CN102002473A

CN102002473A - 产生o-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o-乙酰高丝氨酸的方法

Info

Publication number: CN102002473A
Application number: CN2010101449062A
Authority: CN
Inventors: 金素影; 申容旭; 许仁庚; 金贤雅; 徐昌一; 金朱恩; 孙晟光; 李相穆; 全成后; 李汉珍; 罗光镐
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2011-04-06
Also published as: KR101117012B1; ES2606540T3; JP2011045360A; EP3042950A1; US8283152B2; EP2290051A1; CN106868066A; JP5445243B2; US20110053253A1; EP2290051B1; MY169764A; DK2290051T3; PL2290051T3; KR20110023703A; CN104911136A

Abstract

本发明公开了能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株，在所述菌株中引入以下酶并增强其活性：高丝氨酸乙酰转移酶、天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶；以及选自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸半醛脱氢酶组成的组的至少一种酶。此外，本发明还提供了利用所述菌株产生O-乙酰高丝氨酸的方法。

Description

产生O-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生O-乙酰高丝氨酸的方法

技术领域

本发明涉及能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属(Escherichia sp.)的菌株。另外，本发明还涉及利用所述菌株产生O-乙酰高丝氨酸的方法。

背景技术

可以通过化学或生物学方式合成在动物饲料、食品和医药中使用的蛋氨酸。

在化学合成途径中，蛋氨酸基本上是通过水解5-[2-甲基巯基乙基]乙内酰脲产生的。然而，合成蛋氨酸的不利之处在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，这需要困难的额外方法将它们彼此分开。为了解决该问题，本发明的发明人开发了用于选择性地合成L-蛋氨酸的生物学方法，L-蛋氨酸是已有专利申请(WO 2008/103432)要求保护的化学物质。该方法(简称为“两步法”)包括发酵产生L-蛋氨酸前体以及由L-蛋氨酸前体向L-蛋氨酸的酶促转化。所述蛋氨酸前体优选包括O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸。就对常规方法存在的问题的克服对所述两步法进行评价，所述常规方法存在的问题例如硫化物的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反馈调控，以及胱硫醚γ合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶对中间产物的降解。另外，与产生DL-蛋氨酸的常规化学合成法相比，所述两步法具有以下优点：仅对L-蛋氨酸具有选择性，并且伴随产生作为有用副产物的有机酸，例如琥珀酸和乙酸。

作为蛋氨酸生物合成途径中的中间产物，O-乙酰-高丝氨酸被用作产生蛋氨酸的前体(WO 2008/013432)。如下式所示，在O-乙酰转移酶的协助下由L-高丝氨酸和乙酰-CoA合成O-乙酰-高丝氨酸：

L-高丝氨酸+乙酰-CoA→O-乙酰-高丝氨酸。

在本申请的受让人的美国专利申请第12/062835号中公开了其中引入了负责天冬氨酸激酶活性和高丝氨酸脱氢酶活性的thrA基因和编码高丝氨酸乙酰转移酶的源自奇球菌(Deinococcus)的metX基因从而分别提高L-高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸的生物合成的微生物株，和利用所述微生物株高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的方法。

关于这一点，本发明的发明人认为增强负责高丝氨酸生物合成途径中催化反应的其他三种酶能够以更高于US12/062835所述方法的产量产生O-乙酰高丝氨酸，其中所述其他三种酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)。

与根据本发明的共同增强(concomitant enhancement)参与从磷酸烯醇式丙酮酸到O-乙酰高丝氨酸的转化的一系列酶类似，已经尝试通过同时表达在由天冬氨酸衍生的L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-蛋氨酸)的生物合成中发挥重要作用的酶来提高L-氨基酸的产量。

EP00900872涉及在大肠杆菌(Escherichia coli)中有效地产生L-赖氨酸，其特征在于提高参与赖氨酸生物合成的一系列酶的活性，所述酶包括二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(tetrahydropicolinatesuccinylase，dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶(succinyl diaminopimelatediacylase，lysE)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)。日本专利第JP2006-520460和JP2000-244921号公开了通过提高天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸激酶(thrA)、高丝氨酸脱氢酶(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)和苏氨酸合酶(thrC)的活性从而在大肠杆菌中有效产生L-苏氨酸。另外，WO 2007/012078公开了能够产生水平增加的L-蛋氨酸的棒杆菌(Corynebacterium)重组菌株，其中编码天冬氨酸激酶(lysC)、高丝氨酸脱氢酶(hom)、高丝氨酸乙酰转移酶(metX)、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(metY)、胱硫醚γ合酶(metB)、维生素B₁₂依赖性甲基转移酶(metH)、维生素B₁₂非依赖性蛋氨酸合酶(metE)、甲基四氢叶酸还原酶(metF)和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(zwf)的基因的表达水平提高，而编码蛋氨酸阻遏物蛋白(mcbR)、高丝氨酸激酶(hsk)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)和苏氨酸脱氢酶(livA)的基因的表达水平降低。

所有这些专利均涉及有效产生天冬氨酸衍生的L-氨基酸，即分别为L-丝氨酸、L-苏氨酸和L-蛋氨酸，特征在于应用依赖于各自产物的基因组合。

在本发明中，经过设计使负责O-乙酰高丝氨酸生物合成途径中从磷酸烯醇式丙酮酸到O-乙酰高丝氨酸的催化步骤中的一系列酶的表达水平提高，从而以较高的产量产生O-乙酰高丝氨酸，这在之前的文献中并没有提及。另外，由于终产物不同，本发明中应用的酶组合不同于用于产生天冬氨酸衍生的L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-蛋氨酸)的酶组合。

为实现本发明，本发明的发明人对以最大产量产生O-乙酰高丝氨酸进行了广泛而深入的研究，结果发现共同增强微生物株中基因组DNA和/或质粒形式的编码天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶(thrA)以及高丝氨酸乙酰转移酶(metX)的基因，和编码选自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)的至少一种酶的基因可以使O-乙酰高丝氨酸的产量显著增加。

发明内容

因此，本发明的目的是提供能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的微生物株，其经过设计以增强负责参与从磷酸烯醇式丙酮酸到O-乙酰高丝氨酸的高丝氨酸生物合成途径的酶的一系列基因。

本发明的另一个目的是提供利用所述微生物株以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的方法。

根据本发明的一个方面，提供能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株，其中在所述菌株中引入以下酶并增强其活性：(a)高丝氨酸乙酰转移酶、天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶；和(b)选自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸半醛脱氢酶组成的组的至少一种酶。

根据本发明的另一方面，提供在培养基中产生O-乙酰高丝氨酸的方法，所述方法包括在所述培养基中发酵菌株。

根据本发明的再一方面，提供产生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括：(a)发酵所述菌株从而产生O-乙酰高丝氨酸；(b)分离O-乙酰高丝氨酸；和(c)在选自由胱硫醚γ合酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶组成的组的酶存在下，将O-乙酰高丝氨酸和甲基硫醇一起转化为L-蛋氨酸和乙酸(acetate)。

因此，根据本发明，可以通过发酵埃希氏菌属的菌株以高产量产生O-乙酰高丝氨酸，其中所述菌株以染色体DNA和/或质粒的形式含有负责从磷酸烯醇式丙酮酸到O-乙酰高丝氨酸的生物合成途径的天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶(thrA)、高丝氨酸乙酰转移酶(metX)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)的所有六种基因。此外，根据本发明的发明人提交的发明名称为“Microorganismproducing L-methionine precursor and method of producing L-methionine andorganic acid from the L-methionine precursor”的WO2008/013432中的公开，由本发明的菌株产生的O-乙酰-L-高丝氨酸可以被高产量地转化为L-蛋氨酸。

附图说明

参考以下详细说明并结合附图，可以更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特点和优点，在附图中：

图1为显示本发明菌株的O-乙酰高丝氨酸生物合成途径的示意图；

图2为显示用于染色体整合的pSG-2ppc载体的遗传图和构建的示意图；

图3为显示用于染色体整合的pSG-2aspC载体的遗传图和构建的示意图；

图4为显示用于染色体整合的pSG-2asd载体的遗传图和构建的示意图；

图5为显示表达载体pCJ-thrA(M)-metX-CL的遗传图和构建的示意图。

具体实施方式

根据本发明的一个方面，本发明涉及能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属菌株，在所述菌株中引入以下酶并增强其活性：(a)高丝氨酸乙酰转移酶、天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶；和(b)选自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸半醛脱氢酶组成的组的至少一种酶。

本文使用的术语“L-蛋氨酸前体”旨在表示在蛋氨酸生物合成途径中发现的代谢物或其衍生物，特别是表示O-乙酰高丝氨酸。

本文使用的术语“产O-乙酰高丝氨酸株”旨在表示可以在细胞内或细胞外产生O-乙酰高丝氨酸的原核或真核微生物，特别是表示能够在其中累积O-乙酰高丝氨酸的经遗传修饰的微生物。可用于本发明的所述株的实例包括埃希氏菌属、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)、棒杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、沙门氏菌属(Salmonellar sp.)、短杆菌属(Brevibacteria sp.)、Hypomononas sp.、色杆菌属(Chromobacterium sp.)、诺卡氏菌(Norcardia sp.)、真菌和酵母，优选埃希氏菌属、棒杆菌属和钩端螺旋体属以及酵母。更优选埃希氏菌属。更优选大肠杆菌。更优选能够产生L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸或L-蛋氨酸的大肠杆菌菌株。最优选来自本申请的受让人(US 12/062835)保藏的保藏号为KCCM 10921P或KCCM10925P大肠杆菌菌株的菌株，或来自FTR2533(保藏号为KCCM 10541)的菌株。

本文使用的术语“引入并增强……的活性”旨在表示提高由相应基因编码的酶的细胞内活性，这通常能够通过所述基因的过表达实现。过表达目标基因的方法有很多。例如，可以通过修饰目标基因启动子区内和/或5’-UTR内的碱基；通过在染色体上引入目标基因的额外拷贝；或者通过将目标基因与自体同源启动子或异源启动子相组合引入到载体上，然后将所述载体转化到微生物株中实现过表达。另外，目标基因ORF(开放阅读框)内的突变可以引起其过表达。用数字表示，当发生过表达时，与天然状态的表达相比，相应蛋白的活性或浓度提高了10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％、1000％或高达2000％。引入并增强基因活性的方法包括用携带相应基因的质粒进行转化，增加基因拷贝量，利用针对所述基因的强启动子，或者对所述基因的现有启动子进行突变。

在本发明的优选实施方式中，本发明提供能够以更高产量产生O-乙酰高丝氨酸的微生物株和利用所述微生物株产生O-乙酰高丝氨酸的方法，其中在所述菌株中引入由以下6种酶组成的一列酶并增强其活性：天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶(thrA)、高丝氨酸乙酰转移酶(metX)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)。优选地，通过转化携带相应基因的表达载体而向细胞中引入并增强天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶(thrA)或高丝氨酸乙酰转移酶(metX)，同时编码选自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)的至少一种酶的基因的一个或多个拷贝可以位于所述微生物株的基因组内。最优选，所有这三个基因都以两个或更多个拷贝的形式位于大肠杆菌的基因组内。

更详细地，微生物株经过设计以提高编码负责蛋氨酸生物合成途径第一步的高丝氨酸O-乙酰转移酶的metX基因的水平，从而增强L-蛋氨酸前体O-乙酰高丝氨酸的合成。在本文中，metX通常指编码具有高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的蛋白的基因。对于本发明的应用，新的外源高丝氨酸O-乙酰转移酶可以源自多种微生物。所述可以由其获得编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的基因的微生物的实例包括棒杆菌属、钩端螺旋体属、奇球菌属、假单胞菌属或分支杆菌属(Mycobacterium sp.)，但并不限于此。优选地，高丝氨酸O-乙酰转移酶可以由源自选自以下组的菌株的基因编码：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、迈氏钩端螺旋体(Leptospira meyeri)、耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。更优选地，高丝氨酸O-乙酰转移酶具有UniProt数据库登录号Q9RVZ8(SEQ ID NO.18)、NP_249081(SEQ ID NO.19)或YP_886028(SEQ ID NO.20)的氨基酸序列。已知源自迈氏钩端螺旋体的metX基因显示对反馈抑制的耐性(J Bacteriol.1998Jan；180(2)：250-5.Belfaiza J et al.)。在本发明的发明人此前的研究中还发现其他高丝氨酸O-乙酰转移酶对反馈抑制的耐性。

例如，可以通过引入metX或通过对目标基因的5’-UTR和/或启动子区内的碱基进行修饰，实现高丝氨酸O-乙酰转移酶的引入和增强。优选地，将与自体同源或异源启动子组合的目标基因插入到载体内，然后将所述载体转化到微生物株中。metX的引入和增强引起蛋氨酸前体的合成提高。

此外，经过设计使所述微生物株的天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性提高，从而提高O-乙酰高丝氨酸前体高丝氨酸的合成。在本文中，thrA通常指编码具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性的肽的基因。优选所述天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶由Uniprot数据库登录号AP_000666的基因编码。优选通过质粒引入thrA基因，并且作为质粒DNA保留。也就是说，可以将携带thrA的表达载体转化到菌株中。更优选将metX和thrA引入到菌株中并使其在菌株中作为质粒DNA保留。也就是说，可以将同时携带metX和thrA的表达载体转化到菌株中。

在本发明的实施方式中，产生O-乙酰-L-高丝氨酸的微生物株的制备如下所示：

首先经设计，通过提高分别编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)的基因的拷贝数使微生物株累积O-乙酰-L高丝氨酸。为此，将这些基因分别克隆到用于将基因整合到染色体中的pSG载体中，然后用pSG载体进行转化，从而将各基因的数量增加至2个或更多个拷贝。结果，提高了所述基因的表达。接着，将编码天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶(thrA)以及高丝氨酸乙酰转移酶(metX)的基因作为质粒DNA引入到所述微生物株中。由此构建了由thrA基因(天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶)、源自奇球菌的metX基因(高丝氨酸乙酰转移酶)和CJ1启动子构成的thrA-metX操纵子，并将其克隆至pCL1920(低拷贝质粒)中，随后将所述重组质粒转化到各所述基因(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脱氢酶(asd))均具有2个拷贝的菌株中。由此，所述微生物株在从磷酸烯醇式丙酮酸至O-乙酰高丝氨酸的生物合成途径的每个步骤均得到改进。

如以下反应式所示，从磷酸烯醇式丙酮酸到O-乙酰高丝氨酸的生物合成的催化步骤由一系列酶负责。因此，所述一系列基因的过表达导致O-乙酰高丝氨酸在细胞内的累积。

磷酸烯醇式丙酮酸+H₂O+CO₂<->草酰乙酸+磷酸

草酰乙酸+谷氨酸<->天冬氨酸+a-酮戊二酸

天冬氨酸+ATP<->天冬氨酰-4-磷酸+ADP

天冬氨酰-4-磷酸+NADPH<->天冬氨酸-半醛+磷酸+NADP⁺

天冬氨酸-半醛+NADPH<->高丝氨酸

高丝氨酸+乙酰-CoA<->O-乙酰-高丝氨酸+CoA。

分别编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶以及高丝氨酸乙酰转移酶的基因通常表示为ppc、aspC、asd、thrA和metX。可以从以前公开的大肠杆菌和耐辐射奇球菌R1的基因组序列中获得这些基因(Mol Syst Biol.2006；2：2006.0007.Epub 2006 Feb 21.，Science.1999 Nov 19；286(5444)：1571-7)。另外，也可以从公用数据库，例如美国国立生物技术信息中心((the NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)或日本DNA数据库(DNA DataBank of Japan，DDBJ)构建的公用数据库中获得所述基因序列。例如，ppc的GenBank ID.No.89110074，aspC的GenBank ID.No.85674274，asd的GenBank ID.No.89110578，thrA的GenBank ID.No.89106886，metX的GenBank ID.No.1799718。由此制备的微生物株在由天冬氨酸到O-乙酰高丝氨酸的生物合成途径中涉及的一系列催化步骤上得到改进，从而高产量地产生O-乙酰-L-高丝氨酸。所述产生O-乙酰高丝氨酸的菌株CJM-XPA2(pCJ-thrA(M)-metX-CL)(命名为大肠杆菌CA05-0567)于2009年8月11日保藏在KCCM(Korean Culture of Microorganism，Eulim build，Hongje-1-Dong，Seodaemun-ku，Seoul，361-221，Korea)，保藏号为KCCM11025P。

可以以产生L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸的菌株为基础，优选以产生L-苏氨酸的菌株为基础制备产生L-蛋氨酸的菌株。在这种情况下，这些菌株已经适合合成高丝氨酸，并可以进一步通过工程化的方式提高metX的表达，从而大量产生蛋氨酸前体。

本文使用的术语“产L-苏氨酸株”旨在表示能够在细胞内产生L-苏氨酸的原核或真核微生物。可用于本发明的菌株的实例包括埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒杆菌属、假单胞菌属或短杆菌属，优选埃希氏菌属。更优选大肠杆菌。

在本发明的优选实施方式中，可以使用在WO 2005/075625中公开的产L-苏氨酸株FRT2533。FTR2533源自大肠杆菌TFR7624，TFR7624来源于保藏号为KCCM10236的大肠杆菌，而KCCM10236大肠杆菌又基于大肠杆菌TF4076。保藏号为KCCM10236的大肠杆菌高水平表达编码负责由PEP形成草酰乙酸的酶的ppc基因，以及编码对从苏氨酸到天冬氨酸的生物合成至关重要的酶的基因(包括thrA(天冬氨酸激酶、L-高丝氨酸脱氢酶)，thrB(高丝氨酸激酶)和thrC(苏氨酸合酶))，由此使L-苏氨酸的产量提高。大肠杆菌TFR7624(KCCM10538)携带失活的tyrR基因，该基因抑制生物合成L-苏氨酸所必需的tyrB基因的表达。大肠杆菌FTR2533(KCCM10541)为携带失活galR基因的产L-苏氨酸大肠杆菌菌株。

在本发明的优选实施方式中，可以使用在US 12/062835公开的CJM2-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10925P)。通过缺失metB、thrB、metJ和metA基因并在metA基因座插入源自耐辐射奇球菌的metX基因，然后用携带thrA基因的表达载体转化，从大肠杆菌FTR2533获得该菌株。

另外，在本发明的优选实施方式中，可以使用在US 12/062835公开的CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10921P)。通过缺失metB、thrB、metJ和metA基因并在metA基因座插入源自耐辐射奇球菌的metX基因，然后用携带thrA基因的表达载体转化，从大肠杆菌CJM002(保藏号KCCM10568)获得该菌株。

在本发明的具体实施例中，在大肠杆菌染色体内整合了各两个拷贝的ppc、aspC和asd基因。为此，如图2-4所示，构建了用于整合相应基因的重组质粒，其中图2为pSG-2ppc，图3为pSG-2aspC，图4为pSG-2asd。另外，还构建了重组表达载体pCJ-thrA(M)-metX-CL，从而同时表达thrA和metX(图5)。依次将重组载体pSG-2ppc、pSG-2aspC和pSG-2asd转化到US12/062835中公开的thrA和metX基因得到增强的CJM-X/pthrA(M)-CL菌株(保藏号KCCM 10921P)中。所述转化菌株具有各两个拷贝的整合至其染色体的ppc、aspC和asd基因，命名为CJM-XPA2。用pCJ-thrA(M)-metX-CL载体转化后，在培养瓶(flask)中培养该突变菌株，从而定量分析O-乙酰高丝氨酸的产生。与CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10921P)对照相比，在其染色体中整合了各两个拷贝ppc、aspC、asd基因(负责磷酸烯醇式丙酮酸到天冬氨酸的转化)的菌株中，发现O-乙酰高丝氨酸的产率由29.1％提高至32.7％，提高了3.6％；在以染色体DNA或质粒DNA的形式具有所有ppc、aspC、asd、thrA和metX基因(负责从磷酸烯醇式丙酮酸至O-乙酰高丝氨酸的生物合成途径)的菌株中，O-乙酰高丝氨酸的产率由29.1％提高至46％，提高了16.9％。考虑到仅增强ppc、aspC和asd基因(负责磷酸烯醇式丙酮酸到天冬氨酸的转化)时O-乙酰高丝氨酸的产率为32.7％，以及仅增强thrA和metX时O-乙酰高丝氨酸的产率为37.5％的事实，当同时增强负责从磷酸烯醇式丙酮酸至O-乙酰高丝氨酸的整个生物合成途径的所有基因时，O-乙酰高丝氨酸的产率进一步提高至46％(实施例2，表2)。因此，根据本发明制备的菌株产生O-乙酰高丝氨酸的产率高于野生型的对应菌株。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及产生O-乙酰高丝氨酸的方法，所述方法包括在培养基中发酵产生O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌菌株，从而在培养基中累积O-乙酰高丝氨酸。

根据本发明的再一个方面，本发明涉及产生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括(a)通过发酵本发明的产O-乙酰高丝氨酸埃希氏菌株以产生O-乙酰高丝氨酸；(b)分离O-乙酰高丝氨酸；和(c)在选自胱硫醚γ合酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的转化酶存在下，将分离的O-乙酰高丝氨酸和甲基硫醇一起转化为L-蛋氨酸和乙酸。

当与本发明的菌株一起使用时，本发明的发明人的WO 2008/013432中公开的基于使用转化酶(胱硫醚γ合酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶)的L-蛋氨酸生产方法能够产生更高产量的L-蛋氨酸。

以上制备的产O-乙酰-L-高丝氨酸株可以在本领域已知的培养基和培养条件下培养。本领域技术人员完全理解，可以根据所用菌株对培养方法进行调整。发酵可以以分批、连续培养或分批补料的形式进行，但并不限于此。以下参考文献公开了多种发酵方法：“Biochemical Engineering”by James M.Lee，Prentice-Hall International Editions，pp 138-176。

培养基必须满足特定菌株的培养条件。以下参考文献中公开了多种微生物培养基：“Manual of Methods for General Bacteriology”by the AmericanSociety for Bacteriology，Washington D.C.，USA，1981。通常，培养基包括多种碳源、氮源和微量元素。碳源的实例包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；脂肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，例如甘油和乙醇；和有机酸，例如乙酸。这些碳源可以单独或组合使用。氮源的实例包括有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽膏、玉米浆(CSL)和豆粉；无机氮源，例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，这些氮源可以单独或组合使用。另外，所述培养基还可以包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和/或其相应的含钠盐。另外，所述培养基中还可以以盐的形式包含金属，例如磷酸镁或硫酸铁。此外，还可以加入氨基酸、维生素和适当的前体。可以分批或连续的方式将所述培养基或前体加入到培养物中。

可以利用合适的化合物，例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸和硫酸，调整培养物的pH。为了防止在培养物中产生气泡，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了产生有氧条件，可以向培养基中充入氧或含氧气体(例如空气)。培养基保持在20～45℃，优选25～40℃。将菌株培养至L-蛋氨酸前体的期望水平，优选培养10～160小时。

通过以下实施例可以更好地理解本发明，但以下实施例仅用于说明而非限制本发明的范围。

实施例1：制备产O-乙酰高丝氨酸株

<1-1>构建用于ppc的染色体整合的pSG载体

为了在大肠杆菌的染色体中整合ppc，构建了pSG-2ppc载体。

从NIH的GenBank数据库获得ppc基因的碱基序列(NCBI-gi：89110074)。在该碱基序列的基础上，合成了用于扩增ppc基因的两对引物。一对引物(SEQ ID NOS.1和2)从ppc ORF的起始密码子上游200bp开始，并包含EcoRI和SacI的限制性酶切位点；另一对引物(SEQ ID NOS.3和4)从ppcORF的起始密码子上游200bp开始，并包含SacI和KpnI的限制性酶切位点。

当以大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板时，在高保真DNA聚合酶PfuUltra^TM(Stratagene)的存在下，利用SEQ ID NOS.1和2或SEQ ID NOS.3和4的引物对进行PCR，条件为96℃变性30秒、50℃退火30秒并在72℃延伸4分钟，共30个循环。

由此获得的PCR产物是分别含有EcoRI和SacI位点，以及SacI和KpnI位点的约3.1kb两种ppc基因。

分别使用限制性酶EcoRI和SacI，以及SacI和KpnI进行消化后，将所扩增的两种ppc基因彼此连接，并插入到用限制性酶EcoRI和KpnI处理的pSG76-C载体(J Bacteriol.1997 Jul；179(13)：4426-8)中，从而构建携带两个拷贝ppc基因的重组质粒pSG-2ppc。图2显示了用于向染色体中整合两个拷贝ppc的载体pSG-2ppc的遗传图和构建。

<1-2>构建用于aspC的染色体整合的pSG载体

为了在大肠杆菌的染色体中整合aspC，构建了pSG-2aspC载体。

从NIH的GenBank数据库获得aspC基因的碱基序列(NCBI-gi：85674274)。在该碱基序列的基础上，设计了一对用于扩增aspC基因引物(SEQID NOS.5和6)，其从aspC ORF的起始密码子上游200bp开始并包含限制性酶切位点BamHI。

当以大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板时，在高保真DNA聚合酶PfuUltra^TM(Stratagene)存在下，利用SEQ ID NOS.5和6引物对进行PCR，条件为96℃变性30秒、50℃退火30秒并在72℃延伸2分钟，共30个循环。

由此获得的PCR产物是其中包含BamHI位点的约1.5kb的aspC基因。

用限制性酶BamHI消化后，将所扩增的aspC基因连接到用同一限制性酶处理的pSG76-C载体中，从而构建携带两个拷贝aspC基因的重组质粒pSG-2aspC。图3显示了用于向染色体中整合2个拷贝aspC的载体pSG-2aspC的遗传图和构建。

<1-3>用构建于asd的染色体整合的pSG载体

为了在大肠杆菌的染色体中整合asd，构建了pSG-2asd载体。

从NIH的GenBank数据库获得asd基因的碱基序列(NCBI-gi：89110578)。在该碱基序列的基础上，合成了用于扩增asd基因的两对引物：一对引物(SEQ ID NOS.7和8)从asdORF的起始密码子上游200bp开始，并包含EcoRI和XbaI的限制性酶切位点；另一对引物(SEQ ID NOS.9和10)从asd ORF的起始密码子上游200bp开始，并包含XbaI和EcoRI的限制性酶切位点。

当以大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板时，在高保真DNA聚合酶PfuUltra^TM(Stratagene)存在下，利用SEQ ID NOS.7和8或SEQ ID NOS.9和10引物对进行PCR，条件为96℃变性30秒、50℃退火30秒并在72℃延伸2分钟，共30个循环。

由此获得的PCR产物是其中分别含有EcoRI和XbaI位点，以及XbaI和EcoRI位点的约1.5kb的两种asd基因。

用限制性酶EcoRI和XbaI消化后，将所扩增的asd基因彼此连接，并插入到用限制性酶EcoRI处理的pSG76-C载体中，从而构建携带两个拷贝的 asd基因的重组质粒pSG-2asd。图4显示了用于向染色体中整合2个拷贝的asd的载体pSG-2asd的遗传图和构建。

<1-4>构建用于表达ThrA和MetX的重组pCJ-thrA(M)-metX-CL

为了生物合成O-乙酰高丝氨酸，通过引入携带thrA和metX基因的重组表达载体增强所述基因。

从NIH GenBank获得metX基因的核苷酸序列(NCBI gi：1799718)。在该核苷酸序列的基础上，设计一对引物(SEQ ID NOS.11和12)，其包含从ATG至TAA的metX ORF，并在其两端均具有限制性酶切位点HindIII。

在高保真DNA聚合酶存在下，利用引物SEQ ID NOS.11和12进行PCR，条件为96℃变性30秒、50℃退火30秒并在72℃延伸2分钟，共30个循环，其中，耐辐射奇球菌R1的染色体DNA作为模板。

由此获得的PCR产物是含有限制性酶位点HindIII的约1kb的metX基因。

用限制性酶HindIII消化后，将所扩增的metX基因连接到US12/062835中公开的thrA表达载体pCJ-thrA(M)-CL质粒(预先用同一限制性酶进行处理)中，从而构建携带thrA和metX的重组表达载体(命名为pCJ-thrA(M)-metX-CL，图5)。

<1-5>制备产O-乙酰高丝氨酸株

将在实施例<1-1>中构建的携带两个拷贝ppc基因的质粒pSG-2ppc转化到US12/062835中公开的菌株CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10921P)中，然后在LB-Cm平板(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯霉素25μg/L)上进行培养，针对每个转化体选择10个氯霉素抗性克隆。所选转化体在其染色体的ppc位点处插入pSG-2ppc载体。然后，利用携带限制性酶I-SceI的表达载体pAScep转化其中插入两个拷贝ppc基因的菌株，以便切割pSG载体中存在的I-SceI位点，然后在LB-Ap(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、氨苄青霉素100μg/L)上进行筛选。结果，选出的是其染色体上插入2个拷贝ppc基因并已经从其中除去pSG76-C载体的菌株。针对实施例<1-2>和<1-3>中分别构建的pSG76C-2aspC和 pSG76C-2asd，重复与pSG-2ppc质粒相同的步骤。最后，将源自CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏号10921P)的具有插入到其染色体的ppc、asd和aspC各两个拷贝的菌株命名为CJM-XPA2。

此外，用在实施例<1-4>中构建的pCJ-thrA(M)-metX-CL载体转化CJM-XPA2菌株，然后在LB-Sp(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壮观霉素25μg/L)上培养，选出10个具有壮观霉素耐性的克隆。所述CJM-XPA2(pCJ-thrA(M)-metX-CL)(命名为大肠杆菌CA05-0567)于2009年8月11日保藏在KCCM(Korean Culture of Microorganism，Eulim build，Hongje-1-Dong，Seodaemun-ku，Seoul，361-221，Korea)，保藏号为KCCM11025P。对其产生O-乙酰高丝氨酸的能力进行相互比较。

实施例2：发酵产生O-乙酰高丝氨酸

为了检测实施例1中制备的菌株产生蛋氨酸前体O-乙酰高丝氨酸的能力，在锥形瓶中培养这些菌株。

对于该培养，使用表1中所示的O-乙酰高丝氨酸滴定培养基(titermedium)。

表1

用于生产O-乙酰高丝氨酸的培养基成分

成分	浓度(/L)
		葡萄糖	60g
硫酸铵	17g
		KH₂PO₄	1.0g
MgSO₄·7H₂O	0.5g
		FeSO₄·7H₂O	5mg
MnSO₄·8H₂O	5mg
		ZnSO₄	5mg
CaCO₃	30g
		酵母提取物	2g
蛋氨酸	0.15g
		苏氨酸	0.15g

利用铂环取出在32℃过夜培养的LB平板上产生的单个菌落，并分别接种到25mL的O-乙酰高丝氨酸滴定培养基中，然后在32℃以250rpm振荡培养42～64小时。利用HPLC定量分析各培养物的O-乙酰高丝氨酸。分析数据汇总于下表2中。

如表2所示，与CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10921P)对照相比，在具有整合至其染色体的ppc、aspC、asd基因(负责磷酸烯醇式丙酮酸到天冬氨酸的转化)各两个拷贝的菌株中，发现O-乙酰高丝氨酸的产率由29.1％提高至32.7％，提高了3.6％；在以染色体DNA或质粒DNA的形式具有所有ppc、aspC、asd、thrA和metX基因(负责从磷酸烯醇式丙酮酸至O-乙酰高丝氨酸的生物合成途径)的菌株中，O-乙酰高丝氨酸的产率由29.1％提高至46％，提高了16.9％。

总之，从所述培养瓶试验中获得的数据表明，考虑到仅增强ppc、aspC和asd基因(负责磷酸烯醇式丙酮酸到天冬氨酸的转化)时O-乙酰高丝氨酸的产率为32.7％，以及仅增强thrA和metX时O-乙酰高丝氨酸的产率为37.5％的事实，当同时增强负责从磷酸烯醇式丙酮酸至O-乙酰高丝氨酸的整个生物合成途径的所有基因时，O-乙酰高丝氨酸的产率进一步提高至46％。因此，根据本发明制备的菌株产生O-乙酰高丝氨酸的产率高于野生型的对应菌株。

表2

产生O-乙酰高丝氨酸的培养瓶试验

工业应用性

如上所述，本发明提供了在培养基中发酵时在培养基中高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株。此外，通过两步法，O-乙酰高丝氨酸与甲基硫醇可以一起被转化为L-蛋氨酸，同时伴随乙酸的产生。

尽管出于说明的目的已经公开了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书公开的本发明的范围和精神的前提下，各种修饰、添加和取代都是可能的。

序列表

<110>CJ第一制糖株式会社

<120>产生O-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生O-乙酰高丝氨酸的方法

<130>0PA09052

<150>US12/550,121

<151>2009-08-28

<160>20

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ppc的正向引物

<400>1

gccggaattc tgtcggatgc gatacttgcg c 31

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ppc的反向引物

<400>2

gaaggagctc agaaaaccct cgcgcaaaag 30

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ppc的正向引物

<400>3

gccggagctc tgtcggatgc gatacttgcg c 31

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ppc的反向引物

<400>4

gaagggtacc agaaaaccct cgcgcaaaag 30

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspC的正向引物

<400>5

tccgagctca taagcgtagc gcatcaggca 30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspC的反向引物

<400>6

tccgagctcg tccacctatg ttgactacat 30

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>asd的正向引物

<400>7

ccggaattcc caggagagca ataagca 27

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>asd的反向引物

<400>8

ctagtctaga tgctctattt aactcccg 28

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>asd的正向引物

<400>9

ctagtctaga ccaggagagc aataagca 28

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>asd的反向引物

<400>10

ccggaattct gctctattta actcccg 27

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>metX的正向引物

<400>11

ctgaaagctt atgaccgccg tgctcgcggg 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>metX的反向引物

<400>12

cgccaagctt tcaactcctg agaaacgccc 30

<210>13

<211>1005

<212>DNA

<213>耐辐射奇球菌R1(Deinococcus radioduran R1)

<400>13

atgaccgccg tgctcgcggg ccacgcctct gccctgctgc tgaccgaaga acccgactgt 60

tcggggccgc agacggtcgt tctcttccgg cgtgagccgc tgctgctcga ctgcggacgg 120

gcgctgagcg acgtgcgggt ggcctttcac acctacggca cgccgcgcgc cgacgccacg 180

ctggtgctgc acgccctgac cggcgacagc gcggtgcacg agtggtggcc cgactttctg 240

ggcgcgggcc ggccactgga cccggcagac gactacgtgg tgtgcgccaa cgtcctcggc 300

gggtgcgccg gcacgacgag cgccgctgaa ctcgccgcca cctgttccgg accggtgccg 360

ctcagcctgc gcgacatggc ccgggtgggg cgcgccctgc tggattctct cggcgtgcga 420

cgggtgcggg tcatcggcgc gagcatgggc gggatgctcg cctacgcctg gctgctggag 480

tgccccgacc tggtggaaaa ggccgtgatt ataggagccc cggcgcggca ctcgccctgg 540

gctattggac tgaacacggc ggcccgcagc gccattgccc tcgctcccgg cggcgagggg 600

ctgaaggtgg cgcgccagat tgccatgctc agttaccgca gccccgaaag cctaagccgc 660

acgcaggcgg ggcagcgcgt gccgggggtg cccgccgtta cgtcttacct gcactaccaa 720

ggcgaaaaac tcgccgcccg cttcgacgag cagacctact gcgccctcac ctgggcgatg 780

gacgcctttc agccgagcag cgccgacctc aaagcggtgc gcgcgccggt actcgtcgtc 840

ggcatctcca gcgatctgct ctaccccgcc gccgaggtcc gcgcctgcgc cgccgagctt 900

ccccacgccg actactggga actgggcagc attcacggcc acgacgcctt tttgatggac 960

ccacaggact tgccggagcg ggtgggggcg tttctcagga gttga 1005

<210>14

<211>3125

<212>DNA

<213>大肠杆菌W3110(Escherichia coli W3110)

<400>14

gccgcaataa tgtcggatgc gatacttgcg catcttatcc gaccgacagt gactcaaacg 60

atgcccaact gtaggccgga taaggcgctc gcgccgcatc cggcactgtt gccaaactcc 120

agtgccgcaa taatgtcgga tgcgatactt gcgcatctta tccgacctac acctttggtg 180

ttacttgggg cgatttttta acatttccat aagttacgct tatttaaagc gtcgtgaatt 240

taatgacgta aattcctgct atttattcgt ttgctgaagc gatttcgcag catttgacgt 300

caccgctttt acgtggcttt ataaaagacg acgaaaagca aagcccgagc atattcgcgc 360

caatgcgacg tgaaggatac agggctatca aacgataaga tggggtgtct ggggtaatat 420

gaacgaacaa tattccgcat tgcgtagtaa tgtcagtatg ctcggcaaag tgctgggaga 480

aaccatcaag gatgcgttgg gagaacacat tcttgaacgc gtagaaacta tccgtaagtt 540

gtcgaaatct tcacgcgctg gcaatgatgc taaccgccag gagttgctca ccaccttaca 600

aaatttgtcg aacgacgagc tgctgcccgt tgcgcgtgcg tttagtcagt tcctgaacct 660

ggccaacacc gccgagcaat accacagcat ttcgccgaaa ggcgaagctg ccagcaaccc 720

ggaagtgatc gcccgcaccc tgcgtaaact gaaaaaccag ccggaactga gcgaagacac 780

catcaaaaaa gcagtggaat cgctgtcgct ggaactggtc ctcacggctc acccaaccga 840

aattacccgt cgtacactga tccacaaaat ggtggaagtg aacgcctgtt taaaacagct 900

cgataacaaa gatatcgctg actacgaaca caaccagctg atgcgtcgcc tgcgccagtt 960

gatcgcccag tcatggcata ccgatgaaat ccgtaagctg cgtccaagcc cggtagatga 1020

agccaaatgg ggctttgccg tagtggaaaa cagcctgtgg caaggcgtac caaattacct 1080

gcgcgaactg aacgaacaac tggaagagaa cctcggctac aaactgcccg tcgaatttgt 1140

tccggtccgt tttacttcgt ggatgggcgg cgaccgcgac ggcaacccga acgtcactgc 1200

cgatatcacc cgccacgtcc tgctactcag ccgctggaaa gccaccgatt tgttcctgaa 1260

agatattcag gtgctggttt ctgaactgtc gatggttgaa gcgacccctg aactgctggc 1320

gctggttggc gaagaaggtg ccgcagaacc gtatcgctat ctgatgaaaa acctgcgttc 1380

tcgcctgatg gcgacacagg catggctgga agcgcgcctg aaaggcgaag aactgccaaa 1440

accagaaggc ctgctgacac aaaacgaaga actgtgggaa ccgctctacg cttgctacca 1500

gtcacttcag gcgtgtggca tgggtattat cgccaacggc gatctgctcg acaccctgcg 1560

ccgcgtgaaa tgtttcggcg taccgctggt ccgtattgat atccgtcagg agagcacgcg 1620

tcataccgaa gcgctgggcg agctgacccg ctacctcggt atcggcgact acgaaagctg 1680

gtcagaggcc gacaaacagg cgttcctgat ccgcgaactg aactccaaac gtccgcttct 1740

gccgcgcaac tggcaaccaa gcgccgaaac gcgcgaagtg ctcgatacct gccaggtgat 1800

tgccgaagca ccgcaaggct ccattgccgc ctacgtgatc tcgatggcga aaacgccgtc 1860

cgacgtactg gctgtccacc tgctgctgaa agaagcgggt atcgggtttg cgatgccggt 1920

tgctccgctg tttgaaaccc tcgatgatct gaacaacgcc aacgatgtca tgacccagct 1980

gctcaatatt gactggtatc gtggcctgat tcagggcaaa cagatggtga tgattggcta 2040

ttccgactca gcaaaagatg cgggagtgat ggcagcttcc tgggcgcaat atcaggcaca 2100

ggatgcatta atcaaaacct gcgaaaaagc gggtattgag ctgacgttgt tccacggtcg 2160

cggcggttcc attggtcgcg gcggcgcacc tgctcatgcg gcgctgctgt cacaaccgcc 2220

aggaagcctg aaaggcggcc tgcgcgtaac cgaacagggc gagatgatcc gctttaaata 2280

tggtctgcca gaaatcaccg tcagcagcct gtcgctttat accggggcga ttctggaagc 2340

caacctgctg ccaccgccgg agccgaaaga gagctggcgt cgcattatgg atgaactgtc 2400

agtcatctcc tgcgatgtct accgcggcta cgtacgtgaa aacaaagatt ttgtgcctta 2460

cttccgctcc gctacgccgg aacaagaact gggcaaactg ccgttgggtt cacgtccggc 2520

gaaacgtcgc ccaaccggcg gcgtcgagtc actacgcgcc attccgtgga tcttcgcctg 2580

gacgcaaaac cgtctgatgc tccccgcctg gctgggtgca ggtacggcgc tgcaaaaagt 2640

ggtcgaagac ggcaaacaga gcgagctgga ggctatgtgc cgcgattggc cattcttctc 2700

gacgcgtctc ggcatgctgg agatggtctt cgccaaagca gacctgtggc tggcggaata 2760

ctatgaccaa cgcctggtag acaaagcact gtggccgtta ggtaaagagt tacgcaacct 2820

gcaagaagaa gacatcaaag tggtgctggc gattgccaac gattcccatc tgatggccga 2880

tctgccgtgg attgcagagt ctattcagct acggaatatt tacaccgacc cgctgaacgt 2940

attgcaggcc gagttgctgc accgctcccg ccaggcagaa aaagaaggcc aggaaccgga 3000

tcctcgcgtc gaacaagcgt taatggtcac tattgccggg attgcggcag gtatgcgtaa 3060

taccggctaa tcttcctctt ctgcaaaccc tcgtgctttt gcgcgagggt tttctgaaat 3120

acttc 3125

<210>15

<211>1563

<212>DNA

<213>大肠杆菌W3110

<400>15

gatccgtcca cctatgttga ctacatcatc aaccagatcg attctgacaa caaactgggc 60

gtaggttcag acgacaccgt tgctgtgggt atcgtttacc agttctaata gcacacctct 120

ttgttaaatg ccgaaaaaac aggactttgg tcctgttttt tttatacctt ccagagcaat 180

ctcacgtctt gcaaaaacag cctgcgtttt catcagtaat agttggaatt ttgtaaatct 240

cccgttaccc tgatagcgga cttcccttct gtaaccataa tggaacctcg tcatgtttga 300

gaacattacc gccgctcctg ccgacccgat tctgggcctg gccgatctgt ttcgtgccga 360

tgaacgtccc ggcaaaatta acctcgggat tggtgtctat aaagatgaga cgggcaaaac 420

cccggtactg accagcgtga aaaaggctga acagtatctg ctcgaaaatg aaaccaccaa 480

aaattacctc ggcattgacg gcatccctga atttggtcgc tgcactcagg aactgctgtt 540

tggtaaaggt agcgccctga tcaatgacaa acgtgctcgc acggcacaga ctccgggggg 600

cactggcgca ctacgcgtgg ctgccgattt cctggcaaaa aataccagcg ttaagcgtgt 660

gtgggtgagc aacccaagct ggccgaacca taagagcgtc tttaactctg caggtctgga 720

agttcgtgaa tacgcttatt atgatgcgga aaatcacact cttgacttcg atgcactgat 780

taacagcctg aatgaagctc aggctggcga cgtagtgctg ttccatggct gctgccataa 840

cccaaccggt atcgacccta cgctggaaca atggcaaaca ctggcacaac tctccgttga 900

gaaaggctgg ttaccgctgt ttgacttcgc ttaccagggt tttgcccgtg gtctggaaga 960

agatgctgaa ggactgcgcg ctttcgcggc tatgcataaa gagctgattg ttgccagttc 1020

ctactctaaa aactttggcc tgtacaacga gcgtgttggc gcttgtactc tggttgctgc 1080

cgacagtgaa accgttgatc gcgcattcag ccaaatgaaa gcggcgattc gcgctaacta 1140

ctctaaccca ccagcacacg gcgcttctgt tgttgccacc atcctgagca acgatgcgtt 1200

acgtgcgatt tgggaacaag agctgactga tatgcgccag cgtattcagc gtatgcgtca 1260

gttgttcgtc aatacgctgc aggaaaaagg cgcaaaccgc gacttcagct ttatcatcaa 1320

acagaacggc atgttctcct tcagtggcct gacaaaagaa caagtgctgc gtctgcgcga 1380

agagtttggc gtatatgcgg ttgcttctgg tcgcgtaaat gtggccggga tgacaccaga 1440

taacatggct ccgctgtgcg aagcgattgt ggcagtgctg taagcattaa aaacaatgaa 1500

gcccgctgaa aagcgggctg agactgatga caaacgcaac attgcctgat gcgctacgct 1560

tat 1563

<210>16

<211>1556

<212>DNA

<213>大肠杆菌W3110

<400>16

gaattcccag gagagcaata agcaactctc gcaccatgat tgcccgccgt cttttcggtt 60

cagtatgttt cagtacggac atgaaaatag gtaggtttcc gagcggatcc ataatcagga 120

tcaataaaac tgctgcagaa atgatttcat tcataactca aattccctga taattgccgc 180

ggactttctg cgtgctaaca aagcaggata agtcgcatta ctgatggctt cgctatcatt 240

gattaatttc acttgcgact ttggctgctt tttgtatggt gaaagatgtg ccaagaggag 300

accggcacat ttatacagca cacatctttg caggaaaaaa acgcttatga aaaatgttgg 360

ttttatcggc tggcgcggta tggtcggctc cgttctcatg caacgcatgg ttgaagagcg 420

cgacttcgac gccattcgcc ctgtcttctt ttctacttct cagcttggcc aggctgcgcc 480

gtcttttggc ggaaccactg gcacacttca ggatgccttt gatctggagg cgctaaaggc 540

cctcgatatc attgtgacct gtcagggcgg cgattatacc aacgaaatct atccaaagct 600

tcgtgaaagc ggatggcaag gttactggat tgacgcagca tcgtctctgc gcatgaaaga 660

tgacgccatc atcattcttg accccgtcaa tcaggacgtc attaccgacg gattaaataa 720

tggcatcagg acttttgttg gcggtaactg taccgtaagc ctgatgttga tgtcgttggg 780

tggtttattc gccaatgatc ttgttgattg ggtgtccgtt gcaacctacc aggccgcttc 840

cggcggtggt gcgcgacata tgcgtgagtt attaacccag atgggccatc tgtatggcca 900

tgtggcagat gaactcgcga ccccgtcctc tgctattctc gatatcgaac gcaaagtcac 960

aaccttaacc cgtagcggtg agctgccggt ggataacttt ggcgtgccgc tggcgggtag 1020

cctgattccg tggatcgaca aacagctcga taacggtcag agccgcgaag agtggaaagg 1080

gcaggcggaa accaacaaga tcctcaacac atcttccgta attccggtag atggtttatg 1140

tgtgcgtgtc ggggcattgc gctgccacag ccaggcattc actattaaat tgaaaaaaga 1200

tgtgtctatt ccgaccgtgg aagaactgct ggctgcgcac aatccgtggg cgaaagtcgt 1260

tccgaacgat cgggaaatca ctatgcgtga gctaacccca gctgccgtta ccggcacgct 1320

gaccacgccg gtaggccgcc tgcgtaagct gaatatggga ccagagttcc tgtcagcctt 1380

taccgtgggc gaccagctgc tgtggggggc cgcggagccg ctgcgtcgga tgcttcgtca 1440

actggcgtaa tctttattca ttaaatctgg ggcgcgatgc cgcccctgtt agtgcgtaat 1500

acaggagtaa gcgcagatgt ttcatgattt accgggagtt aaatagagca tctaga 1556

<210>17

<211>2464

<212>DNA

<213>大肠杆菌W3110

<400>17

atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60

gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120

gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180

ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240

gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300

ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360

gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420

cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480

ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540

gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600

gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660

gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720

cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780

ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840

ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900

gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata acatggcaat gttcagcgtt 960

tctggtccgg ggatgaaagg gatggtcggc atggcggcgc gcgtctttgc agcgatgtca 1020

cgcgcccgta tttccgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag catcagtttc 1080

tgcgttccac aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140

gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcagtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200

gtggtaggtg atggtatgcg caccttgcgt gggatctcgg cgaaattctt tgccgcactg 1260

gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320

gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380

aataccgatc aggttatcga agtgtttgtg attggcgtcg gtggcgttgg cggtgcgctg 1440

ctggagcaac tgaagcgtca gcaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500

tgcggtgttg ccaactcgaa ggctctgctc accaatgtac atggccttaa tctggaaaac 1560

tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620

gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680

gcggatcaat atgccgactt cctgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740

gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800

cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860

aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920

tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980

cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040

cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100

attgaacctg tgctgcccgc agagtttaac gccgagggtg atgttgccgc ttttatggcg 2160

aatctgtcac aactcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220

aaagttttgc gctatgttgg caatattgat gaagatggcg tctgccgcgt gaagattgcc 2280

gaagtggatg gtaatgatcc gctgttcaaa gtgaaaaatg gcgaaaacgc cctggccttc 2340

tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtactgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400

gttacagctg ccggtgtctt tgctgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460

tgaa 2464

<210>18

<211>334

<212>PRT

<213>耐辐射奇球菌

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(334)

<223>UniProt数据库登录号为Q9RVZ8的高丝氨酸O-乙酰转移酶肽

<400>18

Mot Thr Ala Val Leu Ala Gly His Ala Ser Ala Leu Leu Leu Thr Glu

1 5 10 15

Glu Pro Asp Cys Ser Gly Pro Gln Thr Val Val Leu Phe Arg Arg Glu

20 25 30

Pro Leu Leu Leu Asp Cys Gly Arg Ala Leu Ser Asp Val Arg Val Ala

35 40 45

Phe His Thr Tyr Gly Thr Pro Arg Ala Asp Ala Thr Leu Val Leu His

50 55 60

Ala Leu Thr Gly Asp Ser Ala Val His Glu Trp Trp Pro Asp Phe Leu

65 70 75 80

Gly Ala Gly Arg Pro Leu Asp Pro Ala Asp Asp Tyr Val Val Cys Ala

85 90 95

Asn Val Leu Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Ser Ala Ala Glu Leu Ala

100 105 110

Ala Thr Cys Ser Gly Pro Val Pro Leu Ser Leu Arg Asp Met Ala Arg

115 120 125

Val Gly Arg Ala Leu Leu Asp Ser Leu Gly Val Arg Arg Val Arg Val

130 135 140

Ile Gly Ala Ser Met Gly Gly Met Leu Ala Tyr Ala Trp Leu Leu Glu

145 150 155 160

Cys Pro Asp Leu Val Glu Lys Ala Val Ile Ile Gly Ala Pro Ala Arg

165 170 175

His Ser Pro Trp Ala Ile Gly Leu Asn Thr Ala Ala Arg Ser Ala Ile

180 185 190

Ala Leu Ala Pro Gly Gly Glu Gly Leu Lys Val Ala Arg Gln Ile Ala

195 200 205

get Leu Ser Tyr Arg Ser Pro Glu Ser Leu Ser Arg Thr Gln Ala Gly

210 215 220

Gln Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Val Thr Ser Tyr Leu His Tyr Gln

225 230 235 240

Gly Glu Lys Leu Ala Ala Arg Phe Asp Glu Gln Thr Tyr Cys Ala Leu

245 250 255

Thr Trp Ala Met Asp Ala Phe Gln Pro Ser Ser Ala Asp Leu Lys Ala

260 265 270

Val Arg Ala Pro Val Leu Val Val Gly Ile Ser Ser Asp Leu Leu Tyr

275 280 285

Pro Ala Ala Glu Val Arg Ala Cys Ala Ala Glu Leu Pro His Ala Asp

290 295 300

Tyr Trp Glu Leu Gly Ser Ile His Gly His Asp Ala Phe Leu Met Asp

305 310 315 320

Pro Gln Asp Leu Pro Glu Arg Val Gly Ala Phe Leu Arg Ser

325 330

<210>19

<211>379

<212>PRT

<213>铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(379)

<223>UniProt数据库登录号为NP_249081的高丝氨酸O-乙酰转移酶肽

<400>19

Met Pro Thr Val Phe Pro Asp Asp Ser Val Gly Leu Val Ser Pro Gln

1 5 10 15

Thr Leu His Phe Asn Glu Pro Leu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Ser Leu

20 25 30

Ala Glu Tyr Asp Leu Val Ile Glu Thr Tyr Gly Glu Leu Asn Ala Thr

35 40 45

Gln Ser Asn Ala Val Leu Ile Cys His Ala Leu Ser Gly His His His

50 55 60

Ala Ala Gly Tyr His Ser Val Asp Glu Arg Lys Pro Gly Trp Trp Asp

65 70 75 80

Ser Cys Ile Gly Pro Gly Lys Pro Ile Asp Thr Arg Lys Phe Phe Val

85 90 95

Val Ala Leu Asn Asn Leu Gly Gly Cys Asn Gly Ser Ser Gly Pro Ala

100 105 110

Ser Ile Asn Pro Ala Thr Gly Lys Val Tyr Gly Ala Asp Phe Pro Met

115 120 125

Val Thr Val Glu Asp Trp Val His Ser Gln Ala Arg Leu Ala Asp Arg

130 135 140

Leu Gly Ile Arg Gln Trp Ala Ala Val Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly

145 150 155 160

Met Gln Ala Leu Gln Trp Thr Ile Ser Tyr Pro Glu Arg Val Arg His

165 170 175

Cys Leu Cys Ile Ala Ser Ala Pro Lys Leu Ser Ala Gln Asn Ile Ala

180 185 190

Phe Asn Glu Val Ala Arg Gln Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Phe Leu

195 200 205

Gly Gly Tyr Phe Gln Glu Gln Gly Val Ile Pro Lys Arg Gly Leu Lys

210 215 220

Leu Ala Arg Met Val Gly His lle Thr Tyr Leu Ser Asp Asp Ala Met

225 230 235 240

Gly Ala Lys Phe Gly Arg Val Leu Lys Thr Glu Lys Leu Asn Tyr Asp

245 250 255

Leu His Ser Val Glu Phe Gln Val Glu Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly

260 265 270

Glu Glu Phe Ser Thr Arg Phe Asp Ala Asn Thr Tyr Leu Leu Met Thr

275 280 285

Lys Ala Leu Asp Tyr Phe Asp Pro Ala Ala Ala His Gly Asp Asp Leu

290 295 300

Val Arg Thr Leu Glu Gly Val Glu Ala Asp Phe Cys Leu Met Ser Phe

305 310 315 320

Thr Thr Asp Trp Arg Phe Ser Pro Ala Arg Ser Arg Glu Ile Val Asp

325 330 335

Ala Leu Ile Ala Ala Lys Lys Asn Val Ser Tyr Leu Glu Ile Asp Ala

340 345 350

Pro Gln Gly His Asp Ala Phe Leu Met Pro Ile Pro Arg Tyr Leu Gln

355 360 365

Ala Phe Ser Gly Tyr Met Asn Arg Ile Ser Val

370 375

<210>20

<211>380

<212>PRT

<213>耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(380)

<223>UniProt数据库登录号为YP_886028的高丝氨酸O-乙酰转移酶肽

<400>20

Met Thr Ile Ile Glu Glu Arg Ala Thr Asp Thr Gly Met Ala Thr Val

1 5 10 15

Pro Leu Pro Ala Glu Gly Glu Ile Gly Leu Val His Ile Gly Ala Leu

20 25 30

Thr Leu Glu Asn Gly Thr Val Leu Pro Asp Val Thr Ile Ala Val Gln

35 40 45

Arg Trp Gly Glu Leu Ala Pro Asp Arg Gly Asn Val Val Met Val Leu

50 55 60

His Ala Leu Thr Gly Asp Ser His Val Thr Gly Pro Ala Gly Asp Gly

65 70 75 80

His Pro Thr Ala Gly Trp Trp Asp Gly Val Ala Gly Pro Gly Ala Pro

85 90 95

Ile Asp Thr Asp His Trp Cys Ala Ile Ala Thr Asn Val Leu Gly Gly

100 105 110

Cys Arg Gly Ser Thr Gly Pro Gly Ser Leu Ala Pro Asp Gly Lys Pro

115 120 125

Trp Gly Ser Arg Phe Pro Gln Ile Thr Ile Arg Asp Gln Val Ala Ala

130 135 140

Asp Arg Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Ile Thr Glu Val Ala Ala Val

145 150 155 160

Val Gly Gly Ser Met Gly Gly Ala Arg Ala Leu Glu Trp Leu Val Thr

165 170 175

His Pro Asp Asp Val Arg Ala Gly Leu Val Leu Ala Val Gly AIa Arg

180 185 190

Ala Thr Ala Asp Gln Ile Gly Thr Gln Ser Thr Gln Val Ala Ala Ile

195 200 205

Lys Ala Asp Pro Asp Trp Gln Gly Gly Asp Tyr His Gly Thr Gly Arg

210 215 220

Ala Pro Thr Glu Gly Met Glu Ile Ala Arg Arg Phe Ala His Leu Thr

225 230 235 240

Tyr Arg Gly Glu Glu Glu Leu Asp Asp Arg Phe Ala Asn Thr Pro Gln

245 250 255

Asp Asp Glu Asp Pro Leu Thr Gly Gly Arg Tyr Ala Val Gln Ser Tyr

260 265 270

Leu Glu Tyr Gln Gly Gly Lys Leu Ala Arg Arg Phe Asp Pro Gly Thr

275 280 285

Tvr Val Val Leu Ser Asp Ala Leu Ser Ser His Asp Val Gly Arg Gly

290 295 300

Arg Gly Gly Val Glu Ala Ala Leu Arg Ser Cys Pro Val Pro Val Val

305 310 315 320

Val Gly Gly Ile Thr Ser Asp Arg Leu Tyr Pro Ile Arg Leu Gln Gln

325 330 335

GLu Leu Ala Glu Leu Leu Pro Gly Cys Gln Gly Leu Asp Val Val Asp

340 345 350

Ser Ile Tyr Gly His Asp Gly Phe Leu Val Glu Thr Glu Leu Val Gly

355 360 365

Lys Leu Ile Arg Arg Thr Leu Glu Leu Ala Gln Arg

370 375 380

Claims

1.一种埃希氏菌属的菌株，其能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸，其中在所述菌株中引入以下酶并增强了酶的活性：

(a)高丝氨酸乙酰转移酶、天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶；和

(b)选自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸半醛脱氢酶组成的组中的至少一种酶。

2.如权利要求1所述的菌株，其中通过使用携带相应基因的质粒进行转化、通过提高相应基因的拷贝数、通过利用相应基因的强启动子或者通过对相应基因的已有启动子进行突变，来实现所述引入和活性的增强。

3.如权利要求2所述的菌株，其中通过引入携带metX和thrA基因的质粒实现高丝氨酸乙酰转移酶、天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶的引入和其活性的增强。

4.如权利要求3所述的菌株，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸半醛脱氢酶各自由相应的基因编码，其中各个所述相应的基因以两个或更多个拷贝位于所述菌株的基因组中。

5.如权利要求1所述的菌株，其中所述高丝氨酸乙酰转移酶、天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸半醛脱氢酶各个酶由来自大肠杆菌的相应基因metX、thrA、ppc、aspC和asd编码。

6.如权利要求1所述的菌株，其中所述高丝氨酸乙酰转移酶源自于选自棒杆菌属、钩端螺旋体属、奇球菌属、假单胞菌属和分支杆菌属的微生物。

7.如权利要求6所述的菌株，其中所述高丝氨酸乙酰转移酶源自于选自谷氨酸棒杆菌、迈氏钩端螺旋体、耐辐射奇球菌、铜绿假单胞菌和耻垢分枝杆菌的微生物。

8.如权利要求7所述的菌株，其中所述高丝氨酸乙酰转移酶具有SEQ IDNO.18、19或20的氨基酸序列或其部分序列。

9.如权利要求1所述的菌株，其中所述高丝氨酸乙酰转移酶具有源自耐辐射奇球菌Q9RVZ8的氨基酸序列或其部分序列。

10.如权利要求1所述的菌株，其源自能够产生L-苏氨酸、L-异亮氨酸或L-赖氨酸的菌株。

11.如权利要求1所述的菌株，其属于大肠杆菌。

12.如权利要求1所述的菌株，其源自大肠杆菌CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10921P)。

13.如权利要求1所述的菌株，其源自大肠杆菌CJM2-X/pthrA(M)-CL(保藏号KCCM 10925P)。

14.如权利要求1所述的菌株，其源自大肠杆菌FTR2533(保藏号KCCM10541)。

15.如权利要求1所述的菌株，其以保藏号KCCM 11025P被保藏。