CN112094872A - 一种产o-乙酰l-高丝氨酸菌株发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于代谢改造菌株发酵技术领域，公开了一种优化后的产O‑乙酰L‑高丝氨酸菌株发酵方法，所述产OAH菌株的优化后的发酵条件为：初始甘油浓度为37.46g/L，氯化铵浓度为3.43g/L，酵母粉浓度为6.82g/L。本发明首先用Plackett‑Buman法筛选出培养基中粗甘油浓度、氯化铵浓度和酵母粉浓度三个影响大的因素，然后进行最陡爬坡实验和BoxBehnken实验，并进行回归分析，得到各因素的最佳培养条件等。本发明以粗甘油为碳源得到的发酵液的O‑乙酰‑L‑高丝氨酸产量为7.01g/L，较基础培养基提高了66.5％。此外，以等量的纯甘油为碳源进行摇瓶培养发酵实验，发酵液的O‑乙酰‑L‑高丝氨酸的含量可以达到9.42g/。根据模型求出的最优条件配制培养基，对模型进行5L发酵罐中发酵验证，分别以纯甘油和粗甘油为碳源，重组大肠杆菌E.coli‑OAH在30℃条件下发酵48h后，OAH的水平分别达到9.21g/L和6.81g/L，与预测值相比无明显差异。

Description

一种产O-乙酰L-高丝氨酸菌株发酵方法
(一)技术领域
本发明属于代谢改造菌株发酵技术领域，尤其涉及一种产O-乙酰L-高丝氨酸菌株发酵方法。
(二)背景技术
O-乙酰-L-高丝氨酸(OAH)能够在乙酰高丝氨酸巯解酶的作用下直接与甲硫醇反应生成蛋氨酸和乙酸，该方法是偶联发酵-酶法合成蛋氨酸的重要工艺路线，并具有较高的产率。目前，发酵法产OAH的水平有限，并未达到工业生产的需求。而微生物发酵受培养条件的影响，尤其是改造后的菌株受培养基中的成分的影响显得尤为突出。微生物发酵的生产水平取决于生产菌的特性和发酵条件，其中发酵条件对微生物产物的代谢合成有很大的影响，对于改造后菌株的代谢产物有其最适的生产条件。
经过代谢工程改造后的菌株对于生长条件和环境要求相比改造之前的菌株会发生变化，因此，优化适合特定菌株的发酵条件是研究利用该菌株的重要基础。不同学者采用响应面法和回归方程的分析对大肠杆菌产其他代谢物质的发酵条件进行优化，提高了发酵水平，缩短了发酵周期，为后续的工业生产奠定了基础。但是，现阶段对改造后的大肠杆菌利用粗甘油为初始碳源进行发酵产O-乙酰-L-高丝氨酸的研究几乎没有，不能满足其作为中间体生产蛋氨酸的工业生产需求。
因此，有必要研究一种大肠杆菌重组菌株E.coli-OAH发酵条件优化方法提高OAH产量来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。
(三)发明内容
本发明提供了一种产O-乙酰-L-高丝氨酸菌株尤其是重组大肠杆菌E.coli-OAH的发酵方法。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案：
一种产O-乙酰-L-高丝氨酸菌株的发酵方法，所述方法包括：将产O-乙酰L-高丝氨酸菌株接种至含有甘油37.46g/L、氯化铵3.43g/L、酵母粉6.82g/L的发酵培养基中，于28～35℃、100～300rpm条件下发酵培养40～70h，得到含有O-乙酰-L-高丝氨酸的发酵液。
本发明方法的优化过程如下：
A、首先用Plackett-Buman法筛选出初始甘油的浓度，氯化铵的浓度，酵母粉的浓度三个影响大的因素；
B、然后进行最陡爬坡实验逐步改变初始甘油的浓度，氯化铵的浓度，酵母粉的浓度，逼近最佳响应面区域；
C、最后通过Box-Behnken法进行回归分析，得到发酵过程中各因素的最佳培养条件；接种于最优培养基中，培养基的甘油浓度为37.46g/L，氯化铵浓度为3.43g/L，酵母粉浓度为6.82g/L。
所述回归分析的二次多项回归方程为：
OAH产量＝5.98-1.08*A+0.27*B-0.25*C-0.23*A*B-0.14*A*C+0.045*B*C-0.77*A2-0.51*B2-0.64*C2(其中A：甘油浓度，B：氯化铵浓度，C：酵母粉浓度)
经优化后，发酵所得到的发酵液的O-乙酰-L-高丝氨酸产量预测值为6.45g/L。
具体的，所述产O-乙酰-L-高丝氨酸菌株为经改造的重组大肠杆菌E.coli-OAH，由如下方法构建：运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将大肠杆菌E.coli W3110中的metJ、metI、metB、thrB、metA、lysA和iclR基因敲除，并将rhtA、thrA和eamA基因的原位启动子替换为trc启动子，得到重组大肠杆菌E.coli-OAH。
具体的，所述发酵培养基终浓度组成如下：甘油37.46g/L、氯化铵3.43g/L、酵母粉6.82g/L、KH2PO4 0.5～1.0g/L、MgSO4 0.2～0.8g/L、CaCO3 10～30g/L、0.5～2mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水。
优选的，所述发酵培养基终浓度组成如下：甘油37.46g/L、氯化铵3.43g/L、酵母粉6.82g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、CaCO3 15g/L、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH7.0；微量元素溶液组成：CuCl2 10g/L、FeSO4·7H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 1g/L、CuSO40.20g/L、NiCl2·7H2O 0.02g/L，溶剂为去离子水。
本发明首先利用Plackett-Buman法确定出初始甘油的浓度，氯化铵的浓度，酵母粉的浓度为重要影响因素；然后通过最陡爬坡实验逐步改变三因素的浓度，接近最佳响应面区域；最后采用Box-Behnken法进行回归分析确定出主要因素的最优浓度，得到最佳发酵培养条件为：甘油浓度为37.46g/L，氯化铵浓度为3.43g/L，酵母粉浓度为6.82g/L，经培养发酵后，该发酵液的O-乙酰-L-高丝氨酸的含量为7.01g/L，较基础培养基提高了66.5％。同时，回归方程所得到的最大预测值与验证值非常接近，说明回归方程能较真实的反映各筛选因素的影响，建立的模型与实际情况是比较吻合的，因此用响应面法优化重组大肠杆菌E.coli-OAH利用发酵产O-乙酰-L-高丝氨酸的培养条件是有效可行的。
本发明的有益效果主要体现在：本发明采用响应面分析法对重组大肠杆菌E.coli-OAH发酵产O-乙酰-L-高丝氨酸的培养条件进行优化，能够有效增加重组大肠杆菌利用粗甘油进行代谢并发酵产O-乙酰-L-高丝氨酸的能力，提高生产效率。
(四)附图说明
图1为本发明实施例2提供的产O-乙酰-L-高丝氨酸菌株发酵条件的优化方法流程图。
图2为本发明实施例2提供的粗甘油浓度和氯化铵浓度交互作用的响应曲面和等高线示意图。
图3为本发明实施例2提供的粗甘油浓度和酵母粉浓度交互作用的响应曲面和等高线示意图。
图4为本发明实施例2提供的酵母粉浓度和氯化铵浓度交互作用的响应曲面和等高线示意图。
图5为本发明实施例2提供的5L发酵罐发酵验证实验结果图；a为纯甘油，b为粗甘油。
(五)具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
实施例1：重组大肠杆菌E.coli-OAH的构建
运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将大肠杆菌E.coli W3110中(购自大肠杆菌遗传育种中心The Coli Genetic Stock Center)的metJ、metI、metB、thrB、metA、lysA和iclR基因敲除，得到大肠杆菌E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔmetBΔthrBΔmetAΔlysAΔiclR(Peng Liu et al.2020.Multiplex design of metabolic network for production ofL-homoserine in Escherichia coli.Applied and Environmental Microbiology)。以大肠杆菌E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔmetBΔthrBΔmetAΔlysAΔiclR为出发菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System.Applied EnvironmentalMicrobiology.81:2506-2514)，将rhtA、thrA和eamA基因的原位启动子替换为trc启动子(序列为：TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGTCACAAAGGAGATATAC)，得到重组菌株OAH：
构建pTarget质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，将质粒上转录sgRNA的20bp碱基通过PCR方式突变为与基因组同源的N20序列，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget质粒。
构建同源臂donor：将trc启动子序列加在待上调基因原始启动子-35区上游500bp及该基因起始密码子(ATG)下游500bp之间，通过overlap PCR技术扩增获得完整的donorDNA片段，用于基因编辑。
将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入出发菌株中，单克隆接种到LB试管中，30℃过夜培养，再以体积浓度1％的接种量接种到含50ml LB培养基的250ml摇瓶中，并加入500μL 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm，30℃培养至OD600 0.4～0.6，4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3edEdition，99-102)的描述。
取5μl基因对应的donor DNA和1μl对应的pTarget质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1ml LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5ml离心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养12～16h，单菌落通过菌落PCR并测序验证，获得基因型为E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔmetBΔthrBΔmetAΔlysAΔiclR Trc-metL Trc-thrA Trc-rhtA Trc-eamA的重组大肠杆菌E.coli-OAH。
实施例2：发酵条件的优化
本发明实施例提供的产O-乙酰-L-高丝氨酸菌株发酵条件的优化方法的粗甘油浓度为37.46g/L(甘油含量约80％，m/m)，氯化铵浓度为3.43g/L，酵母粉浓度为6.82g/L。
如图1所示，本发明实施例提供的产O-乙酰-L-高丝氨酸菌株发酵条件的优化方法包括以下步骤具体包括：
Step1：用Plackett-Buman法筛选出初始粗甘油的浓度，氯化铵的浓度，酵母粉的浓度三个影响大的因素；
Step2：然后进行最陡爬坡实验逐步改变初始粗甘油的浓度，氯化铵的浓度，酵母粉的浓度，逼近最佳响应面区域；
Step3：通过Box-Behnken法进行回归分析，得到发酵过程中各因素的最佳培养条件；接种于最优培养基中，培养基的粗甘油浓度为37.46g/L，氯化铵浓度为3.43g/L，酵母粉浓度为6.82g/L。
所述回归分析的二次多项回归方程为：
OAH产量＝5.98-1.08*A+0.27*B-0.25*C-0.23*A*B-0.14*A*C+0.045*B*C-0.77*A2-0.51*B2-0.64*C2(其中A：粗甘油浓度，B：氯化铵浓度，C：酵母粉浓度)。
下面结合具体实验对本发明的应用效果作进一步的描述：
本发明通过观察所拟合的相应曲面的形状，响应面立体分析图，根据回归方程绘制试验因素间交互效应三维立体响应曲面和等高线图，观察在一个因素不变的情况下，其他两个因素对产O-乙酰-L-高丝氨酸的影响。通过分析得到极大值所对应的各主要因素即粗甘油、氯化铵、酵母粉的最佳浓度分别为37.46g/L，3.43g/L和6.82g/L，此时发酵液的O-乙酰-L-高丝氨酸含量最高，预测值为6.45g/L。
为了进一步分析相关变量之间的交互作用以及确定最优点，通过回归方程绘制了三个关键影响因素对重组大肠杆菌E.coli-OAH发酵水平交互影响的三维立体响应曲面和等高线图(图2～图4)。其中，粗甘油浓度和氯化铵浓度交互作用响应面为开口向下的凸形曲面(图2)，之间交互效应的等高线形状为椭圆形说明粗甘油浓度和氯化铵浓度的交互作用较显著；粗甘油浓度和酵母粉浓度交互作用响应面为开口向下的凸形曲面(图3)，之间交互效应的等高线形状为椭圆形说明粗甘油浓度和酵母粉浓度的交互作用较显著；酵母粉浓度和氯化铵浓度交互作用响应面为开口向下的凸形曲面(图4)，之间交互效应的等高线形状为圆形说明酵母粉浓度和氯化铵浓度的交互作用不显著。从图中发现，在较低的粗甘油浓度，较高的氯化铵浓度和中等酵母粉浓度下，菌株发酵产O-乙酰-L-高丝氨酸的水平最高。通过分析得到极大值所对应的各主要因素为粗甘油、氯化铵、酵母粉的最佳浓度分别为37.46g/L，3.43g/L和6.82g/L。
根据模型求出的最优条件配制培养基，即粗甘油37.46g/L、氯化铵3.43g/L、酵母粉6.82g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、CaCO3 15g/L、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH7.0；微量元素溶液组成：CuCl2 10g/L、FeSO4·7H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 1g/L、CuSO4 0.20g/L、NiCl2·7H2O 0.02g/L，溶剂为去离子水。对模型进行5L发酵罐中发酵验证。分别以纯甘油和粗甘油为碳源，重组大肠杆菌E.coli-OAH在30℃条件下发酵48h后，OAH的水平分别达到9.21g/L和6.81g/L(图5)，与预测值相比无明显差异。与纯甘油相比，重组大肠杆菌E.coli-OAH以粗甘油为碳源进行发酵时，其生物量和产量都比纯甘油的低，这与粗甘油中的高盐(NaCl，KCl等杂质)、高pH和高渗透压等因素的影响相关。但是，经过条件优化后(优化之后OAH的水平为6.81g/L，优化之前OAH的水平为4.21g/L)，重组大肠杆菌E.coli-OAH能较好的利用粗甘油，并进行正常代谢生产目标产物。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种产O-乙酰L-高丝氨酸菌株发酵方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> trc启动子(Unknown)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggtcaca aaggagatat ac 52

Claims (4)

1.一种产O-乙酰-L-高丝氨酸菌株的发酵方法，所述方法包括：将产O-乙酰L-高丝氨酸菌株接种至含有甘油37.46g/L、氯化铵3.43g/L、酵母粉6.82g/L的发酵培养基中，于28～35℃、100～300rpm条件下发酵培养40～70h，得到含有O-乙酰-L-高丝氨酸的发酵液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述产O-乙酰-L-高丝氨酸菌株为经改造的重组大肠杆菌E.coli-OAH，由如下方法构建：运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将大肠杆菌E.coli W3110中的metJ、metI、metB、thrB、metA、lysA和iclR基因敲除，并将rhtA、thrA和eamA基因的原位启动子替换为trc启动子，得到重组大肠杆菌E.coli-OAH。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下：甘油37.46g/L、氯化铵3.43g/L、酵母粉6.82g/L、KH2PO4 0.5～1.0g/L、MgSO4 0.2～0.8g/L、CaCO3 10～30g/L、0.5～2mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下：甘油37.46g/L、氯化铵3.43g/L、酵母粉6.82g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、CaCO3 15g/L、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH7.0；微量元素溶液组成：CuCl2 10g/L、FeSO4·7H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 1g/L、CuSO4 0.20g/L、NiCl2·7H2O 0.02g/L，溶剂为去离子水。
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CN113388564A (zh) * 2021-06-04 2021-09-14 浙江工业大学 一种o-乙酰-l-高丝氨酸生产菌、构建方法及应用

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