KR101493154B1 - 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법 - Google Patents

신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101493154B1
KR101493154B1 KR20130053428A KR20130053428A KR101493154B1 KR 101493154 B1 KR101493154 B1 KR 101493154B1 KR 20130053428 A KR20130053428 A KR 20130053428A KR 20130053428 A KR20130053428 A KR 20130053428A KR 101493154 B1 KR101493154 B1 KR 101493154B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ops
rhtb
leu
microorganism
ala
Prior art date
Application number
KR20130053428A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140133751A (ko
Inventor
김솔
김혜원
장진숙
유인화
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR20130053428A priority Critical patent/KR101493154B1/ko
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to PCT/KR2014/004150 priority patent/WO2014182119A1/en
Priority to EP14794775.8A priority patent/EP2994478B1/en
Priority to ES14794775.8T priority patent/ES2670035T3/es
Priority to US14/890,422 priority patent/US9765124B2/en
Priority to CN201480025110.1A priority patent/CN105377878B/zh
Priority to TW103116552A priority patent/TWI648290B/zh
Publication of KR20140133751A publication Critical patent/KR20140133751A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101493154B1 publication Critical patent/KR101493154B1/ko
Priority to US15/679,679 priority patent/US10125179B2/en
Priority to US15/679,671 priority patent/US10344059B2/en
Priority to US16/156,778 priority patent/US10738091B2/en
Priority to US16/423,986 priority patent/US10752659B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 L-시스테인 전구체인 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)의 배출능이 강화된, RhtB(homoserine/homoserine lactone efflux transporter) 단백질 변이체, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물, 상기 미생물을 이용하여 O-포스포세린을 생산하는 방법; 및 상기 방법으로 생산된 O-포스포세린을 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법{Novel RhtB mutein and the method of producing O-phosphoserine using the same}
본 발명은 L-시스테인 전구체인 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)의 배출능이 강화된, RhtB(homoserine/homoserine lactone efflux transporter) 단백질 변이체, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물, 상기 미생물을 이용하여 O-포스포세린을 생산하는 방법; 및 상기 방법으로 생산된 O-포스포세린을 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임A 생합성의 전구물질로 사용된다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로 1) 우선, 미생물을 이용하여 D,L-ATC를 생물학적으로 전환하는 방법이 알려져 있다(Ryu OH et al., Process Biochem., 32:201-209, 1997). 하지만 이 방법은 전구체인 D,L-ATC의 용해도가 낮아 산업화에 어려움이 있다. 2) 또 다른 방법은 대장균을 이용한 직접 발효법으로 L-시스테인을 생산하는 방법이 알려져 있다(유럽등록특허 EP0885962B; Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). 그러나, 이 방법은 미생물 내 L-시스테인이 과량 축적될 경우 세포 내 독성을 나타낼 수 있어, 미생물을 이용하여 높은 농도의 L-시스테인을 생산하는데 한계가 있다. 이에 본 발명자들은 새로운 L-시스테인 생산 방법을 모색하던 중, 특정 미생물에서는 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 이용하여 L-시스테인을 합성하는 효소(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)가 존재한다는 사실을 알게 되었으며, 이러한 사실에 근거하여 OPS를 축적하도록 변이된 미생물을 배양하여 상기 OPS와 OPSS 효소를 서로 반응시켜 시스테인을 생산하는 방법을 규명하였다(한국공개특허 제10-2012-004111호). 이때, 고수율의 시스테인 생산을 위해서 전구체인 OPS를 과량 생산하여야 할 필요가 여전히 존재하였다. 이에 본 발명자들은 OPS 생산 균주에서 생산된 O-포스포세린이 세포 밖으로 원활하게 배출시킬 수 있는 적절한 배출 인자를 규명하고자 예의 노력하였고, 기존에 밝혀진 다양한 종류의 트랜스포터(transporter)를 기반으로 O-아세틸세린/시스테인 배출 단백질을 코딩하는 ydeD, O-아세틸세린/시스테인 배출 투과효소(Efflux Permease)를 코딩하는 yfiK(Franke I, Resch A, Dassler T, Maier T and Bock A, J. Bacteriology, 185: 1161-166, 2003), 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질을 코딩하는 rhtB (Zakataeva NP, Aleshin VV, Tokmakova IL, Troshin PV, Livshits VA FEBS Lett 1999;452(3);228-32) 등을 스크리닝하였고, 특히 RhtB를 OPS 생산 균주에서 강화시켜 주었을 경우, OPS 농도가 상승하는 것을 확인한 바 있다(한국공개특허 제10-2012-0041115호). 그러나, 보다 높은 수율의 시스테인의 생산을 위하여 전구체인 OPS를 OPS 생산 균주로부터 보다 효과적으로 배출시킬 수 있는 트랜스포터 단백질 개발의 필요성이 여전히 존재하였다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 OPS의 배출능이 보다 증진되어 OPS 생산을 보다 증진시킬 수 있는 RhtB 단백질 변이체를 규명하기 위하여 예의 노력한 결과, OPS의 배출능이 증진된 4 종류의 RhtB 단백질 변이체를 규명하였고, 상기 단백질이 OPS를 보다 효과적으로 OPS 생산 균주로부터 배출시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)의 배출능이 강화된, RhtB(homoserine/homoserine lactone efflux transporter) 단백질 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 변이체를 포함하는, OPS 생산용 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, OPS 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산한 O-포스포세린을 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)의 배출능이 강화된, RhtB(homoserine/homoserine lactone efflux transporter) 단백질 변이체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)"은 세린 및 인산( phosphoric acid)의 에스터로서, 여러 단백질의 구성요소이다. 상기 OPS는 L-시스테인의 전구체로서, OPSS(OPS sulfhydrylase)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 시스테인으로 전환될 수 있다. 따라서, 시스테인의 생산에 있어 상기 OPS의 생산능을 증대시키는 것은 중요한 요소이므로, OPS 생산 균주에 있어서 효과적으로 세포 내 OPS를 밖으로 분비하는 트랜스포터의 개발이 요구된다.
본 발명에서 용어, "RhtB(homoserine/homoserine lactone efflux transporter) 단백질"은 쓰레오닌의 전구물질인 호모세린/호모세린 락톤의 배출인자로 공지되어 있다. 상기 RhtB 단백질에 대한 정보는 NCBI GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession number가 AAT48223(EG11469)인 단백질일 수 있으며, 그 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다.
본 발명에서 용어, "O-포스포세린의 배출능이 강화된, RhtB(homoserine/homoserine lactone efflux transporter) 단백질 변이체"는 OPS 배출 활성이 야생형 RhtB 단백질에 비하여 강화된 단백질로서, 야생형 RhtB 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 형태의 단백질을 의미한다. 본 발명자들은, RhtB 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 임의돌연변이를 유도하여, OPS의 배출능이 강화된 4종의 RhtB 단백질 변이체를 규명하였으며, 규명된 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 RhtB 단백질 변이체를 RhtB m1으로, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 RhtB 단백질 변이체를 RhtB m2로, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 RhtB 단백질 변이체를 RhtB m3로, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 RhtB 단백질 변이체를 RhtB m4로 각각 명명하였다.
본 발명의 RhtB 단백질 변이체는 상기 서열번호 2, 3, 4 또는 5로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 야생형 RhtB 단백질에 비하여 O-포스포세린 배출능이 강화된 단백질이라면 제한없이 포함하며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 RhtB 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동"은 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태인 슈퍼 패밀리 유래 단백질 및 다른 종 유래의 상동 단백질을 포함하며, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용 상에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열이 아미노산 서열의 소정의 길이에 대해 폴리펩티드 매치가 적어도 21%(바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다(예. Sambrook et al., 1989, infra 참고).
본 발명의 상기 RhtB 단백질 변이체는 야생형 RhtB 단백질에 비하여 OPS 배출능이 증대되어 있으므로, 본 발명의 RhtB 단백질 변이체를 OPS 생산 미생물에 발현시켜, 상기 미생물의 OPS 생산능을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 OPS 배출능이 증대된 RhtB 단백질 변이체를 확보하기 위하여, 야생형 RhtB 단백질을 코딩하는 유전자에 임의적 돌연변이를 시켜, 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB) 활성이 약화된 재조합 대장균 미생물에 도입하여, 과량의 OPS가 첨가된 배지 조건 하에서 생육 저하가 해제된 콜로니를 선별하였고, 이로부터 상기 4 종류의 RhtB 단백질 변이체를 규명하였다(실시예 1). 또한, 본 발명의 RhtB 단백질 변이체를 발현하는 내재적 SerB 활성이 약화된 OPS 생산 균주의 경우, 야생형 RhtB 단백질을 발현하는 OPS 생산 균주에 비하여 최대 10% 이상의 OPS 생산능이 증대된 결과를 나타내었으며, RhtB 단백질 변이체를 발현하는 SerA 및 SerC의 활성이 강화된 균주의 경우, 최대 14% 이상의 증가된 OPS 생산능을 나타내었다(실시예 2). 이와 같은 결과는 본 발명의 RhtB 단백질 변이체를 OPS 생산 균주에 사용하는 경우, OPS 생산능을 획기적으로 증가시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 RhtB 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체가 공유결합에 의하여 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체로, 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미하며 본 발명에서는 상기 RhtB 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함하며, 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다(예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) HumGene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64). 또한, 상기 벡터는 트랜스포존(Annu Rev Genet. 2003; 37:3-29.), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322 및 pMW118 벡터 등을 사용할 수 있으며 본 발명의 일 실시예에서는 pCL1920 벡터를 사용하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물을 제공한다.
상기 RhtB 단백질, RhtB 단백질 변이체 및 OPS에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물은 야생형 RhtB 단백질을 포함하는 미생물에 비하여 OPS를 효과적으로 배출시키므로, 시스테인의 전구체인 OPS 생산에 보다 유용하게 사용될 수 있다.
상기 OPS 배출능이 강화된 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물은, 상기 RhtB 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자가 돌연변이되어 OPS 배출능이 내재적 활성보다 증가된 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 미생물 또는/및 OPS 배출능이 강화된 RhtB 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시켜 OPS 배출능이 강화된 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 미생물이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물로서, OPS 배출능이 강화된 RhtB 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 대장균에 도입시켜 OPS 배출능이 강화된 OPS 생산용 미생물을 제작하였다.
또한, 상기 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물은, RhtB 단백질 변이체의 활성이 강화된 것일 수 있다.
상기 RhtB 단백질의 활성을 강화시키는 방법으로는, 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 단백질 변이체를 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 단백질 변이체를 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 단백질 변이체의 활성이 증가되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 단백질의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 활성을 강화시키는 방법은 다른 단백질의 활성 강화 시에도 동일하게 적용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 RhtB 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 당 업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 상기 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "OPS 생산용 미생물"은 OPS를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주를 의미하며, 그 예로 유전적 조작에 의하여 OPS를 축적할 수 있는 미생물이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 미생물은 RhtB 단백질 변이체를 포함하여 OPS를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하며, 그 예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속 미생물이며, 더욱 바람직하게는 대장균을 들 수 있다. 특히, 상기 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속 미생물의 경우, L-세린의 생합성 경로의 효소인 SerA, SerC 및 SerB 단백질을 포함하여, OPS 및 L-세린을 생산할 수 있다(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 october; Wendisch VF et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;71(11):7139-44.).
상기 OPS를 생산하는 미생물은 바람직하게는 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 약화되도록 변이된 미생물이다. SerB는 OPS를 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 지니므로, 상기 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물은 OPS를 축적하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 SerB의 활성 약화는 변형되지 않는 균주에 비하여, SerB의 활성이 감소된 것을 의미하고, 활성이 제거된 경우도 포함한다. 상기 SerB 활성을 약화시키는 방법은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법의 예는, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약한 서열로 교체하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자를 결손시키는 방법 및 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 내재적 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물로서, 한국공개특허 제10-2012-004115호에 개시된 CA07-0012(기탁번호:KCCM11121P)에 본 발명의 RhtB 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입하였다.
또한, 상기 OPS를 생산하는 미생물은 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 강화된 것일 수 있다.
상기 SerA는 3-포스포글리세라이트를 3-포스포하이드록시피루베이트로 전환하는 활성을 가지는 단백질이며, 상기 SerA는 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체가 사용될 수 있다. 또한, 상기 SerC는 3-포스포하이드록시피루베이트를 O-포스포세린으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이다. 따라서, 상기 SerA 또는/및 SerC의 활성이 강화된 미생물은 OPS 생산 균주로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 및 SerC의 활성이 강화된 미생물인 한국공개특허 제10-2012-004115호에 개시된 CA07-0022 / pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC(KCCM11103P)를 OPS 생산 균주로 사용하여, 이 균주에 본 발명의 RhtB 단백질 변이체를 도입하여 OPS를 생산하였다. 또한, 본 발명에서는 OPS 배출능이 강화된 rhtB 변이체가 도입된 대표적인 균주인, 본 발명의 RhtB m1 변이체를 포함하는 OPS 생산 균주 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-rhtB m1을 Escherichia coli CA07-0227이라 명명하고, 이를 2013년 03월 07일자로 부다페스트조약에 따른 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean culture center of microorganisms)에 기탁하여, 기탁번호 KCCM11398P를 부여받았다(실시예 2).
또한, 상기 OPS 생산용 미생물은 추가로 OPS의 세포 안으로의 유입 또는 분해 능력을 감소된 것일 수 있다.
구체적으로, PhnC/PhnD/PhnE 알킬포스포네이트 ABC 트랜스포터(PhnCDE 오페론, 구체적으로 포스포네이트 전달의 ATP-결합요소(ATP-binding component of phosphonate transport, PhnC; EG 10713)-Pn 트랜스포터의 주변세포질 결합단백질 요소(periplasmic binding protein component of Pn transporter, PhnD; EG 10714)-알킬포스포네이트 ABC 수송체의 내재막 요소(integral membrane component of the alkylphosphonate ABC transporter, PhnE; EG 11283)임), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase; PhoA) 또는 에시드포스파아제(acid phosphatase; AphA)의 활성이 약화될 수 있다.
본 발명의 OPS 생산용 미생물은 추가로 피리미딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제(nucleotide transhydrogenase, PntAB; EC 1.6.1.1)의 활성이 강화된 것일 수 있다. 상기 PntAB는 기존 문헌(Sauer U P et al., J Biol Chem.20;279(8):6613-9. Epub 2003)에 명시되어 있는 바와 같이, NADPH 대사작용에 관여하여 세포 내 레독스발란스(redox balance)을 조절하게 된다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OPS 생산용 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, OPS 생산방법을 제공한다.
상기 OPS 및 OPS 생산용 미생물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 생산 방법은 a) 상기 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물을 배양하여 OPS를 생산하는 단계; 및 b) 상기 배양물로부터 OPS를 분리하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 a) RhtB 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물을 배양하여 OPS를 생산하는 단계; 및 b) 상기 배양물로부터 OPS를 분리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 OPS 생산용 미생물은 바람직하게는 내재적 SerB 활성이 약화되어 OPS를 축적할 수 있는 미생물이며, 추가로 세린 피드백이 해제된 SerA 또는/및 SerC 활성이 강화된 것일 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 내재적 SerB 활성이 약화된 재조합 미생물의 배양은, 상기 미생물의 세린 요구성이 유도되어 배지에 글리신 또는 세린을 추가로 포함하여야 한다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 포함하는 이스트 추출물, 트립톤의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10 g/L, 바람직하게는 0.5 내지 3 g/L 이다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5 g/L, 바람직하게는 0.1 내지 1 g/L 이다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속 될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.
본 발명은 상기 배양 단계에서 생산된 OPS를 추가로 분리 및 정제할 수 있으며, 그 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 OPS를 수집할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 4종의 RhtB 변이체를 포함한 플라스미드를 각각 OPS 생산주에 도입한 다음, 이를 배양하여 OPS 생산능을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 4종의 변이체에 대한 플라스미드가 도입된 OPS 생산주는 야생형 RhtB에 대한 플라스미드가 도입된 OPS 생산주에 비하여 최대 14% 이상 OPS 생산이 증대된 결과를 나타내었다(실시예 2).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OPS의 생산 방법으로 생산한 OPS를, O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재하에, 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법은 a) 상기 RhtB 단백질 변이체를 포함하는 OPS 생산용 미생물을 배양하여 OPS를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제 (O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재하에, 상기 a) 단계에서 생산된 OPS를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 시스테인 합성 과정에 대해서는 도 1에 모식도로 나타내었다.
상기 a) 단계에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 본 발명은, b) 단계로, OPSS 단백질 또는 이를 발현하는 미생물의 존재하여, a) 단계에서 생성된 OPS를 황화물과 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 황화물은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드(sulfide, S2-), 티올설페이트(thiosulfate, S2O3 2 -) 등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH기)으로 전환될 수 있는 모든 황화물이면 이용 가능하다. 바람직하게는 티올 그룹을 OPS에 제공하는 Na2S, NaSH,H2S, (NH4)2S, NaSH 및 Na2S2O3를 이용할 수 있다. 상기 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 혹은 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배가 바람직하며, 1 내지 2배가 더욱 바람직하다. 가장 경제적으로 최적인 전환반응은 OPS와 티올그룹을 제공하는 황화물이 1:1(일대일) 몰비로 제공된 경우다.
본 발명에서 용어, "O-포스포세린 설피드릴레이즈(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS(O-phosphoserine)에 티올그룹(thiol, group, SH기)을제공하여 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매한다. 상기 효소는 애로피룸 페닉스(Aeropyrum pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 스메그마틱스(Mycobacterium smegmatics), 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis) (Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551: 133-138, 2003; Burns KE et al., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005)에서 처음으로 밝혀졌다. 또한, 상기 OPSS는 야생형 OPSS 단백질뿐만 아니라, 상기 OPSS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부 서열이 결실, 치환 또는 부가된 서열로서, 야생형 OPSS 단백질의 생물학적 활성과 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내는 단백질 변이체도 포함하며, 한국공개특허 제10-2012-0041115호 및 한국등록특허 제10-1208267호에 개시된 OPSS 단백질 및 이의 단백질 변이체도 모두 포함한다.
또한, 본 발명에서는 추가로 상기 단계 b)의 반응 단계를 통하여 생산된 시스테인을 분리 및 정제하는 단계를 포함한다. 이때, 당해 분야에 공지된 적합한 반응을 이용하여 반응액으로부터 목적하는 시스테인을 분리 및 정제하여 수집할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법으로 제조된 시스테인은 당업계에 공지된 화학적 합성 반응을 통하여 시스테인 유도체를 용이하게 합성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물로서, 대개 화합물 중 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다.
본 발명에서 용어, "시스테인 유도체"는 시스테인의 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미하며, 그 예로, 시스테인의 아민기(-NH2)의 질소 원자 또는 티올기(-SH)의 황 원자에 다른 원자 또는 원자단이 부착된 형태일 수 있으며, 그 예로 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH, (R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteine 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 시스테인은 아세틸레이션 에이젼트(acetylation agent)와 반응하여 NAC(N-acetylcysteine)로 쉽게 합성될 수 있으며, 염기성 조건에서는 할로아세틱 에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)로 합성될 수 있다. 상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로써 진해제, 기침 완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용된다.
본 발명의 RhtB 단백질 변이체는 야생형 RhtB 단백질에 비하여 OPS 배출능이 우수하므로, 이를 OPS 생산 미생물에 적용하여 OPS를 고효율로 생산하는 데 이용할 수 있다.
도 1은, O-포스포세린의 생합성 과정 및 미생물 발효로부터 O-포스포세린을 축적하고, 축적된 O-포스포세린을 기질로 효소 전환을 통하여 L-시스테인을 생산하는 방법을 도식화한 도이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: RhtB ( homoserine / homoserine lactone efflux transporter ) 변이체의 확보
O-포스포세린 균주의 배출능 증가를 위하여 OPS 배출자(exporter)의 특이성을 증가시키고자, 본 발명자들은 OPS 배출자인 RhtB의 변이체를 제작하였고, 그 과정은 하기와 같았다.
우선, 변이체 제작을 위하여 rhtB 개방해독틀(open reading frame)은 대장균(Escherichia coli K12_W3110, ATCC 27325) 게노믹 DNA를 주형으로 하였고, 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer) 쌍을 이용하여 임의돌연변이 유발 PCR(JENA error prone PCR)을 수행하였다. 이와 같은 과정으로 제작한 유전자 단편을 pCL1920 벡터(GenBank No AB236930)에 rmf 프로모터가 삽입되어 있는 pCL Prmf 벡터에 EcoRV와 HindⅢ로 자른 후, 클로닝하였다. 이때, rhtB 유전자의 증폭에는 서열번호 8 및 9의 프라이머를 사용하였다.
상기와 같은 과정으로 제작한 재조합 플라스미드 라이브러리들은 HTS(High Thoughput Screening)를 이용하여 스크리닝하였다. 이때, 스크리닝 기반 균주는 대장균 야생형 균주인 W3110에서 내재적 포스포세린 포스포타아제(phosphoserine phosphatase, serB)의 활성이 약화되도록 변이시킨 재조합 미생물로서, 이는 한국공개특허 제10-2012-0041115호 개시되어 있으며, 본 발명자들은 이를 CA07-0012 (KCCM11121P)로 명명하였다.
OPS 배출 활성이 증가된 변이체를 확보하기 위하여, 제작한 플라스미드 라이브러리들을 CA07-0012에 전기천공법으로 형질전환시킨 다음, 과량의 OPS가 첨가된 배지 조건에서 배양하여 생육 저하가 해제되는 콜로니를 선별하였다. 그 다음, 선별된 콜로니로부터 플라스미드를 획득하여 시퀀싱 기법을 통해 염기서열을 분석하였다.
상기와 같은 과정을 통하여, 과량의 OPS 첨가조건에서 생육 저하를 해제시키는데 관여하는 RhtB 변이체 4종을 선별하였고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 RhtB 단백질 변이체를 RhtB m1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 RhtB 단백질 변이체를 RhtB m2, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 RhtB 단백질 변이체를 RhtB m3, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 RhtB 단백질 변이체를 RhtB m4로 각각 명명하였다.
실시예 2: 실시예 1의 rhtB 변이체의 OPS 생산 균주에서의 OPS 배출능 확인
실시예 1에서 동정한 4종의 변이체를 포함한 플라스미드를 각각 OPS 생산주인 CA07-0012에 도입한 균주를 제작한 다음, 이의 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 1의 25mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 34.5℃의 온도에서, 200rpm으로 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 이의 결과를 표 2에 나타내었다.
조성물 농도 (리터당)
포도당 50g
KH2PO4 6g
(NH4)2SO4 17g
MgSO4 ·7H2O 1g
FeSO4 ·7H2O 5mg
MnSO4 ·4H2O 10mg
L-글리신 2.5g
효모액기스 3g
탄산칼슘 30g
pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당
(g/L) 		O- 포스포세린 (g/L)
CA07-0012 / pCL-Prmf-rhtB(wt) 40 35 1.5
CA07-0012 / pCL-Prmf-rhtB m1 37 35 1.7
CA07-0012 / pCL-Prmf-rhtB m2 41 34 1.8
CA07-0012 / pCL-Prmf-rhtB m3 38 35 1.8
CA07-0012 / pCL-Prmf-rhtB m4 37 35 1.8
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 rhtB 변이체를 도입한 균주의 경우, 야생형 rhtB 유전자를 도입한 균주에 비하여, OPS 생산량이 최대 10%까지 증가하는 우수한 결과를 나타내었다.
본 발명의 rhtB 변이체의 활성을 재확인하기 위하여, OPS 생산능이 증가된 OPS 생산균주로서, OPS 생합성 경로인 SerA(3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase) 및 SerC(3-포스포세린 아미노트랜스퍼레이즈, 3-phosphoserine aminotransferase)의 활성을 강화시킨 균주 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC(KCCM11103P, 한국공개특허 제10-2012-0041115호)를 이용하였다. pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_Prmf-genes 벡터의 제작을 위하여, 상기 pCL-PrhtB-genes 벡터의 증폭에는 서열번호 6 및 7의 프라이머를 사용하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 다음, 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 상기 표 1의 25mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 34.5℃의 온도에서 200rpm으로, 배양기에서 48 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 3에 나타내었다.
균주명 OD562nm 소모당
(g/L) 		O-포스포세린(g/L)
CA07-0022 / pCL Prmf serA*C -Prmf-rhtB(wt) 43 33 2.5
CA07-0022 / pCL Prmf serA*C -Prmf-rhtB m1 41 31 2.6
CA07-0022 / pCL Prmf serA*C -Prmf-rhtB m2 42 31 2.6
CA07-0022 / pCL Prmf serA*C -Prmf-rhtB m3 42 32 3.0
CA07-0022 / pCL Prmf serA*C -Prmf-rhtB m4 41 31 2.6
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 rhtB 변이체를 OPS 생산능이 강화된 OPS 생산 균주에 도입한 경우, OPS 생산량을 최대 14%까지 증가시키는 결과를 나타내어, 본 발명의 rhtB 변이체를 OPS 생산에 유용하게 사용할 수 있음을 시사하였다.
또한, OPS 배출능이 강화된 rhtB 변이체가 도입된 대표적인 균주인, 상기 CA07-0022 / pCL Prmf serA*C-Prmf-rhtB m1을 Escherichia coli CA07-0227이라 명명하였고, 이를 2013년 03월 07일자로 부다페스트조약에 따른 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean culture center of microorganisms)에 기탁하여, 기탁번호 KCCM11398P를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11398P 20130307
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel RhtB mutein and the method of producing O-phosphoserine using the same <130> PA121044KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 206 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(206) <223> rhtB (homoserine / homoserine lactone efflux transporter) <400> 1 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Asn His Gly Tyr Arg Gly Ala Val Ala Ser Ile Ala Gly Leu Gln Thr 35 40 45 Gly Leu Ala Ile His Ile Val Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Leu 50 55 60 Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala 85 90 95 Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe 100 105 110 Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe 115 120 125 Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu 130 135 140 Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Ile 145 150 155 160 Val Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile 165 170 175 Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu 180 185 190 Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala 195 200 205 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(206) <223> rhtB (homoserine / homoserine lactone efflux transporter) m1 <400> 2 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Met Thr Ser Ile Ile Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Asn His Gly Tyr Arg Gly Ala Val Ala Ser Ile Ala Gly Leu Gln Thr 35 40 45 Gly Leu Ala Ile His Ile Ala Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Leu 50 55 60 Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala 85 90 95 Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe 100 105 110 Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe 115 120 125 Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu 130 135 140 Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Ile 145 150 155 160 Val Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile 165 170 175 Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu 180 185 190 Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala 195 200 205 <210> 3 <211> 206 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(206) <223> rhtB (homoserine / homoserine lactone efflux transporter) m2 <400> 3 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Asn His Gly Tyr Arg Gly Ala Val Ala Ser Ile Ala Gly Leu Gln Thr 35 40 45 Gly Leu Ala Ile His Met Val Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Leu 50 55 60 Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala 85 90 95 Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe 100 105 110 Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe 115 120 125 Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu 130 135 140 Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Thr 145 150 155 160 Val Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile 165 170 175 Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu 180 185 190 Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala 195 200 205 <210> 4 <211> 206 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(206) <223> rhtB (homoserine / homoserine lactone efflux transporter) m3 <400> 4 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Asn His Gly Tyr Arg Gly Ala Val Ala Ser Ile Ala Gly Leu Gln Thr 35 40 45 Gly Leu Ala Ile His Ile Val Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Leu 50 55 60 Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala 85 90 95 Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe 100 105 110 Gln Arg Ala Val Leu Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe 115 120 125 Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu 130 135 140 Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Thr 145 150 155 160 Val Met Ile Gly Tyr Ala Pro Pro Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile 165 170 175 Lys Gly Pro Lys Gln Met Arg Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu 180 185 190 Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala 195 200 205 <210> 5 <211> 206 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(206) <223> rhtB (homoserine / homoserine lactone efflux transporter) m4 <400> 5 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Ala Met Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Asn His Gly Tyr Arg Gly Ala Val Ala Ser Ile Ala Gly Leu Gln Thr 35 40 45 Gly Leu Ala Ile His Ile Val Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Leu 50 55 60 Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80 Ala Tyr Met Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala 85 90 95 Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe 100 105 110 Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe 115 120 125 Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Pro 130 135 140 Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Ile 145 150 155 160 Glu Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile 165 170 175 Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu 180 185 190 Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala 195 200 205 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of pCL-PrhtB-genes to constrct pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_Prmf-genes <400> 6 aagcttcggg cctcttcgct attacgc 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of pCL-PrhtB-genes to constrct pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_Prmf-genes <400> 7 aagcttaggc ttacccgtct tactgtc 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of rhtB to construct pCL-Prmf-rhtB <400> 8 gcgatatcat gaccttagaa tggtgg 26 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of rhtB to construct pCL-Prmf-rhtB <400> 9 gctctagatc acgcatgcct cgc 23

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 서열번호 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열을 가지는, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)의 배출능이 강화된, RhtB(homoserine/homoserine lactone efflux transporter) 단백질 변이체.
  3. 제2항의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  5. 제2항의 RhtB(homoserine/homoserine lactone efflux transporter) 단백질 변이체를 포함하는, O-포스포세린 생산용 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 약화되도록 변이된 것인, 미생물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 세린에 대한 피드백이 해제된 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 강화된 것인 미생물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 RhtB 단백질 변이체의 활성이 강화된 것인, 미생물.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  10. a) 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 생산하는 단계;
    b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 OPS를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 황화물은 Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
KR20130053428A 2013-05-10 2013-05-10 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법 KR101493154B1 (ko)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130053428A KR101493154B1 (ko) 2013-05-10 2013-05-10 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법
EP14794775.8A EP2994478B1 (en) 2013-05-10 2014-05-09 Novel rhtb protein variants and the method of producing o-phosphoserine using the same
ES14794775.8T ES2670035T3 (es) 2013-05-10 2014-05-09 Nuevas variantes de la proteína RhtB y método de producción de O-fosfoserina utilizando las mismas
US14/890,422 US9765124B2 (en) 2013-05-10 2014-05-09 RhtB protein variants and the method of producing O-phosphoserine using the same
PCT/KR2014/004150 WO2014182119A1 (en) 2013-05-10 2014-05-09 Novel rhtb protein variants and the method of producing o-phosphoserine using the same
CN201480025110.1A CN105377878B (zh) 2013-05-10 2014-05-09 新的RhtB蛋白变体和使用其产生O-磷酸丝氨酸的方法
TW103116552A TWI648290B (zh) 2013-05-10 2014-05-09 新穎ＲｈｔＢ蛋白變異體及使用該蛋白變異體製造Ｏ-磷絲胺酸的方法
US15/679,679 US10125179B2 (en) 2013-05-10 2017-08-17 RhtB protein variants and the method of producing O-phosphoserine using the same
US15/679,671 US10344059B2 (en) 2013-05-10 2017-08-17 RhtB protein variants and the method of producing O-phosphoserine using the same
US16/156,778 US10738091B2 (en) 2013-05-10 2018-10-10 RHTB protein variants and the method of producing O-phosphoserine using the same
US16/423,986 US10752659B2 (en) 2013-05-10 2019-05-28 RHTB protein variants and the method of producing O-phosphoserine using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130053428A KR101493154B1 (ko) 2013-05-10 2013-05-10 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140133751A KR20140133751A (ko) 2014-11-20
KR101493154B1 true KR101493154B1 (ko) 2015-02-13

Family

ID=51867513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20130053428A KR101493154B1 (ko) 2013-05-10 2013-05-10 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법

Country Status (7)

Country Link
US (5) US9765124B2 (ko)
EP (1) EP2994478B1 (ko)
KR (1) KR101493154B1 (ko)
CN (1) CN105377878B (ko)
ES (1) ES2670035T3 (ko)
TW (1) TWI648290B (ko)
WO (1) WO2014182119A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101493154B1 (ko) 2013-05-10 2015-02-13 씨제이제일제당 (주) 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법
KR101677328B1 (ko) * 2014-08-12 2016-11-18 씨제이제일제당 (주) O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법
KR101694632B1 (ko) * 2015-09-11 2017-01-10 씨제이제일제당 (주) 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
KR101825310B1 (ko) * 2016-12-29 2018-03-15 씨제이제일제당 (주) O-포스포세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인을 생산하는 방법
KR102025867B1 (ko) 2017-07-13 2019-09-27 씨제이제일제당 주식회사 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040099299A (ko) * 2002-03-07 2004-11-26 데구사 악티엔게젤샤프트 아미노산 생성 박테리아 및 ｌ-아미노산의 제조 방법
KR20120041115A (ko) * 2010-10-20 2012-04-30 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법
KR20120041073A (ko) * 2010-10-20 2012-04-30 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 설피드릴라제 변이체

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19726083A1 (de) 1997-06-19 1998-12-24 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten
RU2148642C1 (ru) * 1998-12-23 2000-05-10 ЗАО "Научно-исследовательский институт АДЖИНОМОТО-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты
KR101128106B1 (ko) 2010-07-06 2012-03-29 대한전선 주식회사 이종 도체를 구비한 전력 케이블 접속용 도체 슬리브, 알루미늄 도체를 구비한 전력 케이블 접속용 도체 슬리브, 그 제조 방법, 및 이를 구비한 접속함
KR101211209B1 (ko) 2010-07-06 2012-12-11 성균관대학교산학협력단 위치 정보를 활용한 영상 촬영 장치의 촬영 방법, 위치 정보를 활용한 영상 촬영 장치, 서버에서 위치 정보를 활용한 영상 촬영 방법을 제공하는 방법 및 위치 정보를 활용한 영상 촬영 방법을 제공하는 서버
WO2012053794A2 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same
WO2014145344A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Control of growth-induction-production phases
KR101493154B1 (ko) * 2013-05-10 2015-02-13 씨제이제일제당 (주) 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040099299A (ko) * 2002-03-07 2004-11-26 데구사 악티엔게젤샤프트 아미노산 생성 박테리아 및 ｌ-아미노산의 제조 방법
KR20120041115A (ko) * 2010-10-20 2012-04-30 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법
KR20120041073A (ko) * 2010-10-20 2012-04-30 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 설피드릴라제 변이체

Also Published As

Publication number Publication date
CN105377878A (zh) 2016-03-02
CN105377878B (zh) 2018-12-18
EP2994478A4 (en) 2016-11-09
US20170342114A1 (en) 2017-11-30
US10125179B2 (en) 2018-11-13
TWI648290B (zh) 2019-01-21
ES2670035T3 (es) 2018-05-29
US9765124B2 (en) 2017-09-19
KR20140133751A (ko) 2014-11-20
US10752659B2 (en) 2020-08-25
EP2994478B1 (en) 2018-02-28
US20160130310A1 (en) 2016-05-12
US10344059B2 (en) 2019-07-09
US20190023749A1 (en) 2019-01-24
US10738091B2 (en) 2020-08-11
EP2994478A1 (en) 2016-03-16
TW201500377A (zh) 2015-01-01
WO2014182119A1 (en) 2014-11-13
US20190284247A1 (en) 2019-09-19
US20170342115A1 (en) 2017-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101525663B1 (ko) 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린의 생산방법
EP3181685B1 (en) O-phosphoserine producing microorganism and method for producing o-phosphoserine or l-cysteine using same
US10752659B2 (en) RHTB protein variants and the method of producing O-phosphoserine using the same
EP3348567B1 (en) Novel o-phosphoserine efflux protein variant and method for producing o-phosphoserine, cysteine and derivative thereof using same
KR102414743B1 (ko) 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171129

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181126

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191125

Year of fee payment: 6