KR101200179B1

KR101200179B1 - Ｏ-아세틸-호모세린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용하여 ｏ-아세틸-호모세린을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101200179B1
Application number: KR1020100011648A
Authority: KR
Inventors: 김소영; 신용욱; 허인경; 김현아; 서창일; 김주은; 손성광; 이상목; 전성후; 이한진; 나광호
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2010-02-08
Publication date: 2012-11-13
Also published as: KR20110023702A; EP2292783A2; ES2901190T3; US8609396B2; EP2292783B1; CN102002472A; US20110053252A1; MY155555A; EP3269819B1; JP5536496B2; PL3269819T3; JP2011045359A; ES2688479T3; EP2292783A3; CN103756948B; PL2292783T3; CN102002472B; CN103756948A; EP3269819A1

Abstract

본 발명은 L-메치오닌 전구체인 0-아세틸 호모세린을 고효율로 생산하는 균주 및 상기 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 아세틸-CoA 신타아제 유전자를 도입 및 증진시키거나; 또는 CoA의 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제 유전자를 도입 및 증진시키거나; 또는 상기의 두가지 방법을 병행하여 제작한 O-아세틸 호모세린 고효율 생산 균주, 및 상기 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｏ-아세틸-호모세린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용하여 Ｏ-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 {Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-Acetyl-homoserine using the microorganism}

본 발명은 L-메치오닌 전구체인 0-아세틸 호모세린을 고효율로 생산하는 균주 및 상기 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

메치오닌은 동물 사료, 식품 및 의약품에 적용하기 위하여 화학적으로 또는 생물학적으로 합성될 수 있다.

메치오닌의 화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)하이단토인(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여 L-메치오닌을 생산하는 방법을 이용한다.　　그러나 이런 화학합성을 통하여 생산된 메치오닌은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산되어서, 각각을 분리하는 어려운 추가적 공정이 있다는 단점이 있다.　 이에 본 발명자들은 이러한 문제들을 해결하기 위해, 생물학적 방법을 이용하여 L-메치오닌을 선택적으로 생산할 수 있는 기술을 개발하여 특허를 출원한 바 있다(국제특허공개공보 제2008/013432호). 이 방법은 간편하게 "2단계 공법"으로 명명하며, 발효에 의한 L-메치오닌 전구체 생산 공정, 및 상기 L-메치오닌 전구체를 효소에 의하여 L-메치오닌으로 전환하는 공정을 포함한다. 상기의 L-메치오닌 전구체는 바람직하게 O-아세틸 호모세린(O-acetylhomoserine) 및 O-숙시닐 호모세린(O-succinylhomoserine) 을 포함한다. 이러한 2단계 공법을 개발함으로서, 기존에 문제가 되었던 황화물 특유의 기질 독성 문제 및 메치오닌과 SAMe에 의한 메치오닌 합성에서 피드백 조절 문제 및 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase), O-숙시닐 호모세린 설피드릴라아제(O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 특유의 중간 산물 분해 활성 문제를 모두 해결할 수 있었다. 또한 L-메치오닌만을 선택적으로 생산할 수 있어 DL-메치오닌을 동시에 생산하는 기존의 화학 합성 공정에 비하여 우수한 공정이며, 추가적으로 동일한 반응을 통하여 부산물로서 유기산, 보다 구체적으로는 숙신산 및 아세트산을 동시에 생산 할 수 있는 매우 우수한 공정이다.

O-아세틸 호모세린은 메치오닌 생산의 전구체로 사용되는 물질로 메치오닌 생합성 경로상에 있는 중간체이다(국제특허공개공보 제2008/013432호). O-아세틸 호모세린은 하기의 반응식과 같이 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제(O-acetyl transferase)에 의해 L-호모세린 및 아세틸-CoA를 기질로 하여 합성된다.

L-호모세린 + 아세틸-CoA → O-아세틸-호모세린

기존의 본 발명자들이 출원한 미국공개특허 제2009-253186호의 경우 thrA의 강화를 통하여 L- 호모세린의 합성을 증가시키고, metX 강화를 통하여 O-아세틸-호모세린의 생합성을 증가시키는 균주 및 상기 균주를 이용하여 높은 수율의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공하였다. 이에 본 발명자들은 O-아세틸 호모세린 생합성에 사용되는 기질 중 하나인 아세틸-CoA를 증가시킴으로서, 보다 더 높은 효율로 O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있을 것이라는 것을 착안하고, 이를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

일반적으로 대장균에서 아세틸-CoA는 파이루베이트(pyruvate) 로부터 생합성되지만, 과도한 당이 존재할 경우, 배지 중에 축적된 아세트산(acetic acid)에 의하여 생성될 수 있다. 아세트산으로부터 아세틸-CoA가 합성될 경우 두가지의 서로 다른 생합성 경로를 통하여 합성될 수 있다. 아세트산으로부터 아세틸-CoA를 생합성하는 하나의 경로는 아세틸-CoA 신타아제(ACS)에 의해 아세틸알데닐레이트(acetyladenylate, AcAMP)를 중간체로 하여 아세틸-CoA를 생합성하는 경로이고, 또 하나의 경로는 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK) 및 포스포트랜스아세틸라아제(phosphotransacetylase, PTA)에 의해 아세틸 포스페이트(acetyl phosphate)를 통하여 아세틸-CoA를 생합성하는 경로이다(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, May 1995, p. 2878-2886). 이 중 아세틸-CoA 신타아제에 의한 생합성 경로의 경우 아세틸-CoA 신타아제 효소 자체가 아세테이트에 대한 높은 친화도를 가지고 있어 세포 내 또는 외부에 존재하는 낮은 농도의 아세트산을 아세틸-CoA로 생합성하는 특징을 가지는 반면, ACK-PTA 경로를 통한 아세틸-CoA 생합성의 경우 효소의 아세테이트에 대한 낮은 친화도를 가지는 특성상 혼합산 발효(mixed acid fermentation)에 의해 생성된 높은 농도의 아세테이트에 의해서만 그 활성을 갖는 특징을 나타낸다(J. Gen. Microbiol. 102:327-336.).

상기의 아세틸-CoA를 생합성하는 두가지 경로 중 아세틸-CoA 신타아제의 경우 프로모터의 업스트림(upstream) 에 위치한 CRP-결합 부위가 존재하며 이러한 이유로 전사단계에서 분해대사물 저해(Catabolite repression)에 의해 지수적 성장기까지 발현이 저해되며, 이후 정체기에서는 발현이 증가하는 양상을 나타낸다(Mol Microbiol. 2004 Jan;51(1):241-254.).

따라서 발효 중반에 배지 중에 축적되는 아세테이트는 ACK-PTA 경로를 이용하여 아세틸-CoA 를 합성할 수 있다. 하지만 ACK-PTA 경로의 경우 양방향성을 가지기 때문에 아세테이트의 농도가 낮지 않을 경우 아세틸-CoA 가 아세테이트로 전환될 수 있다. 즉, ACK-TPA 경로 동안 아세틸-CoA가 소모되어, O-아세틸 호모세린의 합성에 부정적 영향을 준다.

아세틸-CoA의 생합성에서 아세테이트 이외에 또 다른 기질로 사용되는 CoA(Coenzyme A)는 대표적인 세포 내의 아실-기(acyl-group) 전달체이며, 그 합성은 비타민 판토테네이트(Pantothenate)로부터 일련의 생합성 과정을 통하여 생합성된다. 판토테네이트로부터 CoA를 생합성하는 효소는 다음과 같다. 그 첫 단계로 판토테네이트 키나아제(Pantothenate Kinase, coaA)에 의해 판토테네이트(비타민 B5)를 4'-포스포판토테네이트(4'-phosphopantothenate)로 합성하고, 두번째 단계로 P-PanCys 신타아제/P-PanCys 데카복실라아제(P-PanCys synthase/P-PanCys decarboxylase, coaBC )에 의해 4'-포스포판토테네이트에 시스테인을 결합하여 4'-포스포판토데노일-L-시스테인(4'-phosphopantothenoyl-L-cysteine)을 합성하여 이를 탈탄산화하여(decarboxylation) 4'-포스포판테테인(4'-phosphopantetheine)을 합성하고, 세번째 단계로 P-PanSH 아데닐트랜스퍼라아제(P-PanSH adenylyltransferase, coaD)에 의해 3-데포스포-CoA(3-dephospho-CoA)를 합성하고, 마지막 단계로 데포스포-CoA 키나아제(dephospho-CoA (deP-CoA) kinase, coaE)에 의해 ATP를 이용하여 인산화하여 CoA를 생합성 한다.

일반적으로 CoA는 세포 내에서 다양한 반응의 기질로 사용되며 이러한 이유로 세포 내의 CoA 농도는 일정량 이상 존재하지 않게 조절을 받는다. CoA pool의 농도를 조절하는 단계는 CoA 생합성 경로상에서 첫 번째 생합성 단계인 판토테네이트로부터 4'-포스포판토테네이트를 합성하는 단계에 관여하며, 속도-조절 효소인 판토테네이트 키나아제가 CoA 농도에 의한 피드백 저해(feedback inhibition)를 받아 그 활성 저해를 받아 세포 내의 CoA 농도를 조절한다(J Biol Chem. 1994 Oct 28;269(43):27051-8). 그러나, 항상 세포 내에서 일정수준으로 유지되는 CoA의 농도는 아세틸-CoA를 통한 O-아세틸 호모세린을 높은 효율로 생산하는데 문제로 작용 할 수 있다. 문헌에 의하면 세포 내 존재하는 CoA pool의 농도에 의해 피드백 저해를 받는 판토테네이트 키나아제의 106번째 아미노산을 R(arginine)에서 A(alanine)로의 치환(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 185, June 2003, p. 3410-3415)할 경우, CoA에 의한 피드백 저해가 해제될 수 있는 것으로 확인된 바 있다. 야생형 단백질의 경우 40mM 의 CoA 존재 시 잔존 활성이 약 20%인데 반하여, R106A 변이 단백질의 경우 동일 농도의 CoA 존재시에도 전혀 활성의 저해가 일어나지 않았다. 또한 변이 단백질을 발현한 균주에서 CoA의 세포 내 농도가 야생형에 비하여 증가하는 현상을 보임을 확인하였다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 O-아세틸 호모세린의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 (a) CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제 유전자를 도입 및 증진시키거나, (b) 아세틸-CoA 신타아제 유전자를 도입 및 증진시키거나, 상기의 두가지 방법을 병행할 경우 O-아세틸 호모세린의 생산능력이 향상되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 보다 높은 효율로 O-아세틸 호모세린을 생산하기 위하여, O-아세틸 호모세린의 생산을 증가시킬 수 있는 acs 유전자의 과발현 및 CoA에 의해 피드백 저해를 받는 coaA 유전자의 피드백 저해 해제를 통하여 아세틸-CoA의 생합성 경로를 강화하고 이를 통하여 높은 효율의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물 균주 및 상기 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 아세틸-CoA 신타아제 유전자(Acetyl-CoA synthase, acs)가 도입 및 증진되거나; 또는 (b) CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 판토테네이트 키나아제 유전자 (Panthothenate kinase, coaA)가 도입 및 증진되거나; 또는 상기 (a)의 아세틸-CoA 신타아제 유전자(acs) 및 상기 (b)의 판토테네이트 키나아제 유전자(coaA) 둘 모두가 도입 및 증진된, O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있는 에스케리치아 속 (Escherichia sp.) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배양배지에서 배양하여, 당해 배지 내에 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있는 에스케리치아 속 균주를 배양하여 발효에 의해 O-아세틸 호모세린을 생산하는 단계; (b) 생산된 O-아세틸 호모세린을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 O-아세틸 호모세린을 메칠머캡탄과 함께, 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase), O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제(O-acetyl homoserine sulfhydrylase) 및 O-숙시닐 호모세린 설피드릴라아제(O-succinyl homoserine sulfhydrylase) 로 이루어진 군에서 선택된 효소를 이용하여 효소반응을 일으켜서, L-메치오닌 및 아세테이트를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 아세틸-CoA 신타아제 유전자(Acetyl-CoA synthase, acs)가 도입 및 증진되거나; 또는 (b) CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 판토테네이트 키나아제 유전자(Panthothenate kinase, coaA)가 도입 및 증진되거나; 또는 상기 (a)의 아세틸-CoA 신타아제 유전자(acs) 및 상기 (b)의 판토테네이트 키나아제 유전자(coaA) 둘 모두가 도입 및 증진된, O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있는 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, “L-메치오닌 전구체”란, 메치오닌 특화 생합성 경로의 일부분인 대사물질 또는 이 대사물질에서 파생된 물질을 말한다. 구체적으로, 본 발명에서의 L-메치오닌 전구체란 O-아세틸 호모세린을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “O-아세틸 호모세린 생산 균주”란, O-아세틸 호모세린을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, 본 발명에 따른 조작에 의해 O-아세틸 호모세린을 균주 내에 축적할 수 있는 균주를 말한다. 예를 들어, 상기 균주는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellar sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.), 노카디아 속(Norcardia sp .), 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모이다. 더 바람직하게는, 에스케리치아 속의 미생물 균주이고, 더욱 더 바람직하게는, 대장균 (Escheria coli .)이고, 더욱 더 바람직하게는 라이신, 트레오닌, 이소류신 또는 메치오닌을 생산하는 균주 유래이며, 가장 바람직하게는 기존의 본 발명자가 제공한 특허(미국공개특허 제2009-253186호)에 기재되어 있는 thrA 및 metX 유전자를 도입한 트레오닌 생산균주 유래의 O-아세틸-L-호모세린 생합성 경로가 강화된 대장균 균주(기탁번호 KCCM 10921P)이다.

바람직한 일 실시태양으로서, 본 발명은 아세틸-CoA 생합성 경로를 강화하여 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상되도록, 아세틸-CoA 생합성에 관여하는 아세틸 CoA 신타아제 유전자를 상기 균주에 도입 및 증진시킨 균주를O-아세틸 호모세린 생산 균주로 제공한다.

바람직한 일 실시태양으로서, 본 발명은 아세틸-CoA 생합성 경로를 강화하여 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상되도록, CoA 생합성 경로상의 CoA 축적에 의한 피드백 저해를 해제한 판토테네이트 키나아제 유전자를 상기 균주에 도입 및 증진시킨 균주를 O-아세틸 호모세린 생산 균주로 제공한다.

바람직한 일 실시태양으로서, 본 발명은 아세틸-CoA 생합성 경로를 강화하여 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상되도록, 아세틸-CoA 생합성 에 관여하는 아세틸 CoA 신타아제 유전자를 상기 균주에 도입 및 증진시키고, 동시에 CoA 생합성 경로상의 CoA 축적에 의한 피드백 저해를 해제한 판토테네이트 키나아제 유전자를 도입 및 증진시킨 균주를 O-아세틸 호모세린 생산 균주로 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “도입 및 증진”은 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 효소의 세포 내 활성의 증가를 의미하며, 이는 유전자의 과발현에 의해 이루어질 수 있다. 목적 유전자의 과발현은 상기 유전자의 프로모터 부위 및 5'-UTR지역의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질 발현을 증진시킬 수 있으며, 목적 유전자를 염색체상에 추가 도입함으로써 발현을 강화시킬 수 있으며, 목적 유전자를 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질 전환시킴으로써 단백질의 발현량을 강화시킬 수 있다. 또한, 목적 유전자의 ORF(open reading frame) 지역에 돌연변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다. 과발현의 측정에 따르면, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것을 알 수 있다.

바람직하게는 상기 유전자를 도입 및 증진시키기 위해서는 강력한 프로모터로의 치환, 프로모터의 변이 유발 또는 유전자 카피수 증가를 통한 방법을 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 강력한 프로모터로의 치환으로 상기 유전자를 도입 및 증진시킬 수 있으며, 상기 강력한 프로모터는 당업계에 발현을 항시 증가시킬 수 있다고 알려져 있는 프로모터이면 그 제한은 없으나, pTac, pTrc, pPro, pR, pL 등의 프로모터가 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 9인 pPro 프로모터이며, 상기 유전자들은 서열번호 9인 pPro 프로모터를 전체 또는 일부를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “아세틸-CoA 신타아제(Acetyl-CoA synthase)” 및 “판토테네이트 키나아제(phantothenate kinase)”는 다양한 미생물 종에서 유래될 수 있으며 이러한 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자는 본 발명에서 각각acs 및 coaA 로 통칭될 수 있다.

보다 구체적으로, 본발명에서는 아세틸-CoA 신타아제 활성이 강화되도록 변형하여, O-아세틸- 호모세린 생산능이 향상된 균주 및 상기 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시태양으로서, O-아세틸 호모세린 생산 균주를 제조하는 방법은 다음과 같다.

O-아세틸-L-호모세린을 생산을 증가시킬 수 있도록 하기 위하여, 균주를 아세틸-CoA 신타아제 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 부분을 서열번호 9의 구성적(constitutive) 프로모터인 P(pro)로 치환하여 목적 유전자가 대사물질 저해가 없는 상시 발현 형태의 플라스미드 형태로 제작하여 과발현을 유도하였다. 상기 아세틸-CoA 신타아제를 코딩하는 유전자를 통칭 acs로 표기한다. 이는 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 의하여 공개된 대장균의 게놈 서열로부터 얻을 수 있다 (gi:89110790).　 또한, 상기 유전자 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다.

상기 아세틸-CoA 신타아제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 아세테이트를 아세틸-CoA로 합성하는 활성을 가지고 있다. 따라서 이러한 활성을 가지는 유전자의 발현을 강화할 경우 세포 내에 아세틸-CoA를 축적을 유도할 수 있다.

아세테이트 + CoA <=> 아세틸-CoA

다음으로 구성적 발현 플라스미드를 포함하는 상기의 방법에 의해 제조된 균주에서 아세틸-CoA의 합성을 증가시키기 위한 조작을 할 수 있다. CoA 생합성 경로 중 첫 번째 단계이며 속도-조절 효소인 판토테네이트 키나아제를 CoA에 의한 피드백 저해를 해제하기 위하여 판토테네이트 키나아제의 유전자 서열상에 돌연변이를 도입한다. 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 유전자인 coaA( R106A ) 유전자의 발현을 강화시킨다. coaA 유전자는 호모세린 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 유전자의 통칭이다. 이는 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 의하여 공개된 대장균의 게놈 서열로부터 얻을 수 있다 (gi:89110060).　 또한, 상기 유전자 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다.

상기 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 판토테네이트를 4'-포스포판토테네이트로 합성하는 활성을 가지고 있으며 세포 내에 축적된 CoA의 농도에 의한 활성 저해를 받지 않는 특성을 가지고 있다. 따라서 이러한 피드백 저해를 받지 않는 활성을 가지는 유전자의 발현을 강화할 경우 세포 내에 CoA pool의 증가를 유도할 수 있다.

판토테네이트 + ATP <=> 4'-포스포판토테네이트 + ADP

상기의 방법을 통하여 제작된 O-아세틸 호모세린 생산균주는 세포 내에 다량의 CoA와 아세틸-CoA를 축적하여 metX에 의해 코딩되는 효소에 의해 호모세린과 아세틸-CoA를 기질로 하여 O-아세틸-L-호모세린을 고효율로 생산할 수 있는 균주를 제작할 수 있다.

상기의 방법을 통하여 제작한 O-아세틸 호모세린 생산 균주인 CJM-X에 pCL-P(pro)-Acs, pCL-P(pro)-coaA(R106A), 및 pCL-P(pro)-acs와 pACYC-coaA(R106A)를 형질 전환한 균주를 각각 "대장균 CA05-0565", "대장균 CA05-0564" 및 "대장균 CA05-0566"으로 명명하고, KCCM(Korean Culture Center of Microorganism, 대한민국, 서울시 서대문구 홍제1동 유림 빌딩 361-221)에 2009년 8 월 11 일자로 각각 기탁번호 KCCM11023P, KCCM11022P 및 KCCM11024P로 기탁하였다.

바람직한 일 실시태양으로서, 본 발명은 아세틸-CoA 생합성에 관여하는 유전자인 acs유전자의 프로모터를 구성적 프로모터인 프로모터Pro로 치환화여 과발현시킨 O-아세틸 호모세린 생산 균주를 제공한다. 보다 구체적으로 pPro 프로모터는 서열번호 9 의 전체 또는 일부가 사용될 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로서, 본 발명은 CoA 생합성 경로상의 주요 단계를 책임지는 판토테네이트 키나아제(Pantothenate kinase)의 CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 균주를 제공한다. 또한, 높은 효율로 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 판토테네이트 키나아제의 아미노산 서열에서 106번째 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환됨으로써 CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제됨으로서 O-아세틸 호모세린 생산능을 향상시킬 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 판토테네이트 키나아제의 아미노산 서열에서 106번째 위치의 알지닌이 알라닌으로 치환됨으로써 CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제됨으로서 O-아세틸 호모세린 생산능을 향상시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제의 아미노산 서열이 서열번호 8인 판토테네이트 키나아제를 이용함으로서 O-아세틸호모세린의 생산능을 향상시킬 수 있다.

또한 바람직한 일 실시태양으로서 상기 두 가지 방법을 병행하여 사용하여, 아세틸-CoA 신타아제 활성이 강화되고 동시에 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제 활성을 강화하여 O-아세틸 호모세린 생산능을 향상시키는 방법 및 이 방법을 이용하여 제작된 O-아세틸 호모세린 생산 대장균을 제공한다.

바람직하게 상기 대장균은 라이신, 트레오닌, 이소류신 또는 메치오닌 생산 균주 중 하나를 이용하여 제조할 수 있다. 더 바람직하게는 (a)호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제의 활성이 도입 및 증진되거나; 또는 (b) 아스파토키나아제 또는 호모세린 디히드로게나아제 활성이 도입 및 증진되거나; 또는 (c) 상기 (a) 및 (b)의 특징이 모두 도입된 균주를 이용하여 제조할 수 있고, 가장 바람직하게는 대장균 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P) 유래 균주를 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, acs 유전자를 클로닝하여, 구성적 프로모터인 서열번호 9인 pPro 프로모터의 발현 조절을 받는 acs 발현용 벡터인 pCL-P(pro)-acs 를 제작하였고(도 2), CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제되도록 아미노산 서열의 106번째 위치의 알지닌이 알라닌으로 치환된 서열번호 8인 변이 coaA 유전자(R106A)를 클로닝하여, 구성적 프로모터인 서열번호 9인 pPro 프로모터의 발현 조절을 받는 변이 coaA 유전자 발현용 벡터인 pCL-P(pro)-coaA ( R106A ) 및 pACYC-coaA(R106A)를 제작하였다(도 3). 본 발명자가 미국공개특허 제2009-253186호에 제공한 thrA 및 metX의 강화 균주인 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P)에서 pthrA(M)-CL 플라스미드를 제거하여 제작된 CJM-X균주에 pCL-P(pro)-acs, pCL-P(pro)-coaA ( R106A ), 및 pCL-P(pro)-acs 및 pACYC-coaA(R106A)를 형질 전환하여, 각각 (a)아세틸-CoA 신타아제 유전자(Acetyl-CoA synthase, acs)가 도입 및 증진되는 균주, (b) CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제 유전자(Panthothenate kinase, coaA)가 도입 및 증진되는 균주, 및 상기 (a) 및 (b)의 특징을 모두 가지는, O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 균주를 제조하였다(실시예 1 내지 3). 상기 균주들의 O-아세틸 호모세린 생산능을 플라스크 배양을 통하여 비교한 결과, 대조군인 CJM-X 보다 상기 (a)의 아세틸-CoA 신타아제 유전자(Acetyl-CoA synthase, acs)를 가지는 pCL-P(pro)-acs가 형질 전환된 균주의 O-아세틸 호모세린 생산량이 2.8g/L. 수율이 4.7% 향상된 것을 확인하였으며, 상기 (b)의 CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제 유전자 (Panthothenate kinase, coaA)를 가지는pCL-P(pro)-coaA ( R106A )가 형질 전환된 균주가 대조군보다 O-아세틸 호모세린 생산량이 2.1g/L. 수율이 3.5% 향상된 것을 확인하였으며, pCL-P(pro)-acs 및 pACYC-coaA(R106A)가 형질 전환된 상기 (a) 및 (b)의 특징을 모두 가지는 균주는 대조군보다, 생산량이 6.8g/L, 수율이 11.4%가 향상됨을 확인하여(실시예 2, 표2), 본 발명의 방법으로 제조된 균주들이 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 것을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 O-아세틸- 호모세린 생산능이 향상된 대장균을 배양배지에서 배양하여, 배지에 O-아세틸-호모세린을 축적시킴으로써, O-아세틸- 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 방법에 의하여 제조된 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 에스케리치아 속(Escherichia sp .) 유래 균주를 배양하여 발효에 의해 O-아세틸 호모세린을 생산하는 단계; (b) 생산된 O-아세틸 호모세린을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 O-아세틸 호모세린 및 메칠머캡탄을 기질로 이용하여 시스타치오닌 감마 산타아제, O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 및 O-숙시닐 호모세린 설파드릴라아제 활성을 갖는 효소로 이루어진 군에서 선택된 전환효소를 이용하여 효소반응을 일으켜서, L-메치오닌 및 아세테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 본 발명자가 2007년 출원한 특허(국제특허공개공보 제2008/013432호)에 의거하여, 메치오닌 전환 효소인 시스타치오닌 감마 신타아제, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제, O-숙시닐 호모세린 설피드릴라아제 활성을 이용하여 L-메티오닌을 생산하는 방법으로, 본 발명에서 제공하는 균주를 이용할 경우, 더 높은 수율로 L-메치오닌을 생산할 수 있다.

상기에서 제조된 O-아세틸-L-호모세린 생산 균주의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다.　 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.　 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.　 다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다.　 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.　 탄소원은 포도당(glucose), 젖당(lactose), 자당(sucrose), 유당, 과당(fructose), 맥아당(maltose), 녹말(starch) 및 섬유소(cellulose)와 같은 탄수화물; 콩 기름(soybean oil), 해바라기 기름(sunflower oil), 피마자 기름, 베버 기름(castor oil) 및 코코넛 기름(coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)산과 같은 지방산; 글리세롤(glycerol) 및 에탄올(ethanol)과 같은 알코올과 아세트산(acetic acid)과 같은 유기산(organic acid)을 포함한다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤(peptone), 효모추출액(yeast extract), 육수(gravy), 맥아추출액(malt extract), 옥수수침출액(corn steep liquor (CSL)) 및 콩가루(bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소(urea), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 암모늄 클로라이드(chloride), 암모늄 포스페이트(phosphate), 암모늄 카보네이트(carbonate) 및 암모늄 니트레이트(nitrate)와 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 포타슘 히드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 소듐 포함 염들(sodium-containing salts)을 포함할 수 있다. 또한 배지는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 또는 아이언 설페이트(iron sulfate)와 같은 금속을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 암모늄 히드록사이드(ammonium hydroxide), 포타슘 히드록사이드(potassium hydroxide), 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가함으로써 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르(polyglycol ester)와 같은 소포제를 사용함으로써 배양하는 동안 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양액의 호기성(aerobic) 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스(예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 배양의 기간은 L-메치오닌 전구체의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 계속될 수 있고 바람직한 배양시간은 10 내지 160 시간이다.

본 발명의 O-아세틸 호모세린을 고효율로 생산할 수 있는 균주를 사용하는 경우, 고효율로 메티오닌을 화학적 합성 방법보다 환경 친화적으로 생산할 수 있다. 또한, 생산된 O-아세틸-L-호모세린은 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제에 의해 메치오닌과 아세트산 합성의 전구체로 사용하여 고효율로 L-메치오닌을 생물 전환할 수 있으며, 전환된 상기 L-메치오닌은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제의 생산에 널리 사용할 수 있다.

도 1은 Acetyl-CoA의 합성이 강화되어 O-아세틸-호모세린을 고효율로 생산할 수 있는 생합성 경로를 나타내는 도면이다.
도 2는 acs 유전자 발현용 벡터 pCL-P(pro)-acs를 나타내는 도면이다.
도 3은 피드백 저해가 해제된 coaA ( R106A ) 유전자 발현용 벡터 pCL-P(pro)-coaA(R106A)와 pACYC-coaA(R106A)를 나타내는 도면이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.　 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: O-아세틸 호모세린 생산 균주의 제조

<1-1> acs 유전자 클로닝

acs 유전자 클로닝은 대장균 W3110의 염색체 DNA(ATCC27325)를 주형으로 한 PCR을 통하여, 아세틸-CoA 신타아제인 acs 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 acs 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 gi:89110790)를 확보하였으며, 그 서열은 서열번호 7로 나타냈다. 상기 서열에 근거하여 acs 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF부분을 증폭하였고, 제한효소 EcoRV와 HindIII인지 부위를 포함하고 있는 프라이머(서열번호 1 및 2)를 합성하였다. 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라아제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, acs 유전자와 제한효소 EcoRV와 HindIII를 함유한 약 2.0kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 acs 유전자에 말단에 포함된 제한효소 EcoRV, HindIII을 처리하고, 제한효소 EcoRV, HindIII가 처리된 pPro-GFP 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고, 최종적으로 구성적 프로모터인 프로모터 Pro 에 의해 발현 조절을 받는 acs 유전자가 클로닝된 pCL-P(pro)-acs 재조합 벡터를 제작하였다. 도 2는 acs 발현용 벡터 pCL-P(pro)-acs 를 나타내는 도면이다.

<1-2> 피드백 저항성 coaA 유전자 클로닝

피드백 저해가 해제된 coaA유전자의 클로닝은 대장균 W3110의 염색체 DNA (ATCC27325)를 주형으로 한 PCR을 통하여, 판토테네이트 키나아제인 coaA 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 coaA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 gi:89110060)를 확보하고, 이에 근거하여 coaA 유전자의 ATG 부분에서부터 피드백 저해의 해제가 가능한 316번째에서 318번째 유전자 서열을 CGT에서 GCC으로 변경하고, 제한 효소 EcoRV가 포함된 프라이머(서열번호 3 및 4)를 합성하였다. 또한, 피드백 저해의 해제가 가능한 316번째에서 318번째 유전자 서열을 CGT에서 GCC으로 변경하고 TAA 부분까지를 포함하고 제한효소 HindIII를 포함하도록 증폭이 가능한 프라이머(서열번호 5 및 6)를 합성하였다.

대장균W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 4와 서열번호5 및 6인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, coaA 유전자의 ATG 부분부터 316번째에서 318번째 유전자 서열이 CGT에서 GCC로 변경된 부분을 포함하도록 돌연변이를 도입한 약 344bp의 증폭된 유전자 단편과, 돌연변이를 도입하여 316번째에서 318번째 유전자 서열이 CGT에서 GCC로 변경된 부분을 포함하고 TAA부분을 포함하는 약 642bp의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기에서 획득한 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 60초; 어닐링 50℃, 60초; 및 중합반응 72℃, 2분을 10회 반복 후 서열번호 3 및 6인 프라이머를 첨가하였고, 그 후 20회 반복하였다. 그 결과, coaA 유전자의 316번째에서 318번째 유전자 서열이 CGT에서 GCC로 변경된 963bp의 증폭된 coaA(R106A) 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 coaA 유전자에 말단에 포함된 제한효소 EcoRV 및 HindIII를 처리하고, 제한효소 EcoRV 및 HindIII가 처리된 pPro-GFP 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고, 최종적으로 구성적 프로모터인 Pro프로모터(서열번호 9)에 의해 발현 조절을 받으며 106번째 아미노산의 코돈이 CGT에서 GCC으로 돌연변이된 coaA 유전자가 클로닝된 pCL-P(pro)-coaA ( R106A ) 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 변이 coaA의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시하였다.

상기에서 제작된 pCL-P(pro)-coaA ( R106A ) 재조합 벡터를 pACYC177 벡터에 클로닝하기 위하여 pCL-P(pro)-coaA ( R106A ) 재조합 벡터에 제한효소 BamHI 및 HindIII를 처리하여 1.45kb의 Pro 프로모터를 포함한 coaA(R106A) 절편을 얻었다. 이렇게 얻어진 Pro 프로모터를 포함한 coaA(R106A) 절편을 BamHI 및 HindIII를 처리한 pACYC177 벡터와 접합하여 pACYC-coaA(R106A) 벡터를 제작하였다. 도 3는 coaA(R106A) 발현용 벡터 pCL-P(pro)-coaA ( R106A ) 및 pACYC-coaA(R106A) 를 나타내는 도면이다.

<1-3> O-아세틸 호모세린 생산 균주 제작.

Acs와 coaA 의 발현이 강화된 O-아세틸 호모세린 생산 균주의 제작을 위하여, 미국공개특허 제2009-253186호에 개시된 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P) 균주에서 pthrA(M)-CL 플라스미드의 제거를 수행하여 pthrA(M)-CL이 제거된 균주인 CJM-X를 제작하였다. 이렇게 제작된 CJM-X 균주에 상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 제조된 pCL-P(pro)-acs 및 pCL-P(pro)-coaA ( R106A ) 플라스미드를 각각 형질 전환(KCCM11023P 및 KCCM11022P)하여, LB-Sp(효모 추출 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 스트랩토마이신 25ug/L) 배지에서 배양한 후, 스트랩토마이신 내성을 가지는 콜로니 10주씩을 선발하였고, 추가적으로 상기에서 제작한 pCL-P(pro)-acs를 포함한 CJM-X 균주에 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 pACYC-CoaA(R106A)를 형질 전환(KCCM11024P)하여 LB-Sp-Ap(효모 추출 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 스트랩토마이신 25ug/L, 앰피실린 50ug/L) 배지에서 배양 후 스트랩토마이신과 앰피실린에 내성을 보이는 콜로니 10주를 선발하여, O-아세틸 호모세린의 생산성을 비교하였다.

실시예 2: O-아세틸 호모세린 생산을 위한 발효

실시예 1에서 제작된 균주의 메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린의 생산 능력을 확인하기 위하여 삼각 플라스크 배양을 실시하였다.

하기 표 1에 나타낸 O-아세틸-호모세린 역가배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 O-아세틸 호모세린의 생산성을 비교하였다.

<O-아세틸-호모세린 생산배지 조성>

조성	농도(리터당)
포도당	60 g
황산암모늄	17 g
KH₂PO₄	1.0 g
MgSO₄ㆍ7H₂O	0.5 g
FeSO₄ㆍ7H₂O	5 mg
MnSO₄ㆍ8H₂O	5 mg
ZnSO₄	5 mg
탄산칼슘	30 g
효모엑기스	2 g
메치오닌	0.15g
트레오닌	0.15g

32℃의 배양기에서 LB 고체배지 중에 밤새 배양한 단일 콜로니를 25 ml의 O-아세틸 호모세린 역가 배지에 1 백금이 씩 접종하여 32℃에서 250 rpm으로 42 내지 64시간 동안 배양하였다. 배양물로부터 O-아세틸 호모세린을 HPLC에 의하여 분석하였다. 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

하기의 표 2에 나타낸 결과와 같이, acs 유전자의 프로모터를 구성적 발현 프로모터인 P(pro)로 치환한 acs 유전자를 과발현할 경우, 대조군 균주인 CJM-X균주에 비하여 O-아세틸 호모세린의 생산량이 2.8g/L, 수율은 4.7% 향상된 것을 확인 할 수 있었으며, 피드백 저해가 해제된 coaA(R106A) 유전자를 과발현 할 경우 대조군 균주인 CJM-X균주에 비하여 O-아세틸 호모세린의 생산량이 2.1g/L, 수율은 3.5% 향상된 것을 확인할 수 있었으며, acs와 coaA ( R106A )를 동시에 과발현하였을 경우, 대조군 균주인 CJM-X균주에 비하여 O-아세틸 호모세린의 생산량이 6.8g/L, 수율은 11.4%가 향상되었음을 확인하였다.

이러한 플라스크 배양 결과로 미루어 볼 때 acs 유전자의 발현 강화, 또는 피드백 저해가 해제된 coaA 유전자의 발현 강화, 또는 acs와 피드백 저해가 해제된 coaA 유전자의 발현 강화가 O-아세틸 호모세린의 생산성 및 수율 향상에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

<Acs, CoaA(R106) 발현을 통한 O-아세틸-호모세린(OAH) 생산>

균주	플라스미드	OAH 생산량 (g/L)	수율 (%)
CJM-X	-	17.5	29.1
	pCL-P(pro)-acs	20.3	33.8
	pCL-P(pro)-coaA( R106A )	19.6	32.6
	pCL-P(pro)-acs , pACYC-coaA(R106A)	24.3	40.5

본 발명의 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 균주는 배양을 통하여 O-아세틸 호모세린을 배지 중에 높은 효율로 생산하여 축적하고, 상기 방법으로 생산된 O-아세틸 호모세린과 메칠머캅탄을 기질로 사용하여 메치오닌 전환 효소로 전환 반응을 수행함으로써 높은 수율로 L-메치오닌과 아세트산을 동시에 생산할 수 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM10921

20080823

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11022

20090811

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11023

20090811

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11024

20090811

서열목록 전자파일 첨부

Claims

시스타치오닌 감마 신타아제(Cystathionine gamma synthase, metB) 활성이 결실된 균주에 있어서,
(a)아세틸-CoA 신타아제 유전자(Acetyl-CoA synthase, acs)가 도입 및 증진되거나; 또는
(b)CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 판토테네이트 키나아제 유전자(Panthothenate kinase, coaA)가 도입 및 증진되거나; 또는
(c) 상기 (a)의 아세틸-CoA 신타아제 유전자(acs) 및 상기 (b)의 판토테네이트 키나아제 유전자(coaA) 둘 모두가 도입 및 증진된, O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있는 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주.
제1항에 있어서, 상기 유전자들의 도입 및 증진은 프로모터 치환, 프로모터 변이 또는 유전자 카피수 증가에 의한 것인 균주.
제2항에 있어서, 상기 프로모터 치환은, pTrc, pPro, pR 및 pL 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 프로모터의 치환에 의한 것인 균주.
제3항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 9인 pPro 프로모터 전체 또는 일부를 포함하도록 치환된 균주.
제1항에 있어서, 상기 판토테네이트 키나아제 유전자(Panthothenate kinase, coaA)가 코딩하는CoA축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제는 야생형 효소의 아미노산 서열(NCBI-GeneID 948479)의 106 번째 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 균주.
제5항에 있어서, 상기 106번째 위치의 아미노산이 야생형 효소의 아미노산인 알지닌 대신 알라닌으로 치환된 것인 균주.
제6항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 8인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 라이신, 트레오닌, 이소류신 또는 메치오닌을 생산할 수 있는 균주에서 유래한 것인 균주.
제8항에 있어서, 상기 균주는 (a) 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제의 활성이 도입 및 증진되거나; 또는 (b) 아스파토키나아제 또는 호모세린 디히드로게나아제 활성이 도입 및 증진되거나; 또는 (c) 상기 (a) 및 (b)의 특징이 모두 도입된 균주에서 유래한 것인 균주.
제9항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM 10921P인 균주에서 유래한 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 (a)의 균주는 대장균(Escherichia coli) CA05-0565(기탁번호 KCCM11023P)인 균주.
제1항에 있어서, 상기 (b)의 균주는 대장균 CA05-0564(기탁번호 KCCM11022P)인 균주.
제1항에 있어서, 상기 (c)의 균주는 대장균 CA05-0566(기탁번호 KCCM11024P)인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 대장균 (Escherichia coli .)인 균주.