ES2901190T3 - Microorganismo que produce o-acetil-homoserina y el método para producir o-acetil-homoserina mediante el uso del microorganismo - Google Patents

Microorganismo que produce o-acetil-homoserina y el método para producir o-acetil-homoserina mediante el uso del microorganismo Download PDF

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Abstract

Una cepa de Escherichia sp. capaz de producir O-acetil homoserina, que tiene un aumento en la actividad intracelular de una enzima codificada por (a) un gen de acetil-CoA sintasa (acs); y (b) un gen de pantotenato quinasa mutado (coaA), en donde la pantotenato quinasa es resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA; por la sobreexpresión de los genes, en donde la sobreexpresión de los dichos genes se implementa mediante la introducción de una copia extra de los genes diana en el cromosoma, o mediante la introducción de los genes diana en combinación con un promotor heterólogo en un vector, o mediante el uso de un promotor heterólogo.

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismo que produce o-acetil-homoserina y el método para producir o-acetil-homoserina mediante el uso del microorganismo
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a una cepa de microorganismos capaz de producir O-acetil homoserina, un precursor de L-metionina, con alto rendimiento. Además, la presente invención se refiere a un método para producir O-acetil homoserina con alto rendimiento mediante el uso de la cepa de microorganismos.
2. Descripción de la técnica relacionada
Para su uso en piensos, alimentos y medicamentos, la metionina puede sintetizarse química o biológicamente. En la síntesis química, en general, la metionina se produce mediante la hidrólisis de 5-(p-metilmercaptoetil)-hidantoína. Sin embargo, la metionina sintetizada está presente de manera desventajosa en una mezcla de formas L y D que necesita un proceso adicional difícil para separarlas entre sí. Para resolver este problema, los presentes inventores desarrollaron un método biológico para sintetizar selectivamente L-metionina, una sustancia química cuya patente (documento núm. WO 2008/103432) ya se ha aplicado. El método, denominado brevemente "un proceso de dos etapas", comprende la producción fermentativa de un precursor de L-metionina y la conversión enzimática del precursor de L-metionina en L-metionina. El precursor de metionina incluye preferentemente O-acetil homoserina y O-succinil homoserina. El proceso de dos etapas se evalúa en términos de haber superado los problemas que padecen los métodos convencionales, tales como la toxicidad de los sulfuros, la regulación por retroalimentación en la síntesis de metionina por metionina y SAMe, y la degradación de productos intermedios por la cistationina gamma sintasa, la O-succinil homoserina sulfhidrilasa y la O-acetil homoserina sulfhidrilasa. Además, en comparación con el método de síntesis química convencional para producir DL-metionina, el proceso de dos etapas tiene la ventaja de ser selectivo solo para L-metionina, con la producción concomitante de ácidos orgánicos, tales como el ácido succínico y el ácido acético como subproductos útiles.
Encontrado como un producto intermedio en la vía de biosíntesis de metionina, la O-acetil-homoserina se usa como precursor para la producción de metionina (documento núm. WO 2008/013432). La O-acetil-homoserina se sintetiza a partir de L-homoserina y acetil-CoA con la ayuda de O-acetil transferasa como se muestra en la siguiente fórmula: L-Homoserina Acetil-CoA ^ O-Acetil-Homoserina.
En la publicación de patente de Estados Unidos núm. US 2009-0253186 A1 del presente cesionario se describe una cepa de microorganismos en la que se introducen genes thrA y metX para mejorar la biosíntesis de L-homoserina y O-acetil-homoserina, respectivamente, y un método para producir O-acetil-homoserina con alto rendimiento mediante el uso de la misma. En este contexto, los presentes inventores concibieron que el enriquecimiento de acetil-CoA, uno de los dos sustratos usados en la biosíntesis de O-acetil-homoserina, aumentaría el rendimiento de producción de O-acetil-homoserina.
En E. coli, la acetil-CoA se sintetiza, en su mayor parte, a partir de piruvato. Sin embargo, si hay un exceso de glucosa, puede producirse acetil-CoA a partir del ácido acético acumulado en el medio. La síntesis de acetil-CoA a partir de ácido acético puede aprovechar dos vías de biosíntesis diferentes. En la única vía de biosíntesis de acetil-CoA, se encuentra un producto intermedio de acetiladenilato (AcAMP) mediante el cual la acetil-CoA sintasa (ACS) activa el acetato a acetil-CoA. En la otra vía, el ácido acético se convierte mediante acetilfosfato en acetil-CoA como un resultado de las reacciones consecutivas catalizadas por la acetato quinasa (ACK) y la fosfotransacetilasa (PTA) (JOURNAL OF BACTERIOLOGY, mayo de 1995, págs. 2878-2886). Al tener una alta afinidad por el acetato, la acetil-CoA sintasa, que desempeña un papel fundamental en la vía de biosíntesis mediada por ella, puede activar el acetato a acetil-CoA incluso a un nivel intracelular o extracelular bajo. Por el contrario, la vía de biosíntesis de acetil-CoA mediada por ACK-PTA se opera solo a un nivel alto de acetato, que puede resultar de la fermentación de ácidos mixtos, porque las enzimas tienen una baja afinidad por el acetato (J. Gen. Microbiol. 102:327-336).
En cuanto a la acetil-CoA sintasa, su expresión se inhibe a nivel de transcripción mediante el control de la represión de catabolitos hasta el crecimiento exponencial debido al sitio de unión a CRP ubicado secuencia arriba del promotor y desde entonces, su expresión aumenta cuando la célula entra en la fase estacionaria (Mol Microbiol. Enero de 2004; 51(1):241-54).
Por tanto, el acetato acumulado en la fase media de la fermentación puede activarse a acetil-CoA mediante la vía ACK-PTA. Sin embargo, si hay un nivel bajo de acetato, la acetil-CoA se convierte en acetato porque la vía ACK-PTA es reversible. Es decir, el agotamiento de acetil-CoA puede ocurrir durante la vía ACK-PTA, lo que muestra un efecto negativo sobre la síntesis de O-acetil homoserina.
La coenzima A (CoA), usada como un sustrato, junto con el acetato, en la biosíntesis de acetil-CoA, es un portador representativo del grupo acilo dentro de las células. La coenzima A se sintetiza en una serie de procesos a partir de pantotenato con catálisis enzimática para cada proceso de la siguiente manera. Primero, la pantotenato quinasa (CoaA) activa el pantotenato (vitamina B5) a 4'-fosfopantotenato al que luego se añade una cisteína para formar 4'-fosfopantotenoil-L-cisteína, seguido de la descarboxilación a 4'-fosfopanteteína por la cooperación de P-PanCys sintasa/P-PanCys descarboxilasa (coaBC). Posteriormente, la 4'-fosfopanteteína se adenila para formar desfosfo-CoA por la enzima fosfopanteteína (P-PanSH) adenililtransferasa (coaD). Finalmente, la desfosfo-CoA se fosforila mediante el uso de ATP a coenzima A por la enzima desfosfocoenzima A (deP-CoA) quinasa (coaE).
Generalmente, la CoA es un cofactor de una multitud de reacciones metabólicas, así como también de muchas reacciones sintéticas dentro de las células. Por ello, su reserva se mantiene en un nivel constante mediante mecanismos de regulación. El principal protagonista clave en la regulación de la reserva de CoA intracelular es la pantotenato quinasa, que cataliza la primera etapa comprometida y es la enzima que controla la velocidad en la biosíntesis de CoA. La regulación de la actividad de la pantotenato quinasa por inhibición por retroalimentación es el factor crítico que controla la concentración de CoA intracelular (J Biol Chem. 28 de octubre de 1994; 269(43):27051-8). Sin embargo, el nivel constante de CoA que se mantiene dentro de las células puede ser una barrera para la producción eficaz de O-acetil homoserina mediante acetil-CoA. Se informa que la sustitución de arginina R en la posición 106 por alanina A altera la pantotenato quinasa de ser sensible a la inhibición por retroalimentación por CoA al ser resistente a la misma (JOURNAL OF Ba Ct ERIOLOGY, 185, junio de 2003, págs. 3410-3415). Se encontró que la proteína de tipo salvaje retenía solo aproximadamente el 20 % de la actividad catalítica en presencia de CoA 40 mM mientras que no se detectaron disminuciones en la actividad catalítica de la proteína mutante R106A a la misma concentración de CoA. Además, se encontró que una cepa mutante que expresaba la proteína mutante tenía niveles intracelulares de CoA significativamente más altos, en comparación con la de tipo salvaje.
Lo que conduce a la presente invención, una investigación intensiva y exhaustiva, realizada por los presentes inventores, dio como resultado el hallazgo de que la introducción y la mejora de uno o ambos de (a) el gen de la pantotenato quinasa resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA y (b) el gen de la O-acetil CoA sintasa, da como resultado una mejora significativa en la productividad de O-acetil homoserina, como se describe en la Figura 1.
Resumen de la invención
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una cepa de microorganismos capaz de producir O-acetil homoserina con alto rendimiento, que está diseñada para fortalecer una vía de biosíntesis de acetil-CoA al sobreexpresar un gen acs y un gen coaA resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir O-acetil homoserina con alto rendimiento, mediante el uso de la cepa de microorganismos.
El objetivo para el que se solicita la protección es el que se define en las reivindicaciones.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una cepa de Escherichia sp. capaz de producir O-acetil homoserina, que tiene un aumento en la actividad intracelular de una enzima codificada por
(a) un gen de acetil-CoA sintasa (acs) y
(b) un gen de pantotenato quinasa mutado (coaA), en donde la pantotenato quinasa es resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA; por la sobreexpresión de los genes, en donde la sobreexpresión de los dichos genes se implementa mediante la introducción de una copia extra de los genes diana en el cromosoma, o mediante la introducción de los genes diana en combinación con un promotor heterólogo en un vector, o mediante el uso de un promotor heterólogo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir O-acetil-homoserina, que comprende la fermentación de la cepa productora de O-acetil-homoserina de la invención en un medio de cultivo para acumular O-acetil-homoserina en el medio.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, existe un método para producir L-metionina y acetato, que comprende: (a) producir O-acetil-homoserina mediante la fermentación de la cepa productora de O-acetil-homoserina de la invención; (b) separar la O-acetil homoserina; y (c) convertir la O-acetil homoserina, junto con el metil mercaptano, en L-metionina y acetato en presencia de una transferasa que se selecciona de cistationina gamma sintasa, O-acetil homoserina sulfhidrilasa y O-succinil homoserina sulfhidrilasa.
De acuerdo con la presente invención, por lo tanto, la O-acetil homoserina puede producirse biológicamente con un alto rendimiento, lo que es más respetuoso con el medio ambiente que los métodos químicos. Además, la O-acetil-L-homoserina producida por la cepa de la presente invención puede convertirse en L-metionina y acetato enzimáticamente, por ejemplo, mediante la O-acetil-homoserina sulfhidrilasa. La L-metionina es útil como un aditivo para alimentos o piensos.
Breve descripción de los dibujos
Los anteriores y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 es una vista esquemática que muestra una vía de biosíntesis de O-acetil-homoserina mediante la cual puede producirse O-acetil-homoserina con alto rendimiento;
La Figura 2 es una vista esquemática que muestra el mapa genético y la construcción de un vector de expresión pCL-P(pro)-acs que porta un gen de acetil-CoA sintasa (acs); y
La Figura 3 es una vista esquemática que muestra el mapa genético y la construcción de los vectores de expresión pCL-P(pro)-coaA(R106A) y pACYC-coaA(R106A), ambos portadores de un gen que codifica la pantotenato quinasa resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA (coaA(R106A)).
Descripción de las modalidades preferidas
De acuerdo con un aspecto de esta, la presente invención proporciona una cepa de Escherichia sp. capaz de producir O-acetil homoserina, que tiene un aumento en la actividad intracelular de una enzima codificada por (a) un gen de acetil-CoA sintasa (acs); y (b) un gen de pantotenato quinasa mutado (coaA), en donde la pantotenato quinasa es resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA por la sobreexpresión de los genes,
en donde la sobreexpresión de los dichos genes se implementa mediante la introducción de una copia extra de los genes diana en el cromosoma, o mediante la introducción de los genes diana en combinación con un promotor heterólogo en un vector, o mediante el uso de un promotor heterólogo.
Como se usa en la presente descripción, el término "precursor de L-metionina" pretende hacer referencia a un metabolito que se encuentra en la vía de biosíntesis de metionina o un derivado de esta, y particularmente a O-acetil homoserina.
Como se usa en la presente descripción, el término "cepa productora de O-acetil homoserina" está destinado a referirse a un microorganismo eucariota o procariota que puede producir O-acetil homoserina intracelular o extracelularmente y particularmente a un microorganismo modificado genéticamente que puede acumular O-acetil homoserina en él. Los ejemplos de la cepa útil en la presente invención incluyen Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp., Norcardia sp., hongos y levaduras, con preferencia por Escherichia sp., Corynebacteria sp. y Leptospira sp., y levadura. Se prefiere más Escherichia sp. Se prefiere mucho más Escherichia coli. Además, se prefiere mucho más una cepa de E. coli que pueda producir lisina, treonina, isoleucina o metionina. La de máxima preferencia es la cepa de E. coli (Núm. de acceso KCCM 10921P) que se deriva de la cepa productora de treonina descrita en el documento núm. US 12/062835 (es decir, la publicación de patente de Estados Unidos núm. US 2009-0253186 A1) con la introducción de genes thrA y metXen ella para mejorar la vía de biosíntesis de O-acetil-L-homoserina.
En una modalidad preferida de la presente descripción, se proporciona una cepa productora de O-acetil homoserina que mejora la productividad de O-acetil homoserina mediante el fortalecimiento de la vía de biosíntesis de acetil-CoA con la introducción de un gen de acetil-CoA sintasa involucrado en la vía de biosíntesis de acetil-CoA en la cepa y la mejora de esta.
En otra modalidad preferida de la presente descripción, se proporciona una cepa productora de O-acetil homoserina que mejora la productividad de O-acetil homoserina mediante el fortalecimiento de la vía de biosíntesis de acetil-CoA con la introducción de un gen de pantotenato quinasa resistente a la inhibición por retroalimentación por acumulación de CoA en la cepa y la mejora de esta.
En una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona una cepa productora de O-acetil-homoserina que ha mejorado la productividad de O-acetil-homoserina mediante el fortalecimiento de la vía de biosíntesis de acetil-CoA con la introducción de un gen de acetil-CoA sintasa involucrado en la vía de biosíntesis de acetil-CoA y un gen de pantotenato quinasa resistente a la inhibición por retroalimentación por acumulación de CoA en la cepa y la mejora de esta.
Como se usa en la presente descripción, el término "introducción y mejora" pretende significar un aumento en la actividad intracelular de una enzima codificada por el gen correspondiente, que generalmente puede lograrse mediante la sobreexpresión del gen. Existen muchos enfoques para la sobreexpresión de un gen diana. Por ejemplo, la sobreexpresión puede implementarse mediante la modificación de una base en la región promotora y/o 5'-UTR para el gen diana, mediante la introducción de la copia extra del gen diana en los cromosomas, o mediante la introducción del gen diana en combinación con un promotor autólogo o heterólogo en un vector, seguido de la transformación del vector en una cepa de microorganismos. Además, una mutación en el ORF (marco de lectura abierto) del gen diana puede dar como resultado la sobreexpresión de este. En términos numéricos, cuando se produce una sobreexpresión, la proteína correspondiente aumenta en actividad o concentración en un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, 1000 % o hasta 2000 %, en comparación a cuando se expresa en estado natural.
Para la introducción y la potenciación de un gen, puede tomarse un promotor fuerte, una mutación en el promotor correspondiente o un aumento en el número de copias del gen. Es preferible el uso de un promotor heterólogo. Siempre que sea constitutivo, puede usarse cualquier promotor en la presente descripción sin que se le impongan limitaciones. Son útiles pTac, pTrc, pPro, pR y pL, con pPro de la SEQ ID NO. 9 es el más preferido. El gen diana puede comprender el promotor pPro de la SEQ ID NO. 9, total o parcialmente.
Las enzimas acetil-CoA sintasa y pantotenato quinasa pueden provenir de una variedad de microorganismos diferentes y están codificadas por genes denominados "acs" y "coaA" en la presente invención, respectivamente. En la presente invención, se proporciona una cepa de microorganismos con alta capacidad de producir O-acetil homoserina en la que se realiza una modificación para fortalecer la actividad de acetil-CoA sintasa y un método para producir O-acetil homoserina mediante el uso de la misma.
En una modalidad de la presente invención, la cepa productora de O-acetil homoserina se prepara como sigue. Para aumentar la productividad de O-acetil-L-homoserina, se sustituye un promotor para el gen que codifica la acetil-CoA sintasa en una cepa con el promotor constitutivo P(pro) de la SEQ iD NO. 9, seguido de la construcción de un plásmido de expresión constitutivo para inducir la sobreexpresión del gen diana sin represión de catabolitos. El gen que codifica la acetil-CoA sintasa generalmente se expresa como acs. Puede obtenerse de la secuencia del genoma (gi:89110790) de Escherichia coli descrita anteriormente (Mol Syst Biol. 2006; 2:2006.0007. Epub 21 de febrero de 2006). Además, la secuencia del gen puede obtenerse a partir de bases de datos públicas, tales como las construidas por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) o el Banco de Datos de ADN de Japón (DDBJ).
La acetil-CoA sintasa tiene la actividad de catalizar la siguiente reacción. Si se potencia, la expresión del gen que codifica la enzima induce la acumulación intracelular de acetil-CoA.
Acetato CoA <=> Acetil-CoA
A continuación, la cepa que alberga el plásmido de expresión constitutivo se manipula para aumentar aún más la síntesis de acetil-CoA. El enfoque adoptado en esta invención es incapacitar la inhibición por retroalimentación contra la síntesis de CoA. En este contexto, la pantotenasa quinasa, que cataliza la primera etapa comprometida y es la enzima que controla la velocidad en la biosíntesis de CoA, está mutada para ser resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA. Para ello, se introduce una mutación en el gen que codifica la pantotenato quinasa, es decir, coaA (R106A). Este gen puede obtenerse de la secuencia del genoma (gi:89110060) de Escherichia coli descrita anteriormente (Mol Syst Biol. 2006; 2:2006.0007. Epub 21 de febrero de 2006). Además, la secuencia de genes puede obtenerse a partir de bases de datos públicas, tales como las construidas por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) o el Banco de Datos de ADN de Japón (DDBJ).
Además de tener la actividad de catalizar la fosforilación de pantotenasa a 4-fosfopantotenato como se muestra en la siguiente reacción, la pantotenato quinasa mutada es insensible a la inhibición por retroalimentación por CoA. Por tanto, la potenciación del gen que codifica la pantotenasa quinasa mutada aumenta el nivel intracelular de la reserva de CoA.
Pantotenato ATP <=> 4'-fosfopantotenato ADP
La cepa mutante obtenida de este modo acumula gran cantidad de CoA y acetil-CoA en ella que se usan como sustratos, junto con la homoserina, para la producción de O-acetil-L-homoserina por la enzima codificada por metX. Por lo tanto, la cepa mutante puede producir O-acetil-L-homoserina con alto rendimiento.
Como tal, tres cepas productoras de O-acetil homoserina, CJM-X/(pCL-P(pro)-Acs), CJM-X/(pCL-P(pro)-coaA(R106A)) y CjM-X/(pCL-P(pro)-acs, pACYC-coaA(R106A)), se denominaron "Escherichia coli CA05-0565", "Escherichia coli CA05-0564" y "Escherichia coli CA05-0566", respectivamente, y se prepararon y pusieron en KCCM (Cultivo de microorganismos de Corea, edificio Eulim, Hongje-1-Dong, Seodaemun-ku, Seúl, 361-221, Corea) el 11 de agosto de 2009, con los núms. de acceso KCCM11023P, KCCM11022P y KCCM11024P, respectivamente. En una modalidad preferida de la presente descripción, se proporciona una cepa productora de O-acetil homoserina en la que acs, un gen implicado en la biosíntesis de acetil-CoA, se sobreexpresa bajo el control del promotor constitutivo Pro. Más detalladamente, el promotor pRro está compuesto por la secuencia de longitud completa o una parte de la SEQ ID NO. 9.
En otra modalidad preferida de la presente descripción, se proporciona una cepa productora de O-acetil homoserina en la que una pantotenato quinasa responsable de la etapa comprometida de biosíntesis de CoA es resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA. Además, se proporciona un método para producir O-acetil homoserina con alto rendimiento. Preferentemente, la pantotenato quinasa resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA se muta en la posición del aminoácido 106. Con mayor preferencia, la pantotenato quinasa se muta en la posición del aminoácido 106 mediante la sustitución de arginina por alanina, lo que es de este modo resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA. Con la máxima preferencia, la pantotenato quinasa resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8.
En una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona una cepa de E. coli productora de O-acetil homoserina en la que los dos enfoques se toman juntos para mejorar tanto la actividad de acetil-CoA sintasa como la actividad de pantotenato quinasa.
Preferentemente, la cepa de E. coli útil para la preparación de la cepa productora de O-acetil homoserina es una capaz de producir lisina, treonina, isoleucina o metionina. Con mayor preferencia, la cepa de E. coli presenta la introducción y la mejora de (a) la actividad de homoserina acetil transferasa; (b) aspartoquinasa u homoserina deshidrogenasa; o (c) tanto (a) como (b). Lo más preferible es E. coli derivada de CJM-X/pthrA(M)-CL (Núm. de acceso KCCM 10921P).
En un ejemplo concreto de la presente invención, el gen acs se clona y se usa para construir el vector de expresión de acs pCL-P(pro)-acs que está bajo el control del promotor constitutivo pPro de la SEQ ID NO. 9 (Figura 2). Un gen coaA se muta en la posición del aminoácido 106 de arginina a alanina para dar un gen coaA mutante de la SEQ ID NO. 8 que codifica la enzima resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA. Este gen mutante se clona en plásmidos que portan el promotor constitutivo pPro de la SEQ ID NO. 9, para proporcionar plásmidos de expresión recombinante, pCL-P(pro)-coaA(R106A) y pACYC-coaA(R106A) (Figura 3) que están bajo el control del promotor constitutivo pPro. Los plásmidos recombinantes pCL-P(pro)-acs y pCL-P(pro)-coaA(R106A) o pACYC-coaA(R106A) se transforman, solos o en combinación, en CJM-X que se construyó mediante la eliminación del plásmido pthrA(M)-CL a partir de CJM-X/pthrA(M)-CL (Núm. de acceso KCCM 10921P), una cepa con un enriquecimiento en thrA y metX como se describe en el documento núm. US12/062835 (es decir, la publicación de patente de Estados Unidos núm. US 2009-0253186 A1), para preparar cepas productoras de O-acetil homoserina que presentan la introducción y el enriquecimiento de (a) un gen que codifica la acetil-CoA sintasa (acs), (b) un gen que codifica la pantotenato quinasa resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA (coaA) y (c) tanto los genes (a) como (b) (Ejemplos de 1 a 3). El cultivo en matraces mostró que, en comparación con el control CJM-X, la productividad de O-acetil homoserina aumentó en 2,8 g/l para la cantidad de producción y en un 4,7 % para el rendimiento de producción en la cepa transformada con el pCL-P(pro)-acs que porta el gen de la acetil-CoA sintasa (acs) de (a), en 2,1 g/l para la cantidad de producción y en un 3,5 % para el rendimiento de producción en la cepa transformada con pCL-P(pro)-coaA(R106A) que porta la pantotenato quinasa resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA de (b) (coaA), y en 6,8 g/l para la cantidad de producción y por un 11,4 % para el rendimiento de producción en la cepa transformada con pCL-P(pro)-acs y pACYC-coaA (R106A) de (b) y (c) (Ejemplo 2, Tabla 2).
De acuerdo con otro aspecto de esta, la presente invención se dirige a un método para producir O-acetilhomoserina, que comprende la fermentación de la cepa de E. coli productora de O-acetil-homoserina en un medio de cultivo para acumular O-acetil-homoserina en el medio.
De acuerdo con otro aspecto de esta, la presente invención se dirige a un método para producir L-metionina y acetato, que comprende (a) producir O-acetil-homoserina mediante la fermentación de una cepa de Escherichia sp. productora de O-acetil homoserina de la presente invención; (b) separar la O-acetil homoserina; y (c) convertir la O-acetil homoserina separada, junto con el metil mercaptano, en L-metionina y acetato en presencia de una transferasa que se selecciona de cistationina gamma sintasa, O-acetil homoserina sulfhidrilasa y O-succinil homoserina sulfhidrilasa.
Cuando está relacionado con la cepa de la presente invención, el método para producir L-metionina, que se basa en el uso de la enzima convertidora, cistationina gamma sintasa, O-acetil homoserina sulfhidrilasa u O-succinil homoserina sulfhidrilasa como se describe en el documento núm. WO 2008/013432, concedida a los presentes inventores, puede producir un mayor rendimiento en la producción de L-metionina.
La cepa productora de 0-acetil-L-homoserina preparada anteriormente puede cultivarse en un medio y en condiciones conocidas en la técnica. Como bien entenderán los familiarizados con la técnica, el método de cultivo puede ajustarse de acuerdo con la cepa usada. La fermentación puede llevarse a cabo en un lote, un cultivo continuo o un tipo de lote alimentado, pero no se limita a ello. En la siguiente referencia se describe una variedad de métodos de fermentación: "Biochemical Engineering" por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, págs.
138-176.
El medio de cultivo debe cumplir las condiciones de cultivo de una cepa específica. En la siguiente referencia se describe una variedad de medios de cultivo de microorganismos: "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Estadounidense de Bacteriología, Washington DC, Estados Unidos, 1981. Generalmente, un medio de cultivo incluye varias fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y oligoelementos. Los ejemplos de la fuente de carbono incluyen carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; grasas, tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes, tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos, tales como ácido acético. Estas fuentes de carbono pueden usarse solas o en combinación. Los ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen fuentes de nitrógeno orgánico, tales como peptona, extracto de levadura, salsa de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz (CSL), y harina de frijoles; y fuentes de nitrógeno inorgánico, tales como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, que pueden usarse solos o en combinación. Además, el medio puede contener dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio y/o las correspondientes sales que contienen sodio de estos. Además, el metal puede estar contenido en forma de sales, como sulfato de magnesio o sulfato de hierro, en el medio. Además, también pueden añadirse aminoácidos, vitaminas y precursores adecuados. Los medios o los precursores pueden añadirse al cultivo por tipo discontinuo o tipo continuo.
El pH del cultivo puede ajustarse con un compuesto adecuado, por ejemplo, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfato y ácido sulfúrico. Para inhibir la generación de burbujas en el cultivo, puede usarse un agente antiespumante tal como el éster de poliglicol de ácido graso. Para generar condiciones aeróbicas, el medio de cultivo puede airearse con oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, el aire). El medio de cultivo se mantiene a 20 ~ 45 °C y preferentemente a 25 ~ 40 °C. La cepa se cultiva hasta un nivel deseado del precursor de L-metionina, preferentemente durante 10 ~ 160 horas.
Puede obtenerse una mejor comprensión de la presente invención mediante los siguientes ejemplos que se exponen para ilustrar, pero no deben interpretarse como limitantes de la presente invención.
Ejemplo 1: Preparación de cepa productora de O-acetil homoserina
<1-1> Clonación del gen acs
Para la clonación del gen acs, el gen acs que codifica la acetil-CoA sintasa se amplificó mediante PCR con el ADN genómico de Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) que sirvió como molde. La secuencia de bases del gen acs se obtuvo de la base de datos GenBank del NIH (NCBI-gi:89110790) y se expresa en la SEQ ID NO. 7. Sobre la base de la secuencia de bases, se amplificó por PCR un ORF que variaba de a Tg a TAA mediante el uso de un conjunto de cebadores (SEQ ID NOS. 1 y 2) que contiene los sitios de las enzimas de restricción EcoRV y HindIII, mientras que el ADN genómico de Escherichia coli W3110 se usó como molde en presencia de la ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (Stratagene). La PCR se realizó con 30 ciclos de desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos para sintetizar un gen acs de aproximadamente 2,0 kb que contiene los sitios EcoRV y HindIII en él.
Después de la digestión con las enzimas de restricción EcoRV y HindIII, el gen acs amplificado se ligó a un vector pPro-GFP que se trató previamente con las mismas enzimas de restricción, para construir un vector de expresión constitutivo recombinante que porta el gen acs y que contiene el promotor constitutivo Pro, denominado pCL-P(pro)-acs. La Figura 2 muestra el mapa genético y la construcción del vector de expresión pCL-P(pro)-acs.
<1-2> Clonación del gen coaA resistente a la retroalimentación
Para la clonación de un gen coaA resistente a la retroalimentación, un gen coaA que codifica pantotenato quinasa acetil-CoA sintasa resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA se amplificó mediante PCR con el ADN genómico de Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) como molde. Para ello, en primer lugar, se obtuvo la secuencia de bases de un gen coaA de la base de datos GenBank del NIH (NCBI-gi:89110060). Sobre la base de la secuencia de bases, un conjunto de cebadores (SEQ ID NOS. 3 y 4) para la amplificación por PCR de un fragmento de coaA de ATG a TAA se diseñó para contener el sitio de la enzima de restricción EcoRV y el codón GCC, en lugar de CGT de las posiciones de los nucleótidos 316 ~ 318, para impartir resistencia a la inhibición por retroalimentación por CoA. Por separado, un conjunto de cebadores (SEQ ID NOS. 5 y 6) para la amplificación por PCR de un fragmento de coaA se diseñó para contener el sitio de la enzima de restricción HindIII y el codón GCC, en lugar de CGT de las posiciones de los nucleótidos 316 ~ 318 por la misma razón que se describió anteriormente.
Mientras que el ADN genómico de Escherichia coli W3110 se usó como molde, la PCR se realizó mediante el uso de los respectivos conjuntos de cebadores sintetizados (SEQ ID NOS. 3 y 4, y SEQ ID NOS. 5 y 6) en presencia de la ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (Stratagene), con 30 ciclos de desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos. Como resultado, se obtuvieron dos fragmentos de genes: uno tenía un tamaño de aproximadamente 344 pb que se extendía desde el codón ATG inicial de coaA, con una mutación del codón CGT, al codón GCC en las posiciones de los nucleótidos de 316 a 318; el otro tenía un tamaño de aproximadamente 642 pb y contenía el codón de terminación TAA, con una mutación del codón CGT al codón GCC en las posiciones de los nucleótidos de 316 a 318.
Mientras que los dos fragmentos se usaron como moldes, la PCR se llevó a cabo con 10 ciclos de desnaturalización a 96 °C durante 60 segundos, hibridación a 50 °C durante 60 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos, seguido de 20 ciclos de las mismas condiciones térmicas mediante el uso de un conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS. 3 y 6. Como resultado, se obtuvo un gen de 963 pb en el que el codón GCC sustituyó al codón CGT en las posiciones de 316 a 318 (coaA(R106A)).
Después de la digestión con las enzimas de restricción EcoRV y HindIII, el gen coaA mutante se clonó mediante ligación a un vector pPro-GFP para construir un vector de expresión recombinante, denominado pCL-P(pro)-coaA(R106A), que estaba bajo el control del promotor constitutivo Pro (SEQ ID NO. 9.) y portaba un gen coaA mutante en el que el codón de un residuo de aminoácido en la posición 106 estaba mutado de CGT a GCC. La secuencia de aminoácidos de coaA mutante se expresa en la SEQ ID NO. 8.
A continuación, el gen coaA mutante se clonó en un vector pACYC177. El plásmido recombinante pCL-P(pro)-coaA(R106A) se trató con las enzimas de restricción para escindir un fragmento de coaA(R106A) de 1,45 kb que contenía el promotor Pro del mismo. El fragmento de coaA(R106A) se insertó en un vector pACYC177 que se trató previamente con BamHI y HindIII para producir un vector recombinante pACYC-coaA(R106A). En la Figura 3, se ilustra esquemáticamente la construcción de los vectores de expresión recombinantes pCL-P(pro)-coaA(R106A) y pACYC-coaA(R106A).
<1-3> Preparación de la cepa productora de O-acetil-homoserina
Los plásmidos construidos en los Ejemplos <1-1> y <1-2>, pCL-P(pro)-acs y pCL-P(pro)-coaA(R106A), se transformaron en la cepa CJM-X, que se construyó mediante la eliminación del plásmido pthrA(M)-CL a partir de CJM-X/pthrA(M)-CL (Núm. de acceso KCCM 10921P) descrito en el documento núm. US12/062835 (es decir, la publicación de patente de Estados Unidos núm. US 2009-0253186 A1), seguido de la incubación en LB-Sp (extracto de levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l, espectinomicina 25 pg/l) para seleccionar 10 colonias resistentes a espectinomicina para cada transformante. Además, el CJM-X que ancla el vector pCL-P(pro)-acs se transformó con el plásmido de expresión recombinante construido en el Ejemplo <1-2>, pACYC-CoaA(R106A), y se cultivó en LB-Sp-Ap (Extracto de levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l, espectinomicina 25 pg/l, ampicilina 50 pg/l) para seleccionar 10 colonias resistentes tanto a espectinomicina como a ampicilina. Se compararon entre sí para determinar la productividad de O-acetil homoserina.
Ejemplo 2: Fermentación para la producción de O-acetil homoserina
Con el fin de examinar las cepas preparadas en el Ejemplo 1 para determinar su capacidad para producir el precursor de metionina O-acetil homoserina, se cultivaron en matraces Erlenmeyer.
Para este cultivo, se empleó el medio de titulación de O-acetil-homoserina que se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000008_0001
Las colonias individuales que se generaron en placas LB durante la incubación durante la noche a 32 °C se tomaron con asas de platino y se inocularon respectivamente en 25 ml del medio de titulación de O-acetil homoserina, seguido del cultivo a 32 °C durante 42 ~ 64 h con agitación a 250 rpm. Cada cultivo se analizó cuantitativamente para O-acetil homoserina mediante el uso de HPLC. Los datos del análisis se resumen en la Tabla 2, a continuación. En comparación con la cepa de control CJM-X, como se muestra en la Tabla 2, se encontró que la cantidad y el rendimiento de producción de O-acetil homoserina aumentaron en 2,8 g/l y 4,7 %, respectivamente, con la sobreexpresión del gen acs bajo el control del promotor de expresión constitutivo P(pro), en 2,1 g/l y 3,5 %, respectivamente, tras la sobreexpresión del gen coaA(R106A) resistente a la inhibición por retroalimentación, y en 6,8 g/l y 11,4 %, respectivamente, sobre la sobreexpresión concomitante tanto de acs como de coaA(R106A).
Tomados en conjunto, los datos obtenidos en las pruebas en matraces indican que la introducción y la mejora de uno o ambos del gene acs y el gen coaA resistente a la inhibición por retroalimentación conduce a un aumento en la productividad y el rendimiento de producción de la O-acetil homoserina.
Tabla 2
Efectos de la expresión de Acs y CoaA(R106) en la producción de O-acetil-homoserina
Figure imgf000009_0001
(Aplicabilidad industrial)
Como se ha descrito hasta ahora, la presente invención proporciona una cepa de Escherichia sp. que produce O-acetil homoserina con alto rendimiento en un medio de cultivo cuando se fermenta en el medio. Además, la O-acetil homoserina puede convertirse, junto con el metil mercaptano, en L-metionina en presencia de una enzima convertidora de metionina, con la producción concomitante de ácido acético.
Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se han descrito con fines ilustrativos, los expertos en la técnica apreciarán que son posibles diversas modificaciones, adiciones y sustituciones, sin apartarse del alcance de la invención como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una cepa de Escherichia sp. capaz de producir O-acetil homoserina,
que tiene un aumento en la actividad intracelular de una enzima codificada por (a) un gen de acetil-CoA sintasa (acs); y (b) un gen de pantotenato quinasa mutado (coaA), en donde la pantotenato quinasa es resistente a la inhibición por retroalimentación por CoA; por la sobreexpresión de los genes,
en donde la sobreexpresión de los dichos genes se implementa mediante la introducción de una copia extra de los genes diana en el cromosoma, o mediante la introducción de los genes diana en combinación con un promotor heterólogo en un vector, o mediante el uso de un promotor heterólogo.
2. La cepa de Escherichia sp. de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la pantotenato quinasa mutada tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de una enzima de tipo salvaje (NCBI-ID del gen 948479) en la posición 106.
3. La cepa de Escherichia sp. de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la pantotenato quinasa mutada tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8.
4. La cepa de Escherichia sp. de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cepa tiene un aumento de la actividad intracelular de aspartoquinasa u homoserina deshidrogenasa.
5. La cepa de Escherichia sp. de acuerdo con la reivindicación 1, perteneciente a Escherichia coli.
6. Un método para producir O-acetil-homoserina, que comprende la fermentación de la cepa productora de O-acetilhomoserina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un medio de cultivo para acumular O-acetil-homoserina en el medio.
7. El método para producir O-acetil-homoserina de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la cepa tiene un aumento en la actividad intracelular de la homoserina acetil transferasa.
8. Un método para producir L-metionina y acetato, que comprende
(a) producir O-acetil-homoserina mediante la fermentación de la cepa productora de O-acetil-homoserina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
(b) separar la O-acetil homoserina; y
(c) convertir la O-acetil-homoserina separada, junto con el metil mercaptano, en L-metionina y acetato en presencia de una transferasa que se selecciona de cistationina gamma sintasa, O-acetil-homoserina sulfhidrilasa y O-succinil-homoserina sulfhidrilasa.
9. El método para producir L-metionina y acetato de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la cepa tiene un aumento en la actividad intracelular de la homoserina acetil transferasa.
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