KR20140044470A - ＧｎｔＫ 활성 조절을 통해 Ｌ-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로 내재적 글루코네이트 키나아제의 활성이 감소 또는 불활성화된 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 내재적 글루코네이트 키나아제 효소의 활성이 감소된 코리네박테리움 속 미생물을 이용하면, NADPH 생산수율이 증가하고, 이에 따라 상기 NADPH를 이용한 L-쓰레오닌의 생산수율을 향상시킬 수 있으므로, L-쓰레오닌의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＧｎｔＫ 활성 조절을 통해 Ｌ-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법 {Corynebacterium sp. microorganism having enhanced L-threonine productivity by regulation of GntK activity and a method of producing L-threonine using the same}

본 발명은 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로 내재적 글루코네이트 키나아제의 활성이 감소 또는 불활성화된 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료, 식품 첨가제 및 동물성장 촉진제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 이와 같은 L-쓰레오닌은 미생물 발효 기술에 의해서 생산될 수 있는 아미노산인데, 대장균(Escherichia coli), 코리네형 세균(Corynebacterium), 브레비형 세균(Brevibacterium), 세라티아속 세균(Serratia), 프로비덴시아속 균주(Providencia)의 야생주로부터 유도된 돌연변이주를 주로 이용한 발효법으로 생산된다.

유전자 재조합 균주에 관한 공지 기술로는 아스파테이트 키나아제-호모세린 디하이드로게나제 (aspartate kinase/homoserine dehydrogenase, thrA), 호모세린 키나아제 (homoserine kinase, thrB) 및 쓰레오닌 신타아제 (threonine synthase, thrC)를 코딩하는 유전자로 구성된 쓰레오닌 오페론 (operon)이 플라스미드 형태로 도입된 재조합 대장균을 사용한 L-쓰레오닌 제조방법 (일본 공개특허공보 제05-227977호), 대장균 염색체로 쓰레오닌 오페론을 추가 삽입의 방법으로 발현강화를 통한 L-쓰레오닌을 생산하는 방법 (대한민국특허 등록번호 제10-0427479호) 및, 대장균 유래의 쓰레오닌 오페론을 쓰레오닌 생산 균주인 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum)에 도입하여 L- 쓰레오닌을 생산하는 방법 (TURBA E, et al, Agric. Biol. Chem. 53:2269~2271, 1989) 등이 있다.

한편, 코리네박테리움 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다. 그러나, L-쓰레오닌의 생산 수율을 증가시키기 위해서 상기 개시된 것과 같이 포스포에놀파이루베이트로부터 쓰레오닌에 이르는 생합성 경로에 연구가 집중되었으나, 여전히 더 높은 수율의 L-쓰레오닌을 공업적으로 대량 생산하기 위한 방법의 필요성이 대두되고 있다.

L-쓰레오닌의 생합성 과정은 포스포에놀 파이루베이트(phosphoenol pyruvate; 이후 PEP라 함)가 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(phosphoenol pyruvate carboxylase; 이후 ppc라 함)에 의하여 그리고/또는 파이루베이트(pyruvate)가 파이루베이트 카르복실레이즈(pyruvate carboxylase; 이후 pyc라 함)에 의하여 L-쓰레오닌 생합성 대사과정의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate; 이후 OAA라 함)로 전환되고 이 OAA가 다시 아스파테이트(aspartate)로 전환된 후, 아스파테이트로부터 L-쓰레오닌을 생합성하는 경로에 관여하는 유전자들인 아스파르테이트 카이네이즈(aspartate kinase; lysC), 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게네이즈(aspartate semialdehyde dehydrogenase; asd), 호모세린 디하이드로게네이즈(homoserine dehydrogenase; hom), 호모세린 카이네이즈(homoserine kinase; thrB), 쓰레오닌 신테이즈(threonine synthase; thrC) 유전자에 의해 여러 단계의 중간 과정을 거쳐 L-쓰레오닌이 합성된다.

한편, 상기 생합성 대사과정 중 2개의 대사과정은 asd 및 hom 유전자에 의해 코딩된 NADPH 의존성 환원효소에 의해 이루어진다.

상기 NADPH 재생과 특정 대사과정의 직접적인 연관관계는 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 L-쓰레오닌의 생합성을 통해 밝혀졌고(Wittmann and Heinzle 2002; Marx et al. 2003; Ohnishi et al. 2005), NADPH는 대부분 pentose phosphate pathway(이하 PP pathway라고 한다)의 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH) 및 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제(6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGD)가 관여하는 산화과정에 의해 생산될 수 있다(Marx et al. 1997; Wittmann and Heinzle 2002).

상기의 일련의 연구들은 PP pathway로의 탄소흐름의 전환이 NADPH 공급이 필요한 특정 대사물질의 생합성을 증대하기 위한 대사공학적 타겟일 수 있다는 점을 제시하였다(Mascarenhas et al. 1991; Sauer et al. 1996; Marx et al. 2003; Ohinishi et al. 2005).

이러한 배경 하에서 본 발명자들은 L-쓰레오닌을 보다 효과적으로 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 내재적 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase, GntK) 효소의 활성을 감소시킬 경우, PP pathway의 활성 증대를 통해 NADPH의 생산을 증대시킬 수 있으며, NADPH의 생합성 증대에 따라 L-쓰레오닌의 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 내재적 글루코네이트 키나아제(GntK)의 활성이 감소 또는 불활성화된, L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 글루코네이트 키나아제(GntK)를 불활성화하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배양하고, 배양물로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 내재적 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase, GntK)의 활성이 감소 또는 불활성화된 것을 특징으로 하는, L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명은 코리네박테리움 속 미생물 세포 내의 중심 탄소 대사활성에 관여하는 유전자들의 활성을 조절하여 상기 미생물의 L-쓰레오닌 생합성 경로를 통한 L-쓰레오닌 생합성 증대효과가 이루어지게 한다. 상기 유전자들의 활성조절은 GntK 유전자의 활성을 조절한 것이고, 상기 유전자들을 불활성화시켜 상기 미생물의 PP pathway의 산화과정이 특이적으로 증대됨에 따라 세포 내 NADPH의 농도가 유의적으로 증가될 수 있다.

상기 유전자들의 불활성화는 서열번호 1로 표시되는 NCgl2399 및 서열번호 2로 표시되는 NCgl2905를 불활성화시키는 것으로서, 상기 유전자들의 염기 서열은 밝혀져 있으나, 그 기능은 완전히 규명되지 않은 단백질로서 GntK 유전자로 추정된다.

본 발명에서 용어, "글루코네이트 키나아제(gluconate Kinase, GntK)"란 오탄당 인산화 경로의 산화과정 중간체인 6-포스포글루콘산의 생합성을 위한 GntK 경로에 관여하는 인산화 효소를 의미하며, 구체적으로는 D-글루코네이트를 6-포스포-D-글루코네이트로 인산화시키는 효소를 의미한다.

본 발명에서 용어, "내재적"이란 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 것을 의미하는데, 본 발명에서는 코리네박테리움 속 미생물이 천연적으로 가지고 있는 GntK 또는 GntK의 활성을 표시할 때 사용한다.

본 발명에서 "글루코네이트 키나아제 효소의 활성이 감소"된다는 것은 GntK를 코딩하는 유전자의 변이에 의해 GntK의 활성이 감소되는 것을 의미한다. 본 발명에서는 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에 존재하는 GntK를 코딩하는 유전자 NCgl2399 및 NCgl2905가 변이되어, 이로부터 발현되는 GntK의 활성이 감소된 상태를 표시할 때 사용한다.

본 발명에서 "불활성화"란 상기 GntK를 코딩하는 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미하고, 상기 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 불활성화 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서 "글루코네이트 키나아제(GntK)의 활성이 감소 또는 불활성화"는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 GntK를 코딩하는 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition), 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법에 의하여 유발될 수 있고, 바람직하게는 상동 재조합에 의하여 상기 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다.

상기 GntK의 활성 감소 또는 불활성화는 GntK를 코딩하는 유전자의 일부가 결실된 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 형질전환을 유도함으로써 이루어질 수 있다. 상기 재조합 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, pK18mobsacB 벡터로부터 유래된 것을 사용함이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, NCgl2399의 내부적 결실을 포함하는 도 2a에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC1034, NCgl2905의 내부적 결실을 포함하는 도 2b에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC1035등을 사용할 수 있다. 상기 pK18mobsacB는 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제되지 않고 타겟 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있다(Schafer et al. 1994).

본 발명의 일 실시예에서는 GntK를 코딩하는 유전자의 일부분이 결실된 유전자 염기서열과 항생제 마커 및 레반수크라아제 유전자(sacB)를 포함하는 재조합 벡터를 이용하였다. 이때, 상기 항생제 마커는 특별히 이에 제한되지 않으나, 카나마이신 내성부여 유전자를 사용함이 바람직하다.

본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에 존재하는 GntK를 코딩하는 유전자를 변이시켜서, GntK의 활성을 감소시키면, GntK에 의하여 사용되지 않는 글루코스가 오탄당 인산화 경로에 따라, 글루코스-6-포스페이트탈수소효소(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)를 거치면서, NADPH를 생산하게 될 뿐만 아니라, 상기 오탄당 인산화 경로에서 NADPH의 생산에 관여하는 효소인 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성이 증가되므로, 결과적으로는 NADPH를 이용한 L-쓰레오닌의 생산수율을 향상시킴을 확인할 수 있었다.

통상적인 오탄당 인산화 경로에 따르면, GDH는 글루코스를 글루코네이트로 전환시키고, 상기 글루코네이트는 6-PG로 전환된 다음, 6PGD에 의하여 NADPH를 생성하면서 리불로스 5-P로 전환되는 것으로 알려져 있다(도 1). 도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 펜토오스 인산(pentose phosphate) 및 GntK 경로를 포함하는 중심 탄소 대사과정을 나타내는 개요도이다.

본 발명자들은 상기 오탄당 인산화 경로에서 GntK를 불활성화시키거나 또는 그의 활성을 감소시키면, 글루코스가 G6P로 전환되고, 상기 G6P는 G6PDH에 의하여 NADPH를 생성하면서 6-PG로 전환된 다음, 6PGD에 의하여 NADPH를 생성하면서 리불로스 5-P로 전환되므로, NADPH의 생합성량이 증가할 것으로 예상하였다. NADPH의 생합성량이 증가한다는 것은 곧 NADPH의 cofactor를 요구하는 L-쓰레오닌의 생합성량이 증가한다는 것을 의미하는바, 결과적으로는 GntK의 불활성화 또는 활성감소에 의하여 L-쓰레오닌의 생합성 증가를 유도할 수 있을 것으로 예상하였으며, 이를 실험적으로 입증하였다.

본 발명에서 용어, "6-포스페이트글루코네이트 탈수소효소(6-phosphategluconate dehydrogenase, 6PGD)"란 세포질에 존재하는 오탄당 인산화 경로에 관여하는 산화환원 효소로, 6-PG를 리불로스 5-P로 전환시키는 반응을 수행함과 동시에, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP+)를 NADPH로 환원시키는 반응에 관여하는 효소를 의미한다.

본 발명에서 용어, "글루코스-6-포스페이트탈수소효소(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH (EC 1.1.1.49))"는 해당경로(glycolysis) 외의 포도당 분해경로인 5탄당-인산경로에서 글루코스-6-포스페이트를 6-포스포노-δ-락톤으로 전환시키는 반응을 수행함과 동시에, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP+)를 NADPH로 환원시키는 반응에 관여하는 효소를 의미한다.

본 발명에서 용어, "L-쓰레오닌"이란 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며 화학식은 NH₂(CH₂)₄CH(NH₂)COOH인, L-아미노산의 일종을 말한다. L-쓰레오닌은 옥살아세트산으로부터 라이신 생합성 경로를 통해 생합성 되며, NADPH 의존성 환원효소가 라이신 생합성을 위한 중간과정을 촉매한다.

본 발명에서 용어, "L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물"은 염색체 상에 존재하는 GntK를 코딩하는 유전자가 변이되어 GntK의 활성이 감소 또는 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 의미하는데, 상기 GntK를 코딩하는 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 NCgl2399 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl2905 등을 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 용어, "코리네박테리움 속 미생물(Corynebacterium sp.)"이란 방선균 유연의 세균 속으로 대체로 주걱형의 장간균의 형태를 가지며, 비운동성, 다형변태성, 포자 비형성 및 그람양성을 특징으로 가지는 미생물을 의미한다. 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물은 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수탁번호 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에서 NCgl0624(호모세린-O-아세틸전이효소, homoserine-O-acetyltransferase), NCgl2046(쓰레오닌-탈수효소, threonine-dehydratase), NCgl1133(디아미노피멜레이트 탈카복실화효소, diaminopimelate decarboxylase) 및 NCgl2528(D-2-하이드록시아이소카푸로에이트 탈수소화효소, D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase)의 일부를 결실시킨 SJ3611(KACC91730P, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)균주 유래일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 SJ3611 균주를 모균주로 하여 추가적으로 GntK로 예측되는 유전자인 NCgl2399 및 NCgl2905를 결실시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3628(KACC31732P, 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3624(KACC91731P, 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611, NCgl2399△, NCgl2905△) 균주일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 글루코네이트 키나아제 유전자가 파괴된 유전체 재조합 균주 SJ3624의 경우, GntK의 특이적 활성이 6.9 % 정도 남아있는 것으로 나타났다(0.29 vs 0.02 U mg/protein). 그리고, SJ3624는 SJ3611에 비하여 NADPH의 농도는 75.2% 증가하였고(2.34 vs. 4.10 mM/g), L-쓰레오닌의 생산량은 9.3배 증가하였다(0.18 vs. 1.86 g/l). 이와 같은 결과는 NADPH의 증가가 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 L-쓰레오닌의 농도를 증가시키는 역할을 한다는 것을 시사한다.

본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 글루코네이트 키나아제(GntK)를 코딩하는 유전자의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및, 상기 형질전환체 중에서 GntK의 활성이 감소 또는 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 L-쓰레오닌의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물의 제조방법은 GntK를 코딩하는 유전자의 일부가 결실된 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을, 숙주세포에 도입할 수 있고 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계; 상기 수득한 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여, 숙주세포의 염색체상에서 상동 재조합이 유도된 형질전환체를 수득하는 단계; 및 상기 형질전환체의 염색체상에서 2차 상동 재조합에 의하여 GntK를 코딩하는 유전자의 결실 및 GntK의 활성이 감소 또는 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함한다.

이때, GntK를 코딩하는 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, Genbank accession number NC_003450의 개방해독틀 DNA 서열을 가지는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 NCgl2399 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl2905를 사용함이 바람직하다.

아울러, 상기 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, L-쓰레오닌을 생산하는 미생물을 이용할 수 있는데, 바람직하게는 GntK 경로를 포함하는 오탄당 인산화 경로에 의하여 NADPH를 생산하고 이에 의하여 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(C. thermoaminogenes) 등의 코리네박테리움 속 미생물을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주일 수 있으며, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611(KACC91730P)일 수 있다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터"란 숙주세포의 염색체와 따로 복제될 수 없는 벡터로서, 유전자 삽입물이 상기 숙주세포의 염색체상의 특정 유전자와 상동 재조합될 수 있는 필수적인 구성요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 구체적으로 항생제 내성 유전자와 레반수크라아제(levansucrase, sacB) 유전자와 같은 선발유전자를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있는 pK18mobsacB 벡터(Schafer et al., Gene 145: 69-73, 1994)를 이용함으로써 유전자 결실을 수행하였다. 구체적으로, 상기 pK18mobsacB 벡터에 GntK를 코딩하는 유전자인 NCgl2399 및 NCgl2905의 일부를 변이, 바람직하게는 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편, 항생제 마커 및 레반수크라아제 유전자(sacB)를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터를 당업계에 알려진 임의의 방법으로 염색체상에 GntK를 코딩하는 유전자를 포함하여 L-쓰레오닌을 생합성할 수 있는 숙주세포에 도입시킨 후, 염색체 내에서 상동 재조합시킴으로써, GntK 활성이 감소 또는 불활성화된 L-쓰레오닌 생산용 코리네박테리움 미생물을 제작하였다.

구체적으로, pK18mobsacB 벡터에 NCgl2399의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 삽입하여 재조합 벡터 pSJC1034을 제작하고, pK18mobsacB 벡터에 NCgl2905의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 삽입하여 재조합 벡터 pSJC1035를 제작하였다.

그런 다음, 상기 제작된 각 재조합 벡터 pSJC1034 또는 pSJC1035를 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611(ATCC13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)에 전기천공법으로 도입하고, 카나마이신 내성 표현형을 선발하여 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 상기 플라스미드가 싱글 크로스오버에 의해 해당 유전자의 염색체 부위에 도입되었음을 확인하였다. 그 후 10%의 수크로오스 배지에서 2차 재조합의 선발과 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 해당 유전자의 염색체 부위로부터 플라스미드가 절제(excision)되었음을 확인하였다. 그 결과 염색체 상에서 GntK를 코딩하는 유전자인 NCgl2399 및 NCgl2905의 일부가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 SJ3624이라 명명하고, 2012년 8월 9일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 KACC91731P의 기탁번호를 부여받았다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 탄소원의 일부 또는 전부로서 글루코스가 포함된 배양 배지에 본 발명의 L-쓰레오닌의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, 상기 배양물로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 L-쓰레오닌의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-쓰레오닌은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서는, 제조된 재조합 균주를 글루코스를 포함하는 MMY2 배지에서 배양하였다.

아울러, 배양물로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 L-쓰레오닌 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.

한편, 본 발명에서는 L-쓰레오닌 생산량을 더욱 증가시키기 위해, L-쓰레오닌의 생합성에 관련된 공지의 효소들의 활성을 추가로 조절할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 추가로 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제 효소의 활성을 조절하기 위하여 상기 효소를 암호화하는 asd 유전자를 과발현시켜 L-쓰레오닌 생산량을 증대시킬 수 있다.

본 발명자들은 상기 제조된 L-쓰레오닌의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 글루코스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하고, 이로부터 생산되는 L-쓰레오닌의 생산량의 증가수준을 상호 비교하였다. 그 결과, GntK의 활성이 크게 감소될 수록 NADPH의 농도와 L-쓰레오닌의 생산량이 증가함을 확인할 수 있었다.

아울러, GntK의 활성이 감소된 본 발명의 재조합 벡터 pSJC1034 또는 pSJC1035가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(SJ3624)에서는 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다.

따라서, GntK의 활성 감소에 의하여 오탄당 인산화 경로가 활성화될 뿐만 아니라, 오탄당 인산화 경로에 관여하는 효소인 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성이 증가함에 의하여, NADPH의 생산량이 증가하며, NADPH의 생산량 증가에 의하여 L-쓰레오닌의 생합성량이 증가함을 다시 한번 확인할 수 있었다.

G6PDH 및 6PGD는 알로스테릭적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 피드백 제어 조절작용의 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Moritz et al. 2000). 그러므로 상기 효소들의 SJ3624 내에서 피드백 제어 조절작용의 해제는 L-쓰레오닌의 생산에 더 큰 영향을 미칠 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 내재적 글루코네이트 키나아제 효소의 활성이 감소된 코리네박테리움 속 미생물을 이용하면, NADPH 생산수율이 증가하고, 이에 따라 상기 NADPH를 이용한 L-쓰레오닌의 생산수율을 향상시킬 수 있으므로, L-쓰레오닌의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 펜토오스 인산(pentose phosphate) 및 GntK 경로를 포함하는 중심 탄소 대사과정을 나타내는 개요도이다.
도 2a는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내에 존재하는 GntK 유전자인 NCgl2399을 변이시키기 위한 벡터 pSJC1034의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
도 2b는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내에 존재하는 GntK 유전자인 NCgl2905를 변이시키기 위한 벡터 pSJC1035의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 불활성화 유도 재조합 벡터 제작

본 발명의 유전체 재조합 모균주인 SJ3611(Lys-, Met-, Ile-)을 제조하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 우선, NCgl0624(호모세린-O-아세틸전이효소, homoserine-O-acetyltransferase), NCgl2046(쓰레오닌-탈수효소, threonine-dehydratase), NCgl1133(디아미노피멜레이트 탈카복실화효소, diaminopimelate decarboxylase) 및 NCgl2528(D-2-하이드록시아이소카푸로에이트 탈수소화효소, D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase) ORF의 불활성화 단편을 제작하기 위해 GenBank accession number NC_003450의 서열을 근거로 각각 프라이머 0624F1, 0624F2, 0624R1, 0624R2, 2046F1, 2046F2, 2046R1, 2046R2, 1133F1, 1133F2, 1133R1, 1133R2, 2528F1, 2528F2, 2528R1, 2528R2를 제작하였다.

부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능하고 sacB 유전자를 포함하여 2차 재조합 균주를 선별할 수 있으며 카나마이신 내성 유전자를 가지고 있는 pK18mobsacB 벡터를 사용하여 수행하였으며, 유전자가 파괴된 변이주(gene-disrupted mutant strain)를 만들기 위하여 NCgl0624, NCgl2046, NCgl1133 와 NCgl2528의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pK18mobsacB 유도체를 만들었다.

상기 pK18mobsacB 유도체는 각각 pSJC2501, pSJC2504, pSJC2505 및 pSJC2507로 명명하였다.

pSJC2501은 2,038-bp 짜리 NCgl0624 ORF의 BamHI-XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl0624 ORF의 KpnI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 KpnI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 0624F1-0624R1 프라이머와 0624F2-0624R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 생성된 것이다.

pSJC2504은 1,902-bp 짜리 NCgl2046 ORF의 XbaI-XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl2046 ORF의 BamHI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 BamHI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2046F1-2046R1 프라이머와 2046F2-2046R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 생성된 것이다.

pSJC2505은 2,018-bp 짜리 NCgl1133 ORF의 XbaI-HindIII 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl1133 ORF의 SmaI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 SmaI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 1133F1-1133R1 프라이머와 1133F2-1133R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 생성된 것이다.

pSJC2507은 2,317-bp 짜리 NCgl2528 ORF의 XbaI-XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl2528 ORF의 SmaI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 SmaI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2528F1-2528R1 프라이머와 2528F2-2528R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 생성된 것이다.

본 발명의 유전체 재조합 균주인 SJC3624를 제조하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 우선, 글루코네이트 키나아제의 일종으로 알려진 NCgl2399 및 당 인산화효소로 알려진 NCgl2905의 불활성화 단편을 제작하기 위해 NCgl2399(서열번호 1) 및 NCgl2905(서열번호 2)의 서열을 근거로 각각 프라이머 2399F1, 2399F2, 2399R1, 2399R2, 2905F1, 2905F2, 2905R1, 및 2905R2를 제작하였다.

부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 상기 pK18mobsacB를 사용하여 수행하였으며, 유전자가 파괴된 변이주(gene-disrupted mutant strain)를 만들기 위하여 NCgl2399 및 NCgl2905의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pK18mobsacB 유도체를 만들었다.

상기 pK18mobsacB 유도체는 각각 pSJC1034와 pSJC1035로 명명하였다(도 2a 및 2b 참고).

pSJC1034는 2,819-bp짜리 NCgl2399의 XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl2399의 KpnI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 KpnI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2399F1-2399R1 프라이머와 2399F2-2399R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다(도 2a).

pSJC1035는 2,267-bp짜리 NCgl2905의 XbaI 말단이 있는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl2905의 SmaI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 SmaI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2905F1-2905R1 프라이머와 2905F2-2905R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다(도 2b).

상기에서 사용한 프라이머들의 서열을 정리하면 하기 표 1과 같다.

PCR 및 재조합 사용된 프라이머

프라이머	핵산 서열
0624F1(서열번호 3)	cgggatccTCCTGGATATTCCTGCGG (BamHⅠ)
0624F2(서열번호 4)	ggggtaccAGCAAGAACACCTCTCC (KpnⅠ)
0624R1(서열번호 5)	ggggtaccTGATGGCTTTGCCGGGAC (KpnⅠ)
0624R2(서열번호 6)	gctctagaTGCTGGGTTGGATTGAGG (XbaⅠ)
2046F1(서열번호 7)	gctctagaTGGAGTCCCTAGTAGAGG (XbaⅠ)
2046F2(서열번호 8)	cgggatccCTATCGCTGGGTTGAAGG (BamHⅠ)
2046R1(서열번호 9)	cgggatccTTGGTGCAATGACGGAGG (BamHⅠ)
2046R2(서열번호 10)	gctctagaCCTTCCACGACTCTCACC (XbaⅠ)
1133F1(서열번호 11)	gctctagaTCCCTGATCCGTTCCTCC (XbaⅠ)
1133F2(서열번호 12)	tcccccgggTACTGCTACGCCATGAGC (SmaⅠ)
1133R1(서열번호 13)	tcccccgggGTCTTCGTGGCTAGTGG (SmaⅠ)
1133R2(서열번호 14)	cccaagcttACTCTGACGACGATCGCA (HindⅢ)
2528F1(서열번호 15)	gctctagaTCAAGGCTGCTGCTGACC (XbaⅠ)
2528F2(서열번호 16)	tcccccgggCAAGCTGGACCGAAACCC (SmaⅠ)
2528R1(서열번호 17)	tcccccgggCACAGGAACAGCACGTCC (SmaⅠ)
2528R2(서열번호 18)	gctctagaCTTGCTGGCTGATCCTCG (XbaⅠ)
2399F1(서열번호 19)	gctctagaCCCCAGAACATGCTGACG (XbaI)
2399F2(서열번호 20)	ggggtaccGGAACCGTCTTCGTCCACC (KpnI)
2399R1(서열번호 21)	ggggtaccCGCTGCTAGGGCTTTACC (KpnI)
2399R2(서열번호 22)	gctctagaGTCACCGCTGGTACATCC (XbaI)
2905F1(서열번호 23)	gctctagaCATTGGAGCATCCGTAGC (XbaI)
2905F2(서열번호 24)	tcccccgggTTCCCGAACAGATCCCC (SmaI)
2905R1(서열번호 25)	tcccccgggGCCTTCACCATCGACCAA (SmaI)
2905R2(서열번호 26)	gctctagaCGCTCTGACCTGCCTAAC (XbaI)

상기 표 1에서 밑줄친 서열은 괄호 안에 나타낸 바와 같은 제한효소에 대한 제한위치를 나타내며, 대문자는 세균성 유전자의 서열을 의미한다.

또한, 상기 실시예에서 사용 또는 제조된 플라스미드 및 이의 구조를 정리하면 하기 표와 같다(표 2).

사용 또는 제조된 플라스미드 및 이의 구조

플라스미드	구조
pK18mobsacB	코리네박테리움에서 non-replicale sacB KmR
pSJC2501	코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 0624F1-0624R1 프라이머와 0624F2-0624R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 2,038-bp의 BamHⅠ-XbaⅠ 말단을 지니는 NCgl0624 단편이 KpnⅠ 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC2504	코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2046F1-2046R1 프라이머와 2046F2-2046R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 1,902-bp의 XbaⅠ-XbaⅠ 말단을 지니는 NCgl2046 단편이 BamHⅠ 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC2505	코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 1133F1-1133R1 프라이머와 1133F2-1133R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 2,018-bp의 XbaⅠ-HindⅢ 말단을 지니는 NCgl1133 단편이 SmaⅠ 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC2507	코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2528F1-2528R1 프라이머와 2528F2-2528R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 2,317-bp의 BamHⅠ-XbaⅠ 말단을 지니는 NCgl0624 단편이 KpnⅠ 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC1034	코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2399F1-2399R1 프라이머와 2399F2-2399R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 2,819-bp의 XbaI-XbaI 말단을 지니는 NCgl2399 단편이 KpnI 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC1035	코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2905F1-2905R1 프라이머와 2905F2-2905R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 2,267-bp의 XbaI-XbaI 말단을 지니는 NCgl2905 단편이 SmaI 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체

상기 정리된 플라스미드들을 이용하여 이하 재조합 균주를 제작하였다.

실시예 2: 재조합 균주 제작

2-1. 모균주 제작

상기 실시예 1에서 제조한 결실 유도 플라스미드 pSJC2501, pSJC2504, pSJC2505와 pSJC2507를 순차적으로 전기천공법을 이용하여 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999) 각각의 상기 플라스미드는 싱글 크로스오버에 의해 염색체에 도입되었다. 그 후, 10%의 수크로오스에서 2차 재조합을 통해 염색체로부터 플라스미드의 절제(excision)를 유도하여, NCgl0624, NCgl2046, NCgl1133 와 NCgl2528의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 모균주 SJ3611(ATCC13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)를 제조하였다. 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 NCgl0624, NCgl2046, NCgl1133, 및 NCgl2528 유전자가 모두 결실된 것을 확인하고 SJ3611으로 명명하였고, 2012년 8월 9일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC91730P를 부여받았다.

2-2. GntK 유전자가 결실된 재조합 균주 제작

상기 실시예 2-1에서 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611(ATCC13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)를 모균주로 하여, 추가로 GntK 유전자 위치로 예측되는 NCgl2399 및 NCgl2905 유전자가 결실시킨 변이주를 제작하였다.

구체적으로는, 상기 실시예 1에서 제조한 결실 유도 플라스미드 pSJC1034 및 pSJC1035를 순차적으로 전기천공법을 이용하여 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999) 각각의 상기 플라스미드는 싱글 크로스오버에 의해 염색체에 도입되었다. 그 후, 10%의 수크로오스에서 2차 재조합을 통해 염색체로부터 플라스미드의 절제(excision)를 유도하여, NCgl2399 및 NCgl2905의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 본 발명의 재조합 균주 SJ3624(ATCC13032, NCgl2399△, NCgl2905△)를 제조하였다.

상기 제조된 균주와 그의 특성을 정리하면 하기 표와 같다.

제조된 균주 및 특성

균주	특성
SJ3611	코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△
SJ3624	코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611, NCgl2399△, NCgl2905△

실시예 3. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 배양

상기 실시예 2에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 재조합 균주인 SJ3611과 SJ3624는 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종배지로 kanamycin(50mg/L)을 포함하는 Recovery Glucose 배지(80g BHI, 20g 글루코스, 60g 소르비톨/L)을 사용하여 24시간 배양하였다. 생산배지는 MMY2 배지[1.0 g KH₂PO₄, 60 g (NH₄)₂SO₄, 0.8 g MgSO₄ㆍ7H₂O, 10 mg MnSO₄ㆍH₂O, 10 mg FeSO₄ㆍ7H₂O, 20 g yeast extract, 0.4 mg 비오틴, 0.3 mg thiamine, 및 60 g 글루코스/L, pH 7.0]를 사용하였다. 종배지를 함유하는 100㎖ 배플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 SJ3611와 본 발명의 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3624를 각각 접종하고 진탕배양(200 rmp)하였다. 종배지에서 배양된 상기 클루타미쿰을 분리하여 수확한 후 상기 글루타미쿰은 600nm에서 흡광도가 0.4 ~ 0.5일 때까지 상기 생산배지 10㎖을 함유하는 100㎖ 배플 플라스크에서 재현탁하였다. 그 후, 10㎖ 당 0.2 g의 멸균된 CaCO₃를 첨가하였고, 필요한 경우 카나마이신(kanamycin)을 50 ㎍/L 의 최종농도까지 첨가하였다. 상기의 배양은 30℃의 200rpm 회전식 교반기에서 수행하였다.

실시예 4. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 L- 쓰레오닌 생산

상기 실시예 2 및 3에서 제조·배양한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 SJ3611과 SJ3624에서의 균주의 성장률, NADPH의 농도 및 L-쓰레오닌 생산 농도를 측정하였다. 이 때, 600 nm에서 분광법으로 세포 성장률을 측정하였고, L-쓰레오닌의 농도는 Agilent 1100 series HPLC(Agilent Technologies, CA, USA) 및 Zorbax Eclipse C₁₈ column을 사용하여 정량하였다. 건조균체량은 600 nm에서의 흡광도 값을 1로 하여 1L당 건조중량 0.3 g에 해당하는 점을 기초로 측정하였다. NADPH의 농도는 EnzyChrom™ NADP⁺/NADPH 분석 키트를 사용한 효소적 순환 반응(enzymatic cycling reaction)으로 측정하였다(BioAssay Systems, CA, USA).

이에 의한 측정값은 하기 표와 같았다(표 4).

재조합 균주의 성장률, NADPH의 농도 및 L-쓰레오닌의 농도

코리네박테리움 글루타미쿰	성장률 (μmax)	NADPH (mM/g)	L-쓰레오닌 (g/L)
SJ3611	0.35	2.34	0.18
SJ3624	0.32	4.10	1.86

상기의 값은 적어도 3개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며 모든 경우에 있어서 표준편차가 10% 이하였다.

표 4에서 보듯이, SJ3624은 SJ3611에 비하여 NADPH의 농도는 75.2% 증가하였고(2.34 vs. 4.10 mM/g), L-쓰레오닌의 생산량은 약 9.3 배 증가하였다(0.18 vs. 1.86 g/l). 과량의 NADPH가 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 L-쓰레오닌의 농도를 증가시키는데 역할을 한다는 것을 시사한다.

아울러, SJ3624는 모균주 SJ3611에 비교하여, 성장률은 거의 비슷하지만, 세포내 NADPH 농도와 L-쓰레오닌의 생산량은 현격히 증가하였다.

실시예 5. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 효소 활성 측정

상기 실시예 2 및 3에서 제조·배양한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 SJ3611과 SJ3624에서의 각종 효소 활성을 측정하였다. 상기 생산배지에서 배양된 코리네박테리움 글루타미쿰은 지수 성장기(exponential phase)동안 원심분리기를 사용하여 수확하였고, 100 mM Tris/HCL 완충액(pH 7.5)으로 재현탁하였다. 세포는 유리알(glass beads)를 사용하여 분쇄하였고 세포 추출물을 얻기 위해 원심분리하였다. 이 모든 처리는 4℃에서 이루어졌으며, 상층액은 특이적 효소 활성 분석을 위하여 채취하였다.

효소분석을 위한 전체 단백질의 양은 브래드 포드법에 의해 측정되었으며(Bradford 1976), G6PDH(d-Glucose-6-phosphate Dehydrogenase), 6PGD(6-Phospho-d-gluconate Dehydrogenase) 및 GntK(Gluconate Kinase)의 활성은 340nm에서 분광학적 분석을 통해 측정되었다(Frunzke et al.2008). 측정된 중심 탄소 대사과정의 핵심 효소의 특이적 활성도는 하기 표와 같았다(표 5).

중심 탄소 대사과정의 핵심 효소의 특이적 활성도

코리네박테리움 글루타미쿰	특이적 활성(U mg/protein)
	G6PDH	6PGD	GntK
SJ3611	0.92	5.83	0.29
SJ3624	0.90	25.31	0.02

상기의 값은 적어도 3개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며 모든 경우에 있어서 표준편차가 10 % 이하였다.

표 5에서 보듯이, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 GntK 유전자로 예측되는 NCgl2399 및 NCgl2905를 모두 불활성화시킨 유전체 재조합 균주인 SJ3624이 모균주 SJ3611에 비해서 GntK의 특이적 활성이 6.9%에 불과한 것을 확인하였다(0.29 vs 0.02 U mg/protein).

반면, 중심 탄소 대사과정의 핵심 효소인 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성을 비교하면, G6PDH의 활성은 모균주 SJ3611과 본 발명의 GntK를 불활성화시킨 SJ3624 균주에서 유의미적인 차이를 보이지 않았으며, 중심 탄소 대사과정에서 최종적으로 NADPH를 생산하는 효소인 6PGD의 특이적 활성은 SJ3624 균주에서 4.3배 이상 현격히 증가하였음을 확인할 수 있었다(5.83 vs. 25.31 mg/protein).

이와 같은 결과를 통하여, NCgl2399 및 NCgl2053이 GntK를 불활성화시킴으로써 L-쓰레오닌 생산능이 증가함을 확인하였으며, 이러한 결과는 GntK 경로를 차단함으로써 L-쓰레오닌의 생산량이 증가한 것은 G6PDH 및 6PDG의 특이적 활성 증가로 인해 NADPH 재생량의 증가에 의한 결과로 판단될 수 있다. 즉, 상기의 결과로부터 GntK 유전자로 확인한 NCgl2399 및 NCgl2905를 불활성화시킨 변이주를 사용하여 글루코스로부터 L-쓰레오닌을 생산하는 방법이 제안될 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

농업유전자원센터 KACC91731P 20120809 농업유전자원센터 KACC91730P 20120809

<110> SANGJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Corynebacterium sp. microorganism having enhanced L-threonine productivity by regulation of GntK activity and a method of producing L-threonine using the same <130> PA120801/KR <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 504 <212> DNA <213> C.glutamicum NCgl2399 <400> 1 atgtcagcag ccgaaggctt acatattgtc gtcatgggcg tttctggctg cggcaaatcc 60 tccgtcggta aagccctagc agcggagctc ggaatcgaat acaaagacgg cgacgaactt 120 cacccccagg aaaacatcga caagatggcc tccggccagg cacttgacga cgacgaccgt 180 gcatggtggc tagtccaggt tggcaagtgg ctccgcgacc gaccaagcgg cgtcatcgca 240 tgctccgccc tcaagcgctc ctaccgcgat ctcctgcgca ccaaatgccc aggaaccgtc 300 ttcgtccacc tccacggcga ctacgatctc ctactttccc gcatgaaggc ccgcgaagat 360 cacttcatgc catccacctt gctagattcc caatttgcaa ccctcgagcc gctcgaagat 420 gacgaagatg gcaaggtttt cgacgttgcc cacaccatca gcgaactggc cgcccaatct 480 gcagagtggg ttcgcaacaa ataa 504 <210> 2 <211> 1485 <212> DNA <213> C.glutamicum NCgl2905 <400> 2 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tccgagcgtt cccgaacaga tcccctctgg cctgtggtgt 900 taccgcgttt cccgcgacca gtgcatcgtt ggtggcgcac tcaacgacgt cggacgcgcc 960 gtcacctggc tggaacgcac cattatcaag cctgaaaacc tcgacgaagt gctgatccgc 1020 gaacccctcg aaggcacccc agctgtcctg ccgttcttct ccggggaacg ctccatcggc 1080 tgggcagcct cagcgcaggc cacgatcacc aacattcagg aacaaaccgg ccctgaacac 1140 ttgtggcgcg gcgttttcga agccctcgca ctctcctacc agcgcgtttg ggaacacatg 1200 gggaaagccg gcgcagcccc tgaacgggtc atcgcatcag gacgagtctc caccgaccac 1260 ccagaattcc tcgcgatgct ttccgacgcc ctcgacaccc cagtcatccc tctggaaatg 1320 aagcgcgcca ccctccgcgg caccgcactt atcgtccttg agcagctcga accaggcggc 1380 acgcgcgcga cgccaccatt cggcacgacg catcagccgc gctttgcgca ccattactcc 1440 aaggcaagag agcttttcga cgccctctac ctcaagttgg tctag 1485 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0624F1 <400> 3 cgggatcctc ctggatattc ctgcgg 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0624F2 <400> 4 ggggtaccag caagaacacc tctcc 25 <210> 5 <211> 26 <212> 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Claims (10)

1. 내재적 글루코네이트 키나아제(GntK)의 활성이 감소 또는 불활성화, L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 감소 또는 불활성화는 GntK를 코딩하는 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법에 의한 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 감소 또는 불활성화는 GntK를 코딩하는 유전자의 일부가 결실된 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 재조합 벡터는 도 2a에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC1034 또는 도 2b에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC1035인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 GntK를 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 코리네박테리움 속 미생물는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 코리네박테리움 속 미생물은 수탁번호 KACC91730P인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611 유래인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 코리네박테리움 속 미생물은 수탁번호 KACC91731P인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3624인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
   
9. (ⅰ) 글루코네이트 키나아제(GntK)를 코딩하는 유전자의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,
   (ⅱ) 상기 형질전환체 중에서 GntK의 활성이 감소 또는 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물의 제조방법.
   
10. (ⅰ) 탄소원의 일부 또는 전부로서 글루코스가 포함된 배양 배지에 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
    (ⅱ) 상기 배양물로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법.
    

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