CN116555136A - 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物工程技术领域，具体公开了一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用。本发明的修饰的棒状杆菌属微生物相比于未修饰的微生物，其草酰乙酸脱羧酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。本发明通过失活草酰乙酸脱羧酶，增强了苏氨酸合成前体草酰乙酸的供应，从而提高了菌株生产苏氨酸的能力。为苏氨酸的生产提供了一个新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体地说，涉及一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用。
背景技术
L-苏氨酸(L-Threonine)，化学名称为β-羟基-α-氨基丁酸，分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12。L-苏氨酸是一种必需氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷棒菌株的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(Reinscheid D J,Eikmanns BJ,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for afeedback-resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228-3230.)、lysC基因(Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspectsof lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacteriumglutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145-163.)。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling在该领域进行了进一步的探索，弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM(Simic P,Willuhn J,Sahm H,et al.Identification of glyA(Encoding SerineHydroxymethyltransferase)and Its Use Together with the Exporter ThrE ToIncrease l-Threonine Accumulation by Corynebacterium glutamicum[J].Appliedand Environmental Microbiology,2002,68(7):3321-3327.)。
但目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在其末端合成路径中，关于前体供应等方面的报道较少。调整糖酵解与TCA循环之间的回补路径与苏氨酸的合成无直接关系，尚未有报道该路径对苏氨酸产量有何影响。且目前现有技术仅对苏氨酸合成路径做了初步研究，并未形成系统，仍有必要对谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的是通过失活草酰乙酸脱羧酶使菌株生产苏氨酸的能力得到提升，从而提供一种产苏氨酸(L-苏氨酸)菌株及其构建方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其草酰乙酸脱羧酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。优选地，草酰乙酸脱羧酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003861462.1，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
进一步地，所述微生物体内草酰乙酸脱羧酶的活性降低或丧失是通过降低编码草酰乙酸脱羧酶基因的表达或敲除内源的编码草酰乙酸脱羧酶的基因来实现的。
可以采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码草酰乙酸脱羧酶基因的表达或敲除内源的编码草酰乙酸脱羧酶的基因。
进一步地，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶的活性增强；其中，与所述苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶中的至少一种；优选地，它们在NCBI上的参考序列编号分别为WP_003855724.1、WP_003854900.1、NP_600790.1、NP_600669.1，或与上述参考序列相似度为90％的氨基酸序列。
优选地，所述微生物为如下①～④中的任一种：
①草酰乙酸脱羧酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶和/或高丝氨酸脱氢酶活性增强的微生物；
②草酰乙酸脱羧酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性增强的微生物；
③草酰乙酸脱羧酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性增强的微生物；
④草酰乙酸脱羧酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性增强的微生物。
所述微生物体内苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对编码酶的基因的核苷酸序列进行改变而增强。
优选地，本发明所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括ATCC13032、ATCC13870、ATCC13869、ATCC21799、ATCC21831、ATCC14067、ATCC13287等(参见NCBI Corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
第二方面，本发明提供产苏氨酸菌株的构建方法，所述方法包括：
A、弱化具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码草酰乙酸脱羧酶的基因，获得基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低草酰乙酸脱羧酶编码基因的表达；和/或
B、增强步骤A基因弱化菌株中与苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶，获得酶活增强菌株；
所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对编码酶的基因的核苷酸序列进行改变而增强；
其中，与所述苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶中的至少一种。
第三方面，本发明提供一种生产苏氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：
a)培养上述微生物，以获得所述微生物的培养物；
b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的苏氨酸。
第四方面，本发明提供编码草酰乙酸脱羧酶的基因的敲除或降低表达在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。
进一步地，通过失活具有氨基酸生产能力的棒杆菌(Corynebacterium)中的草酰乙酸脱羧酶来提高苏氨酸的发酵产量。
优选地，本发明所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括ATCC13032、ATCC13870、ATCC13869、ATCC21799、ATCC21831、ATCC14067、ATCC13287等(参见NCBI Corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
第五方面，本发明提供所述修饰的棒状杆菌属微生物或按照上述方法构建得到的产苏氨酸菌株在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。
上述有关菌株的改造方法包括基因的强化和弱化等均为本领域技术人员可知的改造方式，参见满在伟.高产L-精氨酸钝齿棒杆菌的系统途径工程改造[D].江南大学,2016；崔毅.代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L-亮氨酸[D].天津科技大学；徐国栋.L-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化.天津科技大学,2015。
优选，本发明中，通过使odx基因的开放阅读框碱基缺失，从而导致草酰乙酸脱羧酶失活。
通过使编码天冬氨酸激酶的基因lysC突变，从而使其起始密码子由GTG突变为ATG，其编码氨基酸的第311位氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸，并且使lysC基因由Psod启动转录，最终实现天冬氨酸激酶的表达强化和解调控。Psod的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
通过使编码高丝氨酸脱氢酶的基因hom突变，从而使其编码蛋白携带G378E突变，并且使hom基因由PcspB启动转录，最终实现高丝氨酸脱氢酶的解调控。PcspB的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示。
通过使编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的gnd基因由Psod启动转录，最终实现6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的表达强化。Psod的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
通过使编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf突变，从而使其编码蛋白携带A243T突变，并且使zwf基因由Psod启动转录，最终实现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的解调控。Psod的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
本发明的有益效果至少在于：
本发明通过失活草酰乙酸脱羧酶提高了菌株生产苏氨酸的产量，在进一步通过改造使菌株中的苏氨酸的合成通路/或还原力供应途径被打通后，可高效生产苏氨酸，为苏氨酸的生产提供了一个新的思路。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明涉及的蛋白及其编码基因如下：
草酰乙酸脱羧酶，编码基因名称odx，NCBI编号：Cgl1290、NCgl1241、cg1458。
天冬氨酸激酶，编码基因名称lysC，NCBI编号：cg0306、Cgl0251、NCgl0247。
高丝氨酸脱氢酶，编码基因名称hom，NCBI编号：cg1337、Cgl1183、NCgl1136。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，编码基因名称zwf，NCBI编号：cg1778、Cgl1576、NCgl1514。
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，编码基因名称gnd，NCBI编号：cg1643、Cgl1452、NCgl1396。
本发明在野生菌ATCC13032上失活草酰乙酸脱羧酶，获得的改造菌SMCT345苏氨酸产量0.2g/L，推测该位点有利于苏氨酸的合成，但由于细菌内存在严谨的代谢调控，其苏氨酸合成路径中的天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶受到胞内苏氨酸浓度的严格调控。因此，改造菌株生产苏氨酸，首先要打通其合成路径，主要包括天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶的解调控及表达强化，获得改造菌SMCT346使得菌株具备初步的苏氨酸合成能力，其苏氨酸产量为2.5g/L。在此基础上，失活草酰乙酸脱羧酶，菌株生产苏氨酸的能力由2.5g/L提高至3.4g/L。
本发明进一步在SMCT346菌株中强化表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶中至少一个酶，并进行odx失活，获得的一系列菌株SMCT349、SMCT351、SMCT353，其苏氨酸的产量均有所提高，分别提高40％、46.7％、50％。说明了苏氨酸产量的提升是由于草酰乙酸脱羧酶失活造成的。
改造过程中的表达强化包括启动子的替换，核糖体结合位点的改变、拷贝数的增加、质粒过表达等手段，且以上手段均为本领域研究人员公知手段。以上手段无法通过举例而穷尽，因此本发明中的实施例仅用启动子强化作为代表进行说明。而弱化表达手段包括启动子替换、核糖体结合位点的改变、起始密码子替换、开放阅读框碱基缺失等手段，同样无法通过举例而穷尽，因此本发明中实施例对基因失活采用开放阅读框碱基缺失手段为代表进行说明。
实施例1菌株基因组改造质粒构建
1)天冬氨酸激酶表达强化质粒pK18mobsacB-Psod-lysCg1a-T311I
以ATCC13032基因组为模板，以P21/P22引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P23/P24引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod，以P25/P26引物对进行PCR扩增得到lysCg1a-T311I，以P27/P28引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P21/P24引物对以up、Psod为模版进行融合PCR，获得片段up-Psod。以P21/P28引物对以up-Psod、lysCg1a-T311I、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-Psod-lysCg1a-T311I-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCg1a-T311I。
2)高丝氨酸脱氢酶表达强化质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E
以ATCC13032基因组为模板，以P29/P30引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以ATCC14067基因组为模版以P31/P32引物对进行PCR扩增得到启动子片段PcspB，以ATCC13032基因组为模版以P33/P34引物对进行PCR扩增得到homG378E，以P35/P36引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P29/P32引物对以up、PcspB为模版进行融合PCR，获得片段up-PcspB。以P29/P36引物对以up-PcspB、homG378E、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-PcspB-homG378E-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E。
3)6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶表达强化质粒pK18mobsacB-Psod-gnd
以ATCC13032基因组为模板，以P123/P124引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P125/P126引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod，以P127/P128引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P123/P126引物对以up、Psod为模版进行融合PCR，获得片段up-Psod。以P123/P128引物对以up-Psod、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-Psod-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-gnd。
4)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶表达强化质粒pK18mobsacB-Psod-zwfA243T
以ATCC13032基因组为模板，以P129/P130引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P131/P132引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod，以P133/P134引物对进行PCR扩增得到zwfA243T，以P135/P136引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P129/P132引物对以up、Psod为模版进行融合PCR，获得片段up-Psod。以P129/P136引物对以up-Psod、zwfA243T、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-Psod-zwfA243T-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-zwfA243T。
5)草酰乙酸脱羧酶失活质粒pK18mobsacB-Δodx
以ATCC13032基因组为模板，以P185-odx-up-1F/P186-odx-up-1R引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P187-odx-dn-2F/P188-odx-dn-2R引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P185-odx-up-1F/P188-odx-dn-2R引物对以up、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Δodx。质粒构建过程中所用的引物如下表1所示：
表1
注：表1中加粗字体及下划线为引入相应点突变的引物。
实施例2基因组改造菌株的构建
1)天冬氨酸激酶与高丝氨酸脱氢酶表达强化菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备ATCC13032感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCg1a-T311I以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中目的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株。该菌株中，lysC基因被突变，其起始密码子由GTG突变为ATG，其编码的氨基酸序列的第311位苏氨酸突变为异亮氨酸，且lysC基因的启动子被替换为强启动子Psod。
进一步以上步改造菌出发，进行高丝氨酸脱氢酶表达强化改造(将pK18mobsacB-PcspB-homG378E导入上述改造菌)，获得的改造菌株命名为SMCT346。菌株构建方法参考上述。该菌株中，hom基因进一步被突变，对应的氨基酸突变位点为G378E，且hom基因的启动子被替换为强启动子PcspB。
2)6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶表达强化菌株的构建
菌株构建方法参考上述1)，以SMCT346为出发菌，进行6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶表达强化改造(将pK18mobsacB-Psod-gnd导入SMCT346)，获得的改造菌株命名为SMCT348。该菌株中，gnd基因的启动子被替换为强启动子Psod。
3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶表达强化菌株的构建
菌株构建方法参考上述1)，以SMCT346和SMCT348为出发菌，进行葡萄糖-6-磷酸脱氢酶表达强化改造(将pK18mobsacB-Psod-zwfA243T导入SMCT346和SMCT348)，获得的改造菌株命名为SMCT350和SMCT352。该菌株中，zwf基因被突变，对应的氨基酸突变位点为A243T，且zwf基因的启动子被替换为强启动子Psod。
4)草酰乙酸脱羧酶失活表达菌株的构建
菌株构建方法参考上述1)，以ATCC13032、SMCT346、SMCT348、SMCT350、SMCT352为出发菌，进行草酰乙酸脱羧酶失活改造(将pK18mobsacB-Δodx导入上述出发菌)，获得的改造菌株命名为SMCT345、SMCT347、SMCT349、SMCT351、SMCT353。该菌株中odx基因的开放阅读框碱基缺失，从而导致草酰乙酸脱羧酶失活。
获得的菌株列表如下表2。
表2
| 菌株名称 | 基因型 |
| SMCT345 | ATCC13032,Δodx |
| SMCT346 | ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I，PcspB-homG378E |
| SMCT347 | ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I，PcspB-homG378E，Δodx |
| SMCT348 | ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I，PcspB-homG378E，Psod-gnd |
| SMCT349 | ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I，PcspB-homG378E，Psod-gnd，Δodx |
| SMCT350 | ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I，PcspB-homG378E，Psod-zwfA243T |
| SMCT351 | ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I，PcspB-homG378E，Psod-zwfA243T，Δodx |
| SMCT352 | ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I，PcspB-homG378E，Psod-gnd，Psod-zwfA243T |
| SMCT353 | ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I，PcspB-homG378E，Psod-gnd，Psod-zwfA243T，Δodx |
实施例3构建菌株摇瓶验证
1.培养基
种子活化培养基：BHI 3.7％，琼脂2％，pH 7.0。
种子培养基：蛋白胨5/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，硫酸铵16g/L，尿素8g/L，磷酸二氢钾10.4g/L，磷酸氢二钾21.4g/L，生物素5mg/L，硫酸镁3g/L。葡萄糖50g/L，pH7.2。
发酵培养基：玉米浆50mL/L，葡萄糖30g/L，硫酸铵4g/L，MOPS 30g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素20g/L，生物素10mg/L，硫酸镁6g/L，硫酸亚铁1g/L，VB1·HCl40mg/L，泛酸钙50mg/L，烟酰胺40mg/L，硫酸锰1g/L，硫酸锌20mg/L，硫酸铜20mg/L，pH 7.2。
2.工程菌摇瓶发酵生产L-苏氨酸
(1)种子培养：挑取ATCC13032、SMCT345、SMCT346、SMCT347、SMCT348、SMCT349、SMCT350、SMCT351、SMCT352、SMCT353斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养16h。
(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养24h。
(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-苏氨酸，其浓度如下表3所示。
表3谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸能力的比较
由上表可以看出失活草酰乙酸脱羧酶后的菌株苏氨酸产量均有提高，其中SMCT353在失活前后产酸由3.8g/L提高至5.7g/L，相对提高50％；说明在苏氨酸末端合成路径打通之后，失活草酰乙酸脱羧酶可明显提升菌株生产苏氨酸的能力。
此外，在一系列草酰乙酸脱羧酶失活的菌株中，当苏氨酸合成路径、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达强度增加后，苏氨酸的产量有进一步提升，说明当草酰乙酸脱羧酶失活与上述酶的表达强化相结合有利于苏氨酸的生产。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用
<130> KHP211124463.4
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattcgagct cggtacccgg ggatccagcg acaggacaag cactgg 46
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccggaataa ttggcagcta tgtgcacctt tcgatctacg 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtagatcga aaggtgcaca tagctgccaa ttattccggg 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttctgtacg accagggcca tgggtaaaaa atcctttcgt a 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacgaaagga ttttttaccc atggccctgg tcgtacagaa a 41
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcggaacgag ggcaggtgaa ggtgatgtcg gtggtgccgt ct 42
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agacggcacc accgacatca ccttcacctg ccctcgttcc ga 42
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttagcc tggtaagagg aaacgt 46
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aattcgagct cggtacccgg ggatccctgc gggcagatcc ttttga 46
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atttctttat aaacgcaggt catatctacc aaaactacgc 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgtagtttt ggtagatatg acctgcgttt ataaagaaat 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtatatctcc ttctgcagga ataggtatcg aaagacgaaa 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttcgtcttt cgatacctat tcctgcagaa ggagatatac 40
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tagccaattc agccaaaacc cccacgcgat cttccacatc c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggatgtggaa gatcgcgtgg gggttttggc tgaattggct a 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttgctg gctcttgccg tcgata 46
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgaattcga gctcggtacc cggggatccc gatgtgggtg acacatgggg tgccgtca 58
<210> 18
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggaaacctac gaaaggattt tttacccatg actaatggag ataatctcgc acag 54
<210> 19
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgtgcgaga ttatctccat tagtcatggg taaaaaatcc tttcgtaggt ttcc 54
<210> 20
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtaaaatcgc cactaccccc aaatggttag ctgccaatta ttccgggctt gtga 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcacaagccc ggaataattg gcagctaacc atttgggggt agtggcgatt ttac 54
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<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttc atggtgcgca gtgtggttcg tgcgacg 57
<210> 23
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
catgattacg aattcgagct cggtacccgg ggatccgatg aggctttggc tctgcg 56
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcccggaat aattggcagc tagatggtag tgtcacgatc ct 42
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aggatcgtga cactaccatc tagctgccaa ttattccggg ct 42
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gggtcgtgtt tgtgctcatg ggtaaaaaat cctttcgta 39
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tacgaaagga ttttttaccc atgagcacaa acacgacccc ct 42
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacccaagcc aatatcttca gtcatggtga tctggacgtg gtca 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgaccacgtc cagatcacca tgactgaaga tattggcttg ggtg 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttcgaa tcacgatggc gttt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aattcgagct cggtacccgg gatgcgtttt ggacgaattg c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtccgatggg gccgaaggtg tggtccggtg acagctgttg 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caacagctgt caccggacca caccttcggc cccatcggac 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccacaactg ggttgcccag acgacggcca gtgccaagct 40
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<212> DNA
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<400> 35
tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60
ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120
gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180
gattttttac cc 192
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<211> 260
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acctgcgttt ataaagaaat gtaaacgtga tcggatcgat ataaaagaaa cagtttgtac 60
tcaggtttga agcattttct ccaattcgcc tggcaaaaat ctcaattgtc gcttacagtt 120
tttctcaacg acaggctgct aagctgctag ttcggtggcc tagtgagtgg cgtttacttg 180
gataaaagta atcccatgtc gtgatcagcc attttgggtt gtttccatag catccaaagg 240
tttcgtcttt cgatacctat 260
Claims (9)
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其草酰乙酸脱羧酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。
2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内草酰乙酸脱羧酶的活性降低或丧失是通过降低编码草酰乙酸脱羧酶基因的表达或敲除内源的编码草酰乙酸脱羧酶的基因来实现的。
3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码草酰乙酸脱羧酶基因的表达或敲除内源的编码草酰乙酸脱羧酶的基因。
4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶的活性增强；
其中，与所述苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物为如下①～④中的任一种：
①草酰乙酸脱羧酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶和/或高丝氨酸脱氢酶活性增强的微生物；
②草酰乙酸脱羧酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性增强的微生物；
③草酰乙酸脱羧酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性增强的微生物；
④草酰乙酸脱羧酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性增强的微生物。
6.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对编码酶的基因的核苷酸序列进行改变而增强。
7.根据权利要求1-5任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
8.产苏氨酸菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
A、弱化具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码草酰乙酸脱羧酶的基因，获得基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低草酰乙酸脱羧酶编码基因的表达；和/或
B、增强步骤A基因弱化菌株中与苏氨酸合成途径和/或还原力供应途径相关的酶，获得酶活增强菌株；
所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对编码酶的基因的核苷酸序列进行改变而增强；
其中，与所述苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶中的至少一种。
9.一种生产苏氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)培养权利要求1-7任一项所述的微生物，以获得所述微生物的培养物；
b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的苏氨酸。
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