SK279915B6 - Dna kódujúca aspartokinázu iii, transformovaný mik - Google Patents

Dna kódujúca aspartokinázu iii, transformovaný mik Download PDF

Info

Publication number
SK279915B6
SK279915B6 SK819-94A SK81994A SK279915B6 SK 279915 B6 SK279915 B6 SK 279915B6 SK 81994 A SK81994 A SK 81994A SK 279915 B6 SK279915 B6 SK 279915B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
mutation
lysc
replaced
dna
lysine
Prior art date
Application number
SK819-94A
Other languages
English (en)
Other versions
SK81994A3 (en
Inventor
Konosuke Sano
Hiroyuki Kojima
Yuri Ogawa
Original Assignee
Ajinomoto Co.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co. filed Critical Ajinomoto Co.
Publication of SK81994A3 publication Critical patent/SK81994A3/sk
Publication of SK279915B6 publication Critical patent/SK279915B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Description

Oblasť techniky
Opisovaný vynález, ktorý má význam pre mikrobiologický priemysel, sa týka DNA kódujúcej aspartokinázu III, transformovaného mikroorganizmu a fermentačného spôsobu výroby L-treonínu. L-treonin je esenciálna aminokyselina, ktorá sa používa ako súčasť do rôznych výživových zmesí na lekárske účely. Ďalej sa používa ako doplnok výživy pre zvieratá, ako reagencia vo farmaceutickom a chemickom priemysle, ako rastový faktor pri produkcii aminokyseliny, akými sú napr. lyzín či homoserín, pôsobením mikroorganizmov.
Doterajší stav techniky
V minulosti sa na produkciu L-treonínu fermentáciou využívali baktérie izolované z ich prirodzeného prostredia, či umelé mutanty takýchto baktérií. Sú známe mnohé umelé mutanty produkujúce L-treonín; väčšina z nich je rezistentná proti kyseline α-amino-B-hydroxyvalérovej a patrí k rodu Escherichia, Serratia, Brevibacterium či Corynebacterium. Pokiaľ ide o rod Escherichia, metódy produkcie L-treonínu baktériami transformovanými rekombinovanými plazmidmi obsahujúcimi treonínové operóny sú opísané v JPA 55 - 131397, JPA 59-31691, JPA 56-15696 a v JPW 3-501682.
Najvyššiu hladinu produkcie treonínu a spotrebný koeficient zo všetkých doteraz známych baktérií produkujúcich treonín mal rovnako kmeň Escherichia coli (VKPM) B-3996 (JPW 3-501682). Podľa opisovaného vynálezu predstavuje spotrebný koeficient'' počet gramov cukru potrebný na vyprodukovanie jedného gramu treonínu. Ak je táto baktéria kultivovaná v pokusnom fermentore pri pridávaní cukru a amoniaku ku kultúre v závislosti od hodnoty signálu receptora pH, dosahuje biosyntéza treonínu maximálnu hodnotu 85 g/1 a spotrebný koeficient predstavuje 2 g cukru na jeden gram treonínu.
Aspartokináza (ďalej označovaná skratkou AK) je enzým, ktorý premieňa kyselinu asparágovú na kyselinu B-fosfoasparágovú a predstavuje hlavný regulačný faktor pri biosyntéze z asparágovej kyseliny a aminokyselín od nej odvodených. Ako ukazuje obr. 1, existujú tri typy AK produkované E. coli, označované AK I, AK II a AK III. Prvé dva z nich sú bifunkčnými enzýmami s katalytickou účinnosťou dehydrogenázy homoserínu (niekedy označovaný skratkou HD). Jedným z nich je AK I HD, kódovaný génom thrA, druhým je enzým AK II-HD II, kódovaný génom metL(M).
Len AK III, ktorý je produktom génu s názvom lysC a o ktorom je známe, že pôsobením lyzinu v ňom dochádza k represii a k spätnoväzbovej inhibícii, je monofunkčným enzýmom. Na druhej strane dochádza pri AK I k represii spoločným pôsobením treonínu a izoleucinu a k inhibícii treonínom, zatiaľ čo pri AK II dochádza k represii metionínom. Vzájomný pomer vnútrobunkovej aktivity uvedených troch typov enzýmu AK predstavuje približne AK I : : AK II: AK III = 5 : 1 : 4.
Gén lysC baktérie E. coli bol už klonovaný, a jeho sekvencia báz bola určená (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. a Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986). Rovnako produkcia L-treonínu fermentáciou s pomocou kmeňov E. coli, ktorých aktivita AK III bola zosilnená, bola už opísaná (Mizukami, T. a kol., Agric. Biol. Chem., 50,
1015, 1986). Ale, dostatočné uvoľnenie od lyzinu závislej spätnoväzbovej inhibície na AK III, opísané Mizukamim a kol., doteraz nebolo dosiahnuté.
Predmetom opisovaného vynálezu je teda získavanie AKIII s dostatočným uvoľňovaním spätnoväzbovej inhibícic lyzínom a fermentačná metóda produkcie L-treoninu, ktorá predstavuje veľmi výrazné zlepšenie vzhľadom na predchádzajúci stav.
Podstata vynálezu
Autorom vynálezu sa v rámci výskumu, uskutočňovaného s cieľom prekonať uvedený problém, podarilo získať gén (mutant lysC alebo lysC*), ktorým je kódovaná AK III v E. coli a ktorý uvoľňuje spätnoväzbovú inhibíciu lyzínom v dostatočnej miere. Vynález dovŕšili zistením, že po zavedení tohto génu do baktérie produkujúcej treonín dochádza k účinnému hromadeniu L-treonínu.
Predmetom predloženého vynálezu je teda DNA kódujúca aspartokinázu III, obsahujúca mutovanú sekvenciu aminokyselín, kde sekvencia aminokyselín SEQ ID č. 1 má mutáciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej
i) náhradu zvyšku Gly 323 zvyškom Asp, ii) náhradu zvyšku Gly 323 zvyškom Asp a zvyšku Gly 408 zvyškom Asp, iii) náhradu zvyšku Arg 34 zvyškom Cys a zvyšku Gly 323 zvyškom Asp, iv) náhradu zvyšku Leu 325 zvyškom Phe,
v) náhradu zvyšku Met 318 zvyškom íle a zvyšku Val 349 zvyškom Met, vi) náhradu zvyšku Ser 345 zvyškom Leu, vii) náhradu zvyšku Val 347 zvyškom Met, viii) náhradu zvyšku Thr 352 zvyškom íle a zvyšku Ser 369 zvyškom Phe, ix) náhradu zvyšku Glu 164 zvyškom Lys a
x) náhradu zvyšku Met 417 zvyškom íle a zvyšku Cys 419 zvyškom Tyr.
Ďalej je predmetom vynálezu DNA kódujúca aspartokinázu III, obsahujúca mutovanú sekvenciu aminokyselín, kde sekvencia aminokyselín SEQ ID č. 1 má mutáciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej i') náhradu zvyšku Met 318 zvyškom íle a ii') náhradu zvyšku Thr 352 zvyškom íle.
Predmetom vynálezu je tiež spôsob výroby L-treonínu, ktorý sa vyznačuje tým, že sa kultivuje mikroorganizmus patriaci k rodu Escherichia, ktorý bol transformovaný rekombinovanou DNA zahrnujúcou DNA ako je uvedená.
Inými slovami, opisovaný vynález sa teda ďalej týka uvedenej DNA, ktorá je rekombinovanou DNA zviazanou s vektorovou DNA, schopnou samostatnej replikácie v baktérii rodu Escherichia. Tiež sa týka mikroorganizmov patriacich k rodu Escherichia, ktoré boli transformované zavedením opísanej rekombinovanej DNA do buniek. Do rozsahu opisovaného vynálezu patria mikroorganizmy, ktoré boli transformované tým, že do ich chromozómovej DNA bola zavedená DNA, ktorou je kódovaná vyššie uvedená aspartokináza III pochádzajúca z rodu Escherichia a ktorá obsahuje gén s mutáciou v oblasti kódovania, ktorá pri spomenutej aspartokináze III uvoľňuje spätnoväzbovú inhibíciu lyzínom. Opisovaný vynález sa tiež týka spôsobu výroby L-treonínu, charakterizovaného pestovaním kultúr ľubovoľného z uvedených mikroorganizmov vo fermen tačnom médiu, produkovaním a hromadením L-treonínu v takejto kultúre a získavaním L-treonínu z kultúry.
Teraz bude tento vynález opísaný podrobne.
Ako donorové baktérie na poskytnutie DNA obsahujúcej gén, ktorým je kódovaná AK III (lysC), je možné využiť ľubovoľný mikroorganizmus patriaci k rodu Escherchia. Ide sa obzvlášť o tie, uvcdcnc v práci Ncidhardta (Neidhardt, F.C. a kol., Escheríchia coli and Salmonella typhimurium, Američan Society for Microbiology, Washington, D.C., 1208, tabuľka 1). Ich príkladom môžu byť kmene JM 109 a MC 1061 E. coli.
Ak ako donorové baktérie na poskytnutie DNA obsahujúcej gén, ktorým je kódovaná AK III (lysC), použijeme divoký kmeň, získaný gén kódujúci AK III bude pravdepodobne divokého typu. Aby sme na účely získania génu kódujúceho AK III, ktorý by uvoľňoval spätnoväzbovú inhibíciu L-lyzínom (lysC*), mohli do tohto génu zaviesť mutáciu, môžeme ovplyvniť mutáciu DNA in vitro priamym pôsobením hydroxylamínu. Hydroxylamín je chemickým mutagénom, vyvolávajúcim mutáciu C->T tým, že konvertuje cytozín na Ν-4-hydroxycytozín.
Získať DNA obsahujúcu gén kódujúci AK III, ktorý· by uvoľňoval spätnoväzbovú inhibíciu vyvolanú L-lyzínom, je ďalej možné tak, že sa ako darcovský kmeň DNA použije mutant, ktorý spätnoväzbovú inhibíciu aktivity AK III L-lyzínom uvoľňuje. Tento mutant je možné získať z buniek, pri ktorých boli použité obvyklé mutagény, napr. boli vystavené pôsobeniu ultrafialových lúčov alebo chemickému mutagénu, ako napr. N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidínu (NTG).
Teraz opíšeme prípravu DNA obsahujúcu gén, ktorým je kódovaná AK III (lysC). Najskôr uskutočníme kultiváciu E. coli s divokým typom lysC, napr. kmeňa MC 1061, čím získame bunky kultúrne. Kultiváciu uvedených mikroorganizmov môžeme uskutočniť bežnou metódou kultivácie v pevnej fáze, ale z hľadiska zbierania buniek sa prednostne používa metóda tekutej kultivácie. Ďalej je možné pripraviť kultivačné médium napr. pridaním jednej či viacerých anorganických solí, akými sú napr. dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO3), hydrogenfosforečnan didraselný (K2HPO3), síran horečnatý, chlorid sodný, chlorid horečnatý, chlorid železitý, síran železitý alebo síran mangánu, alebo jedného či viacerých zdrojov dusíka akými sú extrakt z kvasiniek, peptón, extrakt z hovädzieho mäsa, kukuričný výluh alebo likvór sójových bôbov alebo pšenice, v prípade nutnosti potom ďalším pridaním glycidov, vitamínov atď. Vhodná počiatočná hodnota pH kultivačného média by mala byť 7 - 8. Kultiváciu je ďalej treba robiť pri teplote 30 - 42 °C, najlepšie pri 37 °C, počas 4-24 hodín, v hĺbkovej kultúre s aeráciou a miešaním, v trepanej kultúre, v stacionárnej kultúre alebo podobne. Takto získaný kultivačný produkt sa počas piatich minút podrobí separácii v odstredivke, napríklad pri 3 000 otáčkach za minútu, čím sa získajú bunky kmeňa MC 1 061 E. coli.
Na získanie chromozómového DNA z týchto buniek je možné využiť napr. metódu Saitoovu a Miurovu (Biochem. Biophys. Acta 72, 619, 1963), metódu Kirbyho (K.S.Kirby: Biochem. J. 64, 405, 1956) atď.
Na izoláciu génu lysC sa chromozómová DNA, získaná uvedeným postupom, štiepi pomocou vhodného reštrikčného enzýmu. Ak stupeň štiepenia ovládame prostredníctvom času trvania štiepnej reakcie a pod., môžeme použiť širokú škálu reštrikčných enzýmov. Potom je možné gén pripojiť k vektorovej DNA, schopnej replikácie v baktérii rodu Escheríchia a pomocou výslednej rekombinovanej DNA transformovať mutantný kmeň Escheríchia, napr. GT3, ktorý aspartokinázu I, II a III neobsahuje (aby bola vytvorená génová knižnica). Z takto transformovaných baktérií je možné izolovať kmeň, schopný rastu na minimálnom kultivačnom médiu bez lyzínu, a teda opísaným postupom separovať rekombinovanú DNA obsahujúcu gén lysC.
Konkrétne sa chromozómová DNA vylúhuje reštrikčným enzýmom, napr. Sau3AI pri teplote 30 °C či vyššej, výhodne pri 37 °C a pri koncentrácii enzýmu v rozmedzí 1 - 10 jednotiek na mililiter po rôzne dlhý čas (od 1 minúty do dvoch hodín), aby sa dosiahlo úplné či čiastočné vylúhovanie. Tak sa získa zmes, obsahujúca množstvo fragmentov chromozómovej DNA. Vektorová DNA schopná replikácie v baktérii rodu Escheríchia sa vylúhuje reštrikčným enzýmom ŕtawHI, ktorý produkuje rovnakú konečnú sekvenciu bázy ako reštrikčný enzým, Sau3A použitý na štiepenie chromozómovej DNA. Vylúhovanie sa robí pri teplote 30 °C alebo vyššej, pri koncentrácii enzýmu v rozmedzí 1 - 100 jednotiek na mililiter počas 1 hodiny alebo dlhšie, najlepšie 1 - 3 hodiny, s cieľom úplného vylúhovania a tým získania rozštiepenej DNA. Rekombinovaná DNA sa potom dostane zmiešaním zmesi obsahujúcej fragmenty DNA, ktoré boli získané z E. Coli MC 1061 a zahŕňajú gén lysC pripravený uvedeným spôsobom, s rozštiepenou vektorovou DNA, a následným pôsobením DNA-ligázy, najlepšie ligázy T4 DNA, na výslednú zmes, a to pri teplote v rozmedzí 4 - 16 °C a pri koncentrácii enzýmu 1-100 jednotiek na mililiter počas jednej hodiny alebo viac, najlepšie 6 - 24 hodín.
Podľa opisovaného vynálezu by ako vektor DNA mal byť prednostne použitý' plazmid vektora DNA, a to napr. pUC 19, pUC 18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF 1010, a pod. Ďalej je možné použiť vektory vzniknuté úpravou DNA fága. Promótory fungujúce v mikroorganizmoch, napr. lac, trp, PL a pod., je možné využiť na efektívnu expresiu génu, ktorý je na daný účel vhodný. Termín rekombinovaná DNA (recombinant DNA), ako ho používame, zahŕňa DNA, ktorá je výsledkom začlenenia uvedeného génu do chromozómov pomocou metód využívajúcich transpozóny (Berg, D.E. a Berg, C.M., Bio/Technol. I, 417, 1983), Mu-ον fág (Japonská pat. prihláška zverejnená pod číslom HEI 2-109985) alebo homologickú rekombináciu (Experimentes in Molecular Genetics, Cold Spring HarborLab., 1972).
Táto rekombinovaná DNA sa použije na transformáciu napr. kmeňa K-12 E. coli, najlepšie kmeňa GT3 alebo pod. Potom sa z kmeňov so zvýšenou úrovňou aktivity AK alebo z kmeňov s doplnenými nutričnými požiadavkami získa kmeň s «kombinovanou DNA obsahujúci gén lysC. Transformáciu je možné uskutočniť metódou opísanou Morrisonom (D.M. Morrison: Methods in Enzymology, 68, 326, 1979) alebo metódou, pri ktorej sa schopnosť DNA prenikať do hostiteľských buniek zvyšuje pôsobením chloridu vápenatého (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol. 53, 159, 1970). Potom je možné rekombinovanú DNA, pripravenú vložením DNA obsahujúcej gén lysC do vektora z opísaných kmeňov, izolovať metódami, opísanými napr. P. Guerrrym a kol. (J.Bacteriol., 116, 1064, 1973) alebo D.B. Clewellom (J. Bacteriol., 110, 667, 1972).
Skutočnosť, či získaný kmeň skutočne obsahuje rekombinovanú DNA s génom lysC, sa dá overiť prípravou roztoku bunkového extraktu, z neho potom prípravou su rového enzymatického roztoku na potvrdenie aspartokinázovej aktivity, Enzymatickú aktivitu aspartokinázy je možné merať metódou Stadtmana a kol. (Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G. a Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem.,236, 2033, 1961).
Alternatívne sa dá gén lysC získať z chromozómovej DNA, pripravenej metódou Saito a Miura, PCR (polymerázovou reťazovou reakciou, pozri White, T.J. a kol., Trende Genet. 5, 185, 1989). Očko DNA použité na ampliftkáciu je to, ktoré je komplementárne k 3' koncom DNA v tvare dvojitej skrutkovice, ktorá obsahuje celú oblasť génu lysC alebo jeho segment. Ak sa má amplifikovať len časť génu lysC, je treba v génovej knižnici separovať fragmenty DNA obsahujúce celú oblasť a použiť fragment DNA ako očko. Ak sa má amplifikovať celá oblasť, fragment DNA sa vystaví elektroforéze v agarózovom géli a žiadaný pás sa potom vyreže, čím sa získa fragment DNA obsahujúci gén lysC.
Očko DNA sa dá vhodne pripraviť napr. na základe známej sekvencie báz E. coli (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. a Patte, J.C., J. Biol. Chem , 261, 1052, 1986), pričom sa uprednostňujú dva typy očiek schopné amplifikácie kódovania základnej oblasti 1347 génu lysC, a síce 5'-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3' (SEQ. ID Č.2) a 5'- GAATTCCTTTGCGAGCAG-3' (SEQ. ID Č.3).
Syntézu DNA je možné uskutočniť obvyklým spôsobom s použitím syntezátora DNA Modelu 38OB vyrábaného spoločnosťou Applied Biosystems Co. a fosfoamidovej metódy (pozri Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981 ). Reakciu PCR je možné uskutočniť v tepelnom cykleri modelu PJ2000 pomocou DNA-polymerázy Taq, v oboch prípadoch vyrábaných spoločnosťou Takara Shuzo Co., podľa postupu udávaného výrobcom.
Gén lysC, amplifikovaný metódou PCR, je viazaný k vektorovej DNA schopnej samostatnej replikácie v baktérii kmeňa Escherichia, a je vpravovaný do ich buniek. Metóda transformácie hostiteľa používaným vektorom, ako aj metóda overenia prítomnosti génu lysC, sú rovnaké ako v už opísaných prípadoch.
Metóda navodenia mutácie do získaného génu lysC, ako je napr. substitúcia, inzercia či delécia aminokyselín, môže byť uskutočnená prostredníctvom metódy rekombinantnej reakcie PCR (Higuchi, R., 61, v PCR Technology (red. Erlich, H.A., Stockton Press, 1989)), metódy miestne orientovanej mutagenézy (Kramer, W. a Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T. A. a kol., Meth. in Enzymol. 154, 367, 1987) a pod. Použitím týchto metód je možné navodiť žiadanú mutáciu na požadovanom mieste. Ďalej, na zavedenie náhodnej mutácie je možné použiť metódy priameho pôsobenia hydroxylamínom na cieľový gén v chromozóme DNA alebo v plazmide (Hashimoto, T. a Sekiguchi, M., J. Bacteriol. 159, 1039, 1984), bežné metódy spočívajúce vo vystavení cieľovej DNA ultrafialovým lúčom či použitie chemického činidla, akým je N-metyl-N'-nitrózoguanidín, kyselina dusitá a pod., alebo metódy chemickej syntézy cieľového génu.
Metóda výberu mutantného génu lysC* uvoľňujúceho inhibíciu zahŕňa po prvé transformáciu AK- nedostatočného kmeňa, napr. kmeňa GT3 E. coli, mutovanou rekombinovanou DNA.
Ďalej sa transformovaný kmeň kultivuje v minimálnom médiu, napr. M9, obsahujúcom značný podiel lyzínu. Kmene s plazmidmi obsahujúcimi divoký typ lysC, majú inhibíciu AK III lyzínom; AK III je jedinou aspartokinázou v kmeni a teda syntéza treonínu, izoleucinu, metionínu a kyseliny diaminopimelovej (DAP) nie je naďalej možná a rast je inhibovaný. Naopak, kmene s plazmidmi obsahujúcimi lysC*, ktorý inhibíciu lyzínom uvoľňuje, by mali na minimálnom médiu s istým podielom lyzínu byť schopné rastu. Tento jav jc možne využiť a vyselektovať požadované kmene, t.j. kmene s plazmidmi obsahujúcimi lysC*, ktorý uvoľňuje inhibíciu, teda tie, ktoré sú rezistentné proti lyzinu či S-2-aminoetylcysteínu (AEC), analogickému lyzínu.
Tento mutantný gén získaný opísaným spôsobom môže byť ako rekombinovaná DNA zavedený do vhodného hostiteľského mikroorganizmu a môže prebehnúť jeho expresia; získaný mikroorganizmus bude obsahovať AK s uvoľnením spätnoväzbovej inhibície.
V roli hostiteľa, do ktorého sa získaný gén lysC či mutant génu lysC (lysC*) vpravuje a potom amplifikuje na produkciu treonínu, môžu byť použité spomenuté divoké kmene baktérie rodu Escherichia: okrem nich to však môžu byť ľubovoľné iné baktérie za týchto predpokladov: tak počiatočná replikácia rekombinovanej vektorovej DNA vytvorenej na tejto platforme, ako gén lysC a mutovaný gén lysC (t.j. lysC*) v nich fungujú; rekombinovaná vektorová DNA je v nich schopná replikácie; a gén lysC, resp. mutovaný gén lysC (lysC*) v nich môže byť posilnený. Najvhodnejším nositeľom je kmeň B-3996 E. coli.
Opísaným spôsobom získané transformované kmene s rekombinovanou vektorovou DNA obsahujúcou gén, ktorý kóduje aspartokinázu III s uvoľnením spätnoväzbovej inhibície lyzínom, sa kultivujú a dochádza k produkcii a hromadeniu cieľového L-treonínu v kultivačnom roztoku, odkiaľ sa potom získava.
Kultúrnym médiom používaným na produkciu L-treonínu je bežné kultivačné médium obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a v prípade potreby ďalšie organické zložky.
Zdrojom uhlíka môže byť sacharid, ako napr. glukóza, laktóza, galaktóza, fruktóza, hydrolyzovaný škrob, alkohol ako napr. glycerol či sorbitol, či organická kyselina, ako je kyselina fumarová, kyselina citrónová, kyselina jantárová a pod.
Zdrojom dusíka môže byť anorganická amónna soľ ako napr. síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, či organický dusík, ako je hydrolyzát sójových bôbov, plynný amoniak, čpavková voda a pod.
Je žiaduce pridávať vhodné množstvo potrebných látok, akými sú vitamín BI, L-homoserín a pod., alebo extrakt z kvasiniek, ako zdroj organických stopových výživných látok. Okrem nich sa v prípade nutnosti v malom množstve pridávajú fosforečnan draselný, síran horečnatý, ióny železa či ióny mangánu a pod.
Kultiváciu je optimálne uskutočňovať aeróbne počas 16 až 72 hodín, pričom kultivačná teplota sa má pohybovať medzi 25 - 45 °C a pH kultúry v rozmedzí 5 až 8. Na úpravu pH je možné použiť anorganické či organické kyseliny, zásadité látky, plynný čpavok a pod. Na získavanie L-treonínu z fermentovaného rmutu sa používa kombinácia bežnej metódy so živicovým ióntomeničom a zrážacej metódy alebo ľubovoľnej inej všeobecne známej metódy.
SK 27991S Β6
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 predstavuje schematický diagram biosyntetickej cesty treoninu.
Obr. 2 je schéma reštrikčného enzýmu pre pLYSC 1 a pLYSC2 (pozri príklad 1 ).
Na obr. 3 je graficky znázornený vplyv zavedenia mutácií, indukovaných hydroxylamínom, na lysC (pozri príklad 2 (2-4)).
Obr. 4 ukazuje stupeň inhibície lyzínom pri rôznych typoch aspartokinázy kódovaných rôznymi génmi lysC* (pozri príklad 3 (3-4)). Koncentrácia lyzínu je na vodorovnej osi v logaritmickej škále. Špecifické aktivity na zvislej osi sú vyjadrené ako zlomky vzhľadom na 100 % definovaným ako aktivita divokého typu AK III s 0,0 milimólom pridaného lyzínu.
Na obr. 5 je diagram na konštrukciu pLLC* (pozri príklad 4 (4-1)).
Na obr. 6 je diagram na konštrukciu pVICLC*A a pVICLC*B (pozri príklad 4 (4-3)). Obr. 7 ukazuje body mutácie každého lysC* (pozri príklad 5 (5-3)).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Ďalej je prostredníctvom príkladov vynález opísaný konkrétnejšie.
Príklad 1
Klonovanie divokého génu lysC
Sekvencia báz génu lysC E. coli bola už opísaná (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. a Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986) a je známe, že jej otvorený rámec čítania (open reading frame; ORF) má 1347 báz kódujúcich 449 aminokyselín. Keďže je prítomný operátor zodpovedný za represiu lyzínom, bola oblasť tohto operátora odstránená a klonovanie sa uskutočnilo len prostredníctvom amplifikácie oblasti obsahujúcej sekvenciu SD a ORF metódou PCR.
Boli pripravené dve rozdielne očká, a síce 5-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3' (sekvencia č. 2) a 5'-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3' (sekvencia č. 3) a metódou Saitovou a Miurovou (Biochem Biophys. Acta, 72, 319, 1963) bol obnovený celý genóm DNA E. coli kmeňa MC 1061. Tieto vstupy sa použili pri reakcii PCR podľa metódy Erlicha a kol. (PCR Technology, Stockton Press, 1989) na amplifikáciu cieľovej DNA. Výsledná DNA bola digerovaná enzýmami BamHI a Asel a jej konce potom boli otupené a DNA potom bola vsunutá do miesta Smal vektora pUC 18 v mnohých exemplároch. Tak boli získané dva typy plazmidov, jeden s opačným zmyslom (pLYSCl) a jeden s rovnakým zmyslom (pLYSC2) ako pri promótore lacZ (obr. 2).
Tieto plazmidy boli použité na transformáciu kmeňov GT3 E. coli, vôbec neobsahujúcich AK I, II a III (thrA 1016^, metLM 1005, lysC 1004) a keďže požiadavky kmeňa GT3 na homoserín a kyselinu diaminopimelovú boli splnené, potvrdilo sa, že gén, ktorý kódoval aktívnu AK III, bol lysC.
Príklad 2
Získanie mutovaného génu lysC* uvoľňujúceho inhibíciu 2.1
Aby bol gén lysC uvoľňujúci inhibíciu (lysC*) získaný efektívne, bol gén rekombinovanej plazmidovej DNA pripravený v príklade 1 podrobený mutagénnemu pôsobeniu.
Ako spôsob získania mutovaného génu lysC* uvoľňujúceho inhibíciu bol najskôr divoký rekombinovaný plazmid s génom lysC na účely transformácie zavedený do kmeňa GT3 E. coli, ktorému celkom chýbala aspartokináza. K minimálnemu médiu M9, ktorého zloženie je uvedené v tab. 1, bolo pridané veľké množstvo lyzínu a transformanty boli v tomto médiu kultivované. Kmene s divokým typom lysC mali inhibíciu lyzínom pri jedinej AK, t.j. AK III a syntéza treoninu, izoleucínu, metionínu a diaminopimelovej kyseliny (DAP) už nebola možná a rastu bolo zabránené.
Tabuľka 1: Minimálne médium M9
A 20 x M9 (g/1)
Na2HPO4.12H2O 303
kh2po4 60
NaCI 10
NH4C1 20
B: 1 M MgSO4
C: 50% glukóza
D 1 g/1 tiamin
A, B, C, D a voda boli oddelene sterilizované a zmiešané v pomere A : B : C : D : voda= 5 : 0,1 : 1 : 0,1 : 95.
Naopak, pri kmeňoch s plazmidmi s lysC* uvoľňujúcimi inhibíciu lyzínom sa očakáva schopnosť rastu v minimálnom médiu obsahujúcom veľké množstvo lyzínu. Tento jav bol využitý pri uskutočňovaní selekcie kmeňov, ktorých rast bol rezistentný proti lyzínu či S-2-aminoetylcysteínu (AEC), t.j. kmeňov s plazmidmi obsahujúcimi lysC* uvoľňujúci inhibíciu.
2.2. Skúmanie podmienok výberu mutantov lysC (lysC*) vyvolávajúcich rezistenciu proti spätnoväzbovej inhibícii.
Najprv bol tak pLYSC 1, ako pLYSC2 vsunutý do kmeňa GT3 E. coli na účely jeho transformácie, čím boli získané dva rôzne transformované kmene. Kultivácia sa uskutočnila na minimálnom agarovom plošnom médiu M9 obsahujúcom lyzín alebo AEC. Bola taktiež stanovená koncentrácia lyzínu či AEC potrebná na zamedzenie rastu a boli skúmané podmienky na selekciu lysC*.
Ako jasne ukazuje tab. 2, podiel expresie vzhľadom na pLYSC2 bol amplifikovaný promótorom lacZ a rezistencia proti značne vysokej koncentrácii lyzínu alebo AEC sa tak prejavila dokonca i pri kmeňoch s lysC divokého typu, keďže však gén lysC v plazmide pLYSCl mal proti promótoru lacZ opačný zmysel a promótor samotného génu lysC nebol prítomný, podiel expresie bol nízky a rast bol znemožnený už pri nízkej koncentrácii lyzínu či AEC (rast bol celkom inhibovaný už pridaním lyzínu či AEC v koncentráciách cca 0,2 mM. Znamienko + v tabuľke označuje rast transformovaného kmeňa, označuje absenciu rastu). Bolo zistené, že inhibícia rastu sa obnoví po súčasnom pridaní homoserínu a DAP.
Tabuľka 2:
Vzťah medzi rastom kmeňa GT3 s plazmidom lysC úplne bez aspartokinázy a koncentráciou pridaného lyzínu či AEC, podobného lyzínu (a): koncentrácia lyzínu i rast
(mM) 0 0.2 0,4 0,8 1,5 3 6 12 25 50 100 200
GT3/pLYSCl +
GT3/pLYSC2 - T + + + + + + + + ±
b) konceíUiáĽia AEC a rast
(mM) 0 0.2 04 08 1 S 3 ň 12 25 50
GTT/pLYSCl +
GT3/pLYSC2 ± í ± t
agarové médium M9, 37 nC, 2 dni kultivácie * rast. ±: určitý rast, · absencia rastu proti AEC (AECR). Postup je načrtnutý v uvedenej tabuľke 4.
Tabuľka 4: Náčrt postupu (1) Kultivácia buniek obsahujúcich cieľový plazmid v médiu 2 x TY (1,6 % bacto tryptón, 1 % extrakt z kvasiniek. 0,5 % NaCI) Potom nasledoval zber buniek pri absorpcii približne 0.3 pri vlnovej dĺžke 660 rutí (2) Premývanie v tlmivorn roztoku TM (3) Suspenzia v roztoku NTG (0.2 mg/ml v tlmivom roztoku TM): bunky vystavené jeho pôsobeniu pri 37 °C po dobu 0 - 90 minul.
(4) Premývanie v tlmivom rnztňku TM a v médiu 2 x TY. nasledované kultiváciou v med-.u x TY cez noc a fixáciou mutácie (5) Exirakcia plazmidovei DNA 2 buniek, transformácia kmeňa GT3 a triedenie na rekombinované kmene
Plazmid pLYSC t bol teda použitý v experimente zavedenia mutácie a selekčné médium použité pri selekcii lysC* bolo pripravené pridaním 10 M lyzínu alebo 0,2 mM AEC k minimálnemu médiu M9.
2.3. Postup mutácie
Hydroxylamín je chemické mutagénne činidlo, ktoré indukuje mutáciu C->T tým, že konvertuje cytozín na N4-hydroxycytozín. K zavedeniu mutácie do plazmidu boli použité dve metódy. Jednak išlo o priamu mutagenéziu in vitro, keď bol plazmid pod priamym vplyvom hydroxylamínu, jednak o mutagenéziu in vivo, poskytujúcu rad rôznych mutácii. Druhá metóda bola použitá na získanie iných mutácií ako C—>T, pričom bunky obsahujúce plazmidy boli vystavené pôsobeniu nitrózoguanidínu (NTG) a plazmidy potom boli extrahované.
2.4. Mutagenéza hydroxylamínom in vitro
Na DNA v množstve 2 pg pôsobil pri teplote 75 °C reakčný roztok, ktorého zloženie udáva tabuľka 3, t.j. 0,4 M hydroxylamín, počas 1 - 4 hodín. Takto upravená DNA bola vyčistená skleným prachom a potom použitá na transformáciu do kmeňa GT3 s úplne chýbajúcou aspartokinázou, ktorý bol rozložený na kompletnom médiu (L-živná pôda; 1 % bacto tryptón, 0,5 % extrakt z kvasiniek, 0,5 % NaCl, 1,5 % cukor), aby vytváral kolónie. Vytvorené kolónie boli replikované na selekčnom médiu získanom v 2.1. Ako ukazuje obr. 3, podiel výskytu transformantov a podiel mutácií sa menili. Pri štyroch hodinách trvania procesu bol výťažok mutovaných kmeňov 0,5 - 0,8 %, čo je vcelku vysoká hodnota.
Tabuľka 3:
Zloženie reakčného roztoku
0,1 M KH2PO4 - 1 mM EDTA (pH 6,0) 100 μΐ
1M hydroxylamín - 1 mM EDTA (pH 6,0) 80 μΐ
DNA 2 pg
Voda doplniť
Celkom 200 μΙ
2.5. Mutagenézanitrózoguanidínom (NTG) in vivo
Plazmid pLYSC 1 bol použitý· na transformáciu kmeňa MC 1061 E. coli a bunky boli priamo vystavené pôsobeniu NTG. Takto spracované bunky boli cez noc kultivované s cieľom fixovať mutáciu, potom z nich boli extrahované plazmidy a boli použité na transformáciu do GT3. Potom bolo rovnakým spôsobom ako v 2.4. uskutočnené triedenie a získané tak mutanty rezistentné proti lyzínu (LysR) alebo
Tlmivý roztok TM mal nasledujúce zloženie:
Tris 50 mM
Kyselina maleínová 50 mM (NH4)2SO4 lg/1
MgSO4.7H2O 0,1 g/1
Ca(NC>3)2 5 mg/1
FeSO4.7 H2q 0,25 mg/1
Upravené na hodnotu pH 6,0 použitím NaOH.
Príklad 3
Izolácia génu lysC*
3.1.
Do selekčného prostredia bolo vložené celkom 180 použiteľných kmeňov, ktoré boli získané v príklade 2 (48 kmeňov spracovaných pomocou hydroxylamínu, 132 kmeňov spracovaných pomocou NTG ) a prítomnosť AEC alebo odolnosť proti lyzínu potvrdilo 153 kmeňov. Vzhľadom na rozdiely v akumulácii aminokyselín v prostredí, 153 kmeňov bolo rozdelených do 14 skupín a jeden zástupca z každej skupiny bol vybraný na meranie aktivity AK. Pretože nebol podstatný rozdiel medzi mutáciami spracovanými pomocou hydroxylamínu a pomocou NTG, pri experimente neboli tieto rozlišované.
3.2. Meranie aktivity aspartokinázy
Ako hostiteľský kmeň bol použitý kmeň GT3, ktorý neobsahuje žiadnu AK. Na transformáciu vzhľadom naň bolo použitých spomenutých 14 mutácií pLYSC 1 (tzv. rad pLYSC 1 *) a divoké plazmidy pLYSC 1. Potom bol pripravený bezbunkový extrakt z produktov transformácie a bola zmeraná aktivita enzýmu AK III. Na meranie aktivity enzýmu bola použitá táto metóda:
3.3. Metóda merania aktivity AK III
3.3.1 Metóda prípravy roztoku surového enzýmu (1) Kultivácia buniek v prostredí 2 x TY, následný zber buniek pri absorpcii cca 0,8 pri vlnovej dĺžke 660 nm.
(2) Premývanie roztokom 0,02 M ΚΗ2ΡΟ4 (pH 6,75) -0,03 M β-merkaptoetanolu pri 0 °C.
(3) Ultrazvukové drvenie buniek (0 °C, 100W, 4x30 s).
(4) Odstreďovanie pri 0 °C, 33 ot/min počas 1 hodiny, následné pridanie síranu amónneho do kvapaliny nad usadeninou až do nasýtenia 80 %.
(5) Odstreďovanie, nasledovné rozpúšťanie peliet v tlmivom roztoku (2), a uskladnenie (-20 °C).
SK 279915 Β6
3.3.2. Metóda merania aktivity enzýmu
Metóda merania aktivity enzýmu sa zhoduje s metódou Stadtmana et al. (Stadtman, E.R., Cohen, G.N., Lebras, G. a Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033, 1961). Reakčný roztok mal zloženie uvedené v tabuľke 5.
Tabuľka 5: Zloženie reakčného roztoku
Reakčná zmes 0 3 ml
Roztok hvdroxviaminu 0.2 ml
0,1 M aspartátu draselného íoH 7.0) 0.1 ml
Rozlok enzýmu
Voda doplnenie
Celkom 1,0 mi
♦b 9 ml z 1 M Tris-HCl (pH 8,1) + 0,5 ml z 0,3 M MgSO4 + 5 ml z 0,2 M ATP (pH 7,0) *2: 8 M hydroxylamínu neutralizovaného KOH tesne pred použitím. Reakčný roztok bez aspartátu draselného sa považuje za slepý.
Metóda merania je načrtnutá v tabuľke 6.
Tabuľka 6: Náčrt metódy merania (1) Inkubácia reakčného roztoku pri 2’°C po dobu 45 min (2) Pridanie roztoku FeCI3 (0,4 ml z 2.8 N HC1 + 0.4 ml 112·/« TCA * 0.7 mi z W, FeCI3 éHjO/O.l N HCI) na zafarbenia (!) Odstreďovanie, nasledované meraním hodnoty absorpcie pri 540 nm (4$4<j) supemaAkiivita bola vyjadrená ako množstvo kyseliny hydroxámovej, vzniknutej počas jedrq mnóty 1 U - I jimól/min Molárry absorpčný koeficient - 600
Výsledky sú zakreslené na obr. 4
3.4. Stupeň uvoľnenia inhibicie závislej od lyzínu
Aby bolo možné zmerať enzýmovú aktivitu AK, bol do reakčného roztoku enzýmu pridaný lyzín v rôznych koncentráciách. Hladina inhibicie závislej od lyzínu bola určená. Divoký typ AK III bol veľmi silno inhibovaný lyzínom, napr. bola zistená 50 % inhibícia s 0,45 mM lyzínu a približne 100 % inhibícia s 5 mM lyzínu (obr. 4).
Tu získané mutácie AK III mali naopak rôzny stupeň uvoľnenia, ale všetkých štrnásť malo isté uvoľnenie inhibície závislej od lyzínu (obr 4 a tabuľka 7). Prakticky žiadna inhibícia nebola pozorovaná ani so 100 mM lyzínu v prípade vzoriek č. 24, 80, 117, 169 a 172, a 50 % inhibujúca koncentrácia bola 200- násobná alebo väčšia.
Tiež špecifická aktivita, t.j. aktivita enzýmu na jednotkový proteín, bola rovnaká alebo väčšia, ako aktivita divokého typu, aj s uvážením vplyvu rastových podmienok buniek a prípravy vzorky. Nebol pozorovaný žiadny problém zníženej aktivity vzhľadom na vnesenie mutácií (tabuľka 7). Preto sa predpokladalo, že aktívna poloha AK III a poloha zodpovedná za reguláciu lyzínom sú vzájomne nezávislé.
Uvoľnenie inhibicie je v tabuľke 7 uvedené ako aktivita (%) v prítomnosti 100 mM lyzínu vzhľadom na aktivitu reakčného roztoku bez lyzínu a tepelná stabilita je uvádzaná ako zachovanie aktivity (%) po úprave pri 55 °C počas 1,5 hodiny, vzhľadom na aktivitu bez ohrevu.
Tabuľka 7: Uvoľnenie inhibicie lyzínom a tepelná stabilita
Špecifická Ai .we (u/mc DWieinui (tvárnenie inhibicie -1¾.. Tepelne stabiliti -
Divoký iyp C 024’ 18
t 117 0,0069 120 0
514 0 0218 I5O 10
í.sn 0 0244 69 16
£.172 0,0189 07 0
t 16« 0.0128 96 2
£ IStl 0.0062 ?7 25
t 126 CO25O 61 39
£ 149 0 0256 59
i 167 0 0085 41 45
£4» 0.0228 18 92
£60 0.0144 15 .)
č 158 0 0224 22 42
í l$í> 0.0101 |g 2
Č4J 0,0212 17 0
3.5. Tepelná stabilita
Keď je hladina aktivity určitých enzýmov zvýšená pomocou ich zlepšení, je dôležité, aby boli stabilne zachované vnútri buniek. Vzhľadom na rozdiely v aktivite proteáz vnútri a mimo buniek a vzhľadom na vplyv konzervačného roztoku, je meranie pokiaľ možno vykonávané in vivo, ale vzhľadom na experimentálnu výhodnosť bola tepelná stabilita mutácií AK III testovaná ako parameter in vitro.
Výsledkom rôznych testov teploty, pri ktorej dochádza k inaktivácii AK III, bolo to, že k inaktivácii dochádza pri 56 °C a veľkosť zachovania aktivity bola stanovená po úprave trvajúcej 90 minút. Ako je uvedené v tabuľke 7, polovica mutácií bola nadradená divokému typu. Mutované proteíny všeobecne majú tendenciu k nižšej stabilite než zodpovedajúce divoké typy, ale niektoré zo získaných typov AK III mali väčšiu stabilitu než divoký typ a mnohé z nich boli považované za veľmi užitočné enzýmy pri praktickej výrobe L-treoninu.
Príklad 4
Fermentačná výroba L-treonínu použitím kmeňa s vneseným génom lys*C.
4.1.
Z dosiaľ známych kmeňov baktérie E. coli, kmeň B-3996 má najväčšiu schopnosť produkovať treonín. Preto sme sa rozhodli použiť kmeň B-3996 ako hostiteľa na hodnotenie lysC*. Kmeň B-3996 je uložený vo Výskumnom ústave genetiky a výberu priemyselných mikroorganizmov (Research Inštitúte of Genetics and Selection of Industria Microorganism) pod číslom VKPB B-3996. V experimente bolo ďalej použitých 6 typov lysC* s rôznym stupňom uvoľnenia inhibicie a špecifickou aktivitou (č. 24, 43, 60, 80, 149 a 167 v tabuľke 7), ktorých vlastnosti boli hodnotené.
Na zvýšenie stupňa expresie lysC* bol najskôr každý zo spomenutých typov lysC* na pLYSCl* prenesený do promótora lacZ vektora pHSG399 (výrobok firmy Takara Shuzo-Co.) s cieľom obrátiť vloženie každého lysC*. Týmto spôsobom získané nové plazmidy boli súhrnne nazvané rad pLLC* (obr. 5). Kmene baktérie E. coli HB101, do ktorých boli zavedené plazmidy spomenutým lysC* č. 80 a 167 boli nazvané AJ12750 a AJ 12751. Pôvodne boli uložené v Národnom ústave biologických vied a biológie človeka (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology), Japonsko, a to od 1. septembra 1992. AJ12750 bol označený ako FERM P-13136 (a bol prevedený do medzinárodného depozitára od 4. novembra 1993 pod číslom FERM BP-4462). AJ 12751 bol označený číslom FERM P-13137 (a prevedený do medzinárodného depozitám k rovnakému dátumu pod číslom FERM BP-4463). Pretože boli zistené všetky mutačné body každého lysC* tak, ako je opísané, nebol zvyšok génov uložený.
Pracovníci, ktorí majú túto obvyklú zručnosť v odbore, môžu ľahko obnoviť plazmidy zo spomenutej uloženej baktérie podľa metódy Maniatisa et al. (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1,21,1989), s cieľom získať spomenutý zvyšok génu lysC* podľa mutagenetickej metódy orientovanej na polohy (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15,83,1989). Obvyklá metóda bola použitá na zavedenie týchto plazmidov do kmeňa B-3996 na účely hodnotenia.
Kultivácia bola uskutočnená s použitím kultivačného prostredia opísaného v tabuľke 8 (zložky A, B a C boli sterilizované oddelene), kultivačný čas trval 38 hodín pri teplote 37 °C a miešaní 114-116 ot/min.
Tabuľka 8 Prostredie na produkciu treonínu
(NH4)2SO4 16(5'1
ΚΙΙ2ΡΟ4 1 g/i
MgSOq . 7 H2O 1 g/l
FeSOq 1 H2O n.OI g/l
M11SO4 5 h2o 0,01 g/i
kvasinkový extrakt (Difco) 2 g/l
L-Mci 0.5 g/l
Upravené na hodnotu pH 7,C použitím KOH a ohriate v aut oktáve pri 115 ’C po dubu 10 minul (16/20 vol).
B 20 % glukózy. ohriate v auloklave pri 115 T po dobu 10 minút (4/20 vol)
C CaCO3 v lekárnickej čistote, ohriate v autokláve pri 180 °C po dobu 2 dní (3Ω g/l)
D antibiotiká (100 pg/ml streptomycínu. 5 μ g·'ml kanamycinu)
4.2. Zhodnotenie lysC*
Každý zo šiestich radov plazmidov pLLC* bol použitý na transformáciu kmeňa B-3996, a každý produkt transformácie bol kultivovaný v prostredí, keď bol pridaný 1 g/l lyzínu, rovnako ako v prostredí, keď nebol pridaný žiadny lyzín. Na kontrolu boli pripravené hostiteľské kmene B-3996 s plazmidmi a bez plazmidov s divokým typom lysC (pLLC 1 ).
Výsledky sú uvedené v tabuľke 9. Hodnoty v zátvorkách udávajú pomer výťažku lyzínu (g) na 1 g spotrebovaného sacharidu proti výťažku lyzínu (g) na 1 g spotrebovaného sacharidu v prípade, keď kmeň B-3996 bol kultivovaný bez pridania lyzínu (kontrolný pokus). To znamená, že výťažok sa v druhom prípade rovná 1,00. Citlivosť lyzínu je definovaná ako (výťažok lyzínu na spotrebovaný sacharid v prípade pridania lyzínu)/(výťažok lyzínu na spotrebovaný sacharid bez pridania lyzínu). Pre kmeň B-3996 bolo zistené, že výťažok vzťahujúci sa ku spotrebovanému sacharidu v kultúre s pridaným lyzinom bol 0,74 výťažku v kultúre bez pridaného lyzínu.
V prípade kmeňov s vloženým génom lysC* (napr. B-3996/ pLLC * 149) však zníženie výťažku vztiahnutého na spotrebovaný sacharid pozorované v kultúre s pridaným lyzinom bolo približne 0,96 hodnoty zistenej v kultúre bez pridaného lyzínu. Z toho usudzujeme, že AK III zakódovaná génom lysC prispieva k biosyntéze treonínu a že inhibícia aktivity AK III spôsobené pridaním lyzínu je naopak vo vzťahu k inhibícii biosyntézy treonínu. Tento jav je potlačený, pokiaľ je použitý lysC* podľa tohto vynálezu.
Tabuľka 9
Množstvo prid LysC ( ŕ í 11 Zvyškový sacharid Thr (K/l) Výťažok π» spotrebovaný sacharid í /,1) Cillivosť lyzínu
B- 3996 0 0,09 12,1 3C,7 (1,00 )
1 0.12 8.9 22,t 0,74
B - 3996 / 0 0.07 13.1 33.0 (1.03)
pLLCKdtv ) 1 0,14 11.1 28,3 0,87
B-3996/ 0 0.1 l 15.4 38.5 ( 1.25)
pLLC *24 | 0 08 12.7 32,3 0.84
B-3996/ o 0,09 15.1 38.3 íl,25)
pLLC *43 1 0.12 14.4 35.5 0,93
B - 3996 / 0 1.32 U.8 36,J (1 18)
pLLC · 60 2,66 11.6 31,4 0,86
B·3996 / 0 i) 10 15,7 39.7 (| 29)
pLLC * 80 ) 3,09 13,9 35.6 0,90
B - 3996 1 0 3,07 12.8 32.1 (1 04)
pI.l.C *149 | 1 80 1 3 30 ? 0,96
B- 3996/ D 0.07 15.5 39.8 (1.30)
pLLC *167 | 0.10 13.9 35.3 0.89
Vzhľadom na produkciu treonínu v kultúre bez lyzínu bolo zrejmé, že kmene, ktoré obsahovali divoký plazmid lysC, mali lepšiu produktivitu ako kmeň B-3996 bez týchto plazmidov. Produktivita bola ďalej zvýšená v kmeňoch s mutáciami lysC* ( približne 1.3- krát v porovnaní s hostiteľskou kultúrou vo vzorke č. 80).
Tieto výsledky naznačujú, že AK III je jeden z faktorov limitujúcich rýchlosť produkcie treonínu kmeňom B-3996. S bunkami, do ktorých bola vložená mutácia lysC*, dávala kultivácia bez lyzínu zlepšený výťažok v porovnaní s bunkami, do ktorých bol vložený divoký gén lysC. Domnievame sa, že to je dôsledok skutočnosti, že v bunkách s divokým génom lysC sa prejavovala inhibícia divokého typu AK III lyzinom biosyntetizovaným priamo v bunkách.
4.3. Stabilizácia mutovaných plazmidov lysC*
Plazmidy, ako sú nakreslené na obrázku 6, boli pripravené s lysC* vloženým v oboch smeroch v polohe BamHI plazmidu pVIC40 extrahovaného z kmeňa B-3996. Metóda odberu pVIC40 z kmeňa B-3996 bola opísaná. Boli vybraté vzorka č. 80, ktorá mala vysokú hladinu produkcie treonínu, kvôli lysC*, a vzorka č. 43 na porovnanie. Tým boli získané štyri rôzne plazmidy, t.j. pVICLC*80A, pVICLC *80B, pVICLC*43A a pVTCLC*43B.
Na použitie ako hostiteľa bol kmeň B-399 (kmeň B-3996 s odstráneným pVIC40) novopripravený spracovaním kmeňa B- 3996. Spracovanie sa uskutočnilo opakovaním zriedení 1/100 trikrát L-bujónom bez streptomycínu, vzhľadom na kultúrny roztok kmeňa B-3996. Kultivačná teplota bola 40 °C. Do kmeňa B-399 získaného týmto spôsobom boli - zo štyroch plazmidov s génmi lysC* - vložené pVICLC*80A a pVICLC*43A. a kultivácia sa uskutočnila. Výsledky sú uvedené v tabuľke 10. Kmene, do ktorých boli vložené pVICLC*80A a pVICLC*43A mali zvýšenie výťažku v porovnaní s kontrolným kmeňom (B-3996) transformovaným pVIC40 (v pomere 1,10 vzhľadom k pVICLC*80A a 1,07 vzhľadom na pVICLC*43A).
Tabuľka 10
Plazmid Zvyškový sacharid te/i) Thr (g/i) Výťažok na spotrebovaný sacharid (%)
pVIC40 0,15 14,0 35,7 ( 1,00)
pVICLC * 43A 0,09 14.9 38,0 (1,07)
pVICLC ‘ 80A 0,09 15.3 39,1 ( 1,10)
pV[C40 + pLLC · 43 0,97 15,8 41,1 ( 1,15)
pV[C40 + pLLC * 80 6,15 13,7 41,3 ( 1,16)
Domnievame sa, že zníženie prírastku výťažkov - v porovnaní s výsledkami v časti 4.2. - bolo spôsobené nižším počtom kópií, ktorý vyplýval zo zmeny vektora na pVIC40, ale rast bol rovnaký ako v prípade kmeňa B-3996 a plazmidy boli stabilne udržané.
4.4. Zavedenie mutácie génu lysC* do chromozómov
Do kmeňa B-3996 produkujúceho treonín bol vložený mutantný typ lysC* použitím javu homologickej rekombinácie. Pritom bol ako cieľový gén divoký gén lysC v chromozóme. Použitá metóda je modifikácia metódy Russela et al. (Russel, M. a Model, P., J. Bacteriol., 159. 1034, 1984).
Pokiaľ je hostiteľom mutácia E. coli, t.j. kmeň MM382 (polAts, dostupný v centre genetických zásob E. coli v USA), potom sa plazmid pHSG399 môže replikovať pri teplote 37 “C (dovolená teplota), ale nie pri vyšších teplotách, ako je 42 °C (nedovolená teplota). Táto skutočnosť bola využitá na homologickú rekombináciu.
Najskôr boli pLLC43* a pLLC80* vnesené do mutantného kmeňa MM383 ako hostiteľa pri teplote 37 °C, pri ktorej je replikácia možná. Tým boli získané produkty transformácie MM383/pLLC* 43 a MM383/pLLC* 80. Tieto produkty transformácie boli kultivované pri 42 °C. Selekcia bola uskutočnená z tých, ktorým chýbali plazmidy, ale ktoré boli aj tak rezistentné proti chloramfenikolu. Plazmidy boli vložené do chromozómov týchto kmeňov. Nové získané kmene boli označené MM383-C43 a MM383-C80. Tieto kmene boli infikované fágom PI. Bol pripravený roztok fágu, ktorý' bol použitý na infikáciu kmeňa B-3996. Selekcia sa uskutočnila z kmeňov, ktoré obsahovali gén lysC* prenesený do chromozómov. Za ukazovateľ bola považovaná rezistencia proti chloramfenikolu. Kmene boli nazvané B-3996-C43 a B-3996- C80.
Kultivácia B-3996-C43 a B-3996-C80 sa uskutočnila za rovnakých podmienok ako v 4.1. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 11. Bolo pozorované približne 4 % zlepšenie vo výťažku produkcie treonínu.
Tabuľka 11
Príklad 5
Stanovenie základných sekvencii divokého lysC a mutácie lysC*
5.1.
Sekvencia báz divokého génu lysC bola stanovená použitím DNA sekvencéra ABI model 373A od firmy ABI Co. Výsledok je uvedený v priloženom výpise zo sekvencie SEQ ID Č.: 1. Bolo zistené, že sekvencia sa líši od skôr publikovanej sekvencie báz génu lysC baktérie E. coli K-12 JC411 (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. a Patta, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986) v šiestich bázach (a z toho vyplývajú zmeny vo dvoch zvyškoch aminokyselín). Týchto šesť rozdielov prisudzujeme rozdielom v použitých kmeňoch.
5.2. Sekvencia báz mutácie lysC* odolnej proti spätnoväzbovej inhibícii
Sekvencie báz 14 druhov génu lysC* študovaných v príklade 3 boli stanovené rovnakým spôsobom, ako v 5.1. Body mutácie boli bezpečne zistené. Výsledky sú uvedené v tabuľke 12. Zo 14 druhov boli dva páry presne identické, a ostatných 12 boli skutočné mutácie. Mutácie č. 149, 150, 156, 158, 167, 169 a 172 boli získané spracovaním pomocou hydroxylamínu a č. 24, 43, 48, 60, 80, 117 a 126 spracovaním pomocou NTG. Všetky mutácie boli C-»T alebo G—>A. Mutácia G—>A vznikla mutáciou C—>T na voľnom reťazci.
Tabuľka 12: Identifikácia bodov mutácie lysC*
Druh mutácie LysC* Mutagén ( a ) Body mutácie (zmeny aminokyseliny )
No 126 N GGT ->GA*T (”’’Gly -»Asp 1
No 43 N GGT - >GA’T (u’Gly ->Asp ) GGC->GA’C (**Gly ->Asp)
No 149 H ĽGT -»T'GT (” Arg ->Cys ) GGT »GA*T ->Asp)
No 43l167 N/H CTC ->T*TC f nLeu ->Phe )
No. 150 H ATG-»ATA· (’”Met-»rie)
No. 172 H ™C ->T (latertt ) ATG ->ATA* ('Met ->»e ) GTG-*A‘TG (**Val->Met)
No. !I7 N TCA-»TT*A (M!Ser -»Leu)
No. 158 H GTG -»A*1G ( ”’Val -*Met )
No. 24/80 N/N ACC —*AT*C ( ,52Thr->lle )
No 169 H roC-*T (latenr ) ACC ->AT’C (’”Thr ->lle ) TCT ->TT*T (,wSer ->Phe )
No. 60 N “ieG ~>A ( latcrl ) GAA ->A*AA ('‘Glu ->Lys )
M 156 H AIG-+ATA TGT ->TA‘T C’Cys -»Tyr) W'*C ->T (latent. )
(a) H: ošetrenie s hydroxyliminom, N ošetrenie s NTG
Množstvo dodaného lyzinu |R/I) Thr (8/1) Výťažok na spotrebovaný sacharid ía/«)
B - 3996 (J 14,1 34.8 ( 1.00 )
1 9,9 24,6
B - 3996 - C43 0 14,3 35,4 ( 1,02 )
1 11,4 28,1
B - 3996 - C80 14,6 36,1 ( 1,04 )
U.2 27.7
5.3. Identifikácia domén, ktoré prispievajú k uvoľneniu spätnoväzbovej inhibície
Veľké množstvo mutácií sa objavilo na konci C, a to zvlášť v doméne A (od zvyšku 318. Met ku zvyšku 325. Leu) a v doméne B (od zvyšku 345. Ser ku zvyšku 352. Thr) na obrázku 7 (pozri stĺpec body mutácie v tabuľke 12). Baktéria E. coli má okrem lysC (AK 111) dva typy AK - trhA (AK I-HD 1) a metL(M) (AK II-HD II). Mutácia lysC* má dva body s vysokým stupňom homológie k týmto dvom typom, a tieto dve domény sú považované za aktívne centrá AK (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. a Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261,. 1052, 1986). Domény A a B na konci C sa nachádzajú mimo tieto spoločné domény, a
SK 279915 Β6 teda je veľmi pravdepodobné, že sú to lyzínom riadené domény špecifické pre AK III. Obzvlášť vzorky č. 24/80, 172, 169 a 117 s vysokým stupňom uvoľnenia inhibície mali mutácie v doméne B. ľúto skutočnosť pokladáme za dôležitú. Z 12 typov malo 10 mutácie v doméne A alebo B. Vzorky č. 60 a 158 boli výnimočné, mali nízku hladinu uvoľnenia inhibície a tepelnej stability (pozri tabuľka 7). Považujeme to za výsledok čiastočného uvoľnenia inhibície vyvolaného mutačnou zmenou v štruktúre enzýmu ako celku. Rovnako v prípade mutovaných typov s mnohými bodmi mutácie vzniká otázka, ktorý bod mutácie je účinný. Môže byť podané nasledujúce vysvetlenie založené na porovnaní s mutantnými typmi s jedinou mutáciou v rovnakej pozícii.
(1) Vzorky č. 126 ( 1 bod), 43 (2 body) a 149 (2 body)
Bod mutácie vzorky č. 126 v doméne A je spoločný pre všetky tri typy mutácie, ale stupeň uvoľnenia inhibície je rovnaký pre č. 149 a 126. Dôsledkom väčšieho počtu bodov mutácie vo vzorke č. 43 bol opačný jav. To vedie k predpokladu, že bod mutácie vo vzorke č. 126 v doméne A je ten bod, ktorý je zodpovedný za uvoľnené inhibície.
(2) Vzorky č. 24/80 (1 bod) a 169 (2 body)
Jeden z dvoch bodov mutácie vo vzorke č. 169 je totožný s bodom mutácie v doméne B vzorky č. 24/80. Obidve vzorky majú 100 % uvoľnenia inhibície, a preto bod mutácie vo vzorke č. 24/80 je dostatočný.
(3) Vzorky č. 150 (1 bod) a 172 (2 body)
Vzorka č. 150 má jeden bod mutácie v doméne A, vzorka č. 172 má jednu mutáciu v doméne A (rovnako ako č. 150) a jednu v doméne B. Stupeň uvoľnenia inhibície je väčší vo vzorke č. 172, čo ukazuje, že obidve domény A i B prispievajú k uvoľneniu inhibície.
Autori vynálezu týmto spôsobom identifikovali doménu, ktorá má vzťah k uvoľneniu inhibície aktivity aspartokinázy závislej od lyzinu v doméne A (pokiaľ je to vyjadrené pomocou zvyškov aminokyselín, jc to od zvyšku 318. Met do zvyšku 325. Leu) a v doméne B (pokiaľ je to vyjadrené pomocou zvyškov aminokyselín, je to od zvyšku 345. Ser do zvyšku 352. Thr). Autori vynálezu však neurobili záver, že uvoľnenie inhibície aktivity aspartokinázy závislej od lyzinu nastáva len v prípade, kde sú určité zvyšky aminokyselín premenené na iné určité zvyšky aminokyselín. Napríklad, tabuľka 12 ukazuje, že uvoľnenie spätnoväzbovej inhibície sa objavuje, keď je zmenený 323. zvyšok glycínu na zvyšok kyseliny aspartovej, ale pracovníkovi s obvyklou skúsenosťou v odbore je jasné, že k rovnakému uvoľneniu dochádza pri nahradení zvyškom kyseliny glutamovej, miesto zvyšku kyseliny aspartovej. Niektoré aminokyseliny s podobnou štruktúrou, ako sú kyselina aspartová a kyselina glutamová, sa nazývajú homológne aminokyseliny. O zámene aminokyseliny za jej homológnu aminokyselinu sa predpokladá, že nespôsobí podstatnú zmenu vo funkcii proteínu (zoznam homológnych aminokyselín je uvedený v Proteín Engineering, str. 31, CMC Co.,1985).
Často bolo pozorované, že zámena aminokyseliny za nehomológnu aminokyselinu pôsobí rovnako ako zámena za homológnu aminokyselinu. A naopak, zámena aminokyseliny za homológnu aminokyselinu niekedy vyvolá prekvapujúce zmeny vo funkcii proteínu (Estell, D.A., Graycar, T.P. a Wells, J.A., J. Biol. Chem., 260, 6518, 1988; Schultz, S.C. a Richards, J.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1588, 1986; Yutani, K., et al., J. Biol. Chem., 262,
13429, 1987; Yutani, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4441, 1987; Nishiyama, M,, et al., J. Biol. Chem., 266, 14292, 1991 ).
Podľa predkladaného vynálezu neboli niektoré zvyšky aminokyselín v doménach A a B zmenené, ale pretože funkcie proteínov sú definované na základe doménových jednotiek, je rozumné predpokladať, že uvoľnenie spätnoväzbovej inhibície bude pozorované i po vnesení jednej alebo viacerých mutácií zvyškov aminokyselín do domén, do ktorých teraz vnesené neboli. Bolo zaznamenané množstvo podobných príkladov (Furuya, H., et al., Biochemistry, 28, 6848, 1989; Furuya, H., et al., Bichem. Biophys. Research. Commun., 160, 669, 1989; Cunningham, B.C. a Wells, J.A., Science, 244, 1081, 1989).
Stručne povedané, podstatou predkladaného vynálezu je predkladaný objav domén, ktoré majú vzťah k spätnoväzbovej inhibícii. V príkladoch je uvedené len niekoľko príkladov mutácie v doménach. Ako je však opísané, pracovníkovi s obvyklou skúsenosťou v odbore je jasné, že iné mutácie môžu vyvolať rovnaký efekt. Takéto mutácie sú teda tiež v možnostiach predkladaného vynálezu.
Priemyselná využiteľnosť
Ako je uvedené, boli získané gény AK III pochádzajúce z baktérií Escherichia, ktoré dostatočne uvoľňujú spätnoväzbovú inhibíciu spôsobenú lyzínom. Vnesením týchto génov do baktérií, ktoré produkujú treonín, je možné získať ďalšie baktérie, ktoré produkujú treonín ďaleko lepšie, ako predchádzajúce baktérie. Úspešné použitie týchto baktérii, ktoré produkujú treonín, vytvorilo podstatne lepšiu metódu produkcie L-trconínu ako konvenčné metódy.
Výpis sekvencie
SEQ ID č. 1 Dĺžka sekvencie : 2147
Typ sekvencie : nukleová kyselina
Vláknitosť dvojitá
Topológia lineárna
Typ molekuly: genomická DNA
Pôvodný zdroj
Organizmus Escherichia coli
Kmeň : MC 1061
Znak
Kľúč : -35 signál
Pozícia 242..249
Určujúca metóda: S
Znak
Kľúč : -10 signál
Pozícia: 265..273
Určujúca metóda : S
Znak
Kľúč : primer hind
Pozícia: 2128..2147
Určujúca metóda : E
Znak
Kľúč RBS
Pozícia 574..578
Určujúca metóda : S
Znak
Kľúč mat peptide
Pozícia: 584..1930
Určujúca metóda : S
Znak
Kľúč: terminátor
Pozícia: 1941..1968
Určujúca metóda : S
OPIS SEKVENCIE
TCGAAGTGTT TCTGTAGTCC CTCCCAGGCA AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGMTTGTC AAAATCTCAT GCTTTTAGTG tXGTTACCGT AGCATTTATT AGCTGÄÄCTA CTGACCGCCA
GCGCTCTGCG TTCGATTCAT GTTTTTCATT60
ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAĽA120
AATGTTGACT CTAAÄCCCTT AGCGCAGTGA180
GGACTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT240
CGTTGACAAC CXCCCCCTC AZCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC
CACAAGAGGC GC6TTCCCCA
MAACCCTG TTGGAGGACC CAGT'CTGTG ATAACACCTG
360
AGCGCGTCCA TCGCCGAGCT
VCAACGG CTGCCCACCT TCATCATCGG CTXAGOCGCC
480
ACTTCTCCCT gaäaatacta gcgaagtatC CCTCTCCGCC CACCCCTCíT cccctcttcc
540
595
643
GAA GGA CTG GAA CCT GGC Glu Gly Lau Glu Pio Gly
CAG
Gin n« cii
CTT TCT
GTT Val
691
CTC CTG GTC GCT TTA CCT Leu Leu Vil Ala Leu Ala
CTT ATC Val Íle .10
739
835
B93
931
CAC GCC CAG CTG ATG TCG ACC HÍS Gly Glu Leu Mu t. Ser Thr 123
CTG CTG TTT
Leu Ĺuu Pbé
125
GTT GAC Val Glu
ATĽ CTG CGC GAA íle Leu Arq Glu 13Q
CGC GAT GTT CAC GCA Arg Asp Val Gin Ala
135
CAG TGC TTT GAT GTA CCT Gin Trp Pho Asp Väl ArC
140
AAA GTG ATG CGT ACC
Lys Val Met Arg Thr
145
1027
AAC GAC CCA TTT GCT CGT GCA GAG CCA Aan Asp Arg PMe Gly Arg Ala Glu Fro 150 155
CTC GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT Leu Ala Ala Leu Gin Leu Leu rro Arg 165 170
ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT Thr Gin Gly Phe tie Gly Ser Glu Asn 155
GAT ATA GCC GCG CTC GCC GAA Asp tie Ala Ala Leu Ala Glu 160
CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC Leu Asn Glu Gly LCU Val lle 175 1B0
AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu
190 195
1C75
1123
1171
GGC CGT GCA GGC AGC
Cly Arg Gly Gly Ser
200
GAT TAT ACG GCA CCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA
Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Clu Ala Lau 205 210
1219
CAC GCA Ria Ala
ACC GAC GTC CCC CGC ATC TAC ACC
Thr Asp val Pro Cly íle Tyr Thr 225
126?
ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CCC Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala A1.1 Lys Arg
ATT CAT GAA tie Asp Glu
ATC GCG tie Ala
1315
TTT CCC GAA GCG CCA GAG ATG CCA ACT Phe Ala Glu Ala Ala Glu Het Ala Thr 245 250
CCG GCA ACC TTG CT* CGC GCA GTA CGC Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg
265
GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly 2B0 285
TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT Phe Gly Ala Lys Val Leu His
255 260
AGC GAT ATC CCG GTC TTT CTC Ser Asp íle Pro Val Phe val 2'0 275
CCT ACC CTG GTG TGC AAT AAA Cly Thr Leu Val Cys Asn Lys 290
1363
1411
1459
ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CCC AAT CAG
Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg *rg Asr. Gin 29 5 300 305
1507
ACT CTG CTC ACT Ttic Leu Leu Thr
310
TTG CAC ACC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CCC GGT Leu His Ser Leu Asn Met lutu His Ser Arg Gly 315 320
TTC
Phe
1555
CTC CCG GAA GTT TTC GGC.
325 ** “ 330
ATC CTC CCG CCG CAT AAT ATT tl« Leu Ala Arg His Asn íle 335
TCG GTA GAC
5er val Asp
340
1603
TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG CCA TTA ACC CTT
Leu íle Thr Thr Ser Glu Vul Ser val ALu Leu Thr Leu 345 350
GAT ACC ACC
Asp Thr Thr
355
1651
GCT TCA Gly set
ACC TCC
Thr Set
360
ACT GGC CAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTC CTC ATG Thr Gly Asp Thr Leu l*u Thr Glr. Ser Leu Leu Met 365 3’0
1699
SEQ ID č. 2
Dĺžka sekvencie: 20
Typ sekvencie: nukleová kyselina
Vláknitosť: jednoduchá
Topológia: lineárna
Typ molekuly: iná nukleová kyselina, syntetická DNA OPIS SEKVENCIE
CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG20
SEQ ID č. 3
Dĺžka sekvencie: 18
Typ sekvencie: nukleová kyselina
Vláknitosť: jednoduchá Topológia: lineárna
Typ molekuly: iná nukleová kyselina, syntetická DNA OPIS SEKVENCIE
GAATTCCTTT GCGAGCAG18

Claims (3)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. DNA kódujúca aspartokinázu III, obsahujúca mutovanú sekvenciu aminokyselín, kde sekvencia aminokyselín SEQ ID č, 1 má mutáciu vybratú zo skupiny zahrnujúcej
    i) náhradu zvyšku Gly 323 zvyškom Asp, ii) náhradu zvyšku Gly 323 zvyškom Asp a zvyšku Gly 408 zvyškom Asp, iii) náhradu zvyšku Arg 34 zvyškom Cys a zvyšku Gly 323 zvyškom Asp, i v) náhradu zvyšku Leu 325 zvyškom Phe,
    v) náhradu zvyšku Met 318 zvyškom íle a zvyšku Val 349 zvyškom Met, vi) náhradu zvyšku Ser 345 zvyškom Leu, vii) náhradu zvyšku Val 347 zvyškom Met, viii) náhradu zvyšku Thr 352 zvyškom íle a zvyšku Ser 369 zvyškom Phe, ix) náhradu zvyšku Glu 164 zvyškom Lys a
    x) náhradu zvyšku Met 417 zvyškom íle a zvyšku Cys 419 zvyškom Tyr.
  2. 2. DNA kódujúca aspartokinázu III, obsahujúca mutovanú sekvenciu aminokyselín, kde sekvencia aminokyselín SEQ ID č. 1 má mutáciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej i') náhradu zvyšku Met 318 zvyškom íle a ii') náhradu zvyšku Thr 352 zvyškom lle.
  3. 3. Spôsob výroby L-treonínu, vyznačujúci sa t ý m , že sa kultivuje mikroorganizmus patriaci k rodu Escherichia, ktorý bol transformovaný rekombinovanou DNA zahrnujúcou DNA podľa nároku 1 alebo 2.
SK819-94A 1992-11-10 1993-11-10 Dna kódujúca aspartokinázu iii, transformovaný mik SK279915B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30002192 1992-11-10
PCT/JP1993/001640 WO1994011517A1 (en) 1992-11-10 1993-11-10 Process for producing l-threonine by fermentation
CN94102007A CN1071378C (zh) 1992-11-10 1994-02-15 发酵生产l-苏氨酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK81994A3 SK81994A3 (en) 1995-05-10
SK279915B6 true SK279915B6 (sk) 1999-05-07

Family

ID=36950107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK819-94A SK279915B6 (sk) 1992-11-10 1993-11-10 Dna kódujúca aspartokinázu iii, transformovaný mik

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5661012A (sk)
EP (1) EP0643135B1 (sk)
JP (1) JP3331472B2 (sk)
CN (1) CN1071378C (sk)
AT (1) ATE203769T1 (sk)
CZ (1) CZ285453B6 (sk)
DE (1) DE69330518T2 (sk)
DK (1) DK0643135T3 (sk)
ES (1) ES2158867T3 (sk)
RU (1) RU2113484C1 (sk)
SK (1) SK279915B6 (sk)
WO (1) WO1994011517A1 (sk)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
US5998178A (en) * 1994-05-30 1999-12-07 Ajinomoto Co., Ltd. L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation
HU224158B1 (hu) * 1995-06-13 2005-06-28 Ajinomoto Co., Inc. Eljárás L-lizin előállítására fermentálással
JP4088982B2 (ja) * 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
BR0009550A (pt) * 1999-04-09 2002-02-05 Ajinomoto Kk Bactéria methylophilus, métodos para produzir um l-aminoácido e para produzir células bacterianas de uma bactéria methylophilus com um teor aumentado de um l-aminoácido, e, dna
US6927046B1 (en) * 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
DE60210697T2 (de) 2001-02-13 2007-04-05 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia
DE10116518A1 (de) * 2001-04-03 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
US7052883B2 (en) 2001-04-03 2006-05-30 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae that contain an attenuated fruR gene
US20050059124A1 (en) * 2001-07-18 2005-03-17 Mechthild Rieping Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced suca or sucb gene
ATE470711T1 (de) 2001-11-23 2010-06-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur l-aminosäureproduktion mit escherichia
DE10210960A1 (de) * 2002-03-13 2003-09-25 Degussa Verfahren zur fermentativen Hestellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP1483387B1 (en) * 2002-03-13 2008-07-02 Evonik Degussa GmbH Process for the preparation of l-threonine using strains of the family enterobacteriaceae
WO2003076629A2 (en) * 2002-03-13 2003-09-18 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
DE10231115A1 (de) * 2002-07-10 2004-01-22 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterbacteriaceae
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
RU2276687C2 (ru) * 2003-07-16 2006-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-гистидина и способ получения l-гистидина
EP1650296B1 (en) * 2003-07-16 2012-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Mutant serine acetyltransferase and process for producing l-cysteine
RU2276688C2 (ru) * 2003-08-29 2006-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia,- ПРОДУЦЕНТ L-ГИСТИДИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГИСТИДИНА
US20050176033A1 (en) * 2003-11-10 2005-08-11 Klyachko Elena V. Mutant phosphoribosylpyrophosphate synthetase and method for producing L-histidine
KR100608085B1 (ko) * 2004-02-05 2006-08-02 씨제이 주식회사 ｔｙｒＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
US20050181488A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Akhverdian Valery Z. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia
US7915018B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
US20070212764A1 (en) * 2005-01-19 2007-09-13 Ptitsyn Leonid R Method for producing l-amino acids using bacterium of the enterobacteriaceae family
JP2007185184A (ja) * 2005-12-16 2007-07-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP1976994A1 (en) 2006-01-26 2008-10-08 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009095237A (ja) 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) * 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2007119574A2 (en) 2006-03-23 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
JP2009060791A (ja) 2006-03-30 2009-03-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007119890A1 (en) 2006-04-18 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) * 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
RU2337961C2 (ru) * 2006-07-04 2008-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН rspAB
CN101490251B (zh) * 2006-07-19 2016-06-29 味之素株式会社 使用肠杆菌科细菌产生l-氨基酸的方法
RU2355763C2 (ru) 2006-09-13 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008072761A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
KR100868330B1 (ko) 2007-02-01 2008-11-12 씨제이제일제당 (주) 엘-쓰레오닌의 제조방법
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008109237A2 (en) * 2007-02-13 2008-09-12 Washington State University Research Foundation Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010263790A (ja) * 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
RU2395579C2 (ru) * 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
RU2396336C2 (ru) 2007-09-27 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
BRPI0906795A2 (pt) 2008-01-23 2015-08-18 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
WO2010002876A2 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for enhanced amino acid levels in plants
EP2336347B1 (en) 2008-09-08 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid
JP5504608B2 (ja) * 2008-10-23 2014-05-28 東レ株式会社 １，５−ペンタンジアミンの製造方法
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2008148283A (ru) 2008-12-09 2010-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА artI
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
BRPI1007069A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido.
JP5521347B2 (ja) 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
BRPI1014661B1 (pt) 2009-07-29 2020-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012196144A (ja) 2009-08-03 2012-10-18 Ajinomoto Co Inc ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2009136544A (ru) 2009-10-05 2011-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR101270149B1 (ko) 2009-11-25 2013-06-04 한국과학기술원 Ｌ­이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물 및 이의 제조방법
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
RU2460793C2 (ru) * 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
EP2363489A1 (en) * 2010-03-03 2011-09-07 Technische Universität Hamburg-Harburg Enzyme Aspartokinase III having a reduced L-lysine feedback inhibition
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
RU2010122646A (ru) 2010-06-03 2011-12-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2496867C2 (ru) 2011-04-25 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
JP2015013812A (ja) 2011-11-01 2015-01-22 味の素株式会社 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法
RU2012112651A (ru) 2012-04-02 2013-10-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") САМОИНДУЦИРУЕМАЯ ЭКСПРЕССИОННАЯ СИСТЕМА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЕЗНЫХ МЕТАБОЛИТОВ С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2550269C2 (ru) 2012-08-17 2015-05-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, СОДЕРЖАЩЕЙ N-АЦЕТИЛОРНИТИНДЕАЦЕТИЛАЗУ С НАРУШЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
CN103667165B (zh) * 2012-09-12 2017-05-31 中国科学院上海生命科学研究院 高产l‑赖氨酸的生产菌株及其应用
CN103773745B (zh) * 2012-10-18 2018-03-23 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用
CN103215286B (zh) * 2012-11-12 2015-11-25 江南大学 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
WO2015050234A1 (ja) 2013-10-02 2015-04-09 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
RU2013147882A (ru) 2013-10-28 2015-05-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕН ПУТЬ ДЕГРАДАЦИИ ПУТРЕСЦИНА
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015114955A (ru) 2015-04-22 2016-11-10 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-изолейцина с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой сверхэкспрессирован ген cycA
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
EP3420096A1 (en) 2016-02-25 2019-01-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR102011994B1 (ko) * 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
BR112020012044A2 (pt) 2017-12-26 2020-11-24 Ajinomoto Co., Inc. método para produzir glicina ou um sal da mesma, e, bactéria produtora de glicina.
WO2019212052A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-METHIONINE USING A BACTERIUM OF THE GENUS Pantoea
EP3856918A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-methionine using a bacterium
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
BR112021011882A2 (pt) 2018-12-27 2021-09-08 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido básico
WO2020171227A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE
BR112021017870A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
JP2022550084A (ja) 2019-09-25 2022-11-30 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU943282A1 (ru) 1979-07-13 1982-07-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени L-треонина
JPS55131397A (en) 1979-04-02 1980-10-13 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-threonine by fermentation
JPS5931691A (ja) 1982-08-16 1984-02-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法
DE243496T1 (de) * 1985-08-26 1988-06-30 Toray Industries, Inc., Tokio/Tokyo, Jp Verfahren zur herstellung von l-threonin durch gaerung.
FR2627508B1 (fr) 1988-02-22 1990-10-05 Eurolysine Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede
DE3891417T1 (de) 1988-10-25 1991-01-10 Vnii Genetiki Selektsii Promy Stamm der bakterien escherichia coli bkiim b-3996, produziert von l-threonin
DE69332974T2 (de) * 1992-03-19 2004-05-19 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Nukleinsäurefragmente und verfahren zur steigerung des lysin- und threoningehaltes der pflanzensamen

Also Published As

Publication number Publication date
EP0643135A1 (en) 1995-03-15
CN1107179A (zh) 1995-08-23
JP3331472B2 (ja) 2002-10-07
ATE203769T1 (de) 2001-08-15
WO1994011517A1 (en) 1994-05-26
SK81994A3 (en) 1995-05-10
ES2158867T3 (es) 2001-09-16
DE69330518D1 (de) 2001-09-06
EP0643135A4 (en) 1997-04-09
RU94035744A (ru) 1996-10-20
CZ165894A3 (en) 1994-12-15
RU2113484C1 (ru) 1998-06-20
US5661012A (en) 1997-08-26
DK0643135T3 (da) 2001-10-15
DE69330518T2 (de) 2002-05-08
EP0643135B1 (en) 2001-08-01
CZ285453B6 (cs) 1999-08-11
CN1071378C (zh) 2001-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK279915B6 (sk) Dna kódujúca aspartokinázu iii, transformovaný mik
KR100430168B1 (ko) L-라이신에의한피이드백억제가해제된에스케리키아속세균의아스파르토키나제iii를암호화하는dna,당해dna를지닌미생물및당해미생물을이용한l-아미노산의생산방법
JP3132497B2 (ja) 発酵法によるｌ−リジンの製造法
JP3783065B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
EP0358940B1 (en) DNA fragment coding for phosphoenolpyruvat corboxylase, recombinant DNA carrying said fragment, strains carrying the recombinant DNA and method for producing L-aminino acids using said strains
CZ174697A3 (en) Gene encoding lysinedecarboxylase, micro-organism and process for preparing l-lysine
EP0834559B1 (en) Process for producing l-lysine by fermentation
KR100319566B1 (ko) 발효법에의한l-트레오닌의생산방법
MXPA97007921A (en) Procedure for the production of l-aminoacidomediantefermentac
MXPA97010044A (en) Method to produce l-lysine by means of fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20111110