其衍生物的方法，该方法包括在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下，使通过上述用于生产O-磷酸丝氨酸的方法生产的O-磷酸丝氨酸与硫化物反应。
具体地，生产半胱氨酸或其衍生物的方法包括以下步骤：a)通过培养具有增强的多肽活性的生产OPS的微生物而生产OPS，所述多肽具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列并且具有OPS输出活性反应；和 b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下，使步骤a)中生产的OPS与硫化物反应。
如本文所使用的，术语“O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(被描述为“OPSS”)”是指催化反应的酶，在该反应中，将硫醇基(SH)提供给 OPS，以将OPS转化为半胱氨酸。该酶最初被发现于嗜热古细菌 (Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatics)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)中(MinoK and Ishikawa K,FEBSletters,551:133-138,2003； Burns KE et al.,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005)。此外，OPSS 的范围不仅包括野生型OPSS蛋白，还包括变体，所述变体包含缺失、取代或添加一个或多个编码OPSS的多核苷酸序列的核苷酸，并显示出与野生型OPSS蛋白相等或较高的生物活性。另外，OPSS的范围包括在韩国专利公开号10-2012-0041115和韩国专利登记号10-1208267 中公开的OPSS蛋白及其变体。
在本发明中使用的硫化物可以是任何硫化物，其不仅可以本领域通常使用的固体形式提供，而且由于pH、压力和/或溶解度的差别，可以是液体或气体形式，并且可被转化为硫醇基(SH)，例如，以二价硫 (S2-)或硫代硫酸根(S2O3 2-)的形式。具体地，在本发明中使用的硫化物可以是Na2S、NaSH、H2S、(NH4)2S、NaSH或Na2S2O3，其可向 OPS提供硫醇基。在反应中，单个硫醇基被供应至单个反应性OPS基团，以产生单个半胱氨酸或其衍生物。在该反应中，以每摩尔OPS 0.1-3 摩尔，具体地1-2摩尔的量具体地加入硫化物。最具体地，考虑到经济情况，以1:1的摩尔比使用OPS和提供硫醇基的硫化物。
此外，本发明的方法进一步包括对由步骤b)反应产生的半胱氨酸进行分离和纯化的步骤。在此，使用本领域已知的合适反应可以从反应溶液中对其进行分离和纯化来收集所需的半胱氨酸。
另外，由本发明方法所生产的半胱氨酸可以通过本领域已知的化学合成反应被容易地合成为半胱氨酸衍生物。
如本文所使用的，术语“衍生物”是指通过对任何化合物中的一部分进行化学修饰而得到的相似化合物。通常，该术语意思是这样的化合物，其中氢原子或原子基团被另一个氢原子或原子基团所取代。
如本文所使用的，术语“半胱氨酸衍生物”是指这样的化合物，其中半胱氨酸中的氢原子或原子基团被另一个原子或原子基团取代。例如，半胱氨酸衍生物可具有这样的形式，其中半胱氨酸中胺基(-NH2) 中的氮原子或硫醇基(-SH)的硫原子具有所附着的另一个原子或原子基团。半胱氨酸衍生物的实例包括但不限于NAC(N-乙酰半胱氨酸)、 SCMC(S-羧甲基半胱氨酸)、BOC-CYS(ME)-OH、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺基丙酸、D-2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、3-亚磺基-L-丙氨酸、Fmoc-cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-胱氨酸、S-(2- 噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸等。通过与乙酰化试剂反应，半胱氨酸可以被容易地合成为NAC (N-乙酰半胱氨酸)，并且在碱性条件下，通过与卤乙酸反应，其被容易地合成为SCMC(S-羧甲基半胱氨酸)。这些半胱氨酸衍生物主要用作药物材料，包括止咳药、镇咳剂以及用于支气管炎、支气管性气喘和咽喉痛的治疗剂。
发明方式
在下文中，将参考实施例对本发明进行进一步地详细描述。然而，将理解，这些实施例仅用于说明性目的，并不意在限制本发明的范围。
实施例1：鉴定具有O-磷酸丝氨酸输出活性的新型膜蛋白
为了鉴定涉及O-磷酸丝氨酸输出的大肠杆菌膜蛋白，使用大肠杆菌K12_W3110(ATCC 27325)的基因组DNA文库进行筛选。
具体地，为建立受OPS抑制的大肠杆菌生长的条件，构建出生产 OPS的平台菌株。用于筛选的平台菌株是一种经突变以降低野生型大肠杆菌菌株W3110中的内源性磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性的重组微生物，并被命名为“CA07-0012”(KCCM11212P；韩国专利公开号 10-2012-0041115)。使用生产OPS的菌株CA07-0012，通过另外添加 OPS至培养基而建立显示生长抑制的最佳筛选条件。
然后，通过电穿孔将W3110的基因组文库质粒转化进CA07-0012 (van der Rest等人，1999)，并选择在含有过量OPS的培养基条件下显示去除生长抑制的菌落。从所选菌落中获得质粒，并通过测序技术对其核甘酸序列进行分析。结果，鉴定出涉及在含有过量OPS的培养基条件下去除生长抑制的两种大肠杆菌膜蛋白。
经鉴定两种大肠杆菌膜蛋白为yggT和macB，其分别编码预测的内膜蛋白(SEQ IDNO:1)和MacAB-TolC大环内酯输出转运系统-膜亚单元(SEQ ID NO:2)(Ito T,Uozumi N,Nakamura T,Takayama S, Matsuda N,Aiba H,Hemmi H,Yoshimura T(2009)."Theimplication of YggT of Escherichia coli in osmotic regulation."BiosciBiotechnol Biochem 73(12)；2698-704.PMID:19966467,Pao SS,Paulsen IT,Saier MH(1998)."Major facilitator superfamily."Microbiol Mol Biol Rev 1998； 62(1)；1-34.PMID:9529885)。
实施例2：构建yggT-和macB-过度表达的载体
为了考查当实施例1中鉴定的YggT和MacB基因(其涉及通过 O-磷酸丝氨酸去除生长抑制)在生产OPS的菌株中增强时OPS输出活性是否增强，构建了表达每个基因的载体。
因为本发明人确认当高丝氨酸/高丝氨酸内酯转运蛋白RhtB在生产OPS的菌株中增强时OPS浓度增加(韩国专利公开号 10-2012-0041115)，因此RhtB-增强的菌株被用作考查OPS生产率的实验中的阳性对照。此外，也对属于MacB所属的主要易化子超家族 (MFS)的多重药物输出转运蛋白EmrD和YcaD进行评价。
在该实施例中，通过使用W3110的基因组DNA作为模板进行PCR 而获得编码YggT(预测的内膜蛋白)的基因yggT的片段(SEQ ID NO： 3；登录号：b3473)和编码MacB(MacAB-TolC大环内酯输出转运系统-膜亚单元)的基因macB的片段(SEQ ID NO:4；登录号：b2077)。
用于构建表达每种大肠杆菌膜蛋白的载体的引物序列显示在下表 1中。
表1
Figure BDA0000843007890000151
具体地，使用SEQ ID NOS:5和6的引物进行针对yggT的PCR，并使用SEQ ID NOS:7和8的引物进行针对macB的PCR。基于保藏于NIH GenBank和围绕核甘酸序列的K12W3110基因(GenBank登录号AP 003471)的信息，构建用于PCR的引物。用限制酶EcoRV和 HindⅢ对每种扩增基因片段进行处理，并克隆到pCL-PrhtB载体的Ec oRV和HindⅢ限制酶位点，所述pCL-PrhtB载体包含插入到pCL1920 载体(GenBank No AB236930)中的大肠杆菌rhtB基因的启动子，从而构建pCL-PrhtB-yggT、pCL-PrhtB-macB、pCL-PrhtB-emrD和pCL-P rhtB-ycaD。
此外，使用五种构建质粒中的每一种作为模板和SEQ ID NOS N O:15和16的引物对包含rhtB启动子的各基因片段进行扩增。用限制酶HindⅢ对每种扩增片段进行处理，并克隆到包含抵抗丝氨酸反馈的 serA基因和serC基因的pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC中(韩国专利公开号10-2012-0041115)，从而构建pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-rhtB、pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-yggT、pCL-Prmf-serA*(G33 6V)-serC-PrhtB-macB、pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-emrD和pC L-Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-ycaD。
实施例3：构建YggT-和MacB-增强的菌株和评价O-磷酸丝氨酸的生产率
将实施例3中构建的五种质粒中的每一种引入到生产OPS的菌株 CA07-0012中，然后对所得菌株的O-磷酸丝氨酸生产率进行评价。
具体地，将每种菌株接种于LB固体培养基上，并于33℃在培养箱中培养过夜。将在LB固体培养基上培养过夜的每种菌株接种于下表 2中所示的25mL效价培养基(titermedium)中，然后在34.5℃和200 rpm下培养30小时。培养结果显示在表3中。
表2
组分 浓度(每升)
葡萄糖 50g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 6g
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 17g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 5mg
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 10mg
L-甘氨酸 2.5g
酵母提取物 3g
碳酸钙 30g
pH 6.8
表3
Figure BDA0000843007890000161
由上表3可见，相比于对照CA07-0012和具有增强的rhtB、emrD 或ycaD的菌株，当将大肠杆菌膜蛋白基因yggT或macB另外引入大肠杆菌CA07-0012菌株时，菌株中的O-磷酸丝氨酸的产生显著地增加。
此外，使用由于增强SerA(D-3-磷酸甘油酸脱氢酶)和SerC(3- 磷酸丝氨酸氨基转移酶)活性(其涉及OPS的生物合成途径)而具有增加的OPS生产率的生产OPS的菌株 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC(KCCM11103P；韩国专利公开号102012004115)，证实了通过本发明的大肠杆菌膜蛋白YggT和 MacB的OPS输出活性对OPS生产率的增加。结果显示在下表4中。
表4
Figure BDA0000843007890000171
由上表4可见，当将大肠杆菌膜蛋白另外地引入相比于大肠杆菌CA07-0012菌株具有增强的OPS生产率的CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G 336V)-serC时，相比于对照组菌株，具有增强的yggT或macB蛋白基因活性的菌株中的OPS的产生增加约120％，与上表3中显示的结果相似，而具有增强的emrD或ycaD的比较菌株中OPS的产生相比于对照菌株中OPS的产生降低。
此外，CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-yggT——具有增强的SEQID NO:1的YggT活性的生产OPS的微生物的代表性实例——被命名为“大肠杆菌CA07-0228”，并于2013年3月7日保藏于布达佩斯条约下所承认的国际保藏机构，韩国微生物保藏中心，
登录号为KCCM11399P。另外，CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-PrhtB-macB——具有增强的SEQ ID NO:2的MacB活性的生产OPS的菌株的代表性实例——被命名为“大肠杆菌CA07-0229”，并于2 013年3月7日保藏于布达佩斯条约下所承认的国际保藏机构，韩国微生物保藏中心，登录号为KCCM11400P。
上述结果表明，本发明的YggT和MacB蛋白具有优异的OPS输出活性，而不同于属于相同家族的其它蛋白质，这表明本发明的蛋白质对于OPS的生产是有用的。
实施例4：考查YggT和MacB的功能
在实施例3证实生产OPS的样品之中，使用不具有增强的膜蛋白的阴性对照样品和具有增强的YggT或MacB蛋白的样品。具体地，将输出到培养基中的OPS完全移除，然后只收集细胞并使细胞破裂。随后，使用HPLC仪器测量细胞中的OPS浓度，测量结果显示在图1中。
结果显示，相比于对照，具有增强的YggT或MacB的菌株的细胞内OPS浓度降低30％。这样的结果表明，yggT和macB对从细胞中输出OPS起作用，表明当yggT或macB在生产OPS的菌株中增强时，其可对从菌株的细胞中输出OPS起作用，从而增加OPS的产生(图1)。
虽然本发明的优选实施方式已为说明目的而描述，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明随附权利要求的范围和精神下各种修改、添加和替换是可能的。
Figure BDA0000843007890000191
Figure BDA0000843007890000201
Figure IDA0000843007950000011
Figure IDA0000843007950000021
Figure IDA0000843007950000031
Figure IDA0000843007950000041
Figure IDA0000843007950000051
Figure IDA0000843007950000061
Figure IDA0000843007950000071

Claims (8)

1.生产O-磷酸丝氨酸(OPS)的方法，其包括培养生产O-磷酸丝氨酸的微生物，所述微生物的、具有O-磷酸丝氨酸输出活性的、由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的多肽的活性与野生型微生物的多肽活性相比增强。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生产O-磷酸丝氨酸的微生物，与野生型微生物的多肽的活性相比，进一步具有降低的内源性磷酸丝氨酸磷酸酶活性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生产O-磷酸丝氨酸的微生物，与野生型微生物的多肽的活性相比，进一步具有增强的磷酸甘油酸脱氢酶或磷酸丝氨酸氨基转移酶活性。
4.生产O-磷酸丝氨酸的微生物，所述生产O-磷酸丝氨酸的微生物的、具有O-磷酸丝氨酸输出活性的、由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的多肽的活性与野生型微生物的多肽活性相比增强。
5.权利要求4所述的微生物，其中所述微生物进一步具有与野生型微生物的多肽的活性相比降低的内源性磷酸丝氨酸磷酸酶活性。
6.根据权利要求4所述的微生物，其中所述微生物进一步具有与野生型微生物的多肽的活性相比增强的磷酸甘油酸脱氢酶或磷酸丝氨酸氨基转移酶活性。
7.生产半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的方法，其包括以下步骤：
a)培养权利要求4至6中任一项所述的微生物，以生产O-磷酸丝氨酸(OPS)；和
b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下，使步骤a)中生产的所述O-磷酸丝氨酸与硫化物反应，
其中所述半胱氨酸衍生物是NAC(N-乙酰半胱氨酸)、SCMC(S-羧甲基半胱氨酸)、BOC-CYS(ME)-OH、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺基丙酸、D-2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、3-亚磺基-L-丙氨酸、Fmoc-cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、或S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述硫化物是选自Na2S、NaHS、(NH4)2S、H2S和Na2S2O3的一个或多个。
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