CN113322218B - 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及重组谷氨酸棒杆菌及生产L‑苏氨酸的方法。本发明组合改造(或增强)抗反馈抑制的hom基因、lysC基因、thrC基因等，及(或)弱化(或敲除)pck基因和(或)弱化(或敲除)pyk基因，构建了生产苏氨酸的谷氨酸棒杆菌，产酸效果非常显著，远超出了目前有报道的最高水平达到20g/l。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法。
背景技术
L-苏氨酸(L-Threonine)，化学名称为β-羟基-α-氨基丁酸，分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12。苏氨酸为白色斜方晶系或结晶性粉末。无臭，味微甜。253℃熔化并分解。高温下溶于水，25℃溶解度为20.5g/100ml。等电点5.6。不溶于乙醇、乙醚和氯仿。
L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面的用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。在配合饲料中加入L-苏氨酸，具有如下的特点：①可以调整饲料的氨基酸平衡，促进禽畜生长；②可改善肉质；③可改善氨基酸消化率低的饲料的营养价值；④可降低饲料原料成本；因此在欧盟国家(主要是德国、比利时、丹麦等)和美洲国家，已广泛地应用于饲料行业。
苏氨酸的生产方法主要有发酵法，蛋白质水解法和化学合成法三种，目前微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法，目前生产苏氨酸的微生物主要为大肠杆菌及棒杆菌，其中大肠杆菌生产苏氨酸的研究已经比较透彻，但大肠杆菌内毒素的存在影响着其应用范围，而关于利用棒杆菌生产苏氨酸的研究相对较少。
棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)和黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)。为了改善这些微生物的L-苏氨酸生产能力，可以通过传统诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。
谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷棒菌株的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因、lysC基因。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling在该领域进行了进一步的探索，弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM；其研究团队考察了大肠杆菌中苏氨酸外运蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表现，发现将rhtC引入到谷氨酸棒杆菌中，有利于苏氨酸的外运。
目前关于利用谷氨酸棒杆菌生产苏氨酸的研究主要集中在苏氨酸合成的末端途径及苏氨酸的外运这两个方面，而关于苏氨酸前体物草酰乙酸的合成的报道较少。采用代谢工程的思路，利用基因改造技术改造谷氨酸棒杆菌生产苏氨酸的报道中苏氨酸的产量最高为11.8g/l。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法。通过调整代谢途径中pck、pyk、lysC、hom、thrB、thrC基因的表达，实现了苏氨酸的高表达。
本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌，其lysC、hom、thrB、thrC基因中至少一个的表达被强化。
在一些实施例中，所述重组谷氨酸棒杆菌中，lysC、hom、thrB、thrC基因中至少一个的表达被强化；且pck和/或pyk基因的表达被弱化。
本发明中，所述lysC基因的强化包括I)～III)中至少一种：
I)在lysC基因编码区上游插入sod启动子；
II)将lysC基因的起始密码子由GTG突变为ATG；
III)lysC基因突变，使其编码蛋白的N端第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸。
在一些实施例中，sod启动子的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；
在一些实施例中，突变的lysC基因核酸序列如SEQ ID NO：3所示；
一些实施例中，所述lysC基因强化具体为构建表达模块，使其转化入谷氨酸棒杆菌。所述转化的载体为整合型质粒或游离型质粒；所述强化lysC基因的表达模块包括sod启动子和突变的lysC基因，即Psod-lysCV1M-T311I。
本发明中，所述hom基因的强化包括I)～II)中至少一种：
I)在hom基因编码区上游插入cspB的启动子；
II)hom基因突变，使其编码蛋白的378位的甘氨酸突变为谷氨酸。
在一些实施例中，cspB启动子的核酸序列如SEQ ID NO：4所示；
在一些实施例中，突变的hom基因的核酸序列如SEQ ID NO：5所示；
一些实施例中，所述hom基因强化具体为构建表达模块，使其转化入谷氨酸棒杆菌。所述转化的载体为整合型质粒或游离型质粒；所述强化hom基因的表达模块包括cspB启动子和突变的homn基因，即PcspB-homG378E。
thrB基因与hom基因共用同一个启动子，在hom基因启动子强化的基础上，thrB基因的表达也得到提高，本发明中，所述thrB基因的强化还包括增加thrB基因的拷贝数。所述thrB基因的序列为SEQ ID NO：6。
本发明中，所述thrC基因的强化包括I)～II)中至少一种：
I)在thrC基因编码区上游插入sod启动子；
II)thrC基因的起始密码子由GTG突变为ATG。
在一些实施例中，突变的thrC基因的核酸序列如SEQ ID NO：7所示；
一些实施例中，所述thrC基因强化具体为构建表达模块，使其转化入谷氨酸棒杆菌。所述转化的载体为整合型质粒或游离型质粒；所述强化thrC基因的表达模块包括sod启动子和thrC基因，即Psod-thrCV1M。
本发明中，对于lysC、hom、thrB、thrC基因的强化，构建了整合型载体，将基因强化模块整合入谷氨酸棒杆菌，并构建了游离型载体再次转化入谷氨酸棒杆菌，使各基因的拷贝数提高。基因整合的载体采用pK18mobsacB，依次导入Psod-lysCV1M-T311I、PcspB-homG378E、Psod-thrCV1M；游离型质粒为pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-Psod-thrCV1M，。
本发明中，所述pck基因的弱化包括I)～III)中至少一种：
I)将pck基因的启动子替换为cg3069；
II)敲除pck基因；
III)插入片段，使pck基因失活；
一些实施例中，cg3069启动子的核酸序列如SEQ ID NO：8所示；
一些实施例中，使pck基因失活的插入片段核酸序列如SEQ ID NO：1所示。
一些实施例中，敲除pck基因的方法是使pck基因中ATG至TAA整个表达框缺失。
本发明研究表明，敲除pck基因的方式对于提高苏氨酸的产量更有利。本发明构建的pck基因敲除质粒以pK18mobsacB为载体，其中包含来自pck基因的up-dn片段。其中，pck-up片段为pck基因的编码区ATG上游的619bp；pck-dn片段为pck基因编码区TAA后的493bp。
本发明中，所述pyk基因的弱化包括I)～II)中至少一种：
I)将pyk基因的启动子替换为cg3069；
II)敲除pyk基因。
一些实施例中，cg3069启动子的核酸序列如SEQ ID NO：8所示；
一些实施例中，敲除pyk基因的方法是使pyk基因编码区ATG至TAA缺失。
本发明研究表明，敲除pyk基因的方式对于提高苏氨酸的产量更有利。本发明构建的pck基因敲除质粒以pK18mobsacB为载体，其中包含来自pyk基因的up-dn片段。其中，pyk-up片段为pyk基因的ATG上游500bp；pyk-dn片段为pck基因TAA下游500bp。
本发明所述的谷氨酸棒杆菌的起始菌株为Corynebacterium glutamicumATCC13032。
一些具体实施例中，本发明所述谷氨酸棒杆菌的基因型为：ATCC13032，Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M，Δpck，Δpyk。
本发明所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备L-苏氨酸中的应用。
本发明所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括将Psod-lysCV1M-T311I，pcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M整合入谷氨酸棒杆菌的基因组。
本发明所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，在将Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M整合入谷氨酸棒杆菌的基因组后，还包括弱化pck基因和/或pyk基因的表达；然后增加Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M的拷贝数。
本发明还提供了L-苏氨酸的制备方法，包括：发酵所述的重组谷氨酸棒杆菌，获得含有L-苏氨酸的发酵液。
所述发酵的培养基包括水和玉米浆50ml/l，葡萄糖50g/l，硫酸铵4g/l，MOPS 30g/l，磷酸二氢钾10g/l，尿素20g/l，生物素10mg/l，硫酸镁6g/l，硫酸亚铁1g/l，VB1·HC140mg/l，泛酸钙50mg/l，烟酰胺40mg/l，硫酸锰1g/l，硫酸锌20mg/l，硫酸铜20mg/l。所述培养基的pH值为7.2。
所述培养的条件为33℃、220r/min振荡培养24h。
所述发酵前，还包括种子活化和种子培养的步骤。
种子活化的培养基包括水和BHI 3.7％，琼脂2％，pH7。
种子培养的培养基包括水和蛋白胨5g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，硫酸铵16g/l，尿素8g/l，磷酸二氢钾10.4g/l，磷酸氢二钾21.4g/l，生物素5mg/l，硫酸镁3g/l。葡萄糖50g/l，pH 7.2。
本发明组合改造(或增强)抗反馈抑制的hom基因、lysC基因、thrC基因等，及(或)弱化(或敲除)pck基因和(或)弱化(或敲除)pyk基因，构建了苏氨酸的谷氨酸棒杆菌生产菌，产酸效果非常显著，远超出了目前有报道的最高水平达到20g/l。
附图说明
图1为重组质粒pK18mobsacB-Peg3069-pck的示意图；
图2为重组质粒pK18mobsacB-Δpck的示意图；
图3为重组质粒pK18mobsacB-pck：：SEQ1的示意图；
图4为重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pyk的示意图；
图5为重组质粒pK18mobsacB-Δpyk的示意图；
图6为表达质粒pMCT1的示意图。
具体实施方式
本发明提供了重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明中，涉及基因的名称包括：pck(cg3169)：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(EC：4.1.1.32)。pyk(cg2291)：丙酮酸激酶(EC：2.7.1.40)。lysC(cg0306)：天冬氨酸激酶(EC：2.7.2.4)。hom(cg1337)：高丝氨酸脱氢酶(EC：1.1.1.3)。thrB(cg1338)：高丝氨酸激酶(EC：2.7.1.39)。thrC(cg2437)：苏氨酸合酶(EC：4.2.3.1)。
SMCT021工程菌株的构建工作，利用了sacB方法对棒状杆菌基因组进行遗传改造。
以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的L-苏氨酸生产菌种的亲代菌株为ATCC13032，菌种的拉丁学名是Corynebacterium glutamicum ATCC13032。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCV1M-T311I的构建及在ATCC13032中替换
(1)pK18mobsacB-Psod-lysCV1M-T311I质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P21/P22引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P23/P24引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod，以P25/P26引物对进行PCR扩增得到lysCV1M-T311I，以27/28引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P21/P24引物对以up、Psod为模版进行融合PCR，获得片段up-Psod。以P21/P28引物对以up-Psod、lysCV1M-T311I、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-Psod-lysCV1M-T311I-dn。全长片段用BamHI进行酶切，pK18mobsacB用同样的酶酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCV1M-T311I。
(2)在ATCC13032中进行lysC替换
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备ATCC13032感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCV1M-T311I以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT018。
实施例2：重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E的构建及在SMCT018中替换
(1)pK18mobsacB-PcspB-homG378E质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P29/P30引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P31/P32引物对进行PCR扩增得到启动子片段PcspB，以P33/P34引物对进行PCR扩增得到homG378E，以P35/P36引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P29/P32引物对以up、PscpB为模版进行融合PCR，获得片段up-PcspB。以P29/P36引物对以up-PcspB、homG378E、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-PcspB-homG378E-dn。全长片段用BamHI进行酶切，pK18mobsacB用同样的酶酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E。
(2)在SMCT018进行hom替换
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter23)制备SMCT018感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT019。
实施例3：重组质粒pK18mobsacB-Psod-thrCV1M的构建及在SMCT019中替换
(1)pK18mobsacB-Psod-thrCV1M质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P37/P38引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P39/P40引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod-thrCV1M，以P41/P42引物对进行PCR扩增得到dn。以P37/P42引物对以up、Psod-thrCV1M、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-Psod-thrCV1M-dn。全长片段用BamHI进行酶切，pK18mobsacB用同样的酶酶切。两酶切产物以T4DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-thrCV1M。
(2)在SMCT019进行thrC替换
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT019感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Psod-thrCV1M以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT021。
实施例4：重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pck的构建及在SMCT021将pck的启动子替换为Pcg3069
(1)pK18mobsacB-Pcg3069-pck质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P1/P2引物对进行PCR扩增得到上游片段up，以P3/P4引物对进行PCR扩增得到下游片段dn，以P1/P4引物对以up、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-dh。up-dh片段用HindIII进行酶切，pK18mobsacB用同样的酶酶切。两酶切产物以T4DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pck。
(2)在SMCT021将pck的启动子替换为Pcg3069
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Δpck以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT022。
实施例5：重组质粒pK18mobsacB-Δpck的构建及在SMCT021中失活pck
(1)pK18mobsacB-Δpck质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P5/P6引物对进行PCR扩增得到上游片段up，以P7/P8引物对进行PCR扩增得到下游片段dn，以P5/P8引物对以up、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-dh。up-dh片段用BamHI、HindIII进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Δpck。
(2)SMCT021中敲除pck
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Δpck以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT023。
实施例6：重组质粒pK18mobsacB-pck：：SEQ1的构建及在SMCT021中用SEQ ID NO.1序列替换pck
(1)pK18mobsacB-pck：：SEQ1质粒的构建
委托第三方公司合成两端含有SmalI酶切位点及SEQ ID NO.1序列的片段。用SmalI对pK18mobsacB质粒和SEQ ID NO.1片段进行酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-pck：：SEQ ID NO.1。
(2)SMCT021失活pck同时插入SEQ ID NO.1序列
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-pck：：SEQ1以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT024。
实施例7：重组质粒pK18mobsacB-Peg3069-pyk的构建及在SMCT021中弱化pyk启动子
(1)pK18mobsacB-Pcg3069-pyk质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P9/P10引物对进行PCR扩增得到上游片段up，以P11/P12引物对进行PCR扩增得到下游片段dn，以P9/P12引物对以up、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-dh。up-dn片段用BamHI、HindIII进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pyk。
(2)SMCT021中弱化pyk启动子
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pyk以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT025。
实施例8：重组质粒pK18mobsacB-Δpyk的构建及在SMCT021中失活pyk
(1)pK18mobsacB-Δpyk质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P13/P14引物对进行PCR扩增得到上游片段up，以P15/P16引物对进行PCR扩增得到下游片段dn，以P13/P16引物对以up、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-dn。up-dn片段用BamHI、HindIII进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4 DNALigase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Δpyk。
(2)SMCT021中敲除pyk
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Δpck以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT026。
实施例9：在SMCT022、SMCT023、SMCT024中弱化pyk启动子
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT022、SMCT023、SMCT024感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pyk以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为菌株命名为SMCT027、SMCT028、SMCT029。
实施例10：在SMCT022、SMCT023、SMCT024中敲除pyk
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT022、SMCT023、SMCT024感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Δpck以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT030、SMCT031、SMCT032。
实施例11：构建质粒pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378E，Psod-thrCV1M并在SMCT031中过表达
(1)pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M质粒的构建
以SMCT021基因组为模板，以P17/P18引物对进行PCR扩增得到Psod-lysCV1M-T311I片段，以P19/P20引物对进行PCR扩增得到片段PcspB-homG378EthrB，以P43/P44引物对进行PCR扩增得到片段Psod-thrCV1M。以P17/P44为模版，以Psod-lysCV1M-T311I、PcspB-homG378EthrB、Psod-thrCV1M为模版，进行融合PCR获得Psod-lysCV1M-T311I-PcspB-homG378EthrB-Psod-thrCV1M片段。片段用BamHI进行酶切，pEKEx2用同样的酶酶切。两酶切产物以T4 DNALigase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得质粒pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-Psod-thrCV1M，命名为pMCT1。
(2)SMCT031中表达上述质粒
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT031感受态细胞。质粒pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，pcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有50mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子。获得目的突变菌株命名为SMCT033。
实施例12：基因工程菌发酵生产L-苏氨酸
1.培养基
种子活化培养基：BHI 3.7％，琼脂2％，pH7。
种子培养基：蛋白胨5g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，硫酸铵16g/1，尿素8g/l，磷酸二氢钾10.4g/l，磷酸氢二钾21.4g/l，生物素5mg/1，硫酸镁3g/la葡萄糖50g/l，pH7.2。
发酵培养基：玉米浆50ml/l，葡萄糖50g/l，硫酸铵4g/l，MOPS 30g/l，磷酸二氢钾10g/l，尿素20g/l，生物素10mg/l，硫酸镁6g/l，硫酸亚铁1g/l，VB1·HC140mg/l，泛酸钙50mg/l，烟酰胺40mg/l，硫酸锰1g/l，硫酸锌20mg/l，硫酸铜20mg/l，pH 7.2。
2.工程菌摇瓶发酵生产L-苏氨酸
(1)种子培养：挑取ATCC13032、SMCT021、SMCT022、SMCT023、SMCT024、SMCT025、SMCT026、SMCT027、SMCT028、SMCT029、SMCT030、SMCT031、SMCT032、SMCT033斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养16h；
(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养24h。
(3)本实施例重复3次，发酵结束，取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-苏氨酸，其浓度如下表1所示。
表1实施例改造菌株与未改造菌株L-苏氨酸产量汇总
注：*表示与SMCT相比具有极显著差异(P＜0.01)
由表1可知pck改造菌SMCT022、SMCT023、SMCT024苏氨酸的产量达到12-15g/l，与未经pck改造的菌株相比其转化率提高了146-200％，已经超过目前文献报道的最高值11.8g/l。pyk改造菌SMCT025、SMCT026的苏氨酸产量达到14-15g/l，其产量略高于pck改造菌，较文献最高值11.8g/l提高27％。pck的改造使得草酰乙酸回流到磷酸烯醇式丙酮酸的代谢路径削弱或失活，从而草酰乙酸更多的流向苏氨酸合成路径；在棒杆菌中草酰乙酸的合成主要有两条路径，分别是由磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸羧化而来，预计pyk的弱化或失活会提高胞内磷酸烯醇式丙酮酸的含量，降低丙酮酸的含量，从而降低其进入TCA循环减少碳损失，总体而言胞内总的磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸的含量是不变的，进一步推测pyk的改造不会对苏氨酸产量的改变造成太大影响。根据摇瓶结果可以看出，当pyk进行弱化或失活后，苏氨酸的产量明显提升，这是我们预料不到的。
当pck与pyk两个基因改造位点进行叠加，苏氨酸的产量有了进一步的提高，尤其是pck与pyk两者均进行失活改造时，其苏氨酸的产量最高达到了18g/l，较单个位点的改造提高了20％。
目前文章报道的11.8g/l的菌株中含有质粒，该质粒含有苏氨酸合成路径中的基因，而本实施例1-10中的改造菌均不含有质粒，为了更好的对比本实施例中的改造菌与文章报道的改造菌株的性能，我们将含有苏氨酸合成路径中基因的质粒pMCT1导入到本实施例的最优菌株SMCT031中，对其生产L-苏氨酸的性能进行了评估。获得的改造菌SMCT033苏氨酸的产量20g/l，较文章报道最高水平提高69％。
以上实施例中使用引物序列见下表：
表2引物名称及序列
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法
<130> MP1937952
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2468
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60
ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120
aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180
gaagtccagg aggacataca atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg 240
gtcccggctc agcagtcgga attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga 300
tgcgtctgat gaccgagtac ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg 360
ttcgtggcat tgctgtttct gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc 420
tcactgagga cgcttttgca ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta 480
tcggcggcat tgagtaccca cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg 540
ttgttaccgc caataaggct cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg 600
aagccgcaaa cgttgacctg tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg 660
gcccactgcg tcgctccctg gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg 720
gcaccaccaa cttcatcttg gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt 780
tggctgaggc aactcgtttg ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc 840
atgacgccgc atccaaggct gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg 900
cggatgatgt gtactgcgaa ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac 960
agcaggcagg ccacaccatc aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag 1020
gaaagtcggc tatttctgct cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg 1080
cgtcggtaaa caagtccttt aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga 1140
tgttctacgg aaacggtgca ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt gacgacgtcg 1200
ttggtgccgc acgaaacaag gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta 1260
acctgccgat cgctgatttc ggtgagacca ccactcggta ccacctcgac atggatgtgg 1320
aagatcgcgt ggaggttttg gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc 1380
tgcgtacaat ccgacaggaa gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact 1440
ctgcgctgga atctgatctt tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta 1500
aggcaatcaa cagtgcgatc cgcctcgaaa gggactaaat ggcaattgaa ctgaacgtcg 1560
gtcgtaaggt taccgtcacg gtacctggat cttctgcaaa cctcggacct ggctttgaca 1620
ctttaggttt ggcactgtcg gtatacgaca ctgtcgaagt ggaaattatt ccatctggct 1680
tggaagtgga agtttttggc gaaggccaag gcgaagtccc tcttgatggc tcccacctgg 1740
tggttaaagc tattcgtgct ggcctgaagg cagctgacgc tgaagttcct ggattgcgag 1800
tggtgtgcca caacaacatt ccgcagtctc gtggtcttgg ctcctctgct gcagcggcgg 1860
ttgctggtgt tgctgcagct aatggtttgg cggatttccc gctgactcaa gagcagattg 1920
ttcagttgtc ctctgccttt gaaggccacc cagataatgc tgcggcttct gtgctgggtg 1980
gagcagtggt gtcgtggaca aatctgtcta tcgacggcaa gagccagcca cagtatgctg 2040
ctgtaccact tgaggtgcag gacaatattc gtgcgactgc gctggttcct aatttccacg 2100
catccaccga agctgtgcgc cgagtccttc ccactgaagt cactcacatc gatgcgcgat 2160
ttaacgtgtc ccgcgttgca gtgatgatcg ttgcgttgca gcagcgtcct gatttgctgt 2220
gggagggtac tcgtgaccgt ctgcaccagc cttatcgtgc agaagtgttg cctattacct 2280
ctgagtgggt aaaccgcctg cgcaaccgtg gctacgcggc atacctttcc ggtgccggcc 2340
caaccgccat ggtgctgtcc actgagccaa ttccagacaa ggttttggaa gatgctcgtg 2400
agtctggcat taaggtgctt gagcttgagg ttgcgggacc agtcaaggtt gaagttaacc 2460
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<210> 2
<211> 192
<212> DNA
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gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180
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<212> DNA
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tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
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cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
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<212> DNA
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agcattttct ccaattcgcc tggcaaaaat ctcaattgtc gcttacagtt tttctcaacg 300
acaggctgct aagctgctag ttcggtggcc tagtgagtgg cgtttacttg gataaaagta 360
atcccatgtc gtgatcagcc attttgggtt gtttccatag catccaaagg tttcgtcttt 420
cgatacctat tcctgcagaa ggagatatac at 452
<210> 5
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60
attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120
ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180
gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240
ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300
cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360
cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420
tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480
gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540
gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600
ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660
gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720
ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780
aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840
cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900
aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960
ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt gacgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020
gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080
ggtgagacca ccactcggta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt ggaggttttg 1140
gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200
gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260
tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320
cgcctcgaaa gggactaa 1338
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<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120
gtggaaatta ttccatctgg cttggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggcgaagtc 180
cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240
gctgaagttc ctggattgcg agtggtgtgc cacaacaaca ttccgcagtc tcgtggtctt 300
ggctcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgctgcag ctaatggttt ggcggatttc 360
ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca cccagataat 420
gctgcggctt ctgtgctggg tggagcagtg gtgtcgtgga caaatctgtc tatcgacggc 480
aagagccagc cacagtatgc tgctgtacca cttgaggtgc aggacaatat tcgtgcgact 540
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<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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gcacgcgcct acacctaccc gaagttcaac agcgaagaca tcgttcctgt caccgaactc 300
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacatgccga cttatcgcaa gcctggtaat tttataccct agatcgttag actttcgtta 60
Claims (9)
1.重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其lysC、hom、thrB和thrC基因被强化，且pck和/或pyk基因的表达被弱化。
2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，
所述lysC基因的强化包括I）~III）中至少一种：
I）在lysC基因编码区上游插入sod启动子；
II）将lysC基因的起始密码子由GTG突变为ATG；
III）lysC基因突变为如SEQ ID NO:3所示，使其编码蛋白的N端第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸；
所述hom基因的强化包括I）~II）中至少一种：
I）在hom基因编码区上游插入cspB的启动子；
II）hom基因突变为如SEQ ID NO:5所示，使其编码蛋白的378位的甘氨酸突变为谷氨酸；
所述thrB基因的强化为增加thrB基因的拷贝数；
所述thrC基因的强化包括I）~II）中至少一种：
I）在thrC基因编码区上游插入sod启动子；
II）thrC基因的起始密码子由GTG突变为ATG。
3.根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，
所述pck基因的弱化包括包括I）~III）中至少一种：
I）将pck基因的启动子替换为cg3069；
II）敲除pck基因；
III）插入片段，使pck基因失活；
所述pyk基因的弱化包括I）~II）中至少一种：
I）将pyk基因的启动子替换为cg3069；
II）敲除pyk基因。
4.根据权利要求1~3任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其起始菌株为Corynebacterium glutamicum ATCC13032。
5.根据权利要求4所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其基因型为：ATCC13032,Psod-lysCV1M-T311I,PcspB-homG378EthrB,Psod-thrCV1M,△pck,△pyk。
6.权利要求1~5任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备L-苏氨酸中的应用。
7.权利要求1~5任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括将Psod-lysCV1M-T311I,PcspB-homG378EthrB,Psod-thrCV1M整合入谷氨酸棒杆菌的基因组。
8.权利要求7所述的构建方法，其特征在于，还包括弱化pck基因和/或pyk基因的表达；然后增加Psod-lysCV1M-T311I,PcspB-homG378EthrB,Psod-thrCV1M的拷贝数。
9.L-苏氨酸的制备方法，包括：发酵权利要求1~6任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，获得含有L-苏氨酸的发酵液。
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