TW201500377A - 新穎RhtB蛋白變異體及使用該蛋白變異體製造O-磷絲胺酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白)蛋白變異體,該蛋白變異體對輸出為L-半胱胺酸之前驅物的O-磷絲胺酸(OPS)具有增強的活性、編碼該蛋白的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、製造OPS之微生物,該微生物包含該蛋白變異體、使用該微生物製造O-磷絲胺酸的方法、以及製造半胱胺酸或其衍生物的方法,該方法包含於O-磷絲胺酸巰基酶(OPSS)或表現該OPSS的微生物的存在下,使由上述方法製造之O-磷絲胺酸與硫化物進行反應。
Description
本發明是關於RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白(export transporter))蛋白變異體,該蛋白變異體對輸出為L-半胱胺酸之前驅物的O-磷絲胺酸(OPS)具有增強的活性、編碼該蛋白的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、製造OPS之微生物,該微生物包含該蛋白變異體、使用該微生物製造O-磷絲胺酸的方法、以及製造半胱胺酸或其衍生物的方法,該方法包含於O-磷絲胺酸巰基酶(OPSS)或表現該OPSS的微生物的存在下,使由上述方法製造之O-磷絲胺酸與硫化物進行反應。
L-半胱胺酸係一種胺基酸,於所有活的有機體當中之硫的代謝作用扮演了重要的角色,其不僅用於生物蛋白的合成,例如:毛髮角蛋白、麩胱甘肽、生物素、甲硫胺酸以及含硫的代謝物,也用於輔酶A之生物合成的前驅物。
已知有利用微生物製造L-半胱胺酸的方法,包括利用微生物將D,L-ATC生物轉換為L-半胱胺酸的方法(Ryu OH et al.,Process Biochem.,32:201-209,1997)。另一個已知的方法是藉由使用大腸桿菌直接發酵微生物來製造L-半胱胺酸的方法(EP 0885962B;Wada M and Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006)。同時,本案發明人也發現了一種於特定微生物中從O-磷絲胺酸(OPS)合成L-半胱胺酸的酵素(O-磷絲胺酸巰基酶(O-phosphoserine sulfhydrylase,OPSS))。基於這些習知方法,
本案發明人另外發展出了一種製造半胱胺酸的方法,係使OPS與OPSS酵素進行反應,其中,該OPS係由培養經突變的微生物而累積(韓國專利公開案KR 10-2012-004111)。為了製造大量的半胱胺酸,仍有需要製造出超量的OPS。據此,本案發明人盡心地開發了合適的運輸蛋白子(exporter),使得於用以製造OPS菌種中所產生的O-磷絲胺酸能被順利地運出。此外,基於不同種類的運輸蛋白,本案發明人篩選了ydeD,用以編碼O-乙醯基絲胺酸/半胱胺酸排出蛋白(efflux protein)、yfiK,用以編碼O-乙醯基絲胺酸/半胱胺酸輸排出透過酶通透酶(Franke I,Resch A,Dassler T,Maier T and Bock A,J.Bacteriology,185:1161-166,2003)、RhtB,用以編碼高絲胺酸/高絲胺酸內酯排出蛋白(Zakataeva NP,Aleshin VV,Tokmakova IL,Troshin PV,Livshits VA FEBS Lett 1999;452(3);228-32)、以及其他類似物,篩選後,特別地發現製造OPS之菌種中RhtB的擴增使得OPS的濃度增加(韓國專利公開案KR 10-2012-0041115)。然而,針對半胱胺酸更高產量的產出,仍需要開發出具有較高輸出能力的運輸蛋白,以將前驅物OPS由製造OPS之菌種中輸出。
本發明之發明人花費極大的努力開發了一種RhtB蛋白變異體,此種RhtB蛋白變異體具有增強的O-磷絲胺酸輸出活性,以進一步地增加O-磷絲胺酸的產量,並因此,發明人驗證出了四種具有增強的O-磷絲胺酸輸出活性之新穎RhtB蛋白變異體,該些蛋白變異體亦可更有效率地從製造OPS的菌種中輸出OPS,藉此完成了本發明。
本發明之一目的提供一種RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白)蛋白變異體,且此種蛋白變異體具有增強的O-磷絲胺酸(OPS)輸出活性。
本發明之另一目的提供一種編碼該蛋白變異體之多核苷酸,及一種包含該多核苷酸的載體。
本發明之又一目的提供一種製造O-磷絲胺酸的微生物,該微生物包含該蛋白變異體。
本發明之再一目的提供一種製造O-磷絲胺酸的方法,該方法包含培養該微生物。
本發明之又再一目的提供一種製造半胱胺酸或其衍生物的方法,該方法包含將以前述製造O-磷絲胺酸的方法所製造的O-磷絲胺酸與硫化物進行反應,且反應期間存在有O-磷絲胺酸巰基酶(OPSS)或表現OPSS的微生物。
圖1為藉由O-磷絲胺酸的生物合成和微生物發酵來累積O-磷絲胺酸,以及藉由酵素轉換所累積的O-磷絲胺酸以製造L-半胱胺酸之方法的示意圖。
本發明之態樣包括RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白)蛋白變異體,該蛋白變異體具有增強的O-磷絲胺酸(OPS)輸出活性。
於此,用語「O-磷絲胺酸」(下稱”OPS”)指的是絲胺酸與磷酸的酯類,也是許多蛋白的組份。OPS是L-半胱胺酸的前驅物且藉由與硫化物反應可以轉變成半胱胺酸,此種反應係於OPS巰基酶(下稱”OPSS”)的催化下進行。因此,對於在半胱胺酸的製造中提高OPS的產量是重要的因素,且因此,需要發展出可使細胞內之OPS有效地從製造OPS之菌種運送出來的運輸蛋白。
於此,用語「RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白)蛋白」係稱為高絲胺酸/高絲胺酸內酯的運輸子,其係絲胺酸的前驅物。關於RhtB蛋白的資訊係可由資料庫中得知,例如:NCBI基因銀行(NCBI GenBank)。舉例來說,登錄號為AAT48223
(EG11469)的蛋白質,其胺基酸序列可被設定為SEQ ID NO:1。
於此,「RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白)蛋白變異體,該蛋白變異體具有增強的O-磷絲胺酸輸出活性」的描述指的是與野生型的RhtB蛋白相比具有增強的OPS輸出活性的蛋白,其包含野生型的RhtB蛋白之胺基酸序列之一個或多個胺基酸的突變體。具有增強的OPS輸出活性之特定四種RhtB蛋白變異體係藉由誘導在多核苷酸編碼RhtB蛋白中之隨機突變體來識別。在該等識別的變異體當中,具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的RhtB蛋白變異體被標記為「RhtB m1」;具有SEQ ID NO:3之胺基酸序列的RhtB蛋白變異體被標記為「RhtB m2」;具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列的RhtB蛋白變異體被標記為「RhtB m3」;及具有SEQ ID NO:5之胺基酸序列的RhtB蛋白變異體被標記為「RhtB m4」。
本發明之RhtB蛋白變異體不僅包括具有SEQ ID NO:2、3、4或5之胺基酸序列的蛋白,也包含具有與SEQ ID NO:2、3、4或5之胺基酸序列顯示至少70%同源性,特定係至少80%同源性,更特定係至少90%同源性、再特定係至少95%同源性、又再特定係至少98%同源性、甚至是至少99%同源性的胺基酸序列的蛋白,且相對於野生型的RhtB蛋白,具有實際增強的O-磷絲胺酸輸出活性。此外,明顯地,只要包含與前述RhtB蛋白之間的同源性或實際上相同的生物活性,該蛋白便包含缺失、修飾、取代或增加也被包含在本發明範疇中之RhtB蛋白之胺基酸序列的一個或多個胺基酸。
於此,用語「同源性(homology)」所指的是兩個多核苷酸或多肽部分之間同一性的百分比。序列彼此間的對應可以藉由該發明所屬技術領域中的習知技術來決定。舉例來說,同源性可以藉由兩個多核苷酸或多肽部分之間的序列資訊進行直接的比對來決定,此種比對是藉由將序列資訊對齊並利用電腦程式進行比對。或者,同源性也可以藉由多核苷酸的雜交作用來決定,其中,作用條件係可於同源區域中形成穩定的雙股,接著進行單鏈專一性
核酸酶的分解並選擇被分解片段的尺寸。
於此,在所有語法結構和拼字差異中,用語「同源的(homologous)」指的是蛋白之間的關係,此種蛋白具備有相同的演化源頭,包括由源自超家族來的蛋白以及不同種類的同源蛋白。這些蛋白(及其編碼基因)具有序列同源性,反應在其高程度的序列相似度上。然而,在通常使用與本發明中,當以形容詞修飾用語「同源的」時,如:「高程度的」,表示的便是序列的相似度,而非相同的演化源頭。
於此,用語「序列相似度(sequence similarity)」指的是可能或並非共享一相同的演化源頭之蛋白的核酸或胺基酸序列間的同一性或對應的程度。於一實施例中,當多肽至少約21%(更特定地說,至少約50%,再更特定地說,至少約75%、90%、95%、96%、97%或99%)與胺基酸序列之經定義的長度匹配時,兩胺基酸序列係「實質上同源」或「實質上相似」。實質上同源的序列可以藉由使用序列資料銀行中的標準軟體來比較序列來識別,或者例如在前述所定義之特定系統的嚴格條件下藉由南方核酸雜交分析實驗來進行識別。適當的定義雜交分析實驗的條件是該發明所屬技術領域中被習知的技術(請參照文獻Sambrook et al.,1989,infra)。
相較於野生型的RhtB蛋白,因為本發明的RhtB蛋白變異體具有增強的OPS輸出活性,因此製造OPS的微生物之OPS生產率可以藉由表現微生物中之本發明的RhtB蛋白變異體而提高。
於本發明之一實例中,為了識別具有增強的OPS輸出活性之RhtB蛋白變異體,係使編碼野生型的RhtB蛋白的基因隨機地突變,並且,經突變的基因被導入重組體的大腸桿菌微生物中,該微生物具有降低內生性磷絲胺酸磷酸酶(下稱「SerB」)的活性,且菌落在包含有過量的OPS之媒介環境下,該等菌落顯示出生長抑制的移除,藉此識別驗證如前述之實驗例1中所述之四種RhtB蛋白變異體。同時,製造OPS的菌種表現了本發明的RhtB蛋白變異體
並可降低內生性SerB的活性,相較於表現了野生型的RhtB蛋白之製造OPS的菌種,OPS生產率可以增加至10%,並且,具有增強的SerA和SerC活性,表現RhtB蛋白變異體的菌種之OPS生產率可以增加至14%(實例2)。此等結果顯示,對於製造OPS的菌種,本發明的RhtB蛋白變異體可以使菌種之OPS生產率明顯地增加。
本發明之另外態樣也包括編碼該RhtB蛋白變異體的多核苷酸,以及包含該多核苷酸的載體。
於此,用語「多核苷酸」指的是核苷酸單元藉由共價鍵彼此形成鏈狀的聚合物。此用語通常指的是具有任何長度的DNA或RNA股。於本發明中,此用語指的是編碼RhtB蛋白變異體的多核苷酸片段。
於此,用語「載體」指的是用於選殖核酸及/或轉移核酸進入宿主細胞的任何載具。載體可為DNA片段可以附著於其上的複製體(replicon),以攜帶附著的複製片段。用語「複製體」指的是任何在活體內可以作用為DNA複製之自主單元的基因物質(如:質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒),也就是說,可以在自主控制下進行複製。用語「載體」可同時包括病毒和非病毒的載體,用以在活體外、離體或活體內將核酸導入至宿主細胞中。載體也包括微環DNA。舉例來說,載體可為不具細菌DNA序列的質體。細菌DNA序列的移除在CpG聚集的區域是常見的,以減少轉形基因表現沉默的現象,也可以由質體DNA載體產生更多的持續表現(請參考文獻Ehrhardt,A.et al.(2003)HumGene Ther 10:215-25;Yet,N.S.(2002)Mol Ther 5:731-38;Chen,Z.Y.et al.(2004)Gene Ther 11:856-64)。用語「載體」也可以包括轉位子(請參考文獻Annu Rev Genet.2003;37:3-29)或人工染色體。更特定地,可使用載體,例如:pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322和pMW118,且於本發明之一實例中,係使用pCL1920載體。
本發明再一態樣亦包括了包含RhtB蛋白變異體之製造OPS的微生物。
於此,RhtB蛋白、RhtB蛋白變異體以及OPS係如前所述。
相較於包含野生之RhtB蛋白的微生物,包含有本發明之實例中的RhtB蛋白變異體之製造OPS的微生物可以有效地分泌OPS,並因此對於製造半胱胺酸之前驅物,即OPS,來說,是比較有用的。
包含具有增強的OPS輸出活性之RhtB蛋白變異體之製造OPS的微生物可以是包含有RhtB蛋白變異體的微生物,此乃由於編碼該RhtB蛋白的染色體基因的突變,使此種微生物具有增強的OPS輸出活性;及/或可以是包含具有增強的OPS輸出活性之RhtB蛋白變異體的微生物,且係藉由導入包含有編碼RhtB蛋白變異體之多核苷酸的載體而獲得,但本發明並不限於此。於本發明之一實例中,包含具有增強的OPS輸出活性之代表性RhtB蛋白變異體之製造OPS的微生物,可以藉由將載體導入至大腸桿菌中所建構,此種載體係包含編碼具有增強的OPS輸出活性之RhtB蛋白變異體的多核苷酸。
再者,包含有RhtB蛋白變異體之製造OPS的微生物可具有增強的RhtB蛋白變異體之活性。
增強RhtB蛋白之活性的方法包括有(但不限於此):增加編碼蛋白變異體的基因之細胞內的複製數量之方法、將突變導入編碼蛋白變異體之染色體基因的表現調節序列之方法、複製編碼具有強活性序列之蛋白變異體之染色體基因的表現調節序列之方法、以突變成增加蛋白變異體之活性的基因取代編碼該蛋白的染色體基因之方法、以及將突變導入用以編碼該蛋白質的染色體基因以增加該蛋白活性之方法。增加該蛋白之活性的方法同樣地可以應用於增加其他種蛋白之活性。
於此,用語「導入」指的是傳遞載體至宿主細胞的方法,該載體包含編碼RhtB蛋白變異體的多核苷酸。利用該發明所屬技術
領域中任何傳統的方法可以容易地進行此導入。通常,導入方法的舉例包括有:氯化鈣沉澱法、Hanahan法(一種經改善的氯化鈣沉澱法,其係利用二甲亞碸(DMSO)當作還原物料來增加效率)、電穿孔法、磷酸鈣沉澱法、原生質體融合法、利用碳化矽纖維進行的攪拌法、經農桿菌媒介的轉形法、經PEG媒介的轉形法、經硫酸葡聚醣媒介的轉形法、經脂質體(lipofectamine)媒介的轉形法、以及經乾燥/抑制媒介的轉形法。轉形載體的方法並不限於以上所述,該發明所屬技術領域中傳統的轉形或轉染的方法均可利用而無限制。
於此,用語「製造OPS的微生物」指的是其可以製造OPS的原核生物或真核之微生物菌種。舉例來說,製造OPS的微生物可以是藉由基因工程而於其累積OPS的微生物,但本發明並不限於此。為了實現本發明欲達成的目的,該種微生物可以是包含有RhtB蛋白變異體的原核生物或真核微生物,並因此可以製造OPS。該種微生物可以舉例包括:屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、紅色桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、以及短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物菌種。更特定地,該種微生物可以是大腸桿菌屬(Escherichia)之微生物。再更特定地,該種微生物可以是大腸桿菌。特定地,屬於大腸桿菌屬或棒狀桿菌屬的微生物可以製造OPS和左旋絲胺酸(L-serine),因為該些微生物包含SerA、SerC和SerB蛋白,其是左旋絲胺酸(L-serine)的生物合成途徑中的催化劑(Ahmed Zahoor,Computational and structural biotechnology journal,vol 3,2012 october、Wendisch VF et al.,Curr Opin Microbiol.2006 Jun;9(3):268-74、以及Peters-Wendisch P et al.,Appl Environ Microbiol.2005 Nov;71(11):7139-44)。
製造OPS的微生物可以是特定被突變成降低內生性磷絲胺酸磷酸酶(SerB)的活性的微生物。SerB具有可以將OPS轉換為左旋
絲胺酸(L-serine)的活性,並因此,被突變成降低SerB活性的微生物可具有累績其中OPS的特性,意味有用於OPS的製造。降低SerB之活性指的是,相較於沒有經突變的菌種來說,SerB的活性被降低或被去除。利用該發明所術技術領域中不同的習知方法可以達到降低SerB之活性的目的。降低SerB催化劑之活性的方法可以舉例有(但不限於):以突變成降低或去除該催化劑之活性的基因取代編碼該催化劑的染色體基因之方法、將突變導入編碼該催化劑之染色體基因的表現調節基因之方法、置換編碼具有低活性之基因的催化劑之染色體基因之表現調節序列(降低編碼該催化劑之染色體基因)之方法、導入反股寡核苷酸的方法,其中,該反股寡核苷酸互補地結合染色體基因的轉錄體,以抑制mRNA轉譯成蛋白、人工地加入互補於基因的SD序列之序列的方法,該基因係編碼SD序列前端的催化劑以形成二級結構,其中,該二級結構可以避免核醣體的附著、以及反轉錄工程方法(Reverse Transcription Engineering,RTE),其係加入一促進劑至對應序列的開放讀序框架(open reading frame,ORF)的3’端以進行反轉錄。於本發明之一實例中,利用韓國專利公開案(KR 10-2012-004115)以及美國專利公開案(US 2012-0190081)所公開的CA07-0012[登陸號:KCCM11121P]來做為突變成降低內生性SerB的活性的微生物,包含編碼本發明之RhtB蛋白變異體的多核苷酸之載體係被導入該微生物中。
此外,製造OPS的微生物可以是具有磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)的增強活性或磷絲胺酸轉胺酶(SerC)的增強活性之微生物。
SerA是一種具有將3-磷酸甘油酸酯轉換成3-磷酸羥基丙酮酸酯之活性的蛋白,並且,SerA也可為野生型的蛋白或可抵抗絲胺酸回饋抑制的突變種。又,SerC是一種具有將3-磷酸甘油酸酯轉換成O-磷絲胺酸之活性的蛋白。因此,具有增強的SerA及/或SerC增強的活性的微生物有利於作為製造OPS的菌種。於本發明之一實
例中,CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC(登錄號:KCCM11103P)具有SerA增強的活性(可抵抗絲胺酸回饋抑制)和具有SerC增強的活性(公開於韓國專利公開案KR 10-2012-004115),可以做為製造OPS的微生物。本發明之RhtB蛋白變異體係被導入至該種微生物內以製造OPS。同時,於本發明中,製造OPS的菌種(CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-RhtB m1)包含有本發明之RhtB m1蛋白變異體,該菌種係一代表性菌種,其中導入有具有增強之OPS輸出活性的RhtB蛋白變異體,稱為「大腸桿菌CA07-0227(Escherichia coli CA07-0227)」並於2013年3月7日寄存於韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms),登錄編號為KCCM11398P,其中,韓國微生物保存中心是布達佩斯條約下所承認的國際寄存機構。
除此之外,該種微生物進一步具有還原能力,以進行細胞內OPS的吸收和降解。
特定地說,該種微生物可為經突變的微生物,以降低PhnC/PhnD/PhnE磷酸烷基酯ABC運輸蛋白的活性(PhnCDE操縱子,也就是運輸磷酸酯的ATP結合組分(PhnC;EG 10713)-Pn運輸蛋白的胞外結核蛋白組分(PhnD;EG 10714)-磷酸酯ABC的膜主體蛋白組分(PhnE;EG 11283)、鹼性磷酯脢(PhoA)或酸性磷酸酶(AphA)。
本發明之製造OPS的微生物可進一步具有嘧啶核苷酸轉氫酶(PntAB;EC 1.6.1.1)的增強活性。如前述所提及的文獻(Sauer U P et al.,J Biol Chem.20;279(8):6613-9.Epub 2003)中所述,該轉氫酶參與了NADPH的代謝以調節細胞內的氧化還原平衡。
本發明也提供了一種製造OPS的方法,包含培養製造OPS的微生物。
於此,OPS和製造OPS的微生物係如前所述。
特定地說,製造OPS的方法可以包含有下述步驟:a)培養包含有RhtB蛋白變異體之製造OPS的微生物,以製造OPS;以及b)將該OPS與該微生物的培養物隔離。特定地說,此種方法可以包含有下述步驟:a)培養包含有RhtB蛋白變異體之製造OPS的微生物,以製造OPS;以及b)將OPS與微生物的培養物隔離,但本發明並不限於此。
製造OPS之微生物係一種專一性降低內生性SerB的活性的微生物,以使得OPS可以累積於其中。此外,製造OPS的微生物可進一步地增強SerA的活性,以抵抗絲胺酸回饋抑制,及/或進一步地增強SerC的活性,並且於此處之活性係如前所述。
於此,用語「培養」指的是使微生物生長在人工控制的環境當中。於本發明中,培養過程是利用該發明所屬技術領域中習知之適合的培養物和培養條件來進行。任何該發明所屬技術領域中具有通常知識者可以根據所選擇的菌種類型輕易地控制培養過程。特定地說,此種培養可以是分批式的、連續式的、或分批補料式的培養,但本發明並不限於此。
在培養具有內生性SerB之降低活性之重組型微生物時,培養物需要額外地包含有甘胺酸或絲胺酸,此係因為重組型微生物的絲胺酸營養缺陷性會被誘發。提供甘胺酸的形式可以是經純化的甘胺酸、包含甘胺酸的酵母萃取物、或胰化蛋白。於培養物中,甘胺酸的濃度通常是0.1g/L(克/升)至10g/L,更特定地說,是0.5g/L至3g/L。除此之外,提供絲胺酸的形式可以是經純化的絲胺酸、包含絲胺酸的酵母萃取物、或胰化蛋白。於培養物中,絲胺酸的濃度通常是0.1g/L至5g/L,更特定地說,是0.1g/L至1g/L。
此外,培養物可包含有碳源。碳源的舉例可以包括有醣類,以及碳水化合物,如:葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、以及纖維素、油和脂肪,如:沙拉油、葵花油、蓖麻油和椰子油,脂肪酸例如:棕櫚酸、硬脂酸、以及亞麻仁油酸,醇類則
例如:丙三醇和乙醇、以及有機酸例如:乙酸。這些碳源於培養物中可以被單獨使用也可以以組合方式被使用。培養物中的氮源的舉例可以包括有有機氮源例如:蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米浸液、黃豆、以及小麥蛋白質,培養物中的氮源的舉例也可以包括有無機氮源例如:尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、以及硝酸銨。這些氮來源於媒介培養物中可以被單獨使用也可以以組合方式被使用。培養物中的磷源的舉例可以包括有磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、以及對應的鈉鹽。再者,培養物亦可包含有金屬鹽類例如:硫酸鎂或硫酸鐵。此外,培養物係可包含有胺基酸、維他命以及合適的前驅物。這些來源或前驅物係以分批或連續的方式加入培養物中。
於培養期間內,化合物可以適當的方式被加入培養物中,以調整培養基的pH值,例如:氫氧化銨、氧化鉀、氨、磷酸和硫酸。此外,於培養期間,消泡劑,如:脂肪酸聚乙二醇酯可以利用於抑制泡沫的形成。再者,為了將培養基維持為有氧的環境,需要將氧氣或含氧的氣體注入培養基內。若需形成缺氧或微氧的環境,則需要提供氮氣、氦氣或二氧化氮且無須進行充氣。典型地,培養基係被維持於27℃至37℃的溫度條件下,並且更特定地係被維持於30℃至35℃的溫度條件下。至於培養的期間,培養可以持續至可利用的被培養物之數量達到期望數量之時。更特定地說,培養期間可以藉於10小時至100小時之間。
於本發明中,於培養步驟中所製造的OPS係進一步地被隔離與純化。舉例來說,根據培養的方法,可以利用該發明所屬技術領域中習知的適當方法來將所需的OPS由培養物中收集起來,該培養方法例如,分批式的培養、連續式的培養、或分批補料式的培養。
於本發明之實例中,包含四種RhtB蛋白變異體之每一個的質體係被導入製造OPS的菌種,並且培養此種菌種,再檢測其製造OPS的生產率。結果,相較於導入包含有野生型RhtB之質體之製造
OPS的菌種,導入包含有四種RhtB蛋白變異體之每一個的質體之用以製造OPS的菌種顯示增加製造OPS的生產力率達至14%(實例2)。
本發明另一態樣也提供製造半胱胺酸或其衍生物的方法,包含有將以前述製造方法製造的OPS與硫化物進行反應,並於反應期間存在有O-磷絲胺酸巰基酶(OPSS)或能表現OPSS的微生物。
特定地說,製造半胱胺酸或其衍生物的方法包含有下述步驟:a)藉由培養包含有RhtB蛋白變異體之製造OPS的微生物來製造OPS;以及b)將以步驟a)之方法製造的OPS與硫化物進行反應,並於反應期間存在有O-磷絲胺酸巰基酶(OPSS)或表現OPSS的微生物,但本發明並不以此為限。圖1係顯示半胱胺酸之合成過程的示意圖。
步驟a)之方法係如前所述。此外,本發明所提供之方法也包含有步驟b),將以步驟a)之方法製造的OPS與硫化物進行反應,並於反應期間存在有O-磷絲胺酸巰基酶(OPSS)或表現OPSS的微生物。
於本發明中所使用的硫化物可以是任一種硫化物,且不一定需要為該發明所屬領域中所習知的固體形式,由於pH值、壓力、及/或可溶性的差異,所使用的硫化物亦可為液體形式或是氣體形式,且該硫化物可被轉換為硫醇基(SH),如硫化物(S2-)或硫代硫酸根(S2O3 2-)的形式。特定地說,本發明所使用的硫化物可為Na2S、NaSH、H2S、(NH4)2S、NaSH或Na2S2O3,以提供硫醇基予OPS。於此反應中,單一硫醇基被供應至單一反應OPS團,以製造單一半胱胺酸或其衍生物。於此反應中,係於每1莫耳至2莫耳的OPS特定地加入0.1莫耳至3莫耳的硫化物。更特定地,考量到經濟成本,OPS和用以提供硫醇基的硫化物之使用量的莫耳比係為1:1。
於此,用語「O-磷絲胺酸巰基酶(OPSS)」指的是可以催化反應進行的酵素,於反應中,係提供有硫醇基(SH)予OPS,以將OPS轉換成半胱酸。此處所述的酵素最初被發掘於嗜超高溫古生
菌(Aeropyrum pernix)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatics)和陰道鞭毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)中(Mino K and Ishikawa K,FEBSletters,551:133-138,2003;以及文獻Burns KE et al.,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005)。此外,OPSS的範圍不僅涵蓋有野生型的OPSS蛋白,還涵蓋了蛋白變異體,該蛋白變異體包含有缺失、修飾、取代或增加一個或多個多核苷酸序列之核苷酸,可編碼OPS,該蛋白變異體亦顯示了與野生類型OPSS蛋白相等或較高的生物活性。再者,OPSS的範圍也包括韓國專利申請案(KR 10-2012-004115及KR 10-1208267)所公開的OPSS蛋白以及其蛋白變異體。
除此之外,本發明之方法可進一步包括隔離並純化由步驟b)之反應所製造的半胱胺酸。於此,所需的半胱胺酸可藉由隔離和純化以習知的方法由反應溶液中收集。
再者,藉由該發明所屬技術領域中所習知的合成反應,以本發明所提供之方法所製造的半胱胺酸可以輕易地被合成為半胱胺酸衍生物。
於此,用語「衍生物」指的是藉由化學修飾任何化合物的一部份而獲得之相似的化合物。通常,該用語指的是化合物中的一個氫原子或一個原子團被另一個氫原子或一個原子團所取代。
於此,用語「半胱胺酸衍生物」指的是化合物中半胱胺酸的一個氫原子或一個原子團被另一個氫原子或一個原子團所取代。舉例來說,於半胱胺酸衍生物中,胺基(-NH2)的氮原子或硫醇基(-SH)的硫原子會被另一個原子或一個原子團所附著。半胱胺酸衍生物可舉例為(但不限於):N-乙醯半胱胺酸(NAC)、S-羧甲基半胱胺酸(SCMC)、BOC-CYS(ME)-OH、(R)-S-(2-胺基-2-羧乙基)-L-半胱胺酸、(R)-2-胺基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4-(乙硫基)丁酸、3-亞磺酸基-L-丙氨酸、Fmoc-cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-胱胺
酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱胺酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱胺酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱胺酸等。藉由和乙醯劑進行反應,半胱胺酸可以輕易地被合成為N-乙醯半胱胺酸(NAC),藉由在鹼性環境下進行反應,半胱胺酸可以輕易地被合成為S-羧甲基半胱胺酸(SCMC)。這些半胱胺酸衍生物主要係被用作醫藥材料,包含止咳藥、咳嗽緩解劑、及用於支氣管炎、支氣管性氣喘及喉嚨痛治療的治療劑。
以下,將參考實例進一步地來詳細說明本發明。然而,需理解的是,該些實例僅係用以說明性目的,並不意欲用以限制本發明之範疇。
實例1:識別RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白)蛋白變異體
為了增加O-磷絲胺酸(OPS)的輸出的專一性,以增加製造OPS菌種的OPS分泌能力,發明人以下述方式建構出RhtB蛋白變異體,也就是OPS的輸出蛋白。
特定地說,為了建構蛋白變異體,利用大腸桿菌K12_W3110的基因組去氧核糖核酸(ATCC 27325)作為模板以及基因專一性引子對,藉由隨機的基因突變PCR(JENA error-prone PCR)放大RhtB開放讀序框架(open reading frame,ORF)。藉由PCR所獲得的每一個基因片段以EcoRV和HindⅢ切割,並且複製到pCL Prmf載體,該載體包含被插入pCL1920載體(登錄號為AB236930)的rmf啟動子。於此,係利用SEQ ID Nos:8和9的引子來進行RhtB的放大。
經由前述過程所建構出來的重組質體資料庫用以作大量快速篩選(high-throughput screening,HTS)。菌種篩選平台是一種重組微生物突變成降低野生型的大腸桿菌菌種W3110中的內生性磷絲胺酸磷酸酶(SerB)的活性,並且該菌種篩選平台稱為CA07-0012(於韓國專利公開案KR 10-2012-0041115中稱為KCCM11212P)。
為了識別具有增強的OPS輸出活性的突變種,所建構出的重組
質體資料庫藉由電穿孔之細胞膜滲透技術轉形進入前述之CA07-0012,且選擇在包含有過量的OPS之培養物環境下顯示移除生長抑制的菌落。質體是由經選擇的菌落中獲得,且其核苷酸序列係藉由序列技術來進行分析。
結果,選擇以下四種涉及在包含有過量的OPS之培養物環境下移除生長抑制的RhtB蛋白變異體:具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列之RhtB蛋白變異體,稱作「RhtB m1」:具有SEQ ID NO:3之胺基酸序列之RhtB蛋白變異體,稱作「RhtB m2」;具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列之RhtB蛋白變異體,稱作「RhtB m3」;以及具有SEQ ID NO:5之胺基酸序列之RhtB蛋白變異體,稱作「RhtB m4」。
實例2:於製造OPS之菌種中,檢驗RhtB蛋白變異體之OPS輸出活性。
將包含有實例1中四種蛋白變異體之每一個的質體導入至製造OPS之菌種CA07-0012內,並接著評估所得菌種的O-磷絲胺酸生產率。
特定地說,每一個菌種均被種植於LB固體培養物中,並在保溫箱內於33℃的溫度條件下培養整夜。每個於LB固體培養物中被培養整夜的菌種被接種至劑量為25毫升的培養物中,如以下的表1所示,並且接著接種於34.5℃的溫度條件以及每分鐘轉數為200的條件下培養48小時。培養結果如以下的表2所示。
由以上的表2可以得知,相對於導入野生型RhtB基因的菌種,具有本發明之RhtB蛋白變異體的菌種顯示優異的結果,該結果對應到OPS製造量的增加,該OPS製造量可以增加至10%。
為了驗證本發明之RhtB蛋白變異體的活性,具有增強的SerA(D-3-磷酸甘油酸脫氫酶)活性和SerC(3-磷絲胺酸轉胺酶)活性的菌種(CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC;韓國專利公開案KR 10-2012-0041115中的KCCM11103P)係被用以作為製造OPS的菌種,且具有增強的活性。其中,SerA活性和serC活性和OPS
的生物合成途徑有關。為了建構pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_Prmf基因載體,pCL-PRhtB基因載體利用SEQ ID NO:6和7的引子來放大。
更特定地說,每個菌種係被種植於LB固體培養物上且於33℃的溫度條件下在一培養箱中培養整夜。每個被種植於LB固體培養物上經整夜培養的菌種被接種至劑量為25毫升的培養物中,如以下的表1所示,並且接著接種於34.5℃的溫度條件以及每分鐘轉數為200的條件下培養48小時。培養結果如以下的表3所示。
由前述之表3可得知,當本發明之RhtB蛋白變異體被導入至具有增強之製造OPS能力之製造OPS的菌種中,該菌種之OPS的產量可以提高達14%,意味本發明之RhtB蛋白變異體係有用於OPS的製造。
此外,CA07-0022/pCL Prmf serA*C-Prmf-RhtB m1菌種是一種典型菌種,該菌種導入有具有增強之OPS輸出活性的RhtB蛋白變異體,稱為「大腸桿菌CA07-0227(Escherichia coli CA07-0227)」
並於2013年3月7日寄存於韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms),登錄編號為KCCM11398P,其中,韓國微生物保存中心是布達佩斯條約下所承認的國際寄存機構。
以上之說明並未脫離對本發明之技術思想進行例示性說明之範圍,因此若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者,則可於不脫離本發明之本質的特性之範圍內進行多樣的修正及變形。因此,本發明所例示之實施形態並非限定本發明之技術思想者,僅係用於說明,根據該實施形態,並非限定本發明之技術思想之範圍。本發明之保護範圍必須藉由以下申請專利範圍進行解釋,與其同等之範圍內所有之技術思想係必須作為本發明之保護範圍內所包含者進行解釋。
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.財團法人食品工業發展研究所、2014.08.06、BCRC910640
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.韓國、韓國微生物保存中心、2013.03.07、KCCM11398P
Claims (11)
- 一種RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白)蛋白變異體,該蛋白變異體具有增強的O-磷絲胺酸(OPS)輸出活性。
- 如請求項1所述之RhtB蛋白變異體,其中,該蛋白變異體具有SEQ ID NO:2、3、4或5之胺基酸序列。
- 一種多核苷酸,係用以編碼如請求項1所述之蛋白變異體。
- 一種載體,包含如請求項3所述之多核苷酸。
- 一種製造O-磷絲胺酸之微生物,包含如請求項1所述之RhtB(高絲胺酸/高絲胺酸內酯輸出運輸蛋白)蛋白變異體。
- 如請求項5所述之微生物,其中,該微生物更具有降低內生性磷絲胺酸磷酸酶(SerB)的活性。
- 如請求項5所述之微生物,其中,該微生物更具有增強抵抗絲胺酸回饋抑制之磷絲胺酸轉胺酶(SerC)或磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)的活性。
- 如請求項5所述之微生物,其中,該微生物具有增強該RhtB蛋白變異體的活性。
- 一種製造O-磷絲胺酸(OPS)的方法,包含培養如請求項5至8中任一項所述之微生物。
- 一種製造半胱胺酸或其衍生物的方法,包含以下步驟:a)培養如請求項5至8中任一項所述之微生物,以製造O-磷絲胺酸(OPS);以及 b)使步驟a)中所製造的O-磷絲胺酸(OPS)與硫化物反應,該反應係於O-磷絲胺酸巰基酶(OPSS)或表現該OPSS的微生物的存在下進行。
- 如請求項10所述之方法,其中,該硫化物係選自以下群組之一個或多個:Na2S、NaSH、(NH4)2S、H2S以及Na2S2O3。
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