CN113322218B - 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents
重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113322218B CN113322218B CN202010126372.4A CN202010126372A CN113322218B CN 113322218 B CN113322218 B CN 113322218B CN 202010126372 A CN202010126372 A CN 202010126372A CN 113322218 B CN113322218 B CN 113322218B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- sod
- corynebacterium glutamicum
- pck
- lysc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 title claims abstract description 77
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 title claims abstract description 54
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 title claims abstract description 52
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 23
- 101150088738 pckA gene Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 101150067708 pckG gene Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 101150015622 pyk gene Proteins 0.000 claims abstract description 41
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 101150049887 cspB gene Proteins 0.000 claims description 29
- 101150041068 cspJ gene Proteins 0.000 claims description 29
- 101150010904 cspLB gene Proteins 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 claims description 24
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 9
- 101100387232 Escherichia coli (strain K12) asd gene Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 4
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 29
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 24
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 24
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 20
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 20
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 11
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 11
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 11
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 11
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 11
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 10
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 9
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 235000012182 cereal bars Nutrition 0.000 description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 5
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 2
- 241000572303 Corynebacterium pekinense Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 102000006843 Threonine synthase Human genes 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- VUUZLZXGRRDWBP-AAZKHNGSSA-N (2s,3r)-2-azanyl-3-oxidanyl-butanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O.C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O VUUZLZXGRRDWBP-AAZKHNGSSA-N 0.000 description 1
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 101100256230 Homo sapiens SLC5A8 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100027215 Sodium-coupled monocarboxylate transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101710180758 Threonine efflux protein Proteins 0.000 description 1
- -1 VB 1 HC140mg/l Chemical compound 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229940085300 biotin 5 mg Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 101150097303 glyA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150079604 glyA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150094644 rhtC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 101150024466 scpB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01003—Homoserine dehydrogenase (1.1.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/0104—Pyruvate kinase (2.7.1.40)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及重组谷氨酸棒杆菌及生产L‑苏氨酸的方法。本发明组合改造(或增强)抗反馈抑制的hom基因、lysC基因、thrC基因等，及(或)弱化(或敲除)pck基因和(或)弱化(或敲除)pyk基因，构建了生产苏氨酸的谷氨酸棒杆菌，产酸效果非常显著，远超出了目前有报道的最高水平达到20g/l。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法。
背景技术
L-苏氨酸(L-Threonine)，化学名称为β-羟基-α-氨基丁酸，分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12。苏氨酸为白色斜方晶系或结晶性粉末。无臭，味微甜。253℃熔化并分解。高温下溶于水，25℃溶解度为20.5g/100ml。等电点5.6。不溶于乙醇、乙醚和氯仿。
L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面的用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。在配合饲料中加入L-苏氨酸，具有如下的特点：①可以调整饲料的氨基酸平衡，促进禽畜生长；②可改善肉质；③可改善氨基酸消化率低的饲料的营养价值；④可降低饲料原料成本；因此在欧盟国家(主要是德国、比利时、丹麦等)和美洲国家，已广泛地应用于饲料行业。
苏氨酸的生产方法主要有发酵法，蛋白质水解法和化学合成法三种，目前微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法，目前生产苏氨酸的微生物主要为大肠杆菌及棒杆菌，其中大肠杆菌生产苏氨酸的研究已经比较透彻，但大肠杆菌内毒素的存在影响着其应用范围，而关于利用棒杆菌生产苏氨酸的研究相对较少。
棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)和黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)。为了改善这些微生物的L-苏氨酸生产能力，可以通过传统诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。
谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷棒菌株的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因、lysC基因。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling在该领域进行了进一步的探索，弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM；其研究团队考察了大肠杆菌中苏氨酸外运蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表现，发现将rhtC引入到谷氨酸棒杆菌中，有利于苏氨酸的外运。
目前关于利用谷氨酸棒杆菌生产苏氨酸的研究主要集中在苏氨酸合成的末端途径及苏氨酸的外运这两个方面，而关于苏氨酸前体物草酰乙酸的合成的报道较少。采用代谢工程的思路，利用基因改造技术改造谷氨酸棒杆菌生产苏氨酸的报道中苏氨酸的产量最高为11.8g/l。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法。通过调整代谢途径中pck、pyk、lysC、hom、thrB、thrC基因的表达，实现了苏氨酸的高表达。
本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌，其lysC、hom、thrB、thrC基因中至少一个的表达被强化。
在一些实施例中，所述重组谷氨酸棒杆菌中，lysC、hom、thrB、thrC基因中至少一个的表达被强化；且pck和/或pyk基因的表达被弱化。
本发明中，所述lysC基因的强化包括I)～III)中至少一种：
I)在lysC基因编码区上游插入sod启动子；
II)将lysC基因的起始密码子由GTG突变为ATG；
III)lysC基因突变，使其编码蛋白的N端第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸。
在一些实施例中，sod启动子的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；
在一些实施例中，突变的lysC基因核酸序列如SEQ ID NO：3所示；
一些实施例中，所述lysC基因强化具体为构建表达模块，使其转化入谷氨酸棒杆菌。所述转化的载体为整合型质粒或游离型质粒；所述强化lysC基因的表达模块包括sod启动子和突变的lysC基因，即Psod-lysCV1M-T311I。
本发明中，所述hom基因的强化包括I)～II)中至少一种：
I)在hom基因编码区上游插入cspB的启动子；
II)hom基因突变，使其编码蛋白的378位的甘氨酸突变为谷氨酸。
在一些实施例中，cspB启动子的核酸序列如SEQ ID NO：4所示；
在一些实施例中，突变的hom基因的核酸序列如SEQ ID NO：5所示；
一些实施例中，所述hom基因强化具体为构建表达模块，使其转化入谷氨酸棒杆菌。所述转化的载体为整合型质粒或游离型质粒；所述强化hom基因的表达模块包括cspB启动子和突变的homn基因，即PcspB-homG378E。
thrB基因与hom基因共用同一个启动子，在hom基因启动子强化的基础上，thrB基因的表达也得到提高，本发明中，所述thrB基因的强化还包括增加thrB基因的拷贝数。所述thrB基因的序列为SEQ ID NO：6。
本发明中，所述thrC基因的强化包括I)～II)中至少一种：
I)在thrC基因编码区上游插入sod启动子；
II)thrC基因的起始密码子由GTG突变为ATG。
在一些实施例中，突变的thrC基因的核酸序列如SEQ ID NO：7所示；
一些实施例中，所述thrC基因强化具体为构建表达模块，使其转化入谷氨酸棒杆菌。所述转化的载体为整合型质粒或游离型质粒；所述强化thrC基因的表达模块包括sod启动子和thrC基因，即Psod-thrCV1M。
本发明中，对于lysC、hom、thrB、thrC基因的强化，构建了整合型载体，将基因强化模块整合入谷氨酸棒杆菌，并构建了游离型载体再次转化入谷氨酸棒杆菌，使各基因的拷贝数提高。基因整合的载体采用pK18mobsacB，依次导入Psod-lysCV1M-T311I、PcspB-homG378E、Psod-thrCV1M；游离型质粒为pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-Psod-thrCV1M，。
本发明中，所述pck基因的弱化包括I)～III)中至少一种：
I)将pck基因的启动子替换为cg3069；
II)敲除pck基因；
III)插入片段，使pck基因失活；
一些实施例中，cg3069启动子的核酸序列如SEQ ID NO：8所示；
一些实施例中，使pck基因失活的插入片段核酸序列如SEQ ID NO：1所示。
一些实施例中，敲除pck基因的方法是使pck基因中ATG至TAA整个表达框缺失。
本发明研究表明，敲除pck基因的方式对于提高苏氨酸的产量更有利。本发明构建的pck基因敲除质粒以pK18mobsacB为载体，其中包含来自pck基因的up-dn片段。其中，pck-up片段为pck基因的编码区ATG上游的619bp；pck-dn片段为pck基因编码区TAA后的493bp。
本发明中，所述pyk基因的弱化包括I)～II)中至少一种：
I)将pyk基因的启动子替换为cg3069；
II)敲除pyk基因。
一些实施例中，cg3069启动子的核酸序列如SEQ ID NO：8所示；
一些实施例中，敲除pyk基因的方法是使pyk基因编码区ATG至TAA缺失。
本发明研究表明，敲除pyk基因的方式对于提高苏氨酸的产量更有利。本发明构建的pck基因敲除质粒以pK18mobsacB为载体，其中包含来自pyk基因的up-dn片段。其中，pyk-up片段为pyk基因的ATG上游500bp；pyk-dn片段为pck基因TAA下游500bp。
本发明所述的谷氨酸棒杆菌的起始菌株为Corynebacterium glutamicumATCC13032。
一些具体实施例中，本发明所述谷氨酸棒杆菌的基因型为：ATCC13032，Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M，Δpck，Δpyk。
本发明所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备L-苏氨酸中的应用。
本发明所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括将Psod-lysCV1M-T311I，pcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M整合入谷氨酸棒杆菌的基因组。
本发明所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，在将Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M整合入谷氨酸棒杆菌的基因组后，还包括弱化pck基因和/或pyk基因的表达；然后增加Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M的拷贝数。
本发明还提供了L-苏氨酸的制备方法，包括：发酵所述的重组谷氨酸棒杆菌，获得含有L-苏氨酸的发酵液。
所述发酵的培养基包括水和玉米浆50ml/l，葡萄糖50g/l，硫酸铵4g/l，MOPS 30g/l，磷酸二氢钾10g/l，尿素20g/l，生物素10mg/l，硫酸镁6g/l，硫酸亚铁1g/l，VB1·HC140mg/l，泛酸钙50mg/l，烟酰胺40mg/l，硫酸锰1g/l，硫酸锌20mg/l，硫酸铜20mg/l。所述培养基的pH值为7.2。
所述培养的条件为33℃、220r/min振荡培养24h。
所述发酵前，还包括种子活化和种子培养的步骤。
种子活化的培养基包括水和BHI 3.7％，琼脂2％，pH7。
种子培养的培养基包括水和蛋白胨5g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，硫酸铵16g/l，尿素8g/l，磷酸二氢钾10.4g/l，磷酸氢二钾21.4g/l，生物素5mg/l，硫酸镁3g/l。葡萄糖50g/l，pH 7.2。
本发明组合改造(或增强)抗反馈抑制的hom基因、lysC基因、thrC基因等，及(或)弱化(或敲除)pck基因和(或)弱化(或敲除)pyk基因，构建了苏氨酸的谷氨酸棒杆菌生产菌，产酸效果非常显著，远超出了目前有报道的最高水平达到20g/l。
附图说明
图1为重组质粒pK18mobsacB-Peg3069-pck的示意图；
图2为重组质粒pK18mobsacB-Δpck的示意图；
图3为重组质粒pK18mobsacB-pck：：SEQ1的示意图；
图4为重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pyk的示意图；
图5为重组质粒pK18mobsacB-Δpyk的示意图；
图6为表达质粒pMCT1的示意图。
具体实施方式
本发明提供了重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明中，涉及基因的名称包括：pck(cg3169)：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(EC：4.1.1.32)。pyk(cg2291)：丙酮酸激酶(EC：2.7.1.40)。lysC(cg0306)：天冬氨酸激酶(EC：2.7.2.4)。hom(cg1337)：高丝氨酸脱氢酶(EC：1.1.1.3)。thrB(cg1338)：高丝氨酸激酶(EC：2.7.1.39)。thrC(cg2437)：苏氨酸合酶(EC：4.2.3.1)。
SMCT021工程菌株的构建工作，利用了sacB方法对棒状杆菌基因组进行遗传改造。
以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的L-苏氨酸生产菌种的亲代菌株为ATCC13032，菌种的拉丁学名是Corynebacterium glutamicum ATCC13032。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCV1M-T311I的构建及在ATCC13032中替换
(1)pK18mobsacB-Psod-lysCV1M-T311I质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P21/P22引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P23/P24引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod，以P25/P26引物对进行PCR扩增得到lysCV1M-T311I，以27/28引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P21/P24引物对以up、Psod为模版进行融合PCR，获得片段up-Psod。以P21/P28引物对以up-Psod、lysCV1M-T311I、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-Psod-lysCV1M-T311I-dn。全长片段用BamHI进行酶切，pK18mobsacB用同样的酶酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCV1M-T311I。
(2)在ATCC13032中进行lysC替换
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备ATCC13032感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCV1M-T311I以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT018。
实施例2：重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E的构建及在SMCT018中替换
(1)pK18mobsacB-PcspB-homG378E质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P29/P30引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P31/P32引物对进行PCR扩增得到启动子片段PcspB，以P33/P34引物对进行PCR扩增得到homG378E，以P35/P36引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P29/P32引物对以up、PscpB为模版进行融合PCR，获得片段up-PcspB。以P29/P36引物对以up-PcspB、homG378E、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-PcspB-homG378E-dn。全长片段用BamHI进行酶切，pK18mobsacB用同样的酶酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E。
(2)在SMCT018进行hom替换
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter23)制备SMCT018感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT019。
实施例3：重组质粒pK18mobsacB-Psod-thrCV1M的构建及在SMCT019中替换
(1)pK18mobsacB-Psod-thrCV1M质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P37/P38引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P39/P40引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod-thrCV1M，以P41/P42引物对进行PCR扩增得到dn。以P37/P42引物对以up、Psod-thrCV1M、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-Psod-thrCV1M-dn。全长片段用BamHI进行酶切，pK18mobsacB用同样的酶酶切。两酶切产物以T4DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-thrCV1M。
(2)在SMCT019进行thrC替换
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT019感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Psod-thrCV1M以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT021。
实施例4：重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pck的构建及在SMCT021将pck的启动子替换为Pcg3069
(1)pK18mobsacB-Pcg3069-pck质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P1/P2引物对进行PCR扩增得到上游片段up，以P3/P4引物对进行PCR扩增得到下游片段dn，以P1/P4引物对以up、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-dh。up-dh片段用HindIII进行酶切，pK18mobsacB用同样的酶酶切。两酶切产物以T4DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pck。
(2)在SMCT021将pck的启动子替换为Pcg3069
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Δpck以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT022。
实施例5：重组质粒pK18mobsacB-Δpck的构建及在SMCT021中失活pck
(1)pK18mobsacB-Δpck质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P5/P6引物对进行PCR扩增得到上游片段up，以P7/P8引物对进行PCR扩增得到下游片段dn，以P5/P8引物对以up、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-dh。up-dh片段用BamHI、HindIII进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Δpck。
(2)SMCT021中敲除pck
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Δpck以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT023。
实施例6：重组质粒pK18mobsacB-pck：：SEQ1的构建及在SMCT021中用SEQ ID NO.1序列替换pck
(1)pK18mobsacB-pck：：SEQ1质粒的构建
委托第三方公司合成两端含有SmalI酶切位点及SEQ ID NO.1序列的片段。用SmalI对pK18mobsacB质粒和SEQ ID NO.1片段进行酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-pck：：SEQ ID NO.1。
(2)SMCT021失活pck同时插入SEQ ID NO.1序列
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-pck：：SEQ1以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT024。
实施例7：重组质粒pK18mobsacB-Peg3069-pyk的构建及在SMCT021中弱化pyk启动子
(1)pK18mobsacB-Pcg3069-pyk质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P9/P10引物对进行PCR扩增得到上游片段up，以P11/P12引物对进行PCR扩增得到下游片段dn，以P9/P12引物对以up、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-dh。up-dn片段用BamHI、HindIII进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pyk。
(2)SMCT021中弱化pyk启动子
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pyk以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT025。
实施例8：重组质粒pK18mobsacB-Δpyk的构建及在SMCT021中失活pyk
(1)pK18mobsacB-Δpyk质粒的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P13/P14引物对进行PCR扩增得到上游片段up，以P15/P16引物对进行PCR扩增得到下游片段dn，以P13/P16引物对以up、dn为模版进行融合PCR，获得片段up-dn。up-dn片段用BamHI、HindIII进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4 DNALigase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Δpyk。
(2)SMCT021中敲除pyk
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT021感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Δpck以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT026。
实施例9：在SMCT022、SMCT023、SMCT024中弱化pyk启动子
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT022、SMCT023、SMCT024感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Pcg3069-pyk以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为菌株命名为SMCT027、SMCT028、SMCT029。
实施例10：在SMCT022、SMCT023、SMCT024中敲除pyk
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT022、SMCT023、SMCT024感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Δpck以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为SMCT030、SMCT031、SMCT032。
实施例11：构建质粒pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378E，Psod-thrCV1M并在SMCT031中过表达
(1)pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M质粒的构建
以SMCT021基因组为模板，以P17/P18引物对进行PCR扩增得到Psod-lysCV1M-T311I片段，以P19/P20引物对进行PCR扩增得到片段PcspB-homG378EthrB，以P43/P44引物对进行PCR扩增得到片段Psod-thrCV1M。以P17/P44为模版，以Psod-lysCV1M-T311I、PcspB-homG378EthrB、Psod-thrCV1M为模版，进行融合PCR获得Psod-lysCV1M-T311I-PcspB-homG378EthrB-Psod-thrCV1M片段。片段用BamHI进行酶切，pEKEx2用同样的酶酶切。两酶切产物以T4 DNALigase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得质粒pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，PcspB-homG378EthrB，Psod-Psod-thrCV1M，命名为pMCT1。
(2)SMCT031中表达上述质粒
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备SMCT031感受态细胞。质粒pEKEx2-Psod-lysCV1M-T311I，pcspB-homG378EthrB，Psod-thrCV1M以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有50mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子。获得目的突变菌株命名为SMCT033。
实施例12：基因工程菌发酵生产L-苏氨酸
1.培养基
种子活化培养基：BHI 3.7％，琼脂2％，pH7。
种子培养基：蛋白胨5g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，硫酸铵16g/1，尿素8g/l，磷酸二氢钾10.4g/l，磷酸氢二钾21.4g/l，生物素5mg/1，硫酸镁3g/la葡萄糖50g/l，pH7.2。
发酵培养基：玉米浆50ml/l，葡萄糖50g/l，硫酸铵4g/l，MOPS 30g/l，磷酸二氢钾10g/l，尿素20g/l，生物素10mg/l，硫酸镁6g/l，硫酸亚铁1g/l，VB1·HC140mg/l，泛酸钙50mg/l，烟酰胺40mg/l，硫酸锰1g/l，硫酸锌20mg/l，硫酸铜20mg/l，pH 7.2。
2.工程菌摇瓶发酵生产L-苏氨酸
(1)种子培养：挑取ATCC13032、SMCT021、SMCT022、SMCT023、SMCT024、SMCT025、SMCT026、SMCT027、SMCT028、SMCT029、SMCT030、SMCT031、SMCT032、SMCT033斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养16h；
(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养24h。
(3)本实施例重复3次，发酵结束，取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-苏氨酸，其浓度如下表1所示。
表1实施例改造菌株与未改造菌株L-苏氨酸产量汇总
注：*表示与SMCT相比具有极显著差异(P＜0.01)
由表1可知pck改造菌SMCT022、SMCT023、SMCT024苏氨酸的产量达到12-15g/l，与未经pck改造的菌株相比其转化率提高了146-200％，已经超过目前文献报道的最高值11.8g/l。pyk改造菌SMCT025、SMCT026的苏氨酸产量达到14-15g/l，其产量略高于pck改造菌，较文献最高值11.8g/l提高27％。pck的改造使得草酰乙酸回流到磷酸烯醇式丙酮酸的代谢路径削弱或失活，从而草酰乙酸更多的流向苏氨酸合成路径；在棒杆菌中草酰乙酸的合成主要有两条路径，分别是由磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸羧化而来，预计pyk的弱化或失活会提高胞内磷酸烯醇式丙酮酸的含量，降低丙酮酸的含量，从而降低其进入TCA循环减少碳损失，总体而言胞内总的磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸的含量是不变的，进一步推测pyk的改造不会对苏氨酸产量的改变造成太大影响。根据摇瓶结果可以看出，当pyk进行弱化或失活后，苏氨酸的产量明显提升，这是我们预料不到的。
当pck与pyk两个基因改造位点进行叠加，苏氨酸的产量有了进一步的提高，尤其是pck与pyk两者均进行失活改造时，其苏氨酸的产量最高达到了18g/l，较单个位点的改造提高了20％。
目前文章报道的11.8g/l的菌株中含有质粒，该质粒含有苏氨酸合成路径中的基因，而本实施例1-10中的改造菌均不含有质粒，为了更好的对比本实施例中的改造菌与文章报道的改造菌株的性能，我们将含有苏氨酸合成路径中基因的质粒pMCT1导入到本实施例的最优菌株SMCT031中，对其生产L-苏氨酸的性能进行了评估。获得的改造菌SMCT033苏氨酸的产量20g/l，较文章报道最高水平提高69％。
以上实施例中使用引物序列见下表：
表2引物名称及序列
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法
<130> MP1937952
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2468
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60
ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120
aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180
gaagtccagg aggacataca atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg 240
gtcccggctc agcagtcgga attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga 300
tgcgtctgat gaccgagtac ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg 360
ttcgtggcat tgctgtttct gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc 420
tcactgagga cgcttttgca ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta 480
tcggcggcat tgagtaccca cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg 540
ttgttaccgc caataaggct cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg 600
aagccgcaaa cgttgacctg tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg 660
gcccactgcg tcgctccctg gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg 720
gcaccaccaa cttcatcttg gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt 780
tggctgaggc aactcgtttg ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc 840
atgacgccgc atccaaggct gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg 900
cggatgatgt gtactgcgaa ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac 960
agcaggcagg ccacaccatc aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag 1020
gaaagtcggc tatttctgct cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg 1080
cgtcggtaaa caagtccttt aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga 1140
tgttctacgg aaacggtgca ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt gacgacgtcg 1200
ttggtgccgc acgaaacaag gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta 1260
acctgccgat cgctgatttc ggtgagacca ccactcggta ccacctcgac atggatgtgg 1320
aagatcgcgt ggaggttttg gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc 1380
tgcgtacaat ccgacaggaa gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact 1440
ctgcgctgga atctgatctt tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta 1500
aggcaatcaa cagtgcgatc cgcctcgaaa gggactaaat ggcaattgaa ctgaacgtcg 1560
gtcgtaaggt taccgtcacg gtacctggat cttctgcaaa cctcggacct ggctttgaca 1620
ctttaggttt ggcactgtcg gtatacgaca ctgtcgaagt ggaaattatt ccatctggct 1680
tggaagtgga agtttttggc gaaggccaag gcgaagtccc tcttgatggc tcccacctgg 1740
tggttaaagc tattcgtgct ggcctgaagg cagctgacgc tgaagttcct ggattgcgag 1800
tggtgtgcca caacaacatt ccgcagtctc gtggtcttgg ctcctctgct gcagcggcgg 1860
ttgctggtgt tgctgcagct aatggtttgg cggatttccc gctgactcaa gagcagattg 1920
ttcagttgtc ctctgccttt gaaggccacc cagataatgc tgcggcttct gtgctgggtg 1980
gagcagtggt gtcgtggaca aatctgtcta tcgacggcaa gagccagcca cagtatgctg 2040
ctgtaccact tgaggtgcag gacaatattc gtgcgactgc gctggttcct aatttccacg 2100
catccaccga agctgtgcgc cgagtccttc ccactgaagt cactcacatc gatgcgcgat 2160
ttaacgtgtc ccgcgttgca gtgatgatcg ttgcgttgca gcagcgtcct gatttgctgt 2220
gggagggtac tcgtgaccgt ctgcaccagc cttatcgtgc agaagtgttg cctattacct 2280
ctgagtgggt aaaccgcctg cgcaaccgtg gctacgcggc atacctttcc ggtgccggcc 2340
caaccgccat ggtgctgtcc actgagccaa ttccagacaa ggttttggaa gatgctcgtg 2400
agtctggcat taaggtgctt gagcttgagg ttgcgggacc agtcaaggtt gaagttaacc 2460
aaccttag 2468
<210> 2
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60
ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120
gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180
gattttttac cc 192
<210> 3
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 4
<211> 452
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtagcccgag gttaagtcta ttttaggtga acaaatttca gtttcgggta gaagactttc 60
gatgcgcttc agagcttcta ttaggaaatc tgacaccact tgattaaata acctaccccc 120
ggaattgggg gatgggttat tttttgctgt gcgtagtttt ggtagatatg acctgcgttt 180
ataaagaaat gtaaacgtga tcggatcgat ataaaagaaa cagtttgtac tcaggtttga 240
agcattttct ccaattcgcc tggcaaaaat ctcaattgtc gcttacagtt tttctcaacg 300
acaggctgct aagctgctag ttcggtggcc tagtgagtgg cgtttacttg gataaaagta 360
atcccatgtc gtgatcagcc attttgggtt gtttccatag catccaaagg tttcgtcttt 420
cgatacctat tcctgcagaa ggagatatac at 452
<210> 5
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60
attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120
ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180
gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240
ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300
cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360
cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420
tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480
gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540
gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600
ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660
gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720
ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780
aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840
cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900
aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960
ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt gacgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020
gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080
ggtgagacca ccactcggta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt ggaggttttg 1140
gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200
gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260
tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320
cgcctcgaaa gggactaa 1338
<210> 6
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcaattg aactgaacgt cggtcgtaag gttaccgtca cggtacctgg atcttctgca 60
aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120
gtggaaatta ttccatctgg cttggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggcgaagtc 180
cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240
gctgaagttc ctggattgcg agtggtgtgc cacaacaaca ttccgcagtc tcgtggtctt 300
ggctcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgctgcag ctaatggttt ggcggatttc 360
ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca cccagataat 420
gctgcggctt ctgtgctggg tggagcagtg gtgtcgtgga caaatctgtc tatcgacggc 480
aagagccagc cacagtatgc tgctgtacca cttgaggtgc aggacaatat tcgtgcgact 540
gcgctggttc ctaatttcca cgcatccacc gaagctgtgc gccgagtcct tcccactgaa 600
gtcactcaca tcgatgcgcg atttaacgtg tcccgcgttg cagtgatgat cgttgcgttg 660
cagcagcgtc ctgatttgct gtgggagggt actcgtgacc gtctgcacca gccttatcgt 720
gcagaagtgt tgcctattac ctctgagtgg gtaaaccgcc tgcgcaaccg tggctacgcg 780
gcataccttt ccggtgccgg cccaaccgcc atggtgctgt ccactgagcc aattccagac 840
aaggttttgg aagatgctcg tgagtctggc attaaggtgc ttgagcttga ggttgcggga 900
ccagtcaagg ttgaagttaa ccaaccttag 930
<210> 7
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggactaca tttcgacgcg tgatgccagc cgtacccctg cccgcttcag tgatattttg 60
ctgggcggtc tagcaccaga cggcggcctg tacctgcctg caacctaccc tcaactagat 120
gatgcccagc tgagtaaatg gcgtgaggta ttagccaacg aaggatacgc agctttggct 180
gctgaagtta tctccctgtt tgttgatgac atcccagtag aagacatcaa ggcgatcacc 240
gcacgcgcct acacctaccc gaagttcaac agcgaagaca tcgttcctgt caccgaactc 300
gaggacaaca tttacctggg ccacctttcc gaaggcccaa ccgctgcatt caaagacatg 360
gccatgcagc tgctcggcga acttttcgaa tacgagcttc gccgccgcaa cgaaaccatc 420
aacatcctgg gcgctacctc tggcgatacc ggctcctctg cggaatacgc catgcgcggc 480
cgcgagggaa tccgcgtatt catgctgacc ccagctggcc gcatgacccc attccagcaa 540
gcacagatgt ttggccttga cgatccaaac atcttcaaca tcgccctcga cggcgttttc 600
gacgattgcc aagacgtagt caaggctgtc tccgccgacg cagaattcaa aaaagacaac 660
cgcatcggtg ccgtgaactc catcaactgg gcacgcctta tggcacaggt tgtgtactac 720
gtttcctcat ggatccgcac cacaaccagc aatgaccaaa aggtcagctt ctccgtacca 780
accggcaact tcggtgacat ttgcgcaggc cacatcgccc gccaaatggg acttcccatc 840
gatcgcctca tcgtggccac caacgaaaac gatgtgctcg acgagttctt ccgtaccggc 900
gactaccgag tccgcagctc cgcagacacc cacgagacct cctcaccttc gatggatatc 960
tcccgcgcct ccaacttcga gcgtttcatc ttcgacctgc tcggccgcga cgccacccgc 1020
gtcaacgatc tatttggtac ccaggttcgc caaggcggat tctcactggc tgatgacgcc 1080
aactttgaga aggctgcagc agaatacggt ttcgcctccg gacgatccac ccatgctgac 1140
cgtgtggcaa ccatcgctga cgtgcattcc cgcctcgacg tactaatcga tccccacacc 1200
gccgacggcg ttcacgtggc acgccagtgg agggacgagg tcaacacccc aatcatcgtc 1260
ctagaaactg cactcccagt gaaatttgcc gacaccatcg tcgaagcaat tggtgaagca 1320
cctcaaactc cagagcgttt cgccgcgatc atggatgctc cattcaaggt ttccgaccta 1380
ccaaacgaca ccgatgcagt taagcagtac atagtcgatg cgattgcaaa cacttccgtg 1440
aagtaa 1446
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacatgccga cttatcgcaa gcctggtaat tttataccct agatcgttag actttcgtta 60
Claims (9)
1.重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其lysC、hom、thrB和thrC基因被强化，且pck和/或pyk基因的表达被弱化。
2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，
所述lysC基因的强化包括I）~III）中至少一种：
I）在lysC基因编码区上游插入sod启动子；
II）将lysC基因的起始密码子由GTG突变为ATG；
III）lysC基因突变为如SEQ ID NO:3所示，使其编码蛋白的N端第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸；
所述hom基因的强化包括I）~II）中至少一种：
I）在hom基因编码区上游插入cspB的启动子；
II）hom基因突变为如SEQ ID NO:5所示，使其编码蛋白的378位的甘氨酸突变为谷氨酸；
所述thrB基因的强化为增加thrB基因的拷贝数；
所述thrC基因的强化包括I）~II）中至少一种：
I）在thrC基因编码区上游插入sod启动子；
II）thrC基因的起始密码子由GTG突变为ATG。
3.根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，
所述pck基因的弱化包括包括I）~III）中至少一种：
I）将pck基因的启动子替换为cg3069；
II）敲除pck基因；
III）插入片段，使pck基因失活；
所述pyk基因的弱化包括I）~II）中至少一种：
I）将pyk基因的启动子替换为cg3069；
II）敲除pyk基因。
4.根据权利要求1~3任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其起始菌株为Corynebacterium glutamicum ATCC13032。
5.根据权利要求4所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其基因型为：ATCC13032,Psod-lysCV1M-T311I,PcspB-homG378EthrB,Psod-thrCV1M,△pck,△pyk。
6.权利要求1~5任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备L-苏氨酸中的应用。
7.权利要求1~5任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括将Psod-lysCV1M-T311I,PcspB-homG378EthrB,Psod-thrCV1M整合入谷氨酸棒杆菌的基因组。
8.权利要求7所述的构建方法，其特征在于，还包括弱化pck基因和/或pyk基因的表达；然后增加Psod-lysCV1M-T311I,PcspB-homG378EthrB,Psod-thrCV1M的拷贝数。
9.L-苏氨酸的制备方法，包括：发酵权利要求1~6任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，获得含有L-苏氨酸的发酵液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010126372.4A CN113322218B (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010126372.4A CN113322218B (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113322218A CN113322218A (zh) | 2021-08-31 |
| CN113322218B true CN113322218B (zh) | 2022-11-22 |
Family
ID=77412490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010126372.4A Active CN113322218B (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113322218B (zh) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116536226A (zh) * | 2022-01-26 | 2023-08-04 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 产苏氨酸工程菌的构建方法 |
| CN116536227A (zh) * | 2022-01-26 | 2023-08-04 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种生产苏氨酸的修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用 |
| CN116555131A (zh) * | 2022-01-27 | 2023-08-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种重组微生物及其构建方法和应用 |
| CN116555130A (zh) * | 2022-01-27 | 2023-08-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 产苏氨酸基因工程菌的构建方法 |
| CN116555132A (zh) * | 2022-01-28 | 2023-08-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其生产苏氨酸的应用和构建方法 |
| CN116555135A (zh) * | 2022-01-29 | 2023-08-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 高产苏氨酸基因工程菌的构建方法 |
| CN116555134A (zh) * | 2022-01-29 | 2023-08-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 产苏氨酸菌株的构建方法 |
| CN116555137A (zh) * | 2022-01-30 | 2023-08-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种苏氨酸生产菌株及其应用 |
| CN116555136A (zh) * | 2022-01-30 | 2023-08-08 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用 |
| CN116606786A (zh) * | 2022-02-08 | 2023-08-18 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种生产苏氨酸的重组微生物及其构建方法和应用 |
| CN116622597A (zh) * | 2022-02-10 | 2023-08-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 高产苏氨酸工程菌的构建方法 |
| CN116622596A (zh) * | 2022-02-10 | 2023-08-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用 |
| CN116622600A (zh) * | 2022-02-14 | 2023-08-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 苏氨酸生产菌株的构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105505969A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用 |
| CN106459886A (zh) * | 2014-02-14 | 2017-02-22 | 中国科学院微生物研究所 | 一种产l‑氨基酸的重组菌、其构建方法及l‑氨基酸生产方法 |
-
2020
- 2020-02-28 CN CN202010126372.4A patent/CN113322218B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106459886A (zh) * | 2014-02-14 | 2017-02-22 | 中国科学院微生物研究所 | 一种产l‑氨基酸的重组菌、其构建方法及l‑氨基酸生产方法 |
| CN105505969A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A method for gene amplification and simultaneous deletion in Corynebacterium glutamicum genome without any genetic markers;JianzhongXu 等;《Plasmid》;20140331;第72卷;2、7、10 * |
| Characterization of aspartate kinase and homoserine dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum IWJ001 and systematic investigation of L-isoleucine biosynthesis;Xunyan Dong 等;《Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology》;20160601;第43卷(第6期);1、7、10 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113322218A (zh) | 2021-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113322218B (zh) | 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 | |
| EP2246415B1 (en) | Improved promoter and a production method for l-lysine using the same | |
| CN110982772B (zh) | 一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用 | |
| DK2236610T3 (en) | Promoter and improved method for producing L-lysine using the same | |
| CN111471638B (zh) | 一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用 | |
| JP2004129666A (ja) | 染色体上のｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされたＬ−トレオニン生成変異微生物及びこれを用いたＬ−トレオニンの製造方法 | |
| JP4383984B2 (ja) | Ｌ−スレオニンの生産方法 | |
| JP4334565B2 (ja) | 染色体内のｔｄｃＢＣ及びｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された微生物及びこれを用いてＬ−トレオニンを製造する方法 | |
| CN116536227A (zh) | 一种生产苏氨酸的修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用 | |
| CN116606785A (zh) | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其应用与构建方法 | |
| CN116555135A (zh) | 高产苏氨酸基因工程菌的构建方法 | |
| CN116555137A (zh) | 一种苏氨酸生产菌株及其应用 | |
| CN116555134A (zh) | 产苏氨酸菌株的构建方法 | |
| WO2023151406A1 (zh) | 苏氨酸生产菌株的构建方法 | |
| WO2023142871A1 (zh) | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用 | |
| WO2023151409A1 (zh) | 高产苏氨酸工程菌的构建方法 | |
| WO2023151407A1 (zh) | 苏氨酸生产菌株的构建方法 | |
| CN116536226A (zh) | 产苏氨酸工程菌的构建方法 | |
| CN116555251A (zh) | 一种生产苏氨酸的重组微生物及其应用 | |
| CN115029289A (zh) | 高产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| WO2023142848A1 (zh) | 启动子、产苏氨酸重组微生物及其应用 | |
| CN116555130A (zh) | 产苏氨酸基因工程菌的构建方法 | |
| WO2023151408A1 (zh) | 高产苏氨酸菌株的构建方法 | |
| CN116622596A (zh) | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用 | |
| CN117247914A (zh) | 乙酰羟酸合酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |