CN105377878A - 新的RhtB蛋白变体和使用其产生O-磷酸丝氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有增强的输出O-磷酸丝氨酸(OPS)能力的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体——所述O-磷酸丝氨酸是L-半胱氨酸的前体、编码所述蛋白质的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述蛋白变体的产OPS微生物、使用微生物产生O-磷酸丝氨酸的方法、和用于制备半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括使通过上述方法产生的O-磷酸丝氨酸与硫化物在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下反应。

Description

新的RhtB蛋白变体和使用其产生O-磷酸丝氨酸的方法
技术领域
本发明涉及具有增强的输出O-磷酸丝氨酸(OPS)能力的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体——所述O-磷酸丝氨酸是L-半胱氨酸的前体、编码所述蛋白质的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述蛋白变体的产OPS微生物、使用所述微生物产生O-磷酸丝氨酸的方法、和制备半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括使通过产OPS的方法产生的O-磷酸丝氨酸与硫化物在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下反应。
背景技术
L-半胱氨酸——在所有生物体中的硫代谢中起重要作用的氨基酸，不仅用于合成生物蛋白，比如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代谢产物，而且还作为用于生物合成辅酶A的前体。
使用微生物产生L-半胱氨酸的已知方法包括使用微生物将D,L-ATC生物转化为L-半胱氨酸(RyuOH等人，ProcessBiochem.,32:201-209,1997)。另一个已知方法是通过使用大肠杆菌的直接发酵产生L-半胱氨酸(EP0885962B；WadaM和TakagiH，Appl.Micrbiol.Biochem.,73:48-54,2006)。同时，本发明人发现了在某些微生物中从O-磷酸丝氨酸(OPS)合成L-半胱氨酸的酶(O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS))。基于此发现，本发明人开发了通过培养突变微生物以积累其中的OPS，从而通过使OPS与OPSS酶反应产生半胱氨酸的方法(韩国专利公开公布号10-2012-004111)。为了在高产率下产生半胱氨酸，仍存在产生过量的OPS的需要。因此，本发明人已经做了广泛的努力以发现使在产OPS菌株中产生的O-磷酸丝氨酸能够从细胞顺利地释放的适当的输出运载体(exporter)。此外，基于各种类型的已知的运载体，本发明人筛选了编码O-乙酰丝氨酸/半胱氨酸外排蛋白(effluxprotein)的ydeD、编码O-乙酰丝氨酸/半胱氨酸输出透性酶的yfiK(FrankeI、ReschA、DasslerT和BockA，J.Bacteriology,185:1161-166,2003)、编码高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白的rhtB(ZakataevaNP、AleshinVV、TokmakovaIL、TroshinPV、LivshitsVA，FEBSLett1999；452(3)；228-32)等，并且特别发现产OPS菌株中RhtB的增强导致OPS浓度增大(韩国专利公开公布号10-2012-004115)。然而，为了产生更高产率的半胱氨酸，仍需要开发具有从产OPS菌株输出前体OPS的更高能力的运载体。
发明内容
技术问题
本发明人已经做了广泛的努力以发现具有增大的OPS输出活性的RhtB蛋白变体以便能够进一步增大OPS的产生，结果，已经识别具有增大的OPS输出活性的四个新的RhtB蛋白变体，并且已发现所述蛋白质可更有效地从产OPS菌株输出OPS，从而完成本发明。
解决问题的方案
本发明的目的是提供具有增强的O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体。
本发明的另一个目的是提供编码所述蛋白变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体。
本发明的又另一个目的是提供包含所述蛋白变体的产OPS微生物。
本发明的又另一个目的是提供用于产生OPS的方法，其包括培养微生物。
本发明的又另一个目的是提供用于产生半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括使通过用于产生O-磷酸丝氨酸的上述方法产生的O-磷酸丝氨酸与硫化物在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下反应。
发明的有利效果
本发明的RhtB蛋白变体与野生型RhtB蛋白相比具有卓越的OPS输出活性，并且因而当蛋白变体应用于产O-磷酸丝氨酸微生物时，可在微生物中高效地产生O-磷酸丝氨酸。
附图说明
图1是显示通过积累来自生物合成的O-磷酸丝氨酸和微生物发酵O-磷酸丝氨酸及将积累的O-磷酸丝氨酸酶促地转化为L-半胱氨酸从而产生L-半胱氨酸的方法的示意图。
发明具体实施方式
本发明的方面包括具有增强的O-磷酸丝氨酸输出活性的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体。
如本文使用的，术语“O-磷酸丝氨酸(以下描述为“OPS”)”是指丝氨酸和磷酸的酯，即许多蛋白质的组分。所述OPS是L-半胱氨酸的前体并可通过在OPS硫化氢解酶(以下描述为“OPSS”)的催化作用下与硫化物反应转化为半胱氨酸。因此，在半胱氨酸的产生中增大OPS的生产力是重要的因素，并且因而需要开发使胞内OPS能够有效地从产OPS菌株分泌的运载体。
如本文使用的，术语“RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体”已知为高丝氨酸/高丝氨酸内酯的输出运载体，即苏氨酸的前体。可从已知的数据库比如NCBIGenBank获得关于RhtB蛋白的信息。例如，它可以是在登录号AAT48223(EG11469)下存储的蛋白质，并且其氨基酸序列可以在SEQIDNO：1中陈述。
如本文使用的，表述“具有增强的O-磷酸丝氨酸输出活性的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体”是指与野生型RhtB蛋白相比具有增强的OPS输出活性的蛋白质，并且其包含野生型RhtB蛋白的氨基酸序列的一个或多个氨基酸突变。具体地，具有增强的OPS输出活性的四个RhtB蛋白变体是通过在编码RhtB蛋白的多核苷酸中诱导随机突变被识别的。在被识别的蛋白变体中，具有SEQIDNO：2的氨基酸序列的蛋白变体标为“RhtBm1”；具有SEQIDNO：3的氨基酸序列的RhtB蛋白变体标为“RhtBm2”；具有SEQIDNO：4的氨基酸序列的RhtB蛋白变体标为“RhtBm3”；和具有SEQIDNO：5的氨基酸序列的RhtB蛋白变体标为“RhtBm4”。
本发明的RhtB蛋白变体不仅包括具有如SEQIDNO：2、3、4或5中陈述的氨基酸序列的蛋白质，而且包括以下蛋白质，其具有与SEQIDNO：2、3、4或5的氨基酸序列相比，显示至少70％、具体至少80％、更具体至少90％、甚至更具体至少95％、还甚至更具体至少98％、和最具体至少99％的同源性的氨基酸序列，并且具有与野生型RhtB蛋白质相比基本上增强的O-磷酸丝氨酸输出活性。此外，只要其包含具有上述同源性的氨基酸序列并具有基本上等同或相当于RhtB蛋白的生物活性，包含RhtB蛋白的氨基酸序列的一个或多个氨基酸缺失、修饰、替换或添加的蛋白质也明显地包括进本发明的范围中。
如本文使用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽等份之间的同一性百分比。可以通过本领域已知技术确定从一种形式到另一种形式的序列之间的对应。例如，可以通过比对序列信息和使用可容易获得的计算机程序，进而通过直接比较两个多肽分子或多核苷酸分子之间的序列信息确定同源性。可选地，可通过以下方法确定同源性：在同源区之间形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，接着使用单链特异性核酸酶消化，并且对消化的片段进行大小测定。
如本文使用的，所有其语法形式和拼写变化的术语“同源的”是指具有“共同进化起源”的蛋白质之间的关系，包括来自超家族的蛋白质和来自不同物种的同源蛋白。这样的蛋白质(和它们的编码基因)具有序列同源性，如由它们高度的序列相似性所反映的。然而，在常见使用和本发明中，当被形容词比如“非常高”修饰时，术语“同源的”可以是指序列相似性而非共同进化起源。
如本文使用的，术语“序列相似性”是指蛋白质的核酸序列或氨基酸序列之间的同一性或对应的程度，所述蛋白质可以或不可以共有共同进化起源。在一个实施方式中，当至少大约21％(具体至少大约50％，和最具体至少大约75％、90％、95％、96％、97％或99％)的多肽在氨基酸序列的限定长度上匹配时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。可以通过使用序列数据库中可获得的标准软件，或在例如为特定系统定义的严格条件下的DNA杂交实验中通过比较序列识别基本上同源的序列。限定适当的杂交条件在本领域的技术范围内(参见，例如，Sambrook等人，1989，下同)。
因为本发明的RhtB蛋白变体与野生型RhtB蛋白相比具有增强的OPS输出活性，所以产OPS微生物的OPS生产力可通过在微生物中表达本发明的RhtB蛋白变体而增大。
在本发明的实例中，为了识别具有增强的OPS输出活性的RhtB蛋白变体，编码野生型RhtB蛋白的基因被随机突变，并且突变基因被引入具有降低的内源性磷酸丝氨酸磷酸酶(以下描述为“SerB”)活性的重组大肠杆菌微生物，而菌落显示在包含过量OPS的培养基条件下移除了生长抑制，从而识别如上所述的4种RhtB蛋白变体(实施例1)。而且，与表达野生型RhtB蛋白的产OPS菌株相比，表达本发明的RhtB蛋白变体并具有降低的内源性SerB活性的产OPS菌株显示增大高达10％的OPS生产力，而表达RhtB蛋白变体并具有增强的SerA和SerC活性的菌株显示增大高达14％的OPS生产力(实施例2)。这样的结果表明本发明的RhtB蛋白变体在产OPS菌株中可以显著地增大菌株的OPS生产力。
本发明的进一步方面还包括编码RhtB蛋白变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体。
如本文使用的，术语“多核苷酸”是指通过共价键彼此连接以形成链的核苷酸单元的聚合物。所述术语通常意为具有任意长度的DNA或RNA链。在本发明中，所述术语意为编码RhtB蛋白变体的多核苷酸片段。
如本文使用的，术语“载体”是指用于克隆和/或转移核酸进入宿主细胞的任何媒介物。载体可以是另一个DNA区段可以附加至其上的复制子，以便引起所附区段的复制。“复制子”是指作为DNA体内复制的自主单位作用的任何遗传成分(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，即，其能够在其自身控制下复制。术语“载体”可包括用于在体外、离体或体内将核酸引入宿主细胞的病毒与非病毒媒介物二者。它还可以包括小环DNA。例如，载体可以是不含细菌DNA序列的质粒。移除CpG区丰富的细菌DNA序列已经显示减少转基因表达沉默并导致来自质粒DNA载体的更持续的表达(例如，Ehrhardt,A.等人(2003)HumGeneTher10:215-25；Yet,N.S.(2002)MolTher5:731-38；Chen,Z.Y.等人(2004)GeneTher11:856-64)。术语“载体”还可以包括转座子(AnnuRevGenet.2003；37:3-29)，或人工染色体。具体地，可以使用比如pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322和pMW118的载体，并且在本发明的实例中，可使用pCL1920载体。
本发明的进一步方面还包括包含RhtB蛋白变体的产OPS微生物。
在本文，RhtB蛋白、RhtB蛋白变体和OPS都如上所述。
与包含野生型RhtB蛋白的微生物相比，包含本发明的实例的RhtB蛋白变体的产OPS微生物可以有效地分泌OPS，并且因而其对于半胱氨酸的前体的OPS产生更有用。
包含具有增强的OPS输出活性的RhtB蛋白变体的产OPS微生物可以是由于编码RhtB蛋白的染色体基因突变而具有增强的OPS输出活性的包含RhtB蛋白质的微生物，和/或包含具有增强的OPS输出活性的RhtB蛋白变体并通过引入包含编码RhtB蛋白变体的多核苷酸的载体获得的微生物，但是本发明的范围不限于此。在本发明的实例中，可以通过将包含编码具有增强的OPS输出活性的RhtB蛋白变体的多核苷酸的载体引入大肠杆菌，构建包含具有增强的OPS输出活性的代表性RhtB蛋白变体的产OPS微生物。
进一步，包含RhtB蛋白变体的产OPS微生物可具有增强的RhtB蛋白变体活性。
用于增强RhtB蛋白活性的方法包括但不限于，增大编码蛋白变体的基因的胞内拷贝数的方法、将突变引入用于编码蛋白变体的染色体基因的表达调控序列的方法、将用于编码蛋白变体的染色体基因的表达调控序列替换为具有强活性的序列的方法、将编码蛋白质的染色体基因置换为突变以增大蛋白变体活性的方法、和将突变引入编码蛋白质的染色体基因以增强蛋白质活性的方法。增强所述蛋白质活性的方法可同样地应用于增强其它蛋白质的活性。
如本文使用的，术语“引入”是指将包含编码RhtB蛋白变体的多核苷酸的载体转移至宿主细胞的方法。使用本领域已知的任何常规方法可容易地进行此引入。一般而言，引入方法的实例可包括CaCl2沉淀、Hanahan方法——使用DMSO(二甲亚砜)作为还原物质以增大效率的改进的CaCl2方法、电穿孔、磷酸钙沉淀、原生质体融合、使用碳化硅纤维搅拌、农杆菌介导的转化、PEG介导的转化、硫酸葡聚糖介导的转化、脂质体介导的转化、和干燥/抑制介导的转化。用于转移载体的方法不限于上述实例，并且可以无限制地使用本领域已知的任何常规转化或转染方法。
如本文使用的，术语“产OPS微生物”是指能够在其中产生OPS的原核或真核微生物菌株。例如，产OPS微生物可以是能够通过基因工程在其中积累OPS的微生物，但是不限于此。为了本发明的目的，微生物可以是包含RhtB蛋白变体的任何原核或真核微生物，并且因而可以产生OPS。微生物的实例包括属于埃希杆菌属、欧文菌属、粘质沙雷菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属和短杆菌属的微生物菌株。具体地，微生物可以是埃希杆菌属的微生物。更具体地，它可以是大肠杆菌。特别地，埃希杆菌或棒状杆菌属的微生物可以产生OPS和L-丝氨酸，因为其包含在L-丝氨酸的生物合成途径中作为酶的SerA、SerC和SerB蛋白(AhmedZahoor，Computationalandstructuralbiotechnologyjournal，第3卷，2012年10月；WendischVF等人，CurrOpinMicrobiol.2006年6月；9(3):268-74；Peters-WendischP等人，ApplEnvironMicrobiol.2005年11月；71(11):7139-44)。
产OPS微生物可以具体是突变以减小内源性磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性的微生物。SerB具有将OPS转化为L-丝氨酸的活性，并且因而突变以降低SerB的活性的微生物可以具有在其中积累OPS的特性，这表明其对OPS的产生是有用的。减小SerB的活性意为与非突变菌株相比SerB的活性被减小或移除。可以使用本领域众所周知的各种方法实现SerB的活性减小。用于减小SerB酶的活性的方法的实例包括但不限于，将编码酶的染色体基因置换为突变以减小或移除酶活性的基因的方法、将突变引入用于编码酶的染色体基因的表达调控序列的方法、将用于编码酶的染色体基因的表达调控序列替换为具有弱活性的基因的方法、删除编码酶的染色体基因的方法、引入互补结合至染色体基因的转录物的反义寡核甘酸以抑制mRNA翻译为蛋白质的方法、在SD序列前人工添加与编码酶的基因的SD序列互补的序列以形成使核糖体不可能粘附的二级结构的方法、和添加启动子至相应序列的开放阅读框的3’端以便反转录的反转录工程(RTE)方法。在本发明的实例中，使用在韩国专利公开公布号10-2012-004115和美国专利公开申请号2012-0190081中公开的CA07-0012(登录号：KCCM11121P)作为突变以减小内源性SerB的活性的微生物，包含编码本发明的RhtB蛋白变体的多核苷酸的载体被引入所述微生物。
进一步，产OPS微生物可以是具有增强的磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)活性的微生物。
SerA是具有将3-磷酸甘油酸转化为3-磷酸羟基丙酮酸的活性的蛋白质，并且SerA可以是野生型蛋白质或抗丝氨酸反馈抑制的突变体。而且，SerC是具有将3-磷酸甘油酸转化为O-磷酸丝氨酸的活性的蛋白质。因而，具有增强的SerA和/或SerC活性的微生物可以被用作产OPS菌株。在本发明的实例中，使用如在韩国专利公开申请号10-2012-004115中公开的具有增强的SerA(抗丝氨酸反馈抑制)和SerC活性的微生物CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC(登陆号：KCCM11103P)作为产OPS微生物，本发明的RhtB蛋白变体被引入微生物以产生OPS。而且，在本发明中，包含本发明的RhtBm1蛋白变体的产OPS菌株CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC-rhtBm1——在其中引入具有增强的OPS输出活性的rhtB蛋白变体的代表性菌株——被命名为“EscherichiacoliCA07-0227”，并且其在2013年3月7日以登陆号KCCM11398P被保藏在由布达佩斯条约确认的国际保藏单位——韩国微生物保藏中心(实施例2)。
此外，所述微生物可进一步具有减小的进行胞内摄取或OPS降解的能力。
具体地，微生物可以是突变以减小PhnC/PhnD/PhnE磷酸烷基酯ABC运载体(PhnCDE操纵子，即磷酸酯运载体(PhnC；EG10713)的ATP结合组件-Pn运载体(PhnD；EG10714)的周质结合蛋白组件-磷酸烷基酯ABC运载体(PhnE；EG11283)的整合膜组件)、碱性磷酸酶(PhoA)或酸性磷酸酶(AphA)的活性的微生物。
本发明的产OPS微生物可进一步具有增强的嘧啶核苷酸转氢酶(PhtAB；EC1.6.1.1)活性。如先前在SauerUP等人，JBiolChem.20；279(8)8:6613-9.Epub2003中所述，PntAB参与NADPH的代谢以调控胞内氧化还原平衡。
本发明的进一步方面还包括用于产生OPS的方法，其包括培养产OPS微生物。
在本文，OPS和产OPS微生物都如上所述。
具体地，用于产生OPS的方法可包括以下步骤：a)培养包含RhtB蛋白变体的产OPS微生物以产生OPS；和b)从微生物的培养物分离OPS。具体地，方法可包括以下步骤：a)培养包含RhtB蛋白变体的产OPS微生物以产生OPS；和b)从微生物的培养物分离OPS，但不限于此。
产OPS微生物具体是具有减小的内源性SerB活性以便能够在其中积累OPS的微生物。此外，产OPS微生物可以进一步具有增强的抗丝氨酸反馈抑制的SerA和/或SerC的活性，并且所述活性如上所述。
如本文使用的，术语“培养”意为在人工控制条件下使微生物生长。可以使用本领域众所周知的合适培养基和培养条件进行本发明中的培养过程。本领域普通技术人员可以依据所选菌株的类型容易地控制培养过程。具体地，所述培养可以是分批式培养、连续培养或补料分批培养，但不限于此。
在具有减小的内源性SerB活性的重组微生物的培养中，培养基应当额外地包含甘氨酸或丝氨酸，因为丝氨酸营养缺陷型的重组微生物被诱导。可以以纯甘氨酸、含甘氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供甘氨酸。培养基中甘氨酸的浓度通常是0.1-10g/L，并且具体是0.5-3g/L。此外，可以以纯丝氨酸、含丝氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供丝氨酸。培养基中丝氨酸的浓度通常是0.1-5g/L，并且具体是0.1-1g/L。
此外，培养基可包含碳源。碳源的实例可包括糖类和碳水化合物比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪比如豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸比如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类比如甘油和乙醇；和有机酸比如醋酸。可以在培养基中单独或联合使用这些碳源。可包含在培养基中的氮源的实例包括有机氮源比如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆和小麦蛋白质；和无机氮源比如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。可以单独或联合使用这些氮源。可包含在培养基中的磷源的实例包括磷酸二氢钾、磷酸钾和相应的钠盐。此外，培养基可包含金属盐比如硫酸镁或硫酸铁。此外，培养基还可包含氨基酸、维生素和合适的前体。这些源或前体可以以分批或连续的方式被添加至培养基。
在培养期间，比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物可以以合适的方式被添加至培养基以调节培养基的pH。此外，在培养期间，比如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂可用于抑制形成泡沫。进一步，为了维持培养基处于有氧状态，氧或含氧气体可被注入培养基。对于厌氧或微需氧条件，可提供氮、氢或二氧化碳而不需要通气。培养基可通常维持在27℃至37℃，并且具体是30℃至35℃的温度范围下。至于培养周期，可持续培养直到产生期望量的有用物质。具体地，培养周期可以是10-100小时。
在本发明中，培养步骤中产生的OPS可进一步被分离和纯化。例如，可取决于培养方法，例如分批式培养、连续培养或补料分批培养，使用本领域已知的合适方法从培养物收集期望的OPS。
在本发明的实例中，包含四个RhtB蛋白变体中的每一个的质粒被引入产OPS菌株，并且然后培养菌株并检测其OPS生产力。结果，与引入具有野生型RhtB的质粒的产OPS菌株相比，引入四个蛋白变体中的每一个的质粒的产OPS菌株显示增大高达14％的OPS生产力(实施例2)。
本发明的进一步方面还包括用于产生半胱氨酸或其衍生物的方法，方法包括使通过上述OPS产生方法产生的OPS在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下与硫化物反应。
具体地，用于产生半胱氨酸或其衍生物的方法包括以下步骤：a)通过培养包含RhtB蛋白变体的产OPS微生物产生OPS；和b)使在步骤a)中产生的OPS在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下与硫化物反应，但不限于此。图1显示了半胱氨酸合成过程的示意图。
方法的步骤a)如上所述。此外，本发明的方法包括步骤b)：使在步骤a)中产生的OPS在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下与硫化物反应。
本发明中使用的硫化物可以是任何硫化物，其不仅可以以本领域中通常使用的固体形式提供，而且可以由于pH、压力和/或溶液度差异以液体或气体形式提供，并且可以转化为例如硫化物(S2-)或硫代硫酸盐(S2O3 2-)形式的硫醇(SH)基团。具体地，本发明中使用的硫化物可以是Na2S、NaSH、H2S、(NH4)2S、NaSH或Na2S2O3，其可向OPS提供硫醇基团。在反应中，单个硫醇基团被供应至单个反应性OPS基团以产生单个半胱氨酸或其衍生物。在此反应中，具体地以0.1-3摩尔的量添加硫化物，并且具体是每摩尔OPS添加1-2摩尔。最具体地，考虑到经济因素，以1∶1的摩尔比使用OPS和提供硫醇基团的硫化物。
如本文使用的，术语“O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)”是指催化其中硫醇(SH)基团被提供至OPS以将OPS转化为半胱氨酸的反应的酶。该酶在嗜热古菌(Aeropyrumpernix)、结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和阴道毛滴虫中首次发现(MinoK和IshikawaK，FEBSletters,551:133-138,2003；BurnsKE等人，J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005)。此外，OPSS的范围不仅包括野生型OPSS蛋白，而且包括在编码OPSS和显示等于或高于野生型OPSS蛋白的生物活性的多核苷酸序列的一个或多个核苷酸中包含缺失、置换或添加的蛋白变体。进一步，OPSS的范围包括在韩国专利公开公布号10-2012-0041115和韩国专利登记号10-1208267中公开的蛋白质，和其蛋白变体。
此外，本发明的方法可进一步包括分离和纯化通过步骤b)的反应产生的半胱氨酸的步骤。在本文，可通过使用本领域已知的合适反应从反应溶液分离和纯化而收集期望的半胱氨酸。
进一步，可通过本领域已知的化学合成反应容易地将通过本发明的方法产生的半胱氨酸合成为半胱氨酸衍生物。
如本文使用的，术语“衍生物”是指通过化学修饰任何化合物的一部分得到相似化合物。通常，该术语意为在其中氢原子或原子基团被替换为另一个氢原子或原子基团的化合物。
如本文使用的，术语“半胱氨酸衍生物”是指其中半胱氨酸中的氢原子或原子基团被替换为另一个氢原子或原子基团的化合物。例如，半胱氨酸衍生物可具有其中半胱氨酸中的胺基基团(-NH2)的氮原子或硫醇基团(-SH)的硫原子具有附加至其上的另一个原子或原子基团的形式。半胱氨酸衍生物的实例包括但不限于，NAC(N-乙酰半胱氨酸)、SCMC(S-羧甲基半胱氨酸(S-carboxymetylcysteine))、Boc-半胱氨酸(ME)-羟基、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺基丙酸、D-2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、3-亚磺基-L-丙氨酸、Fmoc-半胱氨酸(Boc-甲基)-羟基、硒代L-胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸等。半胱氨酸可通过与乙酰化试剂反应容易地合成NAC(N-乙酰半胱氨酸)，并且在碱性条件下，其可通过与卤乙酸反应合成SCMC(S-羧甲基半胱氨酸)。这些半胱氨酸衍生物主要用作制药材料，包括止咳药、镇咳剂、和用于支气管炎、支气管哮喘和喉咙痛的治疗剂。
实施例
以下，将参照实施例进一步详细描述本发明。然而，应该理解这些实施例仅用于说明性的目的，并不意欲限制本发明的范围。
实施例1：RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体 的识别
为了增大O-磷酸丝氨酸(OPS)输出运载体的特异性以增大产OPS菌株的OPS分泌能力，本发明人以以下方式构建作为OPS输出运载体的RhtB蛋白变体。
具体地，为了构建蛋白变体，使用大肠杆菌(K12_W3110，ATCC27325)的基因组DNA作为模板和基因特异性引物通过随机诱变PCR(JENA易错PCR)扩增rhtB开放阅读框。使用EcoRV和HindIII切割通过PCR获得的每一个基因片段，并且克隆入包含插入pCL1920载体(GenBank号AB236930)的rmf启动子的pCLPrmf载体。在本文，使用SEQIDNO：8和9的引物进行rhtB基因的扩增。
通过上述过程构建的重组质粒文库经历高通量筛选(HTS)。筛选的平台菌株(platformstrain)是突变以减小野生型大肠杆菌菌株W3110中的内源性磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性的重组微生物，并且被命名为“CA07-0012”(KCCM11212P；韩国专利公开公布0-2012-0041115)。
为了识别具有增大的OPS输出活性的突变体，构建的质粒文库通过电穿孔被转化入CA07-0012，并且然后选择在包含过量OPS的培养基条件下显示生长抑制移除的菌落。从所选的菌落获得质粒，并且通过测序技术分析其多核苷酸序列。
结果，涉及在包含过量OPS的培养基条件下移除生长抑制的以下四个RhtB蛋白变体被选择：具有SEQIDNO：2的氨基酸序列且命名为“RhtBm1”的RhtB蛋白变体；具有SEQIDNO：3的氨基酸序列且命名为“RhtBm2”的RhtB蛋白变体；具有SEQIDNO：4的氨基酸序列且命名为“RhtBm3”的RhtB蛋白变体；和具有SEQIDNO：5的氨基酸序列且命名为“RhtBm4”的RhtB蛋白变体。
实施例2：检验产OPS菌株中rhtB蛋白变体的OPS输出活性。
包含在实施例1中识别的四个蛋白变体中的每一个的质粒被引入产OPS菌株CA07-0012，并且然后评估得到的菌株的O-磷酸丝氨酸生产力。
具体地，每一个菌株被铺板在LB固体培养基上并在培养箱中33℃培养过夜。在LB固体培养基上培养过夜的每一个菌株被接种入下面表1中显示的25mL效价培养基(titermedium)，并且然后在34.5℃的温度和200rpm下孵育48小时。培养的结果显示在下面的表2中。
表1
[表1]
组成 浓度(每升)
葡萄糖 50g
KH2PO4 6g
(NH4)2SO4 17g
MgSO4·7H2O 1g
FeSO4·7H2O 5mg
MnSO4·4H2O 10mg
L-甘氨酸 2.5g
酵母提取物 3g
磷酸钙 30g
pH 6.8
表2
[表2]
由上面的表2可以看出，与引入野生型rhtB基因的菌株相比，具有本发明的rhtB蛋白变体的菌株显示相应于高达10％的OPS产生增加的卓越结果。
为了验证本发明的rhtB蛋白变体的活性，具有增强的SerA(D-3-磷酸甘油酸脱氢酶)和SerC(3-磷酸丝氨酸氨基转移酶)活性的菌株CA07-0012/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-SerC(KCCM11103P；韩国专利公开公布号10-2012-0041115)被用作具有增大的产生OPS能力的产OPS菌株，所述SerA和SerC活性涉及OPS的生物合成途径。为了构建pCL-Prmf-SerA(G336V)-SerC_Prmf-genes载体，使用SEQIDNO：6和7的引物扩增pCL-PrhtB-genes载体。
具体地，每一个菌株都铺板在LB固体培养基上并在培养箱中33℃培养过夜。在LB固体培养基上培养过夜的每一个菌株都接种入上面的表1中显示的25ml效价培养基，并且然后在34.5℃的温度和200rpm下孵育48小时。培养的结果显示在下面的表3中。
表3
[表3]
如上面的表3可以看出，当本发明的rhtB蛋白变体被引入具有增强的产生OPS能力的产OPS菌株时，菌株中的OPS的产生增大高达14％，这表面本发明的rhtB蛋白变体对OPS的产生是有用的。
此外，菌株CA07-0022/pCLPrmfserA*C-Prmf-rhtBm1——即引入具有增强的OPS输出活性的rhtB蛋白变体的典型菌株——被命名为“Escherichiacoli07-0227”，并且其在2013年3月7日以登陆号KCCM11398P被保藏在由布达佩斯条约确认的国际保藏单位——韩国微生物保藏中心。
虽然本发明的优选实施方式已经因说明性目的而被描述，但是本领域普通技术人员将理解各种修改、添加和置换都是可能的，而不偏离如所附权利要求中公开的本发明的范围和精神。

Claims (11)

1.具有增强的O-磷酸丝氨酸输出活性的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体。
2.根据权利要求1所述的RhtB蛋白变体，其中所述蛋白变体具有SEQIDNO：2、3、4或5的氨基酸序列。
3.编码权利要求1所述的蛋白变体的多核苷酸。
4.包含权利要求3所述的多核苷酸的载体。
5.包含权利要求1所述的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体的产O-磷酸丝氨酸微生物。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中所述微生物进一步具有减小的内源性磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性。
7.根据权利要求5所述的微生物，其中所述微生物进一步具有增强的抗丝氨酸反馈抑制的磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)或磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)活性。
8.根据权利要求5所述的微生物，其中所述微生物具有增强活性的RhtB蛋白变体。
9.用于产生O-磷酸丝氨酸(OPS)的方法，包括培养权利要求5至8中任一项所述的微生物。
10.用于产生半胱氨酸或其衍生物的方法，包括以下步骤：
a)培养权利要求5至8中任一项所述的微生物以产生O-磷酸丝氨酸(OPS)；和
b)使在步骤a)中产生的所述OPS与硫化物在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下反应。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述硫化物选自Na2S、NaSH、(NH4)2S、H2S和Na2S2O3中的一种或多种。
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