CN102002472A

CN102002472A - 产生o-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o-乙酰高丝氨酸的方法

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Publication number: CN102002472A
Application number: CN2010101448746A
Authority: CN
Inventors: 金素影; 申容旭; 许仁庚; 金贤雅; 徐昌一; 金朱恩; 孙晟光; 李相穆; 全成后; 李汉珍; 罗光镐
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2030-03-22
Also published as: EP2292783B1; EP3269819B1; MY155555A; CN103756948A; PL2292783T3; JP2011045359A; US8609396B2; JP5536496B2; EP2292783A2; ES2688479T3; KR101200179B1; EP3269819A1; EP2292783A3; US20110053252A1; ES2901190T3; PL3269819T3; CN102002472B; KR20110023702A; CN103756948B

Abstract

本发明公开了能够以高产量产生L-蛋氨酸前体O-乙酰高丝氨酸的微生物株和利用所述微生物株产生O-乙酰高丝氨酸的方法。所述微生物株是埃希氏菌属的菌株，其中，向所述菌株中引入并表达了乙酰-CoA合酶基因(acs)和/或编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)。

Description

产生O-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生O-乙酰高丝氨酸的方法

技术领域

本发明涉及能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸(L-蛋氨酸前体)的微生物株。另外，本发明还涉及利用所述微生物株高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的方法。

背景技术

可以通过化学或生物学方式合成在动物饲料、食品和医药中使用的蛋氨酸。

在化学合成中，蛋氨酸基本上是通过水解5-(β-甲基巯基乙基)乙内酰脲产生的。然而，合成的蛋氨酸的不利之处在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，这需要困难的额外方法将它们彼此分开。为了解决该问题，本发明的发明人开发了用于选择性地合成L-蛋氨酸的生物学方法，L-蛋氨酸是已有专利申请(WO 2008/103432)要求保护的化学物质。该方法(简称为“两步法”)包括发酵产生L-蛋氨酸前体和由L-蛋氨酸前体向L-蛋氨酸的酶促转化。所述蛋氨酸前体优选包括O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸。就对常规方法存在的问题的克服对所述两步法进行评价，所述常规方法存在的问题例如硫化物的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反馈调控，以及胱硫醚γ-合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶对中间产物的降解。另外，与产生DL-蛋氨酸的常规化学合成法相比，所述两步法具有以下优点：仅对L-蛋氨酸具有选择性，并且伴随产生作为有用副产物的有机酸，例如琥珀酸和乙酸。

作为蛋氨酸生物合成途径中的中间产物，O-乙酰-高丝氨酸被用作产生蛋氨酸前体(WO 2008/013432)。如下式所示，在O-乙酰转移酶的协助下由L-高丝氨酸和乙酰-CoA合成O-乙酰-高丝氨酸：

L-高丝氨酸+乙酰-CoA→O-乙酰-高丝氨酸。

在本申请的受让人的美国专利公开第US 2009-0253186 A1号中公开了其中引入了thrA和metX基因以分别提高L-高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸的生物合成的微生物株，以及利用所述微生物株高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的方法。关于这一点，本发明的发明人认为增加乙酰-CoA(O-乙酰高丝氨酸的生物合成中使用的两种底物之一)可提高O-乙酰高丝氨酸的产量。

在大肠杆菌中，大部分乙酰-CoA是由丙酮酸合成的。然而，如果存在过量的葡萄糖，可以由培养基中累积的乙酸产生乙酰-CoA。从乙酸合成乙酰-CoA可以利用两种不同的生物合成途径。在一种乙酰-CoA生物合成途径中，存在乙酰腺苷酸(AcAMP)中间产物，而乙酰-CoA合酶(acetyl-CoA synthase，ACS)通过该中间产物将乙酸活化成乙酰-CoA。在另一种途径中，作为由乙酸激酶(ACK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化的连续反应的结果，通过乙酰磷酸将乙酸转化为乙酰-CoA(JOURNAL OF BACTERIOLOGY，May 1995，p.2878-2886)。在由乙酰-CoA合酶介导的生物合成途径中发挥重要作用的乙酰-CoA合酶对乙酸具有高亲和力，其甚至可以将细胞内或细胞外的低水平乙酸活化成为乙酰-CoA。相比而言，ACK-PTA-介导的乙酰-CoA生物合成途径仅在可能由混合酸的发酵形成的高乙酸水平下进行，因为ACK和PTA酶对乙酸具有低的亲和力(J.Gen.Microbiol.102：327-336)。

对于乙酰-CoA合酶，由于位于启动子上游的CRP-结合位点，其表达在指数生长前在转录水平上受到代谢物阻遏控制的抑制，而此后当细胞进入静止期时，其表达增高(Mol Microbiol.2004 Jan；51(1)：241-54.)。

因此，可以通过ACK-PTA途径将在发酵中期累积的乙酸活化成乙酰-CoA。然而，由于ACK-PTA途径是可逆的，如果乙酸的水平低，那么乙酰-CoA被转化为乙酸。也就是说，在ACK-PTA途径中可能发生乙酰-CoA的消耗，显示出对O-乙酰高丝氨酸合成的负作用。

在乙酰-CoA的合成中与乙酸一起作为底物使用的辅酶A(CoA)是细胞内的代表性酰基基团载体。辅酶A由泛酸经过一系列的步骤合成，每个步骤的酶促催化如下所示。首先，泛酸激酶(CoaA)将泛酸(维生素B5)活化成4′-磷酸泛酸，然后向4′-磷酸泛酸上加入半胱氨酸形成4′-磷酸泛酰-L-半胱氨酸(4’-phosphopantothenoyl-L-cysteine)，然后利用P-PanCys合酶/P-PanCys脱羧酶(coaBC)的组合通过脱羧作用形成4′-磷酸泛酰巯基乙胺。然后，通过磷酸泛酰巯基乙胺(P-PanSH)腺苷酰基转移酶(coaD)将4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰化，从而形成脱磷酸-CoA。最后，利用ATP通过脱磷酸辅酶A(deP-CoA)激酶(coaE)将脱磷酸-CoA磷酸化为辅酶A。

通常，CoA是细胞内多数代谢反应以及很多合成反应的辅助因子。为此，通过调节机制将CoA库保持在恒定水平。调节细胞内CoA库的首要关键因子是泛酸激酶，其催化第一关键步骤并且是CoA生物合成中的限速酶。通过反馈抑制调节泛酸激酶是控制细胞内CoA浓度的主要因素(J Biol Chem.1994Oct 28；269(43)：27051-8)。然而，细胞内保持的恒定CoA水平可能是通过乙酰-CoA有效产生O-乙酰高丝氨酸的障碍。据报道，用丙氨酸A取代第106位的精氨酸R使泛酸激酶由对CoA的反馈抑制敏感转变为对反馈抑制具有抗性(Journal Of Bacteriology，185，June 2003，p.3410-3415)。发现在存在40mM CoA时，野生型蛋白仅保留约20％的催化活性，而在相同浓度的CoA下却没有检测到R106A突变蛋白的催化活性降低。另外，发现，与野生型相比，表达突变蛋白的突变株具有显著高的细胞内CoA水平。

为完成本发明，本发明的发明人进行了广泛而深入的研究，发现引入并增强(a)对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶基因，和(b)O-乙酰CoA合酶基因中的任一个或两个都导致O-乙酰高丝氨酸产量显著提高，如图1所示。

发明内容

因此，本发明的目的是提供能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的微生物株，所述微生物株经过设计通过过表达acs基因和对CoA的反馈抑制具有抗性的coaA基因而增强乙酰-CoA的生物合成途径。

本发明的另一个目的是提供利用所述微生物株以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的方法。

根据本发明的一个方面，提供能够产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株，其中，向所述菌株中引入并增强了：

(a)乙酰-CoA合酶基因(acs)；

(b)编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或

(c)(a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)两者。

根据本发明的另一方面，提供在培养基中产生O-乙酰高丝氨酸的方法，所述方法包括在培养基中发酵所述株。

根据本发明的再一方面，提供产生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括：(a)发酵埃希氏菌属的菌株从而产生O-乙酰高丝氨酸；(b)分离O-乙酰高丝氨酸；和(c)在选自由胱硫醚γ-合酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶组成的组的酶存在下，将O-乙酰高丝氨酸和甲基硫醇一起转化为L-蛋氨酸和乙酸(acetate)。

因此，根据本发明可以通过生物学方式高产量地产生O-乙酰高丝氨酸，这种方法的环境友好度高于化学方法。此外，可以酶促地，例如通过O-乙酰-高丝氨酸硫化氢解酶将本发明的微生物株产生的O-乙酰-L-高丝氨酸酶促地转化为L-蛋氨酸和乙酸。L-蛋氨酸可以用作食品或动物饲料的添加剂。

附图说明

参考以下详细说明并结合附图，可以更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特点和优点，在附图中：

图1为显示能够高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的O-乙酰高丝氨酸生物合成途径的示意图；

图2为显示携带乙酰-CoA合酶基因(acs)的表达载体pCL-P(pro)-acs的遗传图和构建的示意图；和

图3为显示均携带编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶(coaA(R106A))的基因的表达载体pCL-P(pro)-coaA(R106A)和pACYC-coaA(R106A)的遗传图和构建的示意图。

具体实施方式

根据本发明一个方面，本发明提供能够产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株，其中，向所述菌株中引入并增强了：(a)乙酰-CoA合酶基因(acs)；(b)编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或(c)(a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)两者。

本文使用的术语“L-蛋氨酸前体”旨在指在蛋氨酸生物合成途径中存在的代谢物或其衍生物，并且尤其指O-乙酰高丝氨酸。

本文使用的术语“产O-乙酰高丝氨酸株”旨在表示能够在细胞内或细胞外产生O-乙酰高丝氨酸的原核或真核微生物，并且尤其表示经遗传修饰能够在其中累积O-乙酰高丝氨酸的微生物。可用于本发明的菌株的实例包括埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)、棒杆菌属(Corynebacteria sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、沙门氏菌属(Salmonellarsp.)、短杆菌属(Brevibacteria sp.)、Hypomononas sp.、色杆菌属(Chromobacterium sp.)、诺卡氏菌(Norcardia sp.)、真菌和酵母，优选埃希氏菌属、棒杆菌属和钩端螺旋体属以及酵母。更优选埃希氏菌属。更优选大肠杆菌(Escherichia coli.)。更优选能够产生赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸的大肠杆菌菌株。最优选大肠杆菌菌株(保藏号KCCM 10921P)，其源自US12/062835(即，美国专利公开第2009-0253186 A1号)中所述的产生苏氨酸的菌株，并向其中引入了thrA和metX基因从而改善O-乙酰-L-高丝氨酸的生物合成途径。

在本发明的优选实施方式中，提供通过增强乙酰-CoA生物合成途径而提高O-乙酰高丝氨酸产量的产O-乙酰高丝氨酸株，其中所述株中引入并增强了乙酰-CoA生物合成途径中涉及的乙酰-CoA合酶基因。

在本发明的另一个优选实施方式中，提供通过增强乙酰-CoA生物合成途径而提高O-乙酰高丝氨酸产量的产O-乙酰高丝氨酸株，其中所述株中引入并增强了对累积CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶基因。

在本发明的另一个优选实施方式中，提供通过增强乙酰-CoA生物合成途径而提高O-乙酰高丝氨酸产量的产O-乙酰高丝氨酸株，其中所述株中引入并增强了乙酰-CoA生物合成途径中涉及的乙酰-CoA合酶和对累积CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶基因。

本文使用的术语“引入并增强”旨在表示提高由相应基因编码的酶的细胞内活性，这通常能够通过所述基因的过表达实现。过表达目标基因的方法有很多。例如，可以通过修饰目标基因的启动子区内和/或5’-UTR内的碱基；通过在染色体上引入目标基因的额外拷贝；或者通过将目标基因与自体同源启动子或异源启动子相组合引入到载体上，然后将所述载体转化到微生物株中实现过表达。另外，目标基因ORF(开放阅读框)内的突变可以引起其过表达。用数字表示，当发生过表达时，与天然状态的表达相比，相应蛋白的活性或浓度提高了10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％、1000％或者高达2000％。

为了引入并增强基因，可以对相应的启动子进行突变或者增加基因的拷贝数。优选使用强启动子。只要其是组成型的启动子，任何启动子均可在本发明中使用而不受限制。可以使用pTac、pTrc、pPro、pR和pL，其中最优选SEQ ID NO.9的pPro。目标基因可以全部或部分地包含SEQ ID NO.9的pPro启动子。

所述乙酰-CoA合酶和泛酸激酶可以来自多种不同的微生物，且可以分别由本发明中称为“acs”和“coaA”的基因编码。

在本发明中，提供了通过修饰而增强乙酰-CoA合酶活性、具有高的产生O-乙酰高丝氨酸的能力的菌株，和利用所述菌株产生O-乙酰高丝氨酸的方法。

在本发明的实施方式中，产O-乙酰高丝氨酸株的制备如下所示。

为了提高O-乙酰-L-高丝氨酸的产生，用SEQ ID NO.9的组成型启动子P(pro)取代菌株中编码乙酰-CoA合酶基因的启动子，然后构建组成型表达质粒从而诱导不受代谢物阻遏的目标基因过表达。编码乙酰-CoA合酶的基因通常表示为acs。它可以从之前公开的大肠杆菌基因组序列(gi：89110790)获得(Mol Syst Biol.2006；2：2006.0007.Epub 2006 Feb 21)。另外，也可以从公用数据库，例如美国国立生物技术信息中心(the National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)和日本DNA数据库(DNA Data Bank of Japan，DDBJ)构建的公用数据库中获得所述基因序列。

乙酰-CoA合酶具有催化以下反应的活性。如果编码所述酶的基因的表达被增强，则会诱导乙酰-CoA在细胞内累积。

乙酸+CoA<＝>乙酰-CoA

接着，对具有组成型表达质粒的微生物株进行操作，从而进一步提高乙酰-CoA的合成。本发明中采取的方法是使针对CoA合成的反馈抑制失效。关于这一点，催化第一关键步骤并作为CoA生物合成中的限速酶的泛酸激酶被突变，从而对CoA的反馈抑制产生抗性。为此，向编码泛酸激酶的基因中引入突变，即coaA(R106A)。该基因可以从之前公开的大肠杆菌基因组序列(gi：89110060)获得(Mol Syst Biol.2006；2：2006.0007.Epub 2006 Feb 21.)。另外，也可以从公用数据库，例如美国国立生物技术信息中心(NCBI)和日本DNA数据库(DDBJ)构建的公用数据库中获得所述基因序列。

除了具有催化如下反应所示的从泛酸至4’-磷酸泛酸的磷酸化的活性外，所述突变的泛酸激酶对CoA反馈抑制不敏感。因此，增强编码突变的泛酸激酶的基因提高细胞内CoA库的水平。

泛酸+ATP<＝>4’-磷酸泛酸+ADP

由此获得的突变株在其中累积了大量作为底物的CoA和乙酰-CoA以及高丝氨酸，用于通过metX编码的酶产生O-乙酰-L-高丝氨酸。因此，所述突变株能够高产量地产生O-乙酰-L-高丝氨酸。

由此，将三株产O-乙酰高丝氨酸株CJM-X/(pCL-P(pro)-Acs)、CJM-X/(pCL-P(pro)-coaA(R106A))和CJM-X/(pCL-P(pro)-acs，pACYC-coaA(R106A))分别命名为“大肠杆菌CA05-0565”、“大肠杆菌CA05-0564”和“大肠杆菌CA05-0566”，制备并于2009年8月11日保藏在KCCM(Korean Culture of Microorganism，Eulim build，Hongje-1-Dong，Seodaemun-ku，Seoul，361-221，Korea)，保藏号分别为KCCM11023P、KCCM11022P和KCCM11024P。

在本发明的优选实施方式中，提供产O-乙酰高丝氨酸株，在该株中，在组成型启动子Pro的控制下过表达参与乙酰-CoA生物合成的基因acs。更具体地，pPro启动子由SEQ ID NO.9的全长序列或其部分构成。

在本发明的另一个优选的实施方式中，提供产O-乙酰高丝氨酸株，在所述株中负责CoA生物合成的关键步骤的泛酸激酶对CoA的反馈抑制具有抗性。另外，本发明还提供高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的方法。优选地，对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶在第106位氨基酸发生突变。更优选地，通过用丙氨酸取代精氨酸使泛酸激酶在第106位氨基酸发生突变，由此对CoA的反馈抑制具有抗性。最优选地，对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。

在本发明的再一个优选实施方式中，提供产生O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌菌株，其中在所述菌株中同时采取两种方法以增强乙酰-CoA合酶的活性和泛酸激酶的活性。

优选地，用于制备产O-乙酰高丝氨酸株的大肠杆菌菌株是能够产生赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸的大肠杆菌菌株。更优选地，所述大肠杆菌菌株的特征在于引入并增强了(a)高丝氨酸乙酰转移酶；(b)天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性；或(c)(a)和(b)两者。最优选的是源自CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10921P)的大肠杆菌。

在本发明的具体实施例中，克隆acs基因并用于构建在SEQ ID NO.9的组成型启动子pPro控制下的acs表达载体pCL-P(pro)-acs(图2)。将coaA基因的第106位氨基酸从精氨酸突变为丙氨酸，从而产生SEQ ID NO.8的突变coaA基因，其编码对CoA的反馈抑制具有抗性的所述酶。将该突变基因克隆至携带SEQ ID NO.9的组成型启动子pPro的质粒中，从而产生在组成型启动子pPro控制下的重组表达质粒pCL-P(pro)-coaA(R106A)和pACYC-coaA(R106A)(图3)。向CJM-X中单独或组合转化入重组质粒pCL-P(pro)-acs和pCL-P(pro)-coaA(R106A)或pACYC-coaA(R106A)，从而制备特征在于引入并增强了(a)编码乙酰-CoA合酶(acs)的基因，(b)编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的基因(coaA)，和(c)(a)和(b)两种基因的产O-乙酰高丝氨酸株(实施例1-3)，其中所述CJM-X是通过从在US12/062835(即美国专利公开第US 2009-0253186 A1号)中公开的增加了thrA和metX的菌株CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10921P)中除去pthrA(M)-CL质粒而构建的。培养瓶培养表明，与对照CJM-X相比，在用携带(a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)的pCL-P(pro)-acs转化的菌株中，O-乙酰高丝氨酸的生产能力在产量上提高了2.8g/L，产率上提高了4.7％；在用携带(b)的对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的pCL-P(pro)-coaA(R106A)转化的菌株中，O-乙酰高丝氨酸的生产能力在产量上提高了2.1g/L，产率上提高了3.5％；在用(b)和(c)的pCL-P(pro)-acs和pACYC-coaA(R106A)转化的菌株中，O-乙酰高丝氨酸生产能力在产量上提高了6.8g/L，产率上提高了11.4％(参见实施例2，表2)。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及产生O-乙酰高丝氨酸的方法，所述方法包括在培养基中发酵产生O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌菌株，从而在培养基中累积O-乙酰高丝氨酸。

根据本发明的再一方面，本发明涉及产生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括(a)通过发酵本发明的产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株产生O-乙酰高丝氨酸；(b)分离O-乙酰高丝氨酸；和(c)在选自胱硫醚γ-合酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的转化酶存在下，将分离的O-乙酰高丝氨酸和甲基硫醇一起转化为L-蛋氨酸和乙酸。

当与本发明的微生物株组合使用时，本发明的发明人的WO 2008/013432中公开的基于使用转化酶(胱硫醚γ-合酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶)的L-蛋氨酸生产方法能够产生更高产量的L-蛋氨酸。

以上制备的产生O-乙酰高丝氨酸的微生物株可以在本领域已知的培养基和培养条件下培养。本领域技术人员完全理解，可以根据所用微生物株对培养方法进行调整。发酵可以以分批、连续培养或分批补料的形式进行，但并不限于此。以下参考文献公开了多种发酵方法：“BiochemicalEngineering”by James M.Lee，Prentice-Hall International Editions，pp 138-176。

培养基必须满足特定微生物株的培养条件。以下参考文献中公开了多种微生物培养基：“Manual of Methods for General Bacteriology”by the AmericanSociety for Bacteriology，Washington D.C.，USA，1981。通常，培养基包括多种碳源、氮源和微量元素。碳源的实例包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；脂肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，例如甘油和乙醇；和有机酸，例如乙酸。这些碳源可以单独或组合使用。氮源的实例包括有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽膏、玉米浆(CSL)和豆粉；无机氮源，例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，这些氮源可以单独或组合使用。另外，所述培养基还可以包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和/或其相应的含钠盐。另外，所述培养基中还可以以盐的形式包含金属，例如磷酸镁或硫酸铁。此外，还可以加入氨基酸、维生素和适当的前体。可以分批或连续的方式将所述培养基或前体加入到培养物(culture)中。

可以利用合适的化合物，例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸和硫酸，调整培养物的pH。为了防止在培养物中产生泡沫，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了产生有氧条件，可以向培养基中充入氧或含氧气体(例如空气)。培养基保持在20～45℃，优选25～40℃。将微生物株培养至L-蛋氨酸前体的期望水平，优选培养10～160小时。

通过以下实施例可以更好地理解本发明，但以下实施例仅用于说明而非限制本发明的范围。

实施例1：制备产O-乙酰高丝氨酸株

<1-1>克隆acs基因

对于acs基因的克隆，利用大肠杆菌W3110(ATCC 27325)的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增编码乙酰-CoA合酶的acs基因。从NIH的GenBank数据库获得acs基因的碱基序列(NCBI-gi：89110790)，并表示为SEQ ID NO.7。在所述碱基序列的基础上，利用含有选择性酶切位点EcoRV和HindIII的引物对(SEQ ID NOS.1和2)，以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，在高保真DNA聚合酶PfuUltra^TM(Stratagene)存在下，通过PCR扩增从ATG至TAA的ORF。所述PCR包括96℃变性30秒、50℃退火30秒和72℃延伸2分钟的30个循环，从而合成含有EcoRV和HindIII位点的约2.0kb的acs基因。

用限制性酶EcoRV和HindIII消化后，将所扩增的acs基因连接到此前用相同酶进行处理的pPro-GFP载体上，从而构建携带acs基因并包含组成型启动子Pro的重组组成型表达载体，称为pCL-P(pro)-acs。图2显示了所述表达载体pCL-P(pro)-acs的遗传图和构建。

<1-2>克隆反馈抗性coaA基因

为了克隆反馈抗性coaA基因，利用大肠杆菌W3110(ATCC 27325)的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的coaA基因。为此，首先从NIH的GenBank数据库获得coaA基因的碱基序列(NCBI-gi：89110060)。在所述碱基序列的基础上，设计用于PCR扩增从ATG至TAA的coaA片段的引物对(SEQ ID NOS.3和4)，使其包含限制性酶切位点EcoRV，并且在第316～318位的核苷酸为密码子GCC而非CGT，从而产生对CoA的反馈抑制的抗性。另外，单独设计用于PCR扩增coaA片段的引物对(SEQ ID NOS.5和6)，使其包含限制性酶切位点HindIII，并且出于与上述相同的原因而使其第316～318位的核苷酸为密码子GCC而非CGT。

当以大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板时，在高保真DNA聚合酶PfuUltra^TM(Stratagene)存在下，分别利用合成引物对SEQ ID NOS.3和4，以及SEQ ID NOS.5和6进行PCR，包括在96℃变性30秒、50℃退火30秒和72℃延伸2分钟，共30个循环。结果，获得两个基因片段：一个片段从coaA的起始ATG密码子开始延伸，并且在第316～318位核苷酸具有从CGT密码子至GCC密码子的突变的大小约344bp的片段；另一个片段是包含终止密码子TAA，并且在第316～318位核苷酸具有从CGT密码子至GCC密码子的突变的大小约642bp的片段。

利用所述两种片段作为模板进行PCR，所述PCR包括96℃变性60秒、50℃退火60秒和72℃延伸2分钟的10个循环，随后利用引物对SEQ ID NOS.3和6在相同的热条件进行20个循环。结果，获得第316～318位的CGT密码子被取代为GCC密码子的963bp的基因(coaA(R106A))。

用限制性酶EcoRV和HindIII消化后，通过连接将突变的coaA基因克隆至pPro-GFP载体上，从而构建称为pCL-P(pro)-coaA(R106A)的重组表达载体，该载体受组成型启动子Pro(SEQ ID NO.9)的控制，并携带第106位氨基酸残基的密码子由CGT突变为GCC的突变coaA基因。所述突变coaA的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.8。

接着，将突变coaA的基因克隆到pACYC177载体中。用限制性酶处理重组质粒pCL-P(pro)-coaA(R106A)，以从其中切出含有Pro启动子的1.45kb的coaA(R106A)片段。将所述coaA(R106A)片段插入到此前用BamHI和HindIII处理的pACYC177载体中，由此构建重组载体pACYC-coaA(R106A)。在图3中，图示说明了重组表达载体pCL-P(pro)-coaA(R106A)和pACYC-coaA(R106A)的构建。

<1-3>制备产O-乙酰高丝氨酸株

将实施例<1-1>和<1-2>中构建的质粒pCL-P(pro)-acs和pCL-P(pro)-coaA(R106A)转化到菌株CJM-X中，然后在LB-Sp(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壮观霉素25μg/L)上培养从而针对每个转化体选出10个壮观霉素抗性菌落，其中，所述CJM-X是通过从US12/062835(即，美国专利公开第US 2009-0253186 A1号)中公开的CJM-X/pthrA(M)-CL中除去pthrA(M)-CL质粒而构建的。另外，用实施例<1-2>中构建的重组表达质粒pACYC-CoaA(R106A)转化携带pCL-P(pro)-acs载体的CJM-X，并在LB-Sp-Ap(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壮观霉素25μg/L、氨苄青霉素50μg/L)上培养，从而选出10个具有壮观霉素和氨苄青霉素抗性的菌落。对其产生O-乙酰高丝氨酸的能力进行相互比较。

实施例2：发酵产生O-乙酰高丝氨酸

为了检测实施例1中制备的菌株产生蛋氨酸前体O-乙酰高丝氨酸的能力，在锥形瓶中培养这些菌株。

对于该培养，使用表1中所示的O-乙酰高丝氨酸滴定培养基(titermedium)。

表1

用于生产O-乙酰高丝氨酸的培养基的组成

组成	浓度(/L)
		葡萄糖	60g
硫酸铵	17g
		KH₂PO₄	1.0g
MgSO₄·7H₂O	0.5g
		FeSO₄·7H₂O	5mg

MnSO₄·8H₂O	5mg
		ZnSO₄	5mg
CaCO₃	30g
		酵母提取物	2g
蛋氨酸	0.15g
		苏氨酸	0.15g

利用铂环取出在32℃过夜培养的LB平板上产生的单个菌落，并分别接种到25mL的O-乙酰高丝氨酸滴定培养基中，然后在32℃以250rpm振荡培养42～64小时。利用HPLC定量分析各培养物的O-乙酰高丝氨酸。分析数据汇总于下表2中。

如表2所示，与CJM-X对照相比，在组成型表达启动子P(pro)的控制下过表达acs基因后，发现O-乙酰高丝氨酸的产量和产率分别提高了2.8g/L和4.7％；在过表达反馈抑制抗性coaA(R106A)基因后，O-乙酰高丝氨酸的产量和产率分别提高了2.1g/L和3.5％；在共同过表达acs和coaA(R106A)基因后，O-乙酰高丝氨酸的产量和产率分别提高了6.8g/L和11.4％。

总之，由该培养瓶(flask)试验获得的数据表明，引入并增强acs基因和反馈抑制抗性coaA基因中任一个或两个都可以提高O-乙酰高丝氨酸的产量和产率。

表2

表达Acs和CoaA(R106)对O-乙酰-高丝氨酸生产的影响

工业应用性

如上所述，本发明提供了在培养基中发酵时在培养基中高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株。此外，在蛋氨酸转化酶存在下，O-乙酰高丝氨酸可以与甲基硫醇一起被转化为L-蛋氨酸，同时伴随乙酸的产生。

尽管出于说明的目的已经公开了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书公开的本发明的范围和精神的前提下，各种修饰、添加和取代都是可能的。

序列表

<110>CJ第一制糖株式会社

<120>产生O-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生O-乙酰高丝氨酸的方法

<130>OPA09051

<150>US12/550,099

<151>2009-08-28

<160>9

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>acs的正向引物

<400>1

atcatgagcc aaattcacaa acac 24

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>acs的反向引物

<400>2

ctggcaaagc ttttacgatg gcatcgcgat ag 32

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coaA(R106A)的正向引物

<400>3

atcatgagta taaaagagca aacg 24

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coaA(R106A)的反向引物

<400>4

gcgcctgcaa tacggcggcg gttgtacttt tcc 33

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coaA(R106A)的正向引物

<400>5

gccgtattgc aggcgctatt aagcc 25

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coaA(R106A)的反向引物

<400>6

ctggcaaagc ttttatttgc gtagtctgac ctc 33

<210>7

<211>1959

<212>DNA

<213>大肠杆菌W3110(Escherichia coli W3110)

<400>7

atgagccaaa ttcacaaaca caccattcct gccaacatcg cagaccgttg cctgataaac 60

cctcagcagt acgaggcgat gtatcaacaa tctattaacg tacctgatac cttctggggc 120

gaacagggaa aaattcttga ctggatcaaa ccttaccaga aggtgaaaaa cacctccttt 180

gcccccggta atgtgtccat taaatggtac gaggacggca cgctgaatct ggcggcaaac 240

tgccttgacc gccatctgca agaaaacggc gatcgtaccg ccatcatctg ggaaggcgac 300

gacgccagcc agagcaaaca tatcagctat aaagagctgc accgcgacgt ctgccgcttc 360

gccaataccc tgctcgagct gggcattaaa aaaggtgatg tggtggcgat ttatatgccg 420

atggtgccgg aagccgcggt tgcgatgctg gcctgcgccc gcattggcgc ggtgcattcg 480

gtgattttcg gcggcttctc gccggaagcc gttgccgggc gcattattga ttccaactca 540

cgactggtga tcacttccga cgaaggtgtg cgtgccgggc gcagtattcc gctgaagaaa 600

aacgttgatg acgcgctgaa aaacccgaac gtcaccagcg tagagcatgt ggtggtactg 660

aagcgtactg gcgggaaaat tgactggcag gaagggcgcg acctgtggtg gcacgacctg 720

gttgagcaag cgagcgatca gcaccaggcg gaagagatga acgccgaaga tccgctgttt 780

attctctaca cctccggttc taccggtaag ccaaaaggtg tgctgcatac taccggcggt 840

tatctggtgt acgcggcgct gacctttaaa tatgtctttg attatcatcc gggtgatatc 900

tactggtgca ccgccgatgt gggctgggtg accggacaca gttacttgct gtacggcccg 960

ctggcctgcg gtgcgaccac gctgatgttt gaaggcgtac ccaactggcc gacgcctgcc 1020

cgtatggcgc aggtggtgga caagcatcag gtcaatattc tctataccgc acccacggcg 1080

atccgcgcgc tgatggcgga aggcgataaa gcgatcgaag gcaccgaccg ttcgtcgctg 1140

cgcattctcg gttccgtggg cgagccaatt aacccggaag cgtgggagtg gtactggaaa 1200

aaaatcggca acgagaaatg tccggtggtc gatacctggt ggcagaccga aaccggcggt 1260

ttcatgatca ccccgctgcc tggcgctacc gagctgaaag ccggttcggc aacacgtccg 1320

ttcttcggcg tgcaaccggc gctggtcgat aacgaaggta acccgctgga gggggccacc 1380

gaaggtagcc tggtaatcac cgactcctgg ccgggtcagg cgcgtacgct gtttggcgat 1440

cacgaacgtt ttgaacagac ctacttctcc accttcaaaa atatgtattt cagcggcgac 1500

ggcgcgcgtc gcgatgaaga tggctattac tggataaccg ggcgtgtgga cgacgtgctg 1560

aacgtctccg gtcaccgtct ggggacggca gagattgagt cggcgctggt ggcgcatccg 1620

aagattgccg aagccgccgt agtaggtatt ccgcacaata ttaaaggtca ggcgatctac 1680

gcctacgtca cgcttaatca cggggaggaa ccgtcaccag aactgtacgc agaagtccgc 1740

aactgggtgc gtaaagagat tggcccgctg gcgacgccag acgtgctgca ctggaccgac 1800

tccctgccta aaacccgctc cggcaaaatt atgcgccgta ttctgcgcaa aattgcggcg 1860

ggcgatacca gcaacctggg cgatacctcg acgcttgccg atcctggcgt agtcgagaag 1920

ctgcttgaag agaagcaggc tatcgcgatg ccatcgtaa 1959

<210>8

<211>316

<212>PRT

<213>大肠杆菌W3110

<400>8

Met Ser Ile Lys Glu Gln Thr Leu Met Thr Pro Tyr Leu Gln Phe Asp

1 5 10 15

Arg Asn Gln Trp Ala Ala Leu Arg Asp Ser Val Pro Met Thr Leu Ser

20 25 30

Glu Asp Glu Ile Ala Arg Leu Lys Gly Ile Asn Glu Asp Leu Ser Leu

35 40 45

Glu Glu Val Ala Glu Ile Tyr Leu Pro Leu Ser Arg Leu Leu Asn Phe

50 55 60

Tyr Ile Ser Ser Asn Leu Arg Arg Gln Ala Val Leu Glu Gln Phe Leu

65 70 75 80

Gly Thr Asn Gly Gln Arg Ile Pro Tyr Ile Ile Ser Ile Ala Gly Ser

85 90 95

Val Ala Val Gly Lys Ser Thr Thr Ala Ala Val Leu Gln Ala Leu Leu

100 105 110

Ser Arg Trp Pro Glu His Arg Arg Val Glu Leu Ile Thr Thr Asp Gly

115 120 125

Phe Leu His Pro Asn Gln Val Leu Lys Glu Arg Gly Leu Met Lys Lys

130 135 140

Lys Gly Phe Pro Glu Ser Tyr Asp Met His Arg Leu Val Lys Phe Val

145 150 155 160

Ser Asp Leu Lys Ser Gly Val Pro Asn Val Thr Ala Pro Val Tyr Ser

165 170 175

His Leu Ile Tyr Asp Val Ile Pro Asp Gly Asp Lys Thr Val Val Gln

180 185 190

Pro Asp Ile Leu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Val Leu Gln Ser Gly Met

195 200 205

Asp Tyr Pro His Asp Pro His His Val Phe Val Ser Asp Phe Val Asp

210 215 220

Phe Ser lle Tyr Val Asp Ala Pro Glu Asp Leu Leu Gln Thr Trp Tyr

225 230 235 240

Ile Asn Arg Phe Leu Lys Phe Arg Glu Gly Ala Phe Thr Asp Pro Asp

245 250 255

Ser Tyr Phe His Asn Tyr Ala Lys Leu Thr Lys Glu Glu Ala Ile Lys

260 265 270

Thr Ala Met Thr Leu Trp Lys Glu Ile Asn Trp Leu Asn Leu Lys Gln

275 280 285

Asn Ile Leu Pro Thr Arg Glu Arg Ala Ser Leu Ile Leu Thr Lys Ser

290 295 300

Ala Asn His Ala Val Glu Glu Val Arg Leu Arg Lys

305 310 315

<210>9

<211>134

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pPro启动子

<400>9

tcgagcatag catttttatc cataagatta gcggatctaa cctttacaat tgtgagcgct 60

cacaattatg atagattcaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacagaat tcattaaaga 120

ggagaaaggt acat 134

Claims

1.一种能够产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株，其中在所述菌株中引入并增强了：

(a)乙酰-CoA合酶基因(acs)；

(c)(a)中的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)中的泛酸激酶基因(coaA)两者。

2.如权利要求1所述的埃希氏菌属的菌株，其中通过利用新的启动子或突变的启动子或者通过增加所述基因的拷贝数来引入并增强所述基因。

3.如权利要求2所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述新的启动子选自由pTrc、pPro、pR和pL组成的组。

4.如权利要求3所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述启动子为pPro启动子，所述pPro启动子具有SEQ ID NO.9的碱基序列或其部分序列。

5.如权利要求1所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述由基因coaA编码、对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的氨基酸序列在第106位不同于野生型酶(NCBI-Gene ID 948479)。

6.如权利要求5所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述氨基酸序列在第106位为丙氨酸残基，而不是所述野生型酶的精氨酸。

7.如权利要求6所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述氨基酸序列具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。

8.如权利要求1所述的埃希氏菌属的菌株，其源自能够产生赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸的菌株。

9.如权利要求8所述的埃希氏菌属的菌株，其源自的菌株中引入并增强了：

(a)高丝氨酸乙酰转移酶活性；

(b)天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性；或

(c)(a)和(b)两者。

10.如权利要求9所述的埃希氏菌属的菌株，其源自保藏号为KCCM10921P的菌株。

11.如权利要求1所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述(a)的菌株为大肠杆菌CA05-0565(保藏号KCCM11023P)。

12.如权利要求1所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述(b)的菌株为大肠杆菌CA05-0564(保藏号KCCM11022P)。

13.如权利要求1所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述(c)的菌株为大肠杆菌CA05-0566(保藏号KCCM11024P)。

14.如权利要求1所述的埃希氏菌属的菌株，其属于大肠杆菌。