TW201907002A - 新穎天冬胺酸激酶變體及其用於生產ｌ－胺基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本公開關於天冬胺酸激酶變體、包含該變體的微生物、以及使用該微生物生產天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其高絲胺酸衍生物的方法。

Description

新穎天冬胺酸激酶變體及其用於生產L-胺基酸的方法
本公開關於天冬胺酸激酶變體、包含該變體的微生物、以及使用該微生物生產天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的方法。
棒狀桿菌屬微生物，特別是麩胺酸棒狀桿菌，是廣泛用於生產L-胺基酸和其它有用物質的革蘭氏陽性微生物。為了生產L-胺基酸和其它有用物質，已進行各種研究以開發用於發酵過程的高效生產微生物和技術。例如，達到特定目標物質的方法主要使用經由增加編碼參與L-離胺酸生物合成的酶的基因表現，或經由剔除生物合成不必要的基因(韓國專利No.10-0838038)。
同時，在L-胺基酸中，L-離胺酸、L-蘇胺酸、L-甲硫胺酸、L-異白胺酸和L-甘胺酸是衍生自天冬胺酸(Asp)的胺基酸，且這些胺基酸通常使用藉由天冬胺酸激酶(LysC，EC 2.7.2.4)自Asp產生的天冬胺醯基磷酸(App)(第1圖)。因此，為了以微生物發酵 方法生產胺基酸，必須將生物合成途徑中使用的酶的活性保持在一定或更高的程度，因此在這方面進行了深入研究。
特別是，已知作為天冬胺酸衍生的胺基酸生物合成途徑中的第一個酶的LysC活性受L-離胺酸和L-蘇胺酸的回饋抑制作用調節(J Mol Biol.2007 Apr 27；368(2)：521-36.線上發表於2007 Feb 20)。因此，儘管已經提出了與回饋抑制相關的應用(美國專利號US 8062869 B和日本專利號JP 3473042 B)，仍需要持續的研究以增加天冬胺酸衍生產物的生產力。
於此情況下，本發明人藉由確認當使用新的天冬胺酸激酶變體時，天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的生產得到改善而完成了本揭露。
本公開之目的是提供天冬胺酸激酶變體，其在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中包含一個或多個胺基酸取代，其中該胺基酸取代包括在SEQ ID NO：1的胺基酸序列位置377的胺基酸被L-離胺酸或L-甲硫胺酸取代。
本公開另一個目的是提供編碼該變體的多核苷酸。
本公開再另一個目的是提供生產天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的棒狀桿菌屬微生物， 其包含天冬胺酸激酶變體或具有其增強的活性。
本發明再另一個目的是提供一種生產天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的方法，包括在培養基中培養微生物；及從培養的微生物或培養基回收天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物。
本發明的再另一個目的是提供一種生產甲硫胺酸的方法，包括在培養基中培養微生物；從培養的微生物或培養基產生乙醯基高絲胺酸或琥珀醯基高絲胺酸；及將乙醯基高絲胺酸或琥珀醯基高絲胺酸轉為甲硫胺酸。
下文中將詳細描述本公開。
同時，於本文公開的每個解釋和例示性實施例可以應用於其他解釋和例示性實施例。意即，本文公開的各種因素的所有組合都屬於本公開的範圍。此外，本公開的範圍不應受下文提供的具體公開內容所限制。
另外，所屬技術領域中具有通常知識者將能夠基於例行實驗辨認或確認本申請中所描述的公開具體實施方案的許多均等物，並且這些均等物意圖涵括於本公開。
為了達成上述目的，本公開一方面提供天冬胺酸激酶變體，其在SEQ ID NO：1的胺基酸序列包含一個或多個胺基酸取代，其中該胺基酸取代包括位置377的胺基酸被另一種胺基酸取代。具體地，本公開的目 的是提供一種天冬胺酸激酶變體，其中SEQ ID NO：1的胺基酸序列中位置377的胺基酸被L-離胺酸或L-甲硫胺酸取代。
如本文所用，術語“天冬胺酸激酶”是指一種催化胺基酸(天冬胺酸)磷酸化的酶，並且在生物合成被稱為天冬胺酸家族的三種必需胺基酸的L-甲硫胺酸，L-離胺酸和L-蘇胺酸的第一步中作用。
在本公開中，術語“天冬胺酸激酶”可與“LysC”或“LysC蛋白質”互換使用。LysC蛋白質可以從已知的資料庫NCBI的GenBank獲得。LysC蛋白質可以是源自棒狀桿菌屬的LysC，更特定地，可以是衍生自麩胺酸棒狀桿菌之具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的多肽，但不限於此。另外，本公開中的LysC可以是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的多肽或與其同源性或一致性為80%、85%、90%、95%、或97%或更高的胺基酸序列。另外，顯而易見的是，具有缺失、修飾、取代或添加一部分序列的胺基酸序列的多肽也包括在本公開的範圍內，只要該胺基序列具有上述同源性或一致性並表現出與該多肽相應的效用即可。
在本公開中，可使用本領域熟知的各種方法獲得天冬胺酸激酶(LysC)。此類方法的實例包括基因合成技術，包括優化密碼子以便在棒狀桿菌屬微生物中以高效獲得酶，該方法通常用於酶的表現，以及使用基於微生物總體基因體的生物資訊學方法篩選有用酶資源的 方法，但方法不限於此。
如本文所用，術語“變體”是至少一個胺基酸以保守取代和/或修飾而與所述多肽不同的多肽，因而保留多肽的功能或特性。變體多肽經由數個胺基酸的取代，缺失或添加而與已鑑定的序列不同。此類變體通常可以經由修飾上述多肽序列之一並評估經修飾多肽的性質而鑑定。換句話說，相對於天然蛋白質，變體的能力可以增強，不變或減弱。此類變體通常可以經由修飾上述多肽序列之一並評估修飾多肽的反應度而鑑定。此外，一部分變體可包括其中一個或多個部分，例如N-末端前導序列或穿膜結構域，已除去的變體。其他變體可包括其中一小部分從成熟蛋白質的N-和/或C-末端已除去的變體。
如本文所用，“保守取代”是指胺基酸被另一具有類似結構和/或化學性質的胺基酸取代。例如，變體可以具有至少一個保守取代，保留一個或多個生物活性。這種胺基酸取代通常基於殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質的相似性來進行。例如，帶正電(鹼性)的胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；帶負電(酸性)的胺基酸包括天冬胺酸和麩胺酸；芳香族胺基酸包括苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸；及疏水性胺基酸包括丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸。通常，保守取代對所得多肽的活性幾乎沒有影響。
變體還可以含有其他修飾，包括對多肽的 特性和二級結構具有最小影響的胺基酸缺失或添加。例如，多肽可以在蛋白質N-末端接合於信號(或前導)序列，其共同轉譯或轉譯後指導蛋白質的轉移。多肽還可以與連接基或其他序列接合，以便於多肽的合成、純化或鑑定。
例如，本文主張的術語“天冬胺酸激酶變體”可以具體地指具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的LysC的經修飾多肽，其衍生自棒狀桿菌屬，並且可以包含於SEQ ID NO：1的胺基酸序列中包含一個或多個胺基酸取代的變體。具體地，它可以是包含於SEQ ID NO：1的胺基酸序列中位置377的胺基酸殘基被另一個胺基酸取代的變體。“其他胺基酸”不受限制，只要它是L-白胺酸以外的胺基酸，該白胺酸為位置377的胺基酸。具體地說，例如，位置377的胺基酸殘基，可以用離胺酸或甲硫胺酸取代。L-離胺酸是鹼性胺基酸的實例，鹼性胺基酸可以是L-離胺酸、L-精胺酸和L-組胺酸之一者。L-甲硫胺酸是非極性胺基酸的實例，及非極性胺基酸可以是L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-丙胺酸、L-半胱胺酸、L-甘胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-脯胺酸、L-色胺酸和L-纈胺酸之一者。然而，不限於此等。
如本文所用，術語“天冬胺酸激酶變體”可與“經修飾的天冬胺酸激酶”或“經修飾的LysC”互換使用。
這種天冬胺酸激酶變體的特徵在於，相較於具有SEQ ID NO：1的天冬胺酸激酶活性的多肽，具 有增強的天冬胺酸激酶活性。
另外，即使在本文中被描述為“具有特定序列號的胺基酸序列的蛋白質”，顯然地，胺基酸序列具有缺失、修飾、取代或添加部分序列的多肽也包括在本發明的範圍內，只要該蛋白質具有與相應序列號的胺基酸序列組成的肽為相同或均等功效即可。具體而言，這種蛋白質不排除在相應序列號的胺基酸序列的前端或尾端未改變蛋白質功能的序列的添加、天然發生的突變、其保守取代或同義突變。此外，具有這種序列添加或突變的蛋白質顯然也包括在本公開的範圍內。
如本文所用，術語“保守取代”是指某些胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族在本領域中是公知的。這類家族的實例可包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有未帶電極性側鏈的胺基酸(例如，天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、在β位置具有分支側鏈的胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、具有芳香側鏈的胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)、具有含羥基(例如，醇性、酚性)側鏈的胺基酸(例如，絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)和具有含硫側鏈的胺基酸(例如，半胱胺酸、甲 硫胺酸)。較佳地，胺基酸的保守取代可以是天冬胺酸和麩胺酸之間的取代，精胺酸、離胺酸和組胺酸之間的取代，色胺酸和苯丙胺酸之間的取代，苯丙胺酸和纈胺酸之間的取代，白胺酸、異白胺酸和丙胺酸之間的取代，以及甘胺酸和丙胺酸之間的取代。
如本文所用，術語“同源性”或“一致性”是指兩個指定胺基酸序列或核苷酸序列之間的相關程度，並且可以表示為百分比。
術語“同源性”和“一致性”通常彼此互換使用。
保留的多核苷酸或多肽序列的序列同源性或一致性可以經由標準比對演算法確定，並且可以由使用的軟體所建立的預設間隙懲罰值(gap penalty)一起使用。通常預期實質上同源或一致的多核苷酸或多肽在中度或高度嚴格條件下與目標多核苷酸或多肽全長的至少約50%、約60%、約70%、約80%或約90%雜交。此雜交也考慮了含有簡併密碼子而非密碼子的多核苷酸。
任兩個多核苷酸或多肽序列彼此是否具有同源性、相似性或一致性，可以使用已知的電腦演算法(例如“FASTA”軟體)以預設參數決定(例如，Pearson等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)。或者，也可以使用Needleman-Wunsch演算法來決定(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)，以EMBOSS套裝軟體的Needleman程式 執行(EMBOSS：歐洲分子生物學開放軟體套組，Rice等，2000，Trends Genet.16：276-277)(較佳為版本5.0.0或其後的版本)(GCG程式套裝軟體(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，[S.][F.,][ET AL.,J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；大型計算機指南，Martin J.Bishop，[ED.,]Academic Press,San Diego,1994,and[CARILLO ETAL.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，可以使用國家生物技術信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW決定同源性或一致性。
多核苷酸或多肽序列的同源性、相似性或一致性可以使用例如公開的GAP電腦程式(例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math(1981)2：482)比較序列資訊來決定。總言之，GAP程式定義同源性或一致性為藉由將類似地對準符號(即核苷酸或胺基酸)的數除以兩個序列中較短的符號總數而獲得的值。GAP程式的預設參數可以包括(1)一元比較矩陣(含一致的值為1，非一致的值為0)和Gribskov等(1986)的加權比較矩陣(Nucl.Acids Res.14：6745)，如公開於Schwartz和Dayhoff的編輯中(Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358,1979)；(2)每個間隙的懲罰值為3.0，每個間隙中的每個符號額外的 0.10懲罰值(或間隙開放罰值為10及延伸間隙罰值為0.5)；(3)對尾端間隙無懲罰值。因此，如本文所用，術語“同源性”或“一致性”是指序列之間的相關性。
本公開的另一態樣提供編碼天冬胺酸激酶變體的多核苷酸。
該天冬胺酸激酶變體如上所述。
如本文所用，術語“多核苷酸”是指核苷酸單體以共價鍵合成鏈所組成的核苷酸聚合物，並且其實例是具有預定或更長長度的DNA或RNA股。具體地，該多核苷酸是指編碼經修飾多肽的多核苷酸片段。
編碼天冬胺酸激酶變體的多核苷酸可以是編碼在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中包含一個或多個胺基酸取代的多肽的多核苷酸，其中該胺基酸取代包括在位置377的胺基酸殘基被另一種胺基酸取代。具體地，作為代表性實例，編碼天冬胺酸激酶變體的多核苷酸可以是編碼在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，位置377的胺基酸殘基被L-離胺酸或L-甲硫胺酸的另一種胺基酸取代的多肽的多核苷酸。更具體地，該多核苷酸可以是編碼具有由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所組成的胺基酸序列的LysC蛋白質的多核苷酸。例如，該多核苷酸可以是由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸序列組成的多核苷酸。由於密碼子簡併性，或考慮到表現蛋白質的生物體偏好的密碼子，只要不會改變由編碼區所表現的蛋白質的胺基酸序列，可以在該編碼區中進行各種修 飾。
因此，顯然由於密碼子簡併性，由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的胺基酸序列組成的多肽，或能夠轉譯成與其具有同源性或一致性的多肽的多核苷酸，也可以包括在本公開的範圍內。或者，可以從已知基因序列，例如，編碼具有由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的酶的活性的蛋白質的序列，經由在嚴格條件下與該多核苷酸序列的全部或部分的互補序列雜交而製備的探針，可以被包括而無限制。
“嚴格條件”是指允許多核苷酸之間特異性雜交的條件。這些條件在文獻中具體公開(例如，J.Sambrook等人)。例如，嚴格條件可以包括具有高同源性或一致性(例如，80%或更多、85%或更多、特別是90%或更多、更具體地95%或更多、甚至更特別地、97%或更多、甚至更具體地99%或更多)的基因彼此之間可以雜交，而具有較低同源性或一致性的基因彼此不能雜交的條件；或常規南方雜交的條件(即，在鹽濃度和溫度對應於60℃，1×SSC和0.1%SDS的情況下洗滌一次，特別是兩次或三次；特別是在60℃，0.1×SSC和0.1%SDS的條件；更具體地說，在68℃，0.1×SSC和0.1%SDS的條件)。
雜交需要兩個核酸具有互補序列，儘管鹼基之間的錯配可能取決於雜交的嚴格度。術語“互補”用於描述彼此能夠雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，就 DNA而言，腺苷與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本公開還可以包括實質上相似的核酸序列，以及與整個序列互補的單離核酸片段。
具體地，可以使用包括Tm值為55℃的雜交步驟的雜交條件，以及使用上述條件來檢測具有同源性或一致性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限於此。所屬技術領域中具有通常知識者可以根據其目的適當地調整Tm值。
多核苷酸雜交的適當嚴格性取決於多核苷酸的互補長度和程度，且該變數是本領域熟知的(Sambrook等，同上，9.50-9.51,11.7-11.8)。
本公開的另一態樣提供含有天冬胺酸激酶變體的宿主細胞，和以含有編碼天冬胺酸激酶變體的多核苷酸的載體所轉形的微生物。具體地，本公開提供產生包含天冬胺酸激酶變體的天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的棒狀桿菌屬的微生物。
含有本公開的天冬胺酸激酶變體的微生物的特徵在於，與野生型或未修飾的微生物相比，天冬胺酸激酶的活性增強。
如本文所用，術語“活性增強”是指引入蛋白質活性，或相較於微生物的內在活性或修飾前的活性被增強的活性。活性的“引入”的意思是微生物本來沒有的特定蛋白質的活性以天然或人工方式表現。“內在活性”是指特定蛋白質在轉形之前存在於親代菌株中的原始活性，轉 形時微生物性狀以天然或人工因素的基因變異被改變。
如本文所用，術語“載體”是指包含編碼目標蛋白的多核苷酸的核苷酸序列可操作地連接至適當的調控序列，以於適當的宿主中表達目標蛋白的DNA構築體。調控序列可包括可啟始轉錄的啟動子，調控轉錄的任何操作子序列(operator sequence)，編碼適當mRNA核糖體結合位點的序列，以及調控轉錄和轉譯之終止的序列。載體可以轉染到合適的宿主中，然後可以獨立於宿主基因組而複製或作用，並且可以整合到該基因組中。
本公開中使用的載體不受特別限制，只要其可以在宿主中表達，並且可以使用本領域已知的任何載體。常用載體的實例為天然狀態或重組狀態的質體、黏接質體、病毒和噬菌體。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌體載體或黏接質體載體；pBR系統、pUC系統、pBluescriptII系統、pGEM系統、pTZ系統、pCL系統和pET系統可用作質體載體。具體地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC載體，但不限於此。
本公開中可以使用的載體沒有特別限制，可以使用已知的表達載體。另外，對於細胞內的染色體插入，編碼目標蛋白質的多核苷酸可以經由載體插入染色體中。多核苷酸插入染色體中可以經由本領域已知的任何方 法進行，例如同源重組，但不特別限於此。載體可以進一步包括篩選標記，用於標示宿主染色體的載體插入。篩選標記用於篩選經載體轉形的細胞，即，確認是否已插入目標核酸分子。因此，篩選標記可賦予細胞顯示抗藥性、細胞毒性劑抗性、自養性或可選的表型表現的能力，例如表面蛋白質的表現。可選擇劑的存在，可以選擇經轉形的細胞，因為只有表現篩選標記的細胞才能存活或顯示另一種表型。
如本文所用，術語“轉形”是指將包括編碼目標蛋白質的多核苷酸的載體引入宿主細胞中，使該多核苷酸所編碼的蛋白質在宿主細胞中表達。只要經轉形的多核苷酸可以在宿主細胞中表達，它可以整合到宿主細胞的染色體中或置於宿主細胞的染色體中，或者存在於染色體外。此外，多核苷酸包括編碼目標蛋白質的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以被引入宿主細胞並在其中表達即可。例如，多核苷酸可以以表現匣(expression cassette)的形式引入宿主細胞，表現匣是包括其自主表達所需的所有元件的基因構築體。表現匣可包括與多核苷酸可操作連接的啟動子、轉錄終止子、核糖體結合位點或轉譯終止子。表現匣可以是可自我複製的表現載體的形式。另外，可以將多核苷酸原樣引入宿主細胞中並與宿主細胞中表現所需的序列可操作地連接，但不限於此。轉形方法包括將核酸導入細胞的任何方法，並且可以根據宿主細胞選擇本領域已知的合適標準技術進行。該 方法的實例包括電穿孔、磷酸鈣(CaPO4)沉澱、氯化鈣(CaCl2)沉澱、微注射、聚乙二醇(PEG)技術，DEAE-葡聚糖技術、陽離子脂質體技術、乙酸鋰-DMSO技術等，但不限於此。
另外，術語“可操作的連接”是指多核苷酸序列被功能性連接至啟始和介導編碼本公開的目標蛋白質的多核苷酸的轉錄的啟動子序列。可操作的連接可以使用本領域已知的基因重組技術製備，並且可以使用已知的裂解酶和連接酶製備特定位點的DNA裂解和連接，但是不限於此。
如本文所用，術語“生產天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基衍生物的微生物”是指天然生產天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的微生物，或指其中天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的生產力是被賦予至缺乏生產天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的能力的親代菌株的微生物。
如本文所用，術語“天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物”是指能夠使用天冬胺酸(天冬胺酸鹽)作為前體進行生物合成的材料，並且可以與術語“天冬胺酸衍生產物”互換使用。“胺基酸衍生物”是指可以由L-胺基酸和包含L-胺基酸前體的材料製備的材料。此外，胺基酸衍生物不受限制，只要它是能夠使用天冬胺酸作為前體進行生物合成而生產的材料即可。具體地，包括通常使用乙醯磷酸合成的材料而沒有限制。例如，胺基酸衍生 物可以是L-離胺酸、L-蘇胺酸、L-甲硫胺酸、L-甘胺酸、高絲胺酸、O-乙醯高絲胺酸、O-琥珀醯高絲胺酸、O-磷酸高絲胺酸、L-異白胺酸和屍胺，但不限於此。
可以使用天冬胺酸作為前體直接生物合成屍胺，或者可以經由離胺酸脫羰酶從離胺酸生產。L-甲硫胺酸可以使用天冬胺酸作為前體直接生物合成，或者可以經由從O-乙醯高絲胺酸或O-琥珀醯高絲胺酸轉換來生產。
如本文所用，術語“天冬胺酸(天冬胺酸)”縮寫為Asp或D，並且是指天冬胺酸，其是用於蛋白質生物合成的α-胺基酸。與所有其他胺基酸一樣，天冬胺酸包括胺基和羧酸基團。一般來說，天冬胺酸激酶(LysC)以磷酸天冬胺醯基的形式生產天冬胺酸，然後在細胞裡轉為L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-高絲氨酸、L-蘇胺酸、L-異白胺酸等。
為了增強天冬胺酸衍生產物的生物合成，可以使用本公開的天冬胺酸激酶變體。例如，為了增強L-離胺酸、L-蘇胺酸、L-甲硫胺酸、L-甘胺酸、高絲胺酸、O-乙醯高絲胺酸、O-琥珀醯高絲胺酸、O-磷酸高絲胺酸、L-異白胺酸和屍胺的生物合成，可以引入本發明的天冬胺酸激酶變體，或者可以增強其活性。此外，經由引入或增強特定蛋白質的活性，或經由特定蛋白質的活性失活，可以進一步提高天冬胺酸衍生產物的生產力。
根據微生物的特徵，可以使用本領域已知 的合適方法進行引入、增強和失活特定蛋白質活性的方法。
生產天冬胺酸衍生產物、L-胺基酸或其胺基酸衍生物的微生物可以是藉由包括本公開的天冬氨酸變體而能夠生產天冬胺酸衍生的“胺基酸”或其胺基酸衍生物的任何微生物。其具體實例可包括埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬、伊文氏桿菌屬、腸桿菌屬、沙門氏菌屬、鏈黴菌屬、假單孢菌屬、短桿菌屬或棒狀桿菌屬，更具體地，微生物可以是麩胺酸棒狀桿菌，但不限於此。
本公開的又另一態樣提供一種製備天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的方法，包括：培養上述微生物；從培養的微生物或培養基回收天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基衍生物。
所屬技術領域中具有通常知識者可以在本領域已知的最佳化培養條件和酶活性條件下輕易決定製備天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基衍生物的方法。具體地，儘管沒有特別限制，但是培養微生物的步驟可以經由本領域已知的分批培養、連續培養和饋料批式培養進行。本文中，培養條件沒有特別限制，但是可以經由使用鹼性化學品(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化學品(例如，磷酸或硫酸)來維持最佳pH(例如，pH 5至9，特別是pH 6至8，更具體的是pH 6.8)。另外，可以經由向細胞培養物添加氧氣或含氧氣體混合物來維持需氧條件。培養溫度可以保持在20℃至45℃，具體地在25 ℃至40℃，並且培養可以進行約10小時至160小時，但不限於此。經由該培養產生的天冬胺酸衍生的胺基酸或其胺基衍生物可以分泌到培養基中，或者可以保留在細胞中。
另外，用於培養的培養基可包括個別的糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉和纖維素)，油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)，脂肪酸(例如，棕櫚酸、硬脂酸和亞麻油酸)，醇(例如，甘油和乙醇)和有機酸(例如，乙酸)或其組合作為碳源；含氮有機化合物(例如，蛋白腖、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米溶液、豆粕粉和尿素)或個別的無機化合物(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨)或其組合作為氮源；以及個別的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或與其相應的含鈉鹽或其組合作為磷源；但不限於此。此外，培養基可含有必需的促進生長的材料，例如其他金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)，胺基酸和維生素。
回收本公開的培養方法中生產的天冬胺酸衍生的胺基酸或其胺基酸衍生物的方法，可以根據培養方法使用該領域中已知的合適方法，從培養基中收集目標胺基酸而進行。例如，可以使用離心、過濾、陰離子層析法、結晶和HPLC，並且可以使用本領域已知的合適方法從培養基或微生物回收目標的天冬胺酸衍生的胺基酸或其胺基酸衍生物。
另外，回收方法可以進一步包括純化步驟，並且可以使用本領域已知的合適方法進行。
本公開的另一態樣提供一種生產L-甲硫胺酸的方法，包括：培養本公開的微生物；從培養的微生物或培養基生產O-乙醯高絲胺酸或O-琥珀醯高絲胺酸；將O-乙醯高絲胺酸或O-琥珀醯高絲胺酸轉為L-甲硫胺酸。
具體而言，“轉為L-甲硫胺酸的步驟”可以包括在硫化物存在下，使O-乙醯高絲胺酸或O-琥珀醯高絲胺酸與O-乙醯高絲胺酸硫氫化酶(sulfhydrylase)或O-琥珀醯高絲胺酸硫氫化酶反應的步驟。“O-乙醯高絲胺酸或O-琥珀醯高絲胺酸”可以是含有由本公開的微生物產生的O-乙醯高絲胺酸或O-琥珀醯高絲胺酸的發酵液，或者可以是經純化的形式。另外，“硫化物”可以是例如甲硫醇，該甲硫醇可以是甲基硫醇鈉(CH3S-Na)，以及氣體或液化狀態的甲硫醇(CH3SH)，和如國際專利公開號WO2010/098629中描述的形式的含有二甲硫醚的甲硫醇(DMS)；且甲硫醇也可以指含有能夠提供硫原子的形式的甲硫醇衍生物。另外，“O-乙醯高絲胺酸硫氫化酶或O-琥珀醯高絲胺酸硫氫化酶”可以是產生其的微生物的發酵液，或者可以是經純化形式。
所屬技術領域中具有通常知識者可以在本領域已知的最佳化培養條件和酶活性條件下輕易決定生產L-甲硫胺酸的方法。具體的培養方法和培養基如上所 述。
相較於包含野生型LysC的微生物，含有本公開的天冬胺酸激酶變體的微生物可以不抑制宿主細胞的生長而以高產率獲得天冬胺酸衍生的L-胺基酸或天冬胺酸衍生的產物。
第1圖顯示麩胺酸棒狀桿菌中天冬胺酸衍生的胺基酸及其胺基衍生物的生物合成途徑。
在下文中，將結合例示性實施例詳細描述本公開內容。然而，本文公開的例示性具體實施例僅用於說明目的，不應解釋為限制本公開的範圍。
實施例1：引入lysC變體的菌株的製備
如下所述，經由天冬胺酸激酶的結構模擬，選擇相較於野生型其活性可增強的變體，製備引入該變體的菌株。
在編碼衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032(以下稱為WT)的天冬胺酸激酶(SEQ ID NO：1)的基因lysC(SEQ ID NO：2)中，選擇位置377的胺基酸作為變異位點，並選擇L-離胺酸(其為鹼性胺基酸)和L-甲硫胺酸(其為非極性胺基酸)作為取代的其他胺基酸代表性實例。
為了製備引入變異的載體，以變異位點為 中心，設計了用於擴增5'上游區域的一對引子(SEQ ID NO：7和8或SEQ ID NO：7和10)和用於擴增3'下游區域的一對引子(SEQ ID NO：9和12或SEQ ID NO：11和12)(表1)。在SEQ ID NO：7和12的引子中，在每個尾端插入XbaI限制酶位點(下底線)。此外，在SEQ ID NO：8和9的一對引子或SEQ ID NO：10和11的一對引子中，將核苷酸取代變異(下底線)置於設計為彼此交叉的位點。
使用WT的染色體作為模板，以SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：7和10、SEQ ID NO：9和12、或SEQ ID NO：11和12的引子進行聚合酶連鎖反應(PCR)。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合30秒。之後，聚合反應在72℃進行7 分鐘。結果，以基因lysC的變異位點為中心，分別獲得5'上游區域的DNA片段(509bp)和3'下游區域的DNA片段(520bp)。
使用兩個擴增的DNA片段作為模板，以SEQ ID NO：7和12的引子進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合60秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，擴增了包含編碼天冬胺酸激酶變體(SEQ ID NO：3)的lysC基因變體(SEQ ID NO：4)的DNA片段(1011bp)，其中位置377的白胺酸被離胺酸取代。另外，為了證實位置377的胺基酸的重要性，也取得包含編碼天冬胺酸激酶變體(SEQ ID NO：5)的lysC基因變體的DNA片段(SEQ ID NO：6)(1011bp)，其中位置377的白胺酸被甲硫胺酸取代。
以限制酶XbaI處理載體pDZ(不能在麩胺酸棒狀桿菌中複製)(韓國專利No.0924065)和DNA片段(1011bp)，並用DNA連接酶連接，進行選殖並獲得質體。該質體命名為pDZ-lysC(L377K)和pDZ-lysC(L377M)。
使用電脈衝方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545)將載體pDZ-lysC(L377K)和pDZ-lysC(L377M)各自轉形到WT中，然後在含有康黴素(25mg/L)的LB培養基中獲得轉 形體菌株。獲得WT：：lysC(L377K)和WT：：lysC(L377M)菌株，其中經二級重組過程(交叉)插入染色體的DNA片段將核苷酸變異引入基因lysC中，並分別命名為麩胺酸棒狀桿菌CA01-2307和CA01-2308。CA01-2307和CA01-2308於2017年3月29日保藏在韓國微生物培養中心，該中心是布達佩斯條約下的國際保藏機構，並分配了登記號KCCM12000P和KCCM12001P。
實施例2：確認引入lysC變體的菌株生產天冬胺酸衍生的胺基酸的能力
為了比較從實施例1獲得的菌株CA01-2307和CA01-2308以及用於生產主要天冬胺酸衍生的胺基酸的WT菌株的能力，使用以下方法培養菌株，並且分析培養基中的組分。
將各菌株接種到含有種子培養基(25mL)的角擋板燒瓶(corner-baffle flask)(250mL)中，在37℃培養20小時，同時以200rpm振盪。將種子培養液(1mL)接種到含有生產培養基(24mL)的角擋板燒瓶(250mL)中，然後在37℃以200rpm振盪培養24小時。經由HPLC分析L-離胺酸和L-蘇胺酸的濃度，其為源自L-天冬胺酸和天冬胺酸的代表性的胺基酸，濃度的分析結果列在表2中。
<種子培養基(pH7.0)>
葡萄糖(20g)、蛋白腖(10g)、酵母提取物(5g)、尿素(1.5g)、KH2PO4(4g)、K2HPO4(8g)、MgSO4．7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、噻胺氯化物(1000μg)、泛酸鈣(2000μg)、菸鹼醯胺(2000μg)(於1L蒸餾水中)。
<生產培養基(pH 7.0)>
葡萄糖(100g)、(NH4)2SO4(40g)、大豆蛋白(2.5g)、玉米浸漬固體(5g)、尿素(3g)、KH2PO4(1g)、MgSO4．7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、噻胺氯化物(1000μg)、泛酸鈣(2000μg)、菸鹼醯胺(3000μg)、CaCO3(30g)(於1L蒸餾水中)。
分析天冬胺酸衍生的胺基酸濃度的結果，證實當引入lysC變異時，L-離胺酸的濃度顯著增加，L- 天冬胺酸和L-蘇胺酸的濃度與WT相比也有所增加。基於上述結果，以與上述相同的方式培養菌株CA01-2307、CA01-2308和WT，以詳細比較其產生離胺酸的能力。此外，以與上述相同的方式分析培養基中L-離胺酸濃度(表3)。
分析L-離胺酸濃度的結果，證實了由包含lysC(L377K)變異的CA01-2307生產的L-離胺酸的生產力如之前所評估相較於其來自WT菌株的產量大量增加。此外，證實了由包含lysC(L377M)變異的CA01-2308生產的L-離胺酸的生產力相較於其來自WT菌株的產量也增加。基於上述結果，證實由於天冬胺酸激酶變體(SEQ ID NO：3)(其在本公開中選擇了位置377的白胺酸被離胺酸取代)，和由於天冬胺酸激酶變體(SEQ ID NO：5)(其中位置377的白胺酸被甲硫胺酸取代)，天冬胺酸衍生的胺基酸中的L-離胺酸生產力 大幅增加。
實施例3：：L-蘇胺酸增強菌株的製備及L-蘇胺酸生產力的證實
為了清楚證實L-蘇胺酸生產力的變化，其係經由引入lysC(L377K)變異且於實施例2中確認具有更高離胺酸生產力，將變異引入編碼生產高絲胺酸的高絲胺酸脫氫酶的基因中，高絲胺酸為L-蘇胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸和高絲胺酸衍生物的生物合成途徑中常見的中間體。具體地，經由將本領域已知的hom(G378E)變體(Appl.Microbiol.Biotechnol.45,612-620(1996))引入實施例1中製備的CA01-2307菌株中來製備菌株。另外，還製備了將hom(G378E)變異引入WT的菌株作為對照組。為了製備引入hom(G378E)的載體，使用WT基因組DNA作為模板，以SEQ ID NO：13和14以及SEQ ID NO：15和16進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合30℃秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。
結果，以基因hom的變異為中心，獲得了5'上游區域的DNA片段(220bp)和3'下游區域的DNA片段(220bp)。使用這兩種PCR產物作為模板，以SEQ ID NO：13和16進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒， 55℃黏合30秒，和72℃聚合30℃秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，擴增了包含基因hom變異的DNA片段(440bp)。
以限制酶XbaI處理先前在實施例1中使用的載體pDZ和DNA片段(440bp)，並以DNA連接酶連接，然後進行選殖得到質體。該質體命名為pDZ-hom(G378E)。
使用電脈衝方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999,52：541-545))將載體pDZ-hom(G378E)導入WT和CA01-2307菌株中，然後在含有康黴素(25mg/L)的選擇性培養基中獲得轉形體菌株。獲得了WT：：hom(G378E)和CA01-2307：：hom(G378E)菌株，其係經由二次重組過程(交叉)插入染色體的DNA片段將核苷酸變異引入基因hom的菌株。為了比較WT：：hom(G378E)和CA01-2307：：hom(G378E)生產蘇胺酸的能力，以與實施例2相同的方式 培養菌株，分析培養基中蘇胺酸的濃度。
分析L-蘇胺酸濃度的結果，證實了包含lysC變異的菌株中L-蘇胺酸的生產力顯著增加(表5)。
實施例4：L-異白胺酸增強菌株的製備和L-異白胺酸生產力的比較
為了證實lysC(L377K)變異的引入對L-異白胺酸生產力的影響，製備本領域已知的，用於增強編碼L-蘇胺酸脫水酶基因的ilvA(V323A)變異表現的載體(Appl.Enviro.Microbiol.，1996年12月，p.43445-4351)。
為了製備引入ilvA基因變異的載體，以變異位點為中心，設計了用於擴增5'上游區的一對引子(SEQ ID NO：17和18)和用於放大3'下游區的一對引子(SEQ ID NOS：19 and 20)。在SEQ ID NO： 17和20的引子中，在每個末端插入BamHI限制酶位點(下劃線)。此外，在SEQ ID NO：18和19的引子中，核苷酸取代變異(下劃線)置於設計為彼此交叉的位點。
使用WT的染色體作為模板，用SEQ ID NO：17和18以及SEQ ID NO：19和20的引子進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合30℃秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，以基因ilvA的變異位點為中心，獲得5'上游區域的DNA片段(627bp)和3'下游區域的DNA片段(608bp)。
使用兩個擴增的DNA片段作為模板，以SEQ ID NO：17和20的引子進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合60℃秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，擴增了包含編碼IlvA變體的ilvA的基因變異的DNA片段(1217bp)，其中 位置323的纈胺酸被丙胺酸取代。
以限制酶BamHI處理pECCG117載體(韓國專利號10-0057684)和DNA片段(1011bp)，並以DNA連接酶連接，然後選殖得到質體。該質體命名為pECCG117-ilvA(V323A)。
將pECCG117-ilvA(V323A)載體引入到實施例3中製備的WT：：hom(G378E)和CA01-2307：：hom(G378E)菌株中，使用電脈衝方法，然後塗抹在含有康黴素(25mg/L)的選擇性培養基以獲得轉形株。
以與實施例2中所示相同的燒瓶培養方法培養菌株，並分析培養基中L-異白胺酸的濃度(表7)。
分析L-異白胺酸濃度結果，證實在包含lysC變異的菌株中L-異白胺酸的生產力大幅增加。
實施例5：O-乙醯高絲胺酸增強菌株的製備和O-乙醯高絲胺酸的生產力比較
為了確定引入lysC(L377K)變異對生產O-乙醯高絲胺酸的影響，刪除了編碼參與O-乙醯高絲胺酸降解途徑的胱硫醚γ-合成酶的metB基因及編碼O-乙醯高絲胺酸(硫醇)裂解酶的metY基因，然後過度表現編碼高絲胺酸O-乙醯轉移酶(其係O-乙醯高絲胺酸生物合成酶)的metX基因，而製備生產O-乙醯高絲胺酸的菌株。首先，為了刪除基因metB，根據該基因的核苷酸序列資訊(來自WT的metB)，設計了一對用於擴增基因metB的5'上游區域的引子(SEQ ID NO：21和22)，及用於擴增3'下游區域的引子(SEQ ID NO：23和24)。
使用WT的染色體作為模板，用SEQ ID NO：21和22，SEQ ID NO：23和24的引子進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，72℃聚合90秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，獲得了 metB基因的5'上游區域的DNA片段(450bp)和3'下游區域的DNA片段(467bp)。
使用兩個擴增的DNA片段作為模板，用SEQ ID NO：21和24的引子進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合3分鐘。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，缺失了metB基因的中心區域，因此擴增了僅包括上游和下游尾端的DNA片段(917bp)。
以限制酶XbaI處理pDZ載體和DNA片段(917bp)，以DNA連接酶連接，然後選殖得到質體。該質體命名為pDZ-△metB。
使用電脈衝方法將載體pDZ-△metB引入實施例3中製備的WT：：hom(G378E)和CA01-2307：：hom(G378E)菌株中，然後從含有康黴素(25mg/L)的選擇性培養基中獲得轉形株。獲得了WT：：hom(G378E)△metB和CA01-2307：：hom(G378E)△metB，其係經由二次重組過程(交叉)插入染色體上的DNA片段而缺失metB基因的菌株。
為了刪除參與O-乙醯高絲胺酸另一個降解途徑的metY基因，根據該基因的核苷酸序列資訊(來自WT的metY)，設計了一對用於擴增metY基因5'上游區域的引子(SEQ ID NO：25和26)和一對用於擴增3'下游區域的引子(SEQ ID NO：27和28)。
使用WT的染色體作為模板，以SEQ ID NO：25和26，SEQ ID NO：27和28進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，72℃聚合90秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，獲得了metY基因的5'上游區域的DNA片段(512bp)和3'下游區域的DNA片段(520bp)。
使用兩個擴增的DNA片段作為模板，以SEQ ID NO：25和28的引子進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合3分鐘。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，缺失了metY基因的中心區域，因此擴增了僅包括上游和下游尾端的DNA片段(1032bp)。
以限制酶XbaI處理pDZ載體和DNA片 段(1032bp)，以DNA連接酶連接，然後基因選殖得到質體。該質體命名為pDZ-△metY。
使用電脈衝法將pDZ-△metY載體導入上述製備的WT：：hom(G378E)△metB和CA01-2307：：hom(G378E)△metB菌株中，然後在含有康黴素(25mg/L)的選擇性培養基中獲得轉形株。獲得了WT：：hom(G378E)△metB△metY和CA01-2307：：hom(G378E)△metB△metY菌株，其係經由二次重組過程(交叉)插入染色體的DNA片段而刪除metY基因。
為了最大化O-乙醯高絲胺酸的產生，製備用於增強metX基因表現的載體。為了擴增編碼高絲氨酸O-乙醯轉移酶(MetX)的基因，根據報導的WT衍生序列，經由在引子的兩端插入BamHI限制酶區域(SEQ ID NO：29和30)設計載體，從啟動子區域(起始密碼子上游約300bp)擴增至終止子區域(終止密碼子下游約100bp)。
使用WT的染色體作為模板，用SEQ ID NO：25和26的引子進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合90℃秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，獲得了包含met X基因的DNA片段(1546bp)。
以限制酶BamHI處理pECCG117載體(韓國專利No.10-0057684)和metX的DNA片段，以DNA連接酶連接，然後選殖得到質體。該質體命名為pECCG117-metX。
使用電脈衝法將pECCG117-metX載體引入上述製備的WT：：hom(G378E)△metB△metY和CA01-2307：：hom(G378E)△metB△metY菌株中，然後塗抹在含有康黴素(25mg/L)選擇性培養基上獲得轉形株。
為了比較上述用於生產O-乙醯高絲胺酸而製備的菌株(下文稱為O-AH)的能力，使用以下方法培養菌株，並分析培養基中O-乙醯高絲胺酸的濃度。
將菌株的一個鉑環接種到含有O-AH生產培養基(25mL)的角擋板燒瓶(250mL)中，並在37℃培養20小時，同時以200rpm振盪。以HPLC分析O-乙醯高絲胺酸的濃度，分析後的濃度示於表11中。
<O-AH生產培養基(pH 7.0)>
葡萄糖(100g)、(NH4)2SO4(40g)、大豆蛋白 (2.5g)、玉米浸漬固體(5g)、尿素(3g)、KH2PO4(1g)、MgSO4．7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、鹽酸噻胺(1000μg)、泛酸鈣(2000μg)、菸鹼醯胺(3000μg)、CaCO3(30g)，L-甲硫胺酸(0.3g)(於1L蒸餾水中)。
如上表所示的O-乙醯高絲胺酸的分析濃度，結果證實由lysC變異產生的O-乙醯高絲胺酸的濃度增加。
實施例6：O-琥珀醯高絲胺酸增強菌株的製備和O-琥珀醯高絲胺酸的生產力比較
為了確定引入lysC(L377K)變異對O-琥珀醯高絲胺酸產生的影響，製備了生產O-琥珀醯高絲胺酸的菌株。由於野生型麩胺酸棒狀桿菌天然不產生O-琥珀醯高絲胺酸，經由取代在O-乙醯轉移酶受質結合區域的胺基酸， 將菌株修飾為具有O-琥珀醯轉移酶(MetX)的活性，該O-乙醯轉移酶係於實施例5中製備，以生產O-琥珀醯高絲胺酸。因此，根據WT衍生的metX基因的序列，設計了一對引子(SEQ ID NO：31和32)以製備用於引入metX變異的載體。
使用WT的染色體作為模板，以SEQ ID NO：27和28的引子進行PCR。在95℃變性5分鐘後，PCR在以下條件進行總共30個循環：95℃變性30秒，55℃黏合30秒，和72℃聚合90℃秒。此後，聚合反應在72℃進行7分鐘。結果，獲得了metX基因的編碼區的DNA片段(1146bp)。
以限制酶XbaI處理pDZ載體和DNA片段(1146bp)，以DNA連接酶連接，然後選殖得到質體。質體命名為pDZ-metX。根據pDZ-metX載體，為了製備變異載體，其中位置176的胺基酸被天冬醯胺酸取代，位置313的胺基酸被精胺酸取代，並設計一對導致位置176的胺基酸變異的引子(SEQ ID NOS：33和34)， 以及引起位置313的胺基酸變異的一對引子(SEQ ID NO：35和36)。
使用定點誘變試劑盒(Stratagene，USA)以及上述各引子製備metX變體基因。將根據現有野生型pDZ-metX質體的轉形質體命名為pDZ-metX(Q176N，L313R)。使用電脈衝法將上述製備的pDZ-metX(Q176N，L313R)載體轉形到實施例5中製備的菌株WT：：hom(G378E)△metB△metY和CA01-2307：：hom(G378E)△metB△metY中，然後在含有康黴素(25mg/L)的選擇性培養基中獲得轉形體菌株。獲得WT：：hom(G378E)metX(Q176N，L313R)△metB△metY和CA01-2307：：hom(G378E)metX(Q176N，L313R)△metB△metY菌株，其中經由二級重組過程(交叉)插入染色體的DNA片段將metX基因取代為metX(Q176N，L313R)。
為了最大化O-琥珀醯高絲胺酸的產生，製 備用於增強metX(Q176N，L313R)基因變體表現的載體。根據實施例5中製備的pECCG117-metX，使用SEQ ID NO：33至36的引子製備過度表現metX變體的載體，其中具有O-琥珀醯轉移酶活性的位置176的變體胺基酸被天冬醯胺取代，位置313的胺基酸被精胺酸取代。具體地，使用定點誘變試劑盒(Stratagene，USA)和每個引子製備載體，並將製備的載體命名為pECCG117-metX(Q176N，L313R)。
用電脈衝法將pECCG117-metX(Q176N，L313R)和空pECCG117載體引入WT：：hom(G378E)metX(Q176N，L313R)△metB△metY和CA01-2307：：hom(G378E)metX(Q176N，L313R)△metB△metY，其係上述製備為生產O-琥珀醯高絲胺酸的菌株，並塗抹在含有康黴素(25mg/L)的選擇培養基上以獲得轉形株。
為了比較菌株生產O-琥珀醯高絲胺酸的能力，使用以下方法培養菌株，並分析培養基中O-琥珀醯高絲胺酸的濃度。
將菌株的一個鉑環接種到含有與實施例5中使用的相同O-AH生產培養基組合物(25mL)的角落擋板燒瓶(250mL)中，並在以200rpm振盪的同時在37℃培養20小時。以HPLC分析O-琥珀醯高絲胺酸的濃度，分析的濃度示於表14中。
分析如上表所示的O-琥珀醯高絲胺酸的濃度，結果證實由lysC變化生產的O-琥珀醯高絲胺酸的生產增加。
這些結果表明，本公開的變體可以增加天冬胺酸衍生的胺基酸和/或其衍生物的生產。
根據前述內容，所屬技術領域中具有通常知識者將能夠理解，本公開可以在不更動本公開的技術概念或必須特徵的情況下以其他特定形式實施。因此，本文公開的例示性實施例僅用於說明目的，不應被解釋為限制本公開的範圍。相反地，本公開不僅涵蓋例示性實施例，還包括在本公開的精神和範圍內由所附權利要求限定的的各種替換、修改、均等物和其他實施例。
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Claims (10)

  1. 一種天冬胺酸激酶變體，其中SEQ ID NO：1的胺基酸序列中位置377的胺基酸被L-離胺酸或L-甲硫胺酸取代。
  2. 一個編碼如申請專利範圍第1項所述的天冬胺酸激酶變體的多核苷酸。
  3. 一種棒狀桿菌屬微生物，其生產包含如申請專利範圍第1項所述的天冬胺酸激酶變體的天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的棒狀桿菌屬微生物，其中該天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基衍生物選自由以下所成群組：離胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸、高絲胺酸、 O-乙醯高絲胺酸、 O-琥珀醯高絲胺酸、異白胺酸和屍胺。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的棒狀桿菌屬微生物，其中該狀桿菌屬微生物係麩胺酸棒狀桿菌。
  6. 一種生產天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基酸衍生物的方法，包含：在培養基中培養如申請專利範圍第3項所述的棒狀桿菌屬微生物；和從培養的微生物或培養基中回收該天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基衍生物。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該天冬胺酸衍生的L-胺基酸或其胺基衍生物選自由以下所成群組： 離胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸、高絲胺酸、 O-乙醯高絲胺酸、 O-琥珀醯高絲胺酸、異白胺酸和屍胺。
  8. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該棒狀桿菌屬微生物係麩胺酸棒狀桿菌。
  9. 一種生產L-甲硫胺酸的方法，包含：在培養基中培養如申請專利範圍第3項所述的棒狀桿菌屬微生物；從培養的微生物或培養基中生產 O-乙醯高絲胺酸或 O-琥珀醯高絲胺酸；和轉換該 O-乙醯高絲胺酸或 O-琥珀醯高絲胺酸成L-甲硫胺酸。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中該棒狀桿菌屬微生物係麩胺酸棒狀桿菌。
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