KR20190003019A - 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법 - Google Patents

신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 아스파토키나제 변이체, 상기 변이체를 포함하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 호모세린 유도체의 생산방법에 관한 것이다.

Description

신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산의 제조방법 {Novel aspartokinase variant and method of producing L-amino acid using thereof}
본 출원은 아스파토키나제 변이체, 상기 변이체를 포함하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 (Corynebacterium sp .) 속 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를들어, L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다 (대한민국 등록특허 제10-0838038호).
한편, L-아미노산 중에서 L-라이신, L-쓰레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글리신은 아스파테이트(aspartate, 이하 Asp)유래의 아미노산들로 Asp에서 아스파토키나제(aspartokinase, 이하, LysC, E.C. 2.7.2.4)에 의해 생성된 아스파틸 포스페이트(Aspartyl phosphate, 이하 App)를 공통적으로 이용한다(도 1). 따라서 상기 아미노산들을 미생물 발효법으로 생산하기 위해서 생합성 경로에서 이용되는 효소들의 활성을 일정 수준 이상으로 유지하는 것은 필수적이며, 이에 대한 집중적인 연구가 이루어져 왔다.
특히, 아스파테이트 유래의 아미노산들의 생합성 경로의 첫번째 효소로 작용하는 LysC는 L-라이신 및 L-쓰레오닌에 피드백 저해에 의해 활성이 조절되는 것으로 알려져 있다(J Mol Biol . 2007 Apr 27;368(2):521-36. Epub 2007 Feb 20). 이에 상기 피드백 저해에 관련된 출원이 있었으나(미국특허등록번호 US 8062869 B, JP 3473042 B) 아스파테이트 유래 산물의 생산능 증가를 위해 지속적인 연구가 여전히 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 신규한 아스파토키나제 변이체가 개량된 효소 활성 및 이를 이용할 경우 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 377번째 아미노산이 L-라이신 또는 L-메치오닌으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 아스파토키나제 변이체를 포함하거나 이의 활성이 강화된, 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 아세틸호모세린 또는 숙시닐호모세린를 생산하는 단계; 및 상기 아세틸호모세린 또는 숙시닐호모세린을 메티오닌으로 전환 하는 단계를 포함하는 메티오닌의 생산 방법을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 377번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "아스파토키나제 (aspartokinase, aspartic kinase)"는 아미노산 아스파테이트의 인산화를 촉매하는 효소로서, "aspartate family"로 알려진 L-메티오닌, L-라이신 및 L-쓰레오닌의 3 가지 필수 아미노산 생합성의 첫 번째 단계에 작용한다.
본 출원에서 아스파토키나제는, "LysC" 또는 "LysC 단백질"과 혼용될 수 있다. 상기 LysC 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 상기 LysC 단백질은 코리네박테리움 속 유래 LysC일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 유래 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 출원에서의 LysC은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 폴리펩타이드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에 있어서, LysC(aspartokinase)를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 그 방법의 예로는 효소 발현에 통상적으로 널리 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에서 효소를 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "아스파토키나제 변이체"는 구체적으로, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp .) 미생물 유래 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 LysC의 N-말단으로부터 377번째 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 '다른 아미노산'은 377번째 아미노산인 L-류신을 제외한 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 구체적으로, 대표적인 예를 들어, 상기 377번째 아미노산 잔기는 라이신(lysine) 또는 메치오닌 (methionine)으로 치환될 수 있다. L-라이신은 염기성 아미노산의 예로서, 염기성 아미노산은 L-라이신, L-알지닌 및 L-히스티딘 중 하나 일 수 있다. L-메티오닌은 비극성 아미노산의 예로서, 비극성 아미노산은 L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-알라닌, L-시스테인, L-글리신, L-이소류신, L-류신, L-프롤린, L-트립토판 및 L- 발린 중 어느 하나 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "아스파토키나제 변이체"는 "변이된 아스파토키나제" 또는 "변이된 LysC"로 혼용될 수 있다.
이와 같은 아스파토키나제 변이체는 서열번호 1의 아스파토키나제의 활성을 갖는 폴리펩타이드에 비해 아스파토키나제 활성이 강화된 특징을 갖는다.
또한, 본원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질'이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (synonymous mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 "아스파토키나제 변이체"에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
상기 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호1의 아미노산 서열에서 377번째 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 대표적인 예를 들어, 서열번호1의아미노산 서열에서 377번째 아미노산 잔기가 다른 L-라이신 또는 L-메티오닌으로 치환된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 5로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 lysC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이와 상동성을 가지는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브(probe), 예를 들면, 상기 폴리뉴크레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 아스파토키나제 변이체를 포함하는 숙주세포 및 상기 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 본 출원은 상기 아스파토키나제 변이체를 포함하는, 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.
상기 본 출원의 아스파토키나제 변이체를 포함하는 미생물은 야생형 또는비 변형 미생물에 비해 아스파토키나제의 활성이 강화된 특징을 갖는다.
본 출원에서 용어, "활성의 강화"는 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 자연적 혹은 인위적으로 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 나타나게 되는 것을 의미한다. "내재적 활성"은, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 미생물" 이란, 자연적으로 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산능이 없는 모균주에 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다.
본 출원에서 용어, '아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체'는 아스파테이트(Aspartic acid)를 전구체로하여 생합성할 수 있는 물질을 의미하며, '아스파테이트 유래 산물'과 혼용될 수 있다. 상기 '아미노산 유도체'는 L-아미노산으로부터 생산될 수 있는 물질 및 L-아미노산의 전구체를 포함하는 의미이며, 아스파테이트를 전구체로 하여 생합성 과정를 통해 생산될 수 있는 물질이라면 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 아세틸 포스페이트를 공통적으로 사용하여 합성되는 물질은 제한없이 포함된다. 예를 들어, L-라이신, L-쓰레오닌, L-메티오닌, L-글리신, 호모세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, O-포스포호모세린, L-이소류신, 및 카다베린 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
카다베린은 아스파테이트를 전구체로 하여 직접 생합성 될 수도 있으며, 라이신 디카르복실라제에 의해 라이신으로부터 생성될 수도 있다. 상기 L-메티오닌은 아스파테이트를 전구체로 하여 직접 생합성 될 수도 있으며, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린으로부터 전환되어 생성될 수도 있다.
본 출원에서 용어 "아스파테이트 (Aspartic acid)는 Asp 또는 D로 약칭되며, 아스파르트 산으로, 단백질의 생합성에 사용되는 α-아미노산이다. 다른 모든 아미노산과 마찬가지로 아미노기와 카르복실산이 포함되어 있다. 일반적으로 아스파테이트는 아스파토키나제(LysC)에 의해 아스파틸 포스페이트(Aspartyl phosphate)로 생성된 뒤, 생체 내에서 L-라이신, L-메티오닌, L-호모세린, L-쓰레오닌, L-이소류신 등으로 변환될 수 있다.
상기 아스파테이트 유래 산물의 생합성을 강화하기 위하여, 본 출원의 아스파토키나제 변이체를 이용할 수 있다. 예를 들어, L-라이신, L-쓰레오닌, L-메티오닌, L-글리신, 호모세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, O-포스포호모세린, L-이소류신 및 카다베린의 생합성을 강화하기 위하여 본 출원의 아스파토키나제 변이체를 도입하거나 이의 활성을 강화할 수 있다. 또한, 추가적으로, 특정 단백질의 활성을 도입 또는 강화하거나, 특정 단백질의 활성을 불활성화함으로써 아스파테이트 유래 산물의 생산능을 보다 더 향상시킬 수 있다.
상기 특정 단백질의 활성을 도입, 강화, 불활성화 하는 방법은 미생물이 가진 특징에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 아스파테이트 유래 산물, L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 미생물은 본 출원의 아스파테이트 변이체 포함하여 아스파테이트 유래 '아미노산' 또는 아미노산 유도체를 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 구체적 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 기술된 미생물을 배양하는 단계 및 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건 에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20℃ 내지 45℃ , 구체적으로는 25℃ 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 아스파테이트 유래 아미노산 또는 아미노산 유도체는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 아스파테이트 유래 아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 아스파테이트 유래 아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 추가적으로 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 기술된 미생물을 배양하는 단계; 상기 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 생산하는 단계; 및 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 L-메티오닌으로 전환하는 단계를 포함하는, L-메티오닌을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로 상기 'L-메티오닌으로 전환하는 단계'는 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린과 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 황화물의 존재하 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 'O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린'은, 본 출원의 기술된 미생물이 생산한 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 함유한 발효액이거나, 정제된 형태일 수 있다. 또한 상기의 '황화물'은 예를 들어 메틸머캅탄일 수 있고, 상기 메틸머캅탄은 액상의 소디움메틸머캅탄(sodium methyl mercaptan, CH3S-Na) 형태, 가스 또는 액화 상태의 메틸머캅탄(CH3SH) 뿐만 아니라 국제 공개특허 제WO2010/098629호에 언급된 형태로 디메칠설파이드(DMS, Dimethylsulfide)를 포함한 메틸머캅탄 등 황 원자를 제공할 수 있는 형태를 포함하고 있는 메틸머캅탄 유도체 모두를 의미할 수 있다. 또한 상기 'O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제'는 이를 생산하는 미생물의 발효액이거나, 정제된 형태일 수 있다.
상기 L-메티오닌을 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적인 배양 방법 및 배지는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에 따른 아스파토키나제 변이체를 포함하는 미생물은, 야생형 LysC 폴리펩티드를 포함하는 미생물에 비하여 숙주세포의 성장 저해 없이 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아스파테이트 유래 산물을 고수율로 수득할 수 있다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 아스파테이트 유래 아미노산 및 아미노산 유도체 생합성 경로를 나타낸 것이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 실시예 1: lysC 변이 도입 균주 제작
아스파토키나제 단백질의 구조 모델링을 통해 야생형보다 활성이 강화될 수 있는 변이를 선별하였으며, 하기와 같이 상기 변이를 도입한 균주를 제작 하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(이하 WT) 유래의 아스파토키나제(서열번호 1)를 코딩하는 lysC 유전자(서열번호 2)를 대상으로 377번째 아미노산을 변이위치로 선정하였으며, 치환하기위한 다른 아미노산의 대표적인 예로, 염기성 아미노산인 L-라이신과, 비극성 아미노산인 L-메티오닌을 선정하였다.
상기 변이 도입 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 7 및 8 혹은 서열번호 7 및 10) 및 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 9 및 12 혹은 서열번호 11 및 12)을 고안하였다(표 1). 서열번호 7 및 12의 프라이머는 각 말단에 XbaⅠ 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 8 및 9의 프라이머 한쌍 혹은 서열번호 10 및 11의 프라이머 한쌍은 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
7 Primer 1 tcctctagaGCTGCGCAGTGTTGAATACG
8 Primer 2 TGGAAATCttTTCGATGTTCACGTTGACAT
9 Primer 3 ACATCGAAaaGATTTCCACCTCTGAGATTC
10 Primer 4 TGGAAATCATTTCGATGTTCACGTTGACAT
11 Primer 5 ACATCGAAATGATTTCCACCTCTGAGATTC
12 Primer 6 gactctagaGTTCACCTCAGAGACGATTA
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8 혹은 서열번호 7 및 서열번호 10, 서열번호 9 및 서열번호 12 혹은 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 509 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 520 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 7 및 서열번호 12의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체(서열번호 3)를 코딩하는 lysC 유전자의 변이(서열번호 4)를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 또한, 377번째 아미노산 위치의 중요성을 확인하기 위하여, 377번째 루신이 메치오닌으로 치환된 아스파토키나제 변이체(서열번호 5)를 코딩하는 lysC 유전자의 변이(서열번호 6)를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(한국 등록특허 제0924065호)와 1011 bp의 DNA 단편들을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-lysC(L377K)과 pDZ-lysC(L377M)라 명명하였다.
pDZ-lysC(L377K)과 pDZ-lysC(L377M) 벡터를 각각 WT에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545)으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 LB 배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 lysC 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::lysC(L377K)과 WT::lysC(L377M)를 획득하였고, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2307 과 CA01-2308이라 각각 명명하였다. 이 중 CA01-2307과 CA01-2308은 2017년 3월 29일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12000P 및 KCCM12001P를 부여받았다.
실시예 2. lysC 변이 도입 균주의 아스파테이트 유래 아미노산 생산능 확인
상기 실시예에서 획득한 CA01-2307 및 CA01-2308 균주와 WT 균주의 아스파테이트 유래 주요 아미노산 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 성분을 분석하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각각 균주를 접종하고, 37℃ 에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 37℃ 에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 L-아스파테이트, 아스파테이트 유래 대표적인 아미노산인 L-라이신 및 L-쓰레오닌 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 [표 2]와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 ·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 ·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
CA01-2307 및 CA01-2308 균주의 아스파테이트 유래 아미노산 생산 농도
균주/농도 L-아스파테이트
(mg/L)		 L-라이신
(mg/L)		 L-쓰레오닌
(mg/L)
WT 20.3 8.0 340.3
CA01-2307 29.7 3647.7 402.7
CA01-2308 30.2 1572.3 385.4
아스파테이트 유래 아미노산 농도 분석 결과, lysC 유전자 변이 도입시 WT과 비교하여 특히 L-라이신 농도가 급격히 증가하고 L-아스파테이트와 L-쓰레오닌 농도가 증가되는 패턴을 확인하였다. 상기의 결과를 바탕으로 CA01-2307 및 CA01-2308 균주와 WT 균주의 라이신 생산능을 상세 비교하고자 상기와 동일한 방법으로 배양하였으며, 배양액 중의 L-라이신 농도를 상기와 동일한 방법으로 분석하였다[표 3].
WT와 CA01-2307 및 CA01-2308 균주의 라이신 생산 농도
균주/농도 L-라이신
(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT 0.008 0.007 0.008
CA01-2307 3.664 3.665 3.598
CA01-2308 1.523 1.475 1.666
L-라이신 농도 분석 결과, 기존 평가와 동일하게 WT 균주 대비 lysC(L377K) 변이를 포함하고 있는 CA01-2307의 L-라이신 생산능이 크게 증가함을 확인하였다. 또한 lysC(L377M) 변이를 포함하고 있는 CA01-2308의 L-라이신 생산능도 WT 균주 대비 증가함을 확인하였다. 상기의 결과를 바탕으로 본 출원에서 선별된 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체(서열번호 3)와 377번째 루신이 메치오닌으로 치환된 아스파토키나제 변이체(서열번호 5)에 의해 아스파테이트 유래 아미노산 중 L-라이신 생산능이 크게 증가함을 확인하였다.
실시예 3. L- 쓰레오닌 강화균주 제작 및 L- 쓰레오닌 생산능 확인
상기 실시예 2의 결과로부터 확인된, 보다 높은 라이신 생산능을 가진 lysC(L377K) 변이 도입에 의한 L-쓰레오닌 생산능 변화를 명확히 확인하기 위하여, L-쓰레오닌, L-이소류신, L-메치오닌 및 Homoserine 유도체 생합성 경로의 공통적 중간체인 호모세린(homoserine)을 생산하는 호모세린 디하이드로게나제(homoserin dehydrogenase)를 코딩하는 유전자에 변이를 도입하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 제작된 CA01-2307 균주에 기 공지된 hom(G378E) 변이(Appl . Microbiol . Biotechnol.　45, 612-620 (1996))가 도입된 균주를 제작하였다. 또한 이의 대조군으로 WT에 hom(G378E) 변이가 도입된 균주도 제작하였다. hom(G378E)를 도입하는 벡터를 제작하기 위하여 WT genomic DNA를 주형으로 서열변호 13과 14, 15과 16를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 220 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 220 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 이 두 개의 PCR product를 주형으로 서열번호 13과 16를 이용하여 PCR을 진행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, hom 유전자의 변이를 포함하는 440 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
13 Primer 7 tcctctagaCTGGTCGCCTGATGTTCTAC
14 Primer 8 GCCAAAACCtCCACGCGATC
15 Primer 9 ATCGCGTGGaGGTTTTGGCT
16 Primer 10 gactctagaTTAGTCCCTTTCGAGGCGGA
앞서 실시예 1에서 사용된 pDZ 벡터와 440 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-hom(G378E)라 명명하였다.
pDZ-hom(G378E) 벡터를 WT 및 CA01-2307균주에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999, 52:541-545)으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 hom 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::hom(G378E)과 CA01-2307::hom(G378E)를 획득하였다. 획득한 WT::hom(G378E)와 CA01-2307::hom(G378E)의 쓰레오닌 생산능을 비교하고자 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였고, 배양액 중의 쓰레오닌 농도를 분석하였다.
WT::hom(G378E)와 CA01-2307::hom(G378E) 균주의 쓰레오닌 생산 농도
균주/농도 L-쓰레오닌
(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT::hom(G378E) 0.456 0.475 0.432
CA01-2307::hom(G378E) 1.210 1.132 1.211
L-쓰레오닌 농도 분석 결과, lysC 변이를 포함하는 균주에서 L-쓰레오닌 생산능이 급격히 증가함을 확인하였다[표 5].
실시예 4. L-이소류신 강화 균주 제작 및 L-이소류신 생산능 비교
lysC(L377K)변이 도입에 의한 L-이소류신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 기 공지된 쓰레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자 ilvA(V323A) 변이(Appl . Enviro . Microbiol ., Dec. 1996, p.4345-4351) 발현을 강화하기 위한 벡터를 제작하였다.
ilvA 유전자를 대상으로 변이 도입 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 17 및 18)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 19 및 20)을 고안하였다. 서열번호 17 및 20의 프라이머는 각 말단에 BamHⅠ 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 18 및 19의 프라이머는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
17 Primer 11 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG
18 Primer 12 ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
19 Primer 13 CTGGTTCTGcCGTGGTGTGCATCATCTCTG
20 Primer 14 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 627 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 608 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 17 및 서열번호 20의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 323번째 발린이 알라닌으로 치환된 IlvA 변이체를 코딩하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1217 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 1011 bp의 DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117- ilvA(V323A) 라 명명하였다.
pECCG117-ilvA(V323A)벡터를 실시예3에서 제작된 WT::hom(G378E)와 CA01-2307::hom(G378E) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환주를 획득하였다.
실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-이소류신 농도를 분석하였다[표 7].
균주 L-이소류신
(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT::hom(G378E)/ pECCG117-ilvA(V323A) 0.102 0.072 0.062
CA01-2307::hom(G378E)/ pECCG117-ilvA(V323A) 0.876 0.900 0.918
L-이소류신 농도 분석 결과, lysC 변이를 포함하는 균주에서 L-이소류신 생산능이 크게 증가함을 확인하였다.
실시예 5: O-아세틸-호모세린 강화 균주 제작 및 O- 아세틸-호모세린 생산능 비교
lysC(L377K)변이 도입에 의한 O-아세틸-호모세린의 생산에 미치는 영향을 파악하기 위해 O-아세틸-호모세린 분해 경로인 시스타치오닌 감마-신타제를 코딩하는 metB 유전자와 O-아세틸호모세린 (티올)-라이아제를 코딩하는 metY 유전자를 결손하고 O-아세틸-호모세린 생합성 효소인 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 metX 유전자를 과 발현하여 O-아세틸-호모세린 생산균주를 제작하였다. 먼저 metB 유전자를 결손하기 위하여 WT 유래의 metB 유전자의 염기서열 정보를 기반으로 metB 유전자의 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 21 및 22)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 23 및 24)을 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
21 Primer 15 TCTAGATGCGCTGATTATCTCACC
22 Primer 16 ACTGGTGGGTCATGGTTGCATATGAGATCAACTCCTGTAA
23 Primer 17 TTACAGGAGTTGATCTCATATGCAACCATGACCCACCAGT
24 Primer 18 TCTAGACCTTGAAGTTCTTGACTG
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23, 및 서열번호 24의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metB 유전자의 5` 상단 부위의 450 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 467 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 21 및 서열번호 24의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, metB 유전자의 중앙부분이 결손되어 상단과 하단만 포함하는 917 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pDZ 벡터와 917 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-△metB라 명명하였다.
pDZ-△metB 벡터를 실시예3에서 제작된 WT::hom(G378E)와 CA01-2307::hom(G378E) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 metB 유전자가 결손된 균주인 WT::hom(G378E)△metB 와 CA01-2307::hom(G378E)△metB 를 획득하였다.
O-아세틸-호모세린의 또 하나의 분해경로인 metY 유전자를 결손하기 위하여 WT유래 metY 유전자의 염기서열 정보를 기반으로 metY 유전자의 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 25및 26)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 27 및 28)을 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
25 Primer 19 TCTAGAAGTAGCGTTGCTGTACAC
26 Primer 20 ATCAATGGTCTCGATGCCCATATGGCATTTGGAGGTCCTTAAG
27 Primer 21 CTTAAGGACCTCCAAATGCCATATGGGCATCGAGACCATTGAT
28 Primer 22 TCTAGATGGAACCGTTGCAACCAC
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 25 및 서열번호 26 서열번호 27, 및 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metY 유전자의 5` 상단 부위의 512 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 520 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 25 및 서열번호 28의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, metY 유전자의 중앙부분이 결손되어 상단과 하단만 포함하는 1032 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pDZ 벡터와 1032 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-△metY라 명명하였다.
pDZ-△metY 벡터를 상기에 제작된 WT::hom(G378E)△metB 와 CA01-2307::hom(G378E)△metB 균주에 각가 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 metY 유전자가 결손된 균주인 WT::hom(G378E)△metB△metY와 CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY 를 획득하였다.
O-아세틸-호모세린 생성 극대화를 위하여, metX 유전자 발현을 강화하기 위한 벡터를 제작하였다. 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제 (MetX) 코딩하는 유전자를 증폭하기 위하여 WT 유래 보고된 서열에 근거하여 프로모터 부위(개시코돈 상단 약 300bp) 로부터 터미네이터 부위(종결코돈 하단 약 100bp)까지 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 29 및 30)의 양 말단에 BamHI 제한 효소 부위를 삽입하여 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
29 Primer 23 ggatccCCTCGTTGTTCACCCAGCAACC
30 Primer 24 ggatccCAAAGTCACAACTACTTATGTTAG
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 25, 26번의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metX 유전자를 포함하는 1546 bp DNA 단편을 수득하였다.
pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 metX DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-metX라 명명하였다.
pECCG117-metX 벡터를 상기에 제작된 WT::hom(G378E)△metB△metY 와 CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 각각의 형질전환주를 획득하였다.
상기에 제작된 균주들 O-아세틸-호모세린(이하, O-AH) 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 O-아세틸호모세린 농도를 분석하였다.
O-AH 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 균주 1백금이를 접종하고, 37℃ 에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 O-아세틸-호모세린 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 [표 11]와 같다.
<O-AH 생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 ·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g, L-methionine 0.3g (증류수 1리터 기준).
균주 O-아세틸호모세린
(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT::hom(G378E)△metB△metY/pECCG117-metX 0.135 0.209 0.175
CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY/pECCG117-metX 2.312 2.045 2.532
상기의 결과에서 보듯이 O-아세틸호모세린 농도 분석 결과, lysC 변이에 의한 O-아세틸호모세린 생산이 증가됨을 확인하였다.
실시예 6: O-숙시닐호모세린 강화 균주 제작 및 O-숙시닐호모세린 생산능 비교
lysC(L377K)변이 도입에 의한 O-숙시닐호모세린의 생산능에 대한 영향성을 파악하기 위해 O-숙시닐호모세린 생산균주를 제작하였다. 코리네박테리아 글루타미쿰 야생형 균주의 경우 자연적으로 O-숙시닐호모세린을 생산하지 못하기 때문에 실시예5에서 제작된 O-아세틸 트랜스퍼라아제 (MetX) 효소의 기질 접합부위 아미노산 교체를 통해 O-숙시닐 트랜스퍼라아제 (MetA) 활성을 가지도록 변형시켜 O-숙시닐호모세린을 생성하고자 하였다. 이에 WT 유래의 metX 유전자 서열 기반으로 실시예 metX 변이을 도입하기 위한 벡터를 제작하기 위하여 프라이머 한쌍(서열번호 31 및 32)을 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
31 Primer 25 tctagaATGCCCACCCTCGCGCCTTC
32 Primer 26 tctagaTTAGATGTAGAACTCGATG
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 27과 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metX 유전자의 코딩 부위 1146 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
pDZ 벡터와 1146 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-metX라 명명하였다. pDZ-metX 벡터를 기반으로 176번째 아미노산이 아스파라긴으로 313번째 아미노산이 알지닌으로 치환되는 변이벡터를 만들기 위해 176 번째 변이부여 프라이머 한쌍 (서열번호 33 및 34)과 313번째 변이부여 프라이머 한쌍 (서열번호 35 및 36)을 고안하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
33 Primer 27 ACGCGCCAGCGCCTGGaacATCGGCATTCAATCCG
34 Primer 28 CGGATTGAATGCCGATgttCCAGGCGCTGGCGCGT
35 Primer 29 TAGATACCGATATTcgGTACCCCTACCACCAG
36 Primer 30 CTGGTGGTAGGGGTACcgAATATCGGTATCTAC
상기 각각의 프라이머와 함께 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene, 미국)을 이용하여 metX 변이 유전자를 제조하였다. 기존 야생형 플라스미드 pDZ-metX를 기반으로 한 변이형 플라스미드는 pDZ-metX(Q176N, L313R) 이라 명명하였다. 상기에 제작된 pDZ-metX(Q176N, L313R) 벡터를 실시예 5에서 제작된 WT::hom(G378E)△metB△metY와 CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 metX 유전자가 metX ( Q176N , L313R ) 로 교체된 WT::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY 와 CA01-2307::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY 균주를 획득하였다.
O-숙시닐-호모세린 생성 극대화를 위하여, metX(Q176N, L313R) 변이 유전자 발현을 강화하기 위한 벡터를 제작하였다. 실시예 5에서 제작한 pECCG117-metX 를 기반으로 O-숙시닐 트랜스퍼라아제 활성을 가지는 변이 176번째 아미노산이 아스파라긴으로 313번째 아미노산이 알지닌으로 치환하는 프라이머인 서열번호 (33~36)을 이용하여 변이 metX 과발현 벡터를 제작하였다. 구체적으로 각각의 프라이머와 함께 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene, 미국)을 이용하였고 벡터를 제작하였고 pECCG117-metX (Q176N, L313R) 이라 명명하였다.
pECCG117-metX (Q176N, L313R) 와 공벡터 pECCG117 벡터를 상기의 제작된O-숙시닐-호모세린 생산균주인 WT::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY 와 CA01-2307::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY 에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환주를 획득하였다.
상기 균주의 O-숙시닐호모세린 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 O-숙시닐호모세린 농도를 분석하였다.
실시예 5에서 사용한 동일한 O-AH 생산배지 조성으로 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 균주 1백금이를 접종하고, 37℃ 에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 O-숙시닐호모세린 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 [표 14]와 같다.
균주 O-숙시닐호모세린
(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
WT::hom(G378E)metX((Q176N, L313R)△metB△metY/ pECCG117-metX(Q176N, L313R) 0.052 0.120 0.087
CA01-2307::hom(G378E)△metB△metY/ pECCG117-metX(Q176N, L313R) 1.529 1.632 1.874
상기의 결과에서 보듯이 O-숙시닐호모세린 농도 분석 결과, lysC 변이에 의한 O-숙시닐호모세린 생산이 증가됨을 확인하였다.
이상의 결과들은 본 발명의 변이체가 아스파테이트 유래 아미노산 및/또는 이의 유도체의 생산을 증가시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12000P
수탁일자 : 20170329
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<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel aspartokinase variant and method of producing L-amino acid using thereof <130> KPA170270-KR <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 2 <211> 1266 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 3 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 4 <211> 1266 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga 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tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaaaa gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 5 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Met Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 6 <211> 1266 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaaat gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 7 tcctctagag ctgcgcagtg ttgaatacg 29 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 8 tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 9 acatcgaaaa gatttccacc tctgagattc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 10 tggaaatcat ttcgatgttc acgttgacat 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 11 acatcgaaat gatttccacc tctgagattc 30 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 12 gactctagag ttcacctcag agacgatta 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 13 tcctctagac tggtcgcctg atgttctac 29 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 14 gccaaaacct ccacgcgatc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 15 atcgcgtgga ggttttggct 20 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 16 gactctagat tagtcccttt cgaggcgga 29 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 17 acggatccca gactccaaag caaaagcg 28 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 18 acaccacggc agaaccaggt gcaaaggaca 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 13 <400> 19 ctggttctgc cgtggtgtgc atcatctctg 30 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14 <400> 20 acggatccaa ccaaacttgc tcacactc 28 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15 <400> 21 tctagatgcg ctgattatct cacc 24 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 16 <400> 22 actggtgggt catggttgca tatgagatca actcctgtaa 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 17 <400> 23 ttacaggagt tgatctcata tgcaaccatg acccaccagt 40 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 18 <400> 24 tctagacctt gaagttcttg actg 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 19 <400> 25 tctagaagta gcgttgctgt acac 24 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 20 <400> 26 atcaatggtc tcgatgccca tatggcattt ggaggtcctt aag 43 <210> 27 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 21 <400> 27 cttaaggacc tccaaatgcc atatgggcat cgagaccatt gat 43 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 22 <400> 28 tctagatgga accgttgcaa ccac 24 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 23 <400> 29 ggatcccctc gttgttcacc cagcaacc 28 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 24 <400> 30 ggatcccaaa gtcacaacta cttatgttag 30 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> 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Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 377번째 아미노산이 L-라이신 또는 L-메치오닌으로 치환된 아스파토키나제 변이체.
  2. 제1항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1항의 아스파토키나제 변이체를 포함하는 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체는 라이신, 쓰레오닌, 메티오닌, 호모세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, 이소류신, 및 카다베린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것인 코리네박테리움속 미생물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 미생물.
  6. 제3항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아스파테이트 유래 L-아미노산 또는 아미노산 유도체는 라이신, 쓰레오닌, 메티오닌, 호모세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, 이소류신, 및 카다베린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것인 생산 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 생산 방법.
  9. 제3항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계;
    상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 생산하는 단계; 및
    상기 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린을 L-메티오닌으로 전환하는 단계를 포함하는 L-메티오닌 생산 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 생산 방법.

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