HU224158B1 - Eljárás L-lizin előállítására fermentálással - Google Patents
Eljárás L-lizin előállítására fermentálással Download PDFInfo
- Publication number
- HU224158B1 HU224158B1 HU9900149A HUP9900149A HU224158B1 HU 224158 B1 HU224158 B1 HU 224158B1 HU 9900149 A HU9900149 A HU 9900149A HU P9900149 A HUP9900149 A HU P9900149A HU 224158 B1 HU224158 B1 HU 224158B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- residue
- lysine
- gene
- bacterium
- dna
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 262
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title abstract description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title abstract description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 131
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 129
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 104
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 99
- 241000607720 Serratia Species 0.000 claims abstract description 75
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 69
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 57
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 claims description 55
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 46
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 18
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical class N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 13
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 13
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 10
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 8
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 7
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 7
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 101000779368 Bacillus subtilis (strain 168) Aspartokinase 3 Proteins 0.000 claims description 5
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 121
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 120
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 102
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 57
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 49
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 49
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 48
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 44
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 41
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 35
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 101150075693 AK gene Proteins 0.000 description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 29
- 101000779367 Escherichia coli (strain K12) Lysine-sensitive aspartokinase 3 Proteins 0.000 description 28
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 27
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 22
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 13
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 5
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000007160 ty medium Substances 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 3
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical class Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 3
- 150000008545 L-lysines Chemical class 0.000 description 3
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 3
- 101150000582 dapE gene Proteins 0.000 description 3
- 101150057904 ddh gene Proteins 0.000 description 3
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound CN=C(N)NN=O DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100206315 Clostridium perfringens tetP gene Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- YKZPPPNXRZHVGX-PXYKVGKMSA-L dipotassium;(2s)-2-aminobutanedioate;hydron;hydrate Chemical compound [H+].[H+].O.[K+].[K+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC([O-])=O.[O-]C(=O)[C@@H](N)CC([O-])=O YKZPPPNXRZHVGX-PXYKVGKMSA-L 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229940068988 potassium aspartate Drugs 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N s-(2-aminoethyl)-l-cysteine Chemical compound NCCSCC(N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 2
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AQVDGWSWFLGAHQ-PIKHSQJKSA-N (2r)-2-amino-3-phosphonobutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C(C(O)=O)P(O)(O)=O AQVDGWSWFLGAHQ-PIKHSQJKSA-N 0.000 description 1
- UWOCFOFVIBZJGH-YFKPBYRVSA-N (S)-2,3-dihydrodipicolinic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CC=CC(C(O)=O)=N1 UWOCFOFVIBZJGH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 10,10-diamino-1,6-dioxacyclotridecane-2,5,7,13-tetrone Chemical compound NC1(CCC(=O)OC(CCC(=O)OC(CC1)=O)=O)N VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWOCFOFVIBZJGH-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrodipicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1CC=CC(C(O)=O)=N1 UWOCFOFVIBZJGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 101100499417 Chlamydia pneumoniae dnaA1 gene Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101000779372 Escherichia coli (strain K12) Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010009197 Succinyldiaminopimelate transaminase Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 101150005180 dapA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070277 dapA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 101150020338 dnaA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015094 jam Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 125000000018 nitroso group Chemical group N(=O)* 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091006091 regulatory enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
A találmány Serratia nemzetségbe tartozó baktériumra vonatkozik, amelyEscherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó, L-lizin általifeed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt tartalmazódihidropikolinát-szintázt kódoló DNS-sel van transzformálva, és adottesetben L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációttartalmazó aszpartokinázt is hordoz. A találmány tárgya továbbáeljárás L-lizin előállítására a találmány szerinti, a Serratianemzetségbe tartozó transzformált baktérium fermentálásával.
Description
A találmány a mikrobiológia területére, és közelebbről L-lizin fermentálással történő előállítására alkalmas eljárásra, valamint a fenti eljárásban alkalmazott DNS-ekre és mikroorganizmusokra vonatkozik.
Az L-lizin fermentálással történő előállítására szolgáló ismert eljárásokban a mikrobatörzset természetes környezetből izolálják, vagy egy ilyen mikrobatörzsből kapott mesterséges mutáns törzset alkalmaznak a termelékenység növelésére. Számos mesterséges mutáns törzs ismert, amely L-lizint termel. Ezek többsége S-(2-amino-etil)-ciszteinnel (AEC) szemben rezisztens mutáns törzs, és a Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia vagy Serratia nemzetségbe tartozik. Ezenkívül ismertek különféle módszerek is az aminosavtermelés fokozására, így például rekombináns DNS alkalmazásával kapott transzformánsok alkalmazása (US 4 278 765 számú szabadalmi leírás).
A Serratia nemzetségbe tartozó baktériumokat például széles körben alkalmazzák különféle aminosavak, például L-prolin, L-hísztidin, L-arginin, L-treonin, L-valin és L-izoleucin termelésére, és aminosavtermelő baktériumként ezek kiváló tulajdonságokkal rendelkeznek több szempontból is [lásd például „Oyo Bunshi Idengaku (Applied Molecular Genetics), kiadó: Kodansha Scientific, ISBN 4-06-139659-5 (1986}; és .Aminosan Hakko (Amino Acid Fermentation)”, kiadó: Gakkai Shuppan Center, ISDBN 4-7622-9454-3 (1986)]. Ismertették különféle aminosavak előállítását a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok alkalmazásával. Az egyik ilyen publikációban [JP 51-9393 (1976) számon publikált szabadalmi leírás] leírták, hogy az L-lizint 5,4% hozammal állították elő ilyen baktériummal (a hozamot úgy számították ki, hogy a termelt L-lizin-HCI-só koncentrációját osztották a szénforrás kiindulási koncentrációjával).
A Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok egyik képviselője, a Serratia marcescens, az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokhoz hasonlít génszerkezetében és a génexpresszió és -szabályozás mechanizmusában, továbbá az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokban a DNS rekombinálására alkalmazható klónozóvektorok a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumokban is alkalmazhatók [JP 2-27980 (1990) és 5-10076 (1993) számon publikált szabadalmi leírások].
Ismert továbbá, hogy a dihidrodipikolinát-szintáz (DDPS) egy olyan enzim, amely a dihidrodipikolinsav előállítása során az aszpartoszemialdehidet és piroszőlősavat dehidratálja és kondenzálja. Ez a reakció az aszparaginsavcsaládba tartozó aminosavak bioszintézisében az L-lizin-bioszintézis-rendszerhez vezető leágazásnál lokalizálódik. Ismert, hogy ez az enzim az L-lizin bioszintézisének fontos szabályozóhelyéért felelős, ugyanúgy, mint az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokban az aszpartokináz.
A DDPS-t egy dapA-nak nevezett gén kódolja
E. coliban (Escherichia coli). A dapA-t klónozták, és bázisszekvenciáját is meghatározták [Richaud F. és munkatársai, J. Bacteriol., 297 (1986)].
Másrészről az aszpartokináz (amelynek rövidítése a továbbiakban AK) egy olyan enzim, amely az aszparaginsavat β-foszfo-aszparaginsawá alakító reakciót katalizálja, és fő szabályozóenzim szerepet tölt be az aszparaginsavcsaládba tartozó aminosavak bioszintézis-rendszerében. Az E. coli AK enzimjének három típusa van (AKI, AKII, AKIII), amelyek közül kettő komplex enzim homoszerin-dehidrogenázzal (amelynek rövidítése a továbbiakban helyenként HD). A komplex enzimek egyike az AKI-HDI, amelyet a thrA gén kódol, és a másik az AKII-HDII, amelyet a metLM gén kódol. Az AKI-et a treonin és izoleucin együttesen szuppresszálja, és a treonin gátolja, míg az AKII-t a metionin szuppresszálja.
Ezzel szemben ismert, hogy csak az AKIII egyszerű funkciójú enzim, amelyet a lysC gén termel, és amelyre az L-lizin fejt ki szuppressziót és feed-back gátlást. Az AKI:AKII:AKIII intracelluláris aktivitásának aránya körülbelül 5:1:4.
A DDPS-t és az AKIll-at - mint fent említettük - az L-lizin feed-back gátlással gátolja, és ez akadályozza az L-lizin hatékony termelését. Várható, hogy az L-lizin akkor termelhető hatékonyan fermentálással Serratia nemzetségbe tartozó baktérium alkalmazásával, ha a DDPS vagy AKIII enzim egy olyan mutánsát elő tudjuk állítani, amely az L-lizin általi feed-back gátlásra nem érzékeny. Azonban a szakirodalomban nem írták le a DDPS mutáns enzimjét, és noha egy publikációban leírták az AKIII mutáns enzimjét [Boy és munkatársai, J. Bacteriol. 112, 84 (1972)], nincs példa, amelyből arra lehetne következtetni, hogy ez a mutáns enzim javíthatja az L-lizin-termelést. Ezenkívül ezek az enzimek nem ismertek a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok L-lizin-bioszintézis-rendszerének génjei vonatkozásában.
A találmány célja - fentiek figyelembevétel - L-lizin általi feed-back gátlásra eléggé érzéketlenné tett DDPS és AK, és közelebbről Serratia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó DDPS és AKIII előállítása volt, valamint olyan eljárás kidolgozása volt L-lizin előállítására Serratia nemzetségbe tartozó baktérium alkalmazásával, amely hatékonyabb, mint a technika állásából ismert eljárások.
A kitűzött célokat úgy sikerült megvalósítanunk, hogy előállítottunk egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó, L-lizin általi feed-back gátlásra eléggé érzéketlenné tett DDPS-t kódoló DNS-t. Az E. coliból származó, L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett DDPS-t kódoló DNS-t a leírásban mutáns dapA-nak vagy dapA*-nak nevezzük.
Ezenkívül előállítottunk egy olyan Serratia nemzetségbe tartozó baktériumot is, amely L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett aszpartokinázt és L-lizin általi feed-back gátlásra eléggé érzéketlenné tett DDPS-t hordoz. Az E. coliból származó, L-lizin általi feed-back gátlásra eléggé érzéketlenné tett aszpartokinázt kódoló DNS rövidítése a leírásban helyenként mutáns lysC vagy lysC*.
Előállítottunk továbbá egy olyan Serratia nemzetségbe tartozó baktériumot, amely mutáns dapA-t és mutáns lysC-t hordoz. Azt találtuk, hogy a Serratia nemzetségbe tartozó fent említett baktérium megfelelő
HU 224 158 Β1 tápközegben végzett tenyésztése során a tenyészlében jelentős mennyiségű L-lizin termelődik és halmozódik fel.
A találmány tárgya tehát egy Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amelyet úgy transzformáltunk, hogy a baktériumsejtbe bevezettünk egy L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt tartalmazó dihidropikolinát-szintázt kódoló DNS-t. A dihidropikolinát-szintáz például egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó enzim lehet. Az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó dihidropikolinát-szintázt tekintve az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutáció például a 81. alaninmaradék helyettesítése valinmaradékkal, vagy a 118. hisztidinmaradék helyettesítése tirozinmaradékkal, vagy a 81. alaninmaradék helyettesítése valinmaradékkal, és a 118. hisztidinmaradék helyettesítése tirozinmaradékkal a dihidropikolinát-szintáz 4. azonosító számú aminosavszekvenciájában az N-terminális aminosavtól számítva. A dihidropikolinát-szintáz egy Serratia nemzetségbe tartozó baktériumban előforduló enzim is lehet, feltéve, hogy L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációval rendelkezik.
A találmány továbbá a Serratia nemzetségbe tartozó, L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett aszpartokinázt hordozó baktériumra is vonatkozik. A Serratia nemzetségbe tartozó, L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett aszpartokinázt hordozó baktériumot úgy állíthatjuk elő, hogy a baktériumsejtbe bevezetünk egy L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt tartalmazó, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó aszpartokináz lll-at kódoló DNS-t.
Az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó aszpartokináz III L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációja például egy olyan mutáció lehet, amikor a 323. glicinmaradékot egy aszparaginsavmaradék helyettesíti, vagy a 323. glicinmaradékot egy aszparaginsavmaradék és a 408. glicinmaradékot egy aszparaginsavmaradék helyettesíti, a 34. argininmaradékot egy ciszteinmaradék és a 323. glicinmaradékot egy aszparaginsavmaradék helyettesíti, a 325. leucinmaradékot egy fenil-alaninmaradék és a 318. metioninmaradékot egy izoleucinmaradék helyettesíti, a 318. metioninmaradékot egy izoleucinmaradék és a 349. valinmaradékot egy metioninmaradék helyettesíti, a 345. szerinmaradékot egy leucinmaradék helyettesíti, a 347. valinmaradékot egy metioninmaradék helyettesíti, a 352. treoninmaradékot egy izoleucinmaradék helyettesíti, a 352. treoninmaradékot egy izoleucinmaradék és a 369. szerinmaradékot egy fenil-alaninmaradék helyettesíti, a 164. glutaminsavmaradékot egy lizinmaradék helyettesíti, és a 417. metioninmaradékot egy izoleucinmaradék és a 419. ciszteinmaradékot egy tirozinmaradék helyettesíti, ahol az aminosavak számozása aszpartokináz III 8. azonosító számú aminosavszekvenciájában az N-terminálistól kezdődik.
Magától értetődően az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett aszpartokináz egy Serratia nemzetségbe tartozó baktérium enzimje is lehet.
Az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt tartalmazó dihidrodipikolinát-szintázt kódoló DNS és az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt tartalmazó aszpartokinázt kódoló DNS a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjében azonos plazmidon vagy különálló plazmidokon fordulhat elő.
A Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amely L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt tartalmazó dihidrodipikolát-szintázt kódoló DNS-t tartalmaz, például egy lizin-dekarboxiláz-hiányos baktérium lehet.
A találmány tárgya továbbá eljárás L-lizin előállítására, oly módon, hogy egy Serratia nemzetségbe tartozó, fent definiált baktériumot megfelelő közegben tenyésztünk, amelynek során a baktérium a tenyésztőközegben L-lizint termel és halmoz fel, és az L-lizint a tenyészetből összegyűjtjük.
A leírásban DDPS-t vagy AKIII-at kódoló DNS-t, vagy a fentieken kívül egy promotert is tartalmazó DNS-t DDPS génnek vagy AKIN génnek nevezünk. Ezenkívül mutáns enzimnek nevezzük azt az enzimet, amelyet L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tettünk, míg azt a DNS-t, amely ezt az enzimet kódolja, vagy ezenkívül még egy promotert is tartalmaz, mutáns génnek nevezzük. Ezenkívül L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett alatt azt értjük, hogy elegendő a gátlással szemben nagymértékben érzéketlenné tétel, a teljes érzéketlenné tétel nem szükséges.
A találmányt részletesen az alábbiakban ismertetjük. <1> Találmány szerinti eljárásban alkalmazott mutáns dihidropikolinát-szintázt (DDPS) kódoló DNS
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott mutáns DDPS-t kódoló DNS a vad típusú DDPS-t kódoló DNS-ben egy olyan mutációt tartalmaz, amely érzéketlenné teszi a kódolt DDPS-t az L-lizin általi feed-back gátlásra. A DDPS Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokból, különösen E. coliból származó DDPS lehet. Ezenkívül Serratia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó DDPS is alkalmazható, feltéve, hogy az tartalmaz egy L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt. Az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó DDPS L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációja például az alábbi lehet:
1. a 81. alaninmaradék helyettesítése valinmaradékkal;
2. a 118. hisztidinmaradék helyettesítése tirozinmaradékkal; és
3. a 81. alaninmaradék helyettesítése valinnal, és a 118. hisztidinmaradék helyettesítése tirozinnal;
a szekvenciái istában 4. azonosító számú aminosavszekvenciával rendelkező DDPS N-terminálisától számítva.
A vad típusú DDPS-t kódoló DNS nem különösebben kritikus, amennyiben az Escherichia vagy Serratia nemzetségbe tartozó baktériumból származó DDPS-t kódol. Az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó DDPS-t kódoló DNS konkrétan a 4. azonosító számú aminosavszekvenciát kódoló DNS lehet,
HU 224 158 Β1 és ez továbbá konkrétan a 3. azonosító számú bázisszekvenciában a 272-1147. számú bázisokat tartalmazó DNS-t jelenti. Ezekben a szekvenciákban a fenti aminosavmaradék-helyettesítéseket okozó, bázisszekvenciában bekövetkezett mutációkat tartalmazó szekvenciák jelentik a találmány szerinti mutáns DDPS-t kódoló DNS-t. A helyettesített aminosavmaradéknak megfelelő bármely kodon alkalmazható, fajtájától függetlenül, feltéve, hogy ugyanazt az aminosavmaradékot kódolja. Ezenkívül kikötjük, hogy a kódolt DDPS-ek szekvenciája csekély mértékben eltérő lehet a különböző baktériumfajokban és baktériumtörzsekben, ha azonban a bennük lévő aminosavmaradék-helyettesítések, deléciók és inszerciók olyan helyzetben vannak, amelyek az enzimaktivitás szempontjából nem számottevők, az ilyen, ezeket kódoló mutáns DDPS gének szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.
A fent definiált mutáns gének előállítására szolgáló eljárás az alábbi lehet. Először a vad típusú DDPS gént vagy a DDPS enzim aktivitását károsan lényegében nem befolyásoló mutációt tartalmazó DDPS gént tartalmazó DNS-t in vitro mutációs kezelésnek vetjük alá, és a mutációs kezelés után a DNS-t egy, a gazdához illő DNS-vektorral lígáljuk, így kapjuk a rekombináns DNS-t. A rekombináns DNS-t egy gazdamikroorganizmusba bevezetve kapjuk a transzformánsokat. Az így kapott transzformánsok közül kiválasztjuk azt, amely a mutáns DDPS-t expresszálja, vagyis azt a transzformánst, amely egy mutáns gént tartalmaz. Alternatív módon vad típusú DDPS gént vagy más mutációt tartalmazó DDPS gént tartalmazó DNS-t is ligálhatunk egy, a gazdához illő vektor-DNS-sel, és így állítjuk elő a rekombináns DNS-t. A rekombináns DNS-t ezután in vitro mutációs kezelésnek vetjük alá, és a mutációs kezelés után a rekombináns DNS-t egy gazdamikroorganizmusba vezetve állítjuk elő a transzformánsokat. A fenti transzformánsok közül kiválasztjuk a mutáns DDPS-t expresszáló transzformánst, vagyis azt, amely mutáns gént tartalmaz.
Úgy is eljárhatunk, hogy egy vad típusú enzimet termelő mikroorganizmust vetünk alá mutációs kezelésnek, és ezzel olyan mutáns törzset állítunk elő, amely a mutáns enzimet termeli, majd a mutáns törzsből előállítjuk a mutáns gént. Alternatív módon egy olyan transzformánst vetünk alá mutációs kezelésnek, amelybe egy vad típusú génnel ligáit rekombináns DNS-t vezettünk be, és így állítjuk elő a mutáns enzimet termelő mutáns törzset. Ha ezután a rekombináns DNS-t a mutáns törzsből kinyerjük, a fenti DNS egy mutáns gént fog tartalmazni.
A DNS in vitro mutációs kezelésére alkalmas szer például a hidroxil-amin és hasonlók. A hidroxil-amin egy kémiai mutagén szer, amely citozin->timin mutációt okoz a citozin N4-hidroxi-citozinná alakítása révén. Alternatív módon, amikor magát a mikroorganizmust vetjük alá mutációs kezelésnek, a kezelést ultraibolyafény-besugárzással vagy mesterséges mutációk létrehozására szokásosan alkalmazott mutagén szerrel, például N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel (NTG) vagy salétromossawal végezzük.
Vad típusú DDPS gént vagy egyéb mutációt tartalmazó DDPS gént tartalmazó DNS-hez donormikroorganizmusként bármely Escherichia vagy Serratia nemzetségbe tartozó mikroorganizmust alkalmazhatunk. Közelebbről, az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusként alkalmazhatók a Neidhardt és munkatársai által ismertetett mikroorganizmusok (Neidhardt F. C. és munkatársai, Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society fór Microbiology, Washington D. C., 1208,1. táblázat). Közelebbről említhetjük az E. coli JM109 törzset és az MC1061 törzset. Ha DDPS gént tartalmazó DNS-hez donormikroorganizmusként egy vad törzset alkalmazunk, vad típusú DDPS gént tartalmazó DNS-t kapunk.
Másrészről a Serratia nemzetségbe tartozó mikroorganizmus lehet például Serratia marcescens, például a Serratia marcescens AJ13125 törzs (FERM BP-5441).
(1) Vad típusú DDPS gén előállítása
DDPS gént tartalmazó DNS előállítását az alábbiakban ismertetjük. Az előállítást itt az E. coli vonatkozásában ismertetjük, de egyéb Escherichia nemzetségbe vagy Serratia nemzetségbe tartozó baktériumból is hasonló módon állíthatjuk elő a DDPS gént.
Először a vad típusú dapA-t tartalmazó E. coli, például az MC1061 törzs tenyésztésével előállítunk egy tenyészetet. Amikor a fent ismertetett mikroorganizmust tenyésztjük, a tenyésztést szokásos szilárd tápközeges módszerrel is végezhetjük, előnyösen azonban folyékony tápközeges módszerrel végezzük a tenyésztést, ha figyelembe vesszük a baktérium összegyűjtésének hatékonyságát. Tápközegként egy vagy több nitrogénforrást, például élesztőextraktumot, peptont, húskivonatot, kukoricalekvárt vagy szójabab- vagy búzaexudátumot alkalmazhatunk, egy vagy több szervetlen sóval, például kálium-dihidrogén-foszfáttal, dikálium-hidrogén-foszfáttal, magnézium-szulfáttal, nátrium-kloriddal, magnézium-kloriddal, vas(lll)-kloriddal, vas(lll)-szulfáttal vagy mangán-szulfáttal, és kívánt esetben megfelelő mennyiségű cukortartalmú anyaggal, vitaminnal vagy hasonlóval együtt. A tápközeg kiindulási pH-értékét 6-8-ra állítjuk be. A tenyésztést 4-24 órán keresztül 30-42 °C-on végezzük, előnyösen 37 °C-on, mélykultúrában levegőztetéssel és keveréssel, rázott tenyészetben vagy álló tenyészetben vagy hasonló módon.
A tenyészetet ezután például 3000 fordulat/perccel 5 percen keresztül centrifugálva kapjuk az E. coli MC1061 törzs sejtüledékét. A sejtüledékből például Saito és Miura [Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)] vagy K. S. Kirby [Biochem. J. 64, 405 (1956)] módszerével állíthatunk elő kromoszomális DNS-t.
Az így kapott kromoszomális DNS-ből a DDPS gén izolálására egy kromoszomális DNS-könyvtárat állítunk elő. Először a kromoszomális DNS-t részlegesen emésztjük különféle restrikciós enzimekkel, így különféle fragmentumok elegyét kapjuk. A restrikciós enzimek széles választéka alkalmazható, ha a hasítás mértéke szabályozható a hasítási reakció idejével vagy hasonlóval. így például a kromoszomális DNS-t Sau4
HU 224 158 Β1
3AI-gyel legalább 30 °C hőmérsékleten, előnyösen 37 °C-on 1-10 egység/ml enzim koncentráció mellett különféle időkön keresztül (1 perc-2 óra) reagáltatva emésztjük a DNS-t.
Ezután a kapott DNS-ffagmentumokat az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokban autonóm módon replikálódó vektor-DNS-sel ligáivá rekombináns DNS-t állítunk elő. Konkrétan, a vektor-DNS-t a Sau3AI restrikciós enzimmel előállított terminális bázisszekvenciával komplementer szekvenciát generáló restrikciós enzimmel, például BamHI-gyel hasítjuk legalább 30 °C hőmérsékleten, 1-100 egység/ml enzim koncentráció mellett, legalább 1 órán, előnyösen 1-3 órán keresztül, így teljesen emésztett és szétvágott és hasított DNS-t kapunk. Ezután a fenti módon kapott kromoszomális DNS-fragmens-elegyet a hasított és vágott vektorDNS-sel elegyítjük DNS-ligáz, előnyösen T4 DNS-ligáz jelenlétében 4-16 °C-on, 1-100 egység/ml enzim koncentráció mellett, legalább 1 órán, előnyösen 6-24 órán keresztül, ily módon kapjuk a rekombináns DNS-t.
A kapott rekombináns DNS-t alkalmazzuk az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmus transzformálására, például egy DDPS-hiányos mutáns törzset, például Escherichia coli K-12 törzset, előnyösen JE7627 törzset (ponB704 dacB12 pfv+ tonA2 dapA lysA strma1A38 metB1 ilvH611 leuA371 proA3 lac-3tsx-76) transzformálva kromoszomális DNS-könyvtárat állítunk elő. A transzformációt például D. M. Morrison [Methods in Enzymology 68, 326 (1979)] módszerével vagy egy olyan módszerrel végezhetjük, amelyben a recipiens baktériumsejteket kalcium-kloriddal kezeljük a DNS permeabilitásának fokozására [Mandel M. és Higa A., J. Mól. Bioi. 53, 159 (1970)]. A JE7627 törzs a National Institute of Geneticstől szerezhető be (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japán).
A kapott kromoszomális DNS-könyvtárból a DDPS gén rekombináns DNS-ét tartalmazó baktériumtörzset azok a törzsek képviselik, amelyek megnövekedett DDPS-aktivitással rendelkeznek, vagy azok a törzsek, amelyekben a DDPS gén hiányából származó auxotrófia kiegészül. Például a DDPS-hiányos mutáns törzs szaporodásához diamino-pimelinsavat igényel. Ezért amikor DDPS-hiányos mutáns törzset alkalmazunk gazdaként, a DDPS gént tartalmazó DNS-fragmentumot úgy állíthatjuk elő, hogy izoláljuk azt a baktériumtörzset, amely képessé vált diamino-pimelinsavat nem tartalmazó tápközegen szaporodni, és a kapott baktériumtörzsből visszanyerjük a rekombináns DNS-t.
Azt a kérdést, hogy egy DDPS gént tartalmazó rekombináns DNS-t tartalmazó törzs ténylegesen hordoz-e olyan rekombináns DNS-t, amelyben a DDPS gén klónozva van, úgy dönthetjük el, hogy a kérdéses törzsből sejtextraktumot készítünk, és abból nyers enzimoldatot állítunk elő, majd megvizsgáljuk, hogy a DDPS-aktivitás növekedett-e vagy sem. A DDPS enzim aktivitását Yugari és munkatársai módszere szerint határozhatjuk meg [Yugari Y. és Gilvarg C., J. Bioi. Chem. 240, 4710(1962)].
A DDPS gént tartalmazó DNS-t vektor-DNS-be inszertálva tartalmazó rekombináns DNS-t például P.
Guerry és munkatársai [J. Bacteriol. 116, 1064 (1973)] vagy D. B. Clewell [J. Bacteriol. 110, 667 (1972)] módszerével izolálhatjuk a fenti baktériumtörzsből.
A vad típusú DDPS gén egy kromoszómájában DDPS gént tartalmazó törzsből előállítjuk a kromoszomális DNS-t Saito és Miura módszerével vagy hasonló módon, és a DDPS gént polimeráz-láncreakció (PCR)-módszerrel [White T. J. és munkatársai, Trends Génét. 5, 185 (1989)] felerősítjük. A felerősítésre alkalmazott DNS-primerek azok, amelyek a DDPS gén teljes vagy parciális régióját tartalmazó kettős szálú DNS mindkét 3'-terminálisával komplementerek. Ha a DDPS génnek csak egy parciális régióját erősítjük fel, ilyen DNS-fragmenseket kell alkalmazni primerként, hogy egy kromoszomális DNS-könyvtárból a teljes régiót tartalmazó DNS-fragmens kiszűrését végrehajtsuk. Ha a DDPS gén teljes régióját erősítjük fel, a PCR-reakcióoldatot, amely a felerősített DDPS gént tartalmazó DNS-fragmentumokat tartalmazza, agarózgél-elektroforézisnek vetjük alá, majd a kívánt DNS-fragmenst extraháljuk. így visszanyerhetjük a DDPS gént tartalmazó DNS-fragmenseket.
A DNS-primerek megfelelő módon előállíthatok például az E. coliban ismert szekvencia alapján [Richaud
F. és munkatársai, J. Bacteriol., 297 (1986)]. Konkrétan, előnyösek azok a primerek, amelyek a DDPS gént kódoló 1150 bázist tartalmazó régiót képesek felerősíteni, megfelelő például az 1. és 2. azonosító számú szekvenciával definiált két primer. A primerek szintézisét szokásos módon hajthatjuk végre, például foszfoamidátmódszerrel [Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)], kereskedelmi forgalomból beszerezhető DNS-szintetizátor (például DNS Synthesizer Model 380 B, gyártja az Applied Biosystems) alkalmazásával. Ezenkívül a PCR-t lejátszathatjuk kereskedelmi forgalomból beszerezhető PCR-készülék (például DNS Thermal Cycler Model PJ2000, gyártja a Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazásával, Taq DNS-polimerázt alkalmazva a gyártó (Takara Shuzo Co., Ltd.) előírásai szerint.
A PCR-módszerrel megsokszorozott DDPS gént tekintve a műveletek, például a mutáció bevezetése a DDPS génbe könnyűvé válik, ha azt az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben autonóm módon replikálódni képes vektor-DNS-hez ligáljuk, és Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumsejtekbe bevezetjük. Az alkalmazott vektor-DNS, a transzformációs módszer és a DDPS gén jelenlétének kimutatására szolgáló módszer ugyanaz, mint amelyeket a fent említett eljárással kapcsolatban ismertettünk.
A Serratia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó DDPS gént a fent ismertetett módon állíthatjuk elő, és a gént a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó kromoszomális DNS-könyvtárból izolálhatjuk hibridizálással, próbaként E. coliból származó DDPS gént vagy annak egy részét alkalmazva. A Serratia nemzetségbe tartozó baktériumból származó DDPS gént PCR-módszerrel is előállíthatjuk templátként a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok kromoszomális DNS-ét, és primerként az E. coliból származó DDPS gén bázisszekvenciája alapján
HU 224 158 Β1 előállított oligonukleotidot, például az 1. és 2. azonosító számú szekvenciát tartalmazó oligonukleotidot alkalmazva.
A Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok nagyon hasonlítanak az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokhoz, és ismert, hogy a kétféle baktérium proteinjeinek aminosavszekvenciájában és génjeinek bázisszekvenciájában nagymértékű a homológia. Ilyen gén például a thrA, thrB és thrC, amelyek homológiája 83%, 73%, illetve 84% [K. Omori és munkatársai, J. Bacteriol. 175, 785-794 (1993)]. Ezenkívül egy Serratia nemzetségbe tartozó baktérium génjének izolálására egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó génszekvencia alkalmazásával példaként ismert a dnaA [0. Skovgaard és F. G. Hansen, J. Bacteriol. 169, 3976-3981 (1987)]. Ezért a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok DDPS génje bizonyosan izolálható hibridizálással vagy PCR-módszerrel az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok DDPS génjének bázisszekvenciája alapján.
(2) Mutáció bevezetése a DDPS génbe
Mutáció, például aminosavhelyettesítés, inszerció és deléció kivitelezésére szolgáló módszer például a rekombináns PCR-eljárás [Higuchi R., 61, PCR Technology (szerk.: Erlich H. A., Stockton press (1989)] és a helyspecifikus mutageneziseljárás [Kramer W. és Frits H. J., Meth. in Enzymol. 154, 350 (1987); Kunkel T. A. és munkatársai, Meth. in Enzymol. 154, 367 (1987)]. A fenti módszerek alkalmazásával célzott mutációt lehet előidézni egy célzott helyen.
Ezenkívül egy kívánt gén kémiai szintézisével szintén lehet mutációt vagy véletlenszerű mutációt bevezetni egy kívánt helyre.
Ezenkívül alkalmazható egy olyan eljárás is, amelyben a DDPS gént a kromoszómán vagy plazmidban közvetlenül kezeljük hidroxil-aminnal [Hashimoto T. és Sekiguchi M., J. Bacteriol. 159,1039 (1984)]. Alternatív módon olyan eljárás is alkalmazható, amelyben a DDPS gént tartalmazó, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot ultraibolya fénnyel besugározzuk, vagy egy olyan eljárás, amely egy kémiai szerrel, például N-metil-N’-nitrozo-guanidinnel vagy salétromossavval végzett kezelésen alapul. A fenti eljárások szerint véletlenszerű mutációt lehet előidézni.
A mutáns gén kiválasztására szolgáló eljárást tekintve a DDPS gént és egy vektor-DNS-t tartalmazó DNS-fragmenst magában foglaló rekombináns DNS-t először közvetlenül mutációs kezelésnek vetjük alá hidroxil-aminnal vagy hasonlóval, amelyet például E. coli W3110 törzs transzformálására alkalmaznak. Ezután a transzformált törzseket minimáltápközegben, például M9 tápközegben tenyésztjük, amely L-lizin-analógként S-2-amino-etil-ciszteint (AEC) tartalmaz. A vad típusú DDPS gént tartalmazó rekombináns DNS-t hordozó törzsek nem tudnak L-lizint és diamino-pimelinsavat (DAP) szintetizálni, és szaporodásuk ezért szuppresszált, mivel a rekombináns DNS által expresszált DDPS-t az AEC gátolja. Ezzel szemben azok a törzsek, amelyek L-lizin általi gátlásra érzéketlenné tett DDPS gént tartalmazó rekombináns DNS-t hordoznak, a fenti rekombináns DNS-ben lévő DDPS gén által kódolt olyan mutáns enzimmel rendelkeznek, amelyet az AEC nem gátol. Ezért az ilyen törzsek képesek olyan minimáltápközegen szaporodni, amelyhez AEC-t adtunk. Ezt a jelenséget alkalmazhatjuk az L-lizin analógjára, az AEC-re rezisztens törzsek szelektálására, azaz az olyan törzsek szelektálására, amelyek a gátlásra érzéketlenné tett mutáns DDPS gént tartalmazó rekombináns DNS-t hordoznak.
Az így kapott mutáns DNS-t rekombináns DNS-ként bevezethetjük egy Serratia nemzetségbe tartozó baktériumba, és expresszálhatjuk. így olyan baktériumot kapunk, amely feed-back gátlásra érzéketlenné tett DDPS-t hordoz. Alternatív módon a rekombináns DNS-ből kivehetünk egy mutáns DDPS génfragmentumot, és azt egy másik vektorba inszertálva alkalmazhatjuk. A találmány értelmében alkalmazható vektor-DNS előnyösen egy plazmidvektor-DNS, például pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, PHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 és pMW218. Ezenkívül fág DNS-vektorokat is alkalmazhatunk.
Ezenkívül a mutáns DDPS gén hatékony expresszálásának érdekében Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben működő másik promotert, például lac-ot, trp-t és PL-t is ligálhatunk a mutáns DDPS-t kódoló DNS-szekvenciától felfelé, vagy egy, a DDPS génben lévő promotert alkalmazhatunk vagy változatlanul vagy a promoter felerősítése után.
<2> A találmány értelmében alkalmazott mutáns aszpartokinázt (AK) kódoló DNS A találmány értelmében alkalmazott mutáns AK-t kódoló DNS a vad típusú AK-t kódoló DNS-ben olyan mutációt tartalmaz, amely a kódolt AK-t L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné teszi. Az AK például Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó AK, különösen E. coliból származó AKIII lehet. Ezenkívül lehet ez a Serratia nemzetségbe tartozó baktérium aszpartokináza is, feltéve, ha az tartalmaz L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt.
Az AKIN L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációja például az alábbi lehet:
a) a 323. glicinmaradék helyettesítése aszparaginsavmaradékkal;
b) a 323. glicinmaradék helyettesítése aszparaginsavmaradékkal és a 408. glicinmaradék helyettesítése aszparaginsavmaradékkal;
c) a 34. argininmaradék helyettesítése ciszteinmaradékkal és a 323. glicinmaradék helyettesítése aszparaginsavmaradékkal;
d) a 325. leucinmaradék helyettesítése fenil-alanin-maradékkal;
e) a 318. metioninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal;
f) a 318. metioninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal és a 349. valinmaradék helyettesítése metioninmaradékkal;
g) a 345. szerinmaradék helyettesítése leucinmaradékkal;
HU 224 158 Β1
h) a 347. valinmaradék helyettesítése metioninmaradékkal;
i) a 352. treoninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal;
j) a 352. treoninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal és a 369. szerinmaradék helyettesítése fenil-analin-maradékkal;
k) a 164. glutaminsavmaradék helyettesítése lizinmaradékkal, és
l) a 417. metioninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal és a 419. ciszteinmaradék helyettesítése tirozinmaradékkal;
a 8. azonosító számú szekvencia által definiált AKIII aminosavszekvenciájában az N-terminális aminosavtól számítva.
A vad típusú AKIII-at kódoló DNS például egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból, például az E. coliból származó AKIII-at kódoló DNS lehet. Közelebbről, ezek a 8. azonosító számú aminosavszekvenciát kódoló DNS-ek, illetve a 7. azonosító számú szekvencia bázisszekvenciájában az 584-1930. bázisok által alkotott szekvencia lehet. Egyébként az E. coli AKIII-at egy lysC gén kódolja.
A találmány értelmében alkalmazott mutáns AKIII-at kódoló DNS-ek például fenti szekvenciák közül azok, amelyek bázisszekvenciájukban olyan mutációt tartalmaznak, amely a fent említett aminosavcseréket vagy aminosavhelyettesítéseket okozza. A helyettesített aminosavmaradéknak megfelelő bármely kodon megfelel, függetlenül annak fajtájától, feltéve, hogy ugyanazt az aminosavmaradékot kódolja. Ezenkívül a mutáns AKIII gén által kódolt vad típusú AKIII aminosavszekvenciája kismértékben különbözhet a baktériumfajokban és baktériumtörzsekben lévő eltérésektől függően. A találmány értelmében alkalmazott mutáns AKIII gének körébe tartoznak azok is, amelyek olyan aminosavszekvenciákat kódolnak, amelyek az enzimaktivitás szempontjából nem jelentős helyzetekben tartalmaznak aminosavhelyettesítéseket, deléciókat vagy inszerciókat. így például a 2. példa szerint előállított vad típusú lysC gén bázisszekvenciája (7. azonosító számú szekvencia) hat helyen tér el az E. coli K-12 JC411 törzs ismert lysC szekvenciájától [Cassan M„ Parsot C., Cohen G. N. és Patté J. C., J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)]. A kódolt aminosavmaradékok két helyen térnek el (a JC411 lysC-jében az 58. glicinmaradékot egy ciszteinmaradék helyettesíti, és a 401. glicinmaradékot egy alaninmaradék helyettesíti, a 8. azonosító számú szekvenciában meghatározott lysC aminosavszekvenciájának N-terminálisától számítva). Még az E. coli K-12 JC411 törzs lysC szekvenciájával azonos lysC esetén is várható, hogy L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt tartalmazó lysC-t kapunk, ha a fenti a)—I) mutációkat bevezetjük.
Az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett mutáns AK-t kódoló DNS előállítására szolgáló eljárás az alábbi. Először a vad típusú AK gént vagy egy más mutációt tartalmazó AK gént tartalmazó DNS-t in vitro mutációs kezelésnek vetjük alá, és a mutációs kezelés után kapott DNS-t egy, a gazdához illő vektor-DNS-sel ligáivá rekombináns DNS-t állítunk elő. A rekombináns
DNS-t egy gazdamikroorganizmusba bevezetve transzformánsokat állítunk elő. A fenti transzformánsok közül kiválasztunk egy olyat, amely mutáns AK-t expresszál, vagyis egy mutáns gént tartalmazó transzformánst. Úgy is eljárhatunk, hogy egy vad típusú AK gént vagy más mutációt tartalmazó AK gént tartalmazó DNS-t egy gazdaszervezethez illő vektor-DNS-sel ligáivá rekombináns DNS-t állítunk elő, és a rekombináns DNS-t ezután in vitro mutációs kezelésnek vetjük alá, majd a mutációs kezeléssel kapott rekombináns DNS-t vezetjük be a gazdamikroorganizmusba, hogy transzformánsokat állítsunk elő. Ezután a transzformánsok közül kiválasztunk egy mutáns AK-t expresszáló transzformánst, vagyis egy mutáns gént hordozó transzformánst.
Úgy is eljárhatunk, hogy egy vad típusú enzimet termelő mikroorganizmust vetünk alá mutációs kezelésnek, és így egy olyan mutáns törzset állítunk elő, amely mutáns enzimet termel, majd a kapott mutáns törzsből állítunk elő egy mutáns gént. A DNS közvetlen mutációs kezelésére alkalmas szer például hidroxil-amin vagy hasonló lehet. A hidroxil-amin egy kémiai mutagén szer, amely citozin->timin mutációt okoz azáltal, hogy a citozint N4-hidroxi-citozinná alakítja. Alternatív módon, amikor magát a mikroorganizmust vetjük alá mutációs kezelésnek, a kezelést ultraibolyafény-besugárzással, vagy mesterséges mutáció kiváltására szokásosan alkalmazott mutagén szer, például N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin (NTG) alkalmazásával végezzük.
A vad típusú AK gént vagy más mutációt tartalmazó AK gént tartalmazó DNS donormikroorganizmusaként bármely mikroorganizmus alkalmazható, feltéve, hogy az Escherichia vagy a Serratia nemzetségbe tartozik. Közelebbről, a Neidhardt és munkatársai könyvében ismertetett mikroorganizmusok alkalmazhatók (Neidhardt F. C. és munkatársai, Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society fór Microbiology, Washington D. C., 1208, 1. táblázat). így például E. coli JM109 törzset és MC1061 törzset alkalmazhatunk. A Serratia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusokra példaként említhetjük a Serratia marcescenst, például a Serratia marcescens AJ13125 törzset (FERM BP-5441).
A fenti törzsekből az AK gén előállítása során a kromoszomális DNS előállítását, a kromoszomális DNS-könyvtár előállítását és hasonló műveleteket a DDPS gén előállítására fent ismertetett módon végezhetjük. A könyvtár előállítására gazdaként előnyösen egy AKI-ben, ll-ben és lll-ban teljesen hiányos törzset, például E. coli GT3 törzset alkalmazhatunk [beszerezhető az E. coli Genetic Stock Centerből (Connecticut, US)].
A kapott kromoszomális DNS-könyvtárból az AK gén rekombináns DNS-ét tartalmazó baktériumtörzset olyan törzsként kapjuk, amely fokozott AK-aktivitással rendelkezik, vagy amelyben az auxotrófia kiegészült. A kérdéses törzsekből sejtextraktumokat, és ezekből nyers enzimoldatokat előállítva meghatároztuk az AK-aktivitást. Az AK-enzimaktivitás mérését Stadtman és munkatársai módszere szerint végezhetjük [Stadt7
HU 224 158 Β1 mán E. R., Cohen G. N., LeBras G. és Robichon-Szulmajster H„ J. Bioi. Chem. 236, 2033 (1961)].
így például ha gazdaként egy AK-ban teljesen hiányos mutáns törzset alkalmazunk, az AK gént tartalmazó DNS-fragmensét úgy állíthatjuk elő, hogy izolálunk egy olyan transzformált törzset, amely L-lizint, L-treonint, L-metionint és diamino-pimelinsavat nem tartalmazó tápközegen, vagy homoszerint és diamino-pimelinsavat nem tartalmazó tápközegen képes szaporodni, és a baktériumtörzsből kinyerjük a rekombináns DNS-t.
Ha a kromoszomális DNS-ből az AK gént PCR-módszerrel erősítjük fel, a PCR-reakcióban alkalmazható DNS-primereket az E. coli ismert szekvenciája alapján állíthatjuk elő [Cassan M., Parsot C., Cohen
G. N. és Patté J. C„ J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)]. Azonban alkalmasak a lysC gén 1347 bázist magában foglaló régióját felerősíteni tudó primerek is, és például megfelel az 5. és 6. azonosító számú szekvenciával rendelkező két primer.
A Serratia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó AK gént hasonló módon állíthatjuk elő, és a gént a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok kromoszomális DNS-könyvtárából izolálhatjuk hibridizálással, próbaként E. coliból származó AK gént vagy annak egy részét alkalmazva. A Serratia nemzetségbe tartozó baktériumból származó AK gén PCR-eljárással is előállítható, templátként a Serratia nemzetségbe tartozó baktérium kromoszomális DNS-ét és E. coliból származó AK gén bázisszekvenciája alapján előállított oligonukleotidot alkalmazva.
A fenti módon előállított AK génben mutáció - például aminosavmaradékok helyettesítése, inszertálása és deléciója - előállítására alkalmas eljárás például a rekombináns PCR-eljárás, a helyspecifikus mutagenezis és hasonlók, amelyeket a DDPS gén mutációs kezelésére fent ismertetett módon hajtunk végre.
A kívánt gén kémiai szintézisének megfelelően bevezethetünk mutációt vagy véletlenszerű mutációt egy kívánt helyre.
Ezenkívül olyan eljárás is létezik, amelyben a kromoszomális vagy extrakromoszomális rekombináns DNS-ben lévő AK gén DNS-ét közvetlenül kezeljük hidroxil-aminnal [Hashimoto T. és Sekiguchi M., J. Bacteriol. 159, 1039 (1984)]. Elfogadható módszer az is, amikor a kromoszomális vagy extrakromoszomális rekombináns DNS-ben lévő AK génnel rendelkező, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot ultraibolya fénnyel besugározzuk, vagy az az eljárás, amikor a kezelést kémiai szerrel, például N-metil-N’-nitrozo-guanidinnel vagy salétromossavval végezzük.
A mutáns AK génre történő szelektálás! eljárást tekintve egy AK-ban teljesen hiányos törzset, például az E. coli GT3 törzset először egy mutagén kezelésnek alávetett AK gént tartalmazó rekombináns DNS-sel transzformálunk. Ezután a transzformált törzset minimáltápközegben, például M9 tápközegben tenyésztjük, amely jelentős mennyiségű L-lizint tartalmaz. A vad típusú AK gént tartalmazó DNS-t hordozó törzsek nem tudnak L-treonint, L-izoleucint, L-metionint és diamino-pimelinsavat (DAP) szintetizálni, és szaporodásuk szuppresszált, mivel csak egy AK-t gátol az L-lizin. Ezzel szemben az L-lizin általi gátlásra érzéketlenné tett mutáns AK gént tartalmazó rekombináns DNS-t hordozó törzs képes olyan minimáltápközegben szaporodni, amelyhez jelentős mennyiségű L-lizint adtunk. Ezt a jelenséget alkalmazhatjuk olyan törzs szelektálására, amelynek szaporodása L-lizinre vagy AEC-re mint L-lizin-analógra érzéketlen, azaz olyan törzs szelektálására, amely gátlásra érzéketlenné tett mutáns AK gént tartalmazó rekombináns DNS-t hordoz.
Az így kapott mutáns gént, mint rekombináns DNS-t, bevezethetjük egy Serratia nemzetségbe tartozó baktériumba és expresszálhatjuk. így olyan baktériumot kapunk, amely feed-back gátlásra érzéketlenné tett AK-t tartalmaz. Alternatív módon a mutáns AK gén fragmensét a rekombináns DNS-ből kivehetjük, és másik vektorba inszertálva alkalmazhatjuk. A találmány értelmében alkalmazható vektor-DNS előnyösen egy plazmidvektor-DNS, például pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 és pMW218. Ezek mellett fág vektor-DNS-ek is alkalmazhatók.
A mutáns AK gén hatékony expresszálása érdekében Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben működő másik promotert, például lac, trp és PL promotert is ligálhatunk a mutáns AK-t kódoló DNS-szekvenciától felfelé, vagy az AK génben lévő promotert alkalmazhatjuk mint olyat, vagy felerősítés után.
<3> L-lizin előállítása a találmány szerinti eljárással
Az L-lizint hatékonyan állíthatjuk elő oly módon, hogy megfelelő tápközegben tenyésztünk egy Serratia nemzetségbe tartozó baktériumot, amelyet a fenti módon kapott mutáns DDPS gén bevezetésével transzformáltunk, és L-lizin általi feed-back gátlással deszenzitivizált AK-t tartalmaz, amely baktérium a tenyésztés során a tenyésztőközegben L-lizint termel és halmoz fel, majd a tenyészetből az L-lizint összegyűjtjük. Közelebbről, az L-lizint hatékonyan állíthatjuk elő olyan, a Serratia nemzetségbe tartozó baktériummal, amely mind a mutáns DDPS-t, mind a mutáns AK-t hordozza.
Az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett AK-t hordozó, Serratia nemzetségbe tartozó baktérium például egy olyan Serratia nemzetségbe tartozó baktérium lehet, amelyet a baktériumsejtbe az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt hordozó AK-t kódoló DNS egy, a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumsejtekben autonóm módon replikálódni képes vektor-DNS-sel történő ligálásával rekombináns DNS bevezetésével transzformáltunk.
Az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett AK egy vad típusú AK is lehet, amely L-lizin általi feed-back gátlástól mentes. A Serratia nemzetségbe tartozó baktérium egy ilyen vad típusú AK génnel hasonló módon transzformált baktérium is lehet. Ezenkívül alkalmazható a Serratia nemzetségbe tartozó olyan mutáns baktériumtörzs is, amelyben a mutáns AK termelését a Serratia nemzetségbe tartozó baktérium sejtjeinek mutációs kezelésével váltottuk ki.
Ezenkívül, a Serratia nemzetségbe tartozó baktérium mutáns DDPS gén bevezetésével történő transz8
HU 224 158 Β1 formálását úgy végezhetjük, hogy a sejtekbe egy, a mutáns DDPS gén egy, a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben autonóm módon replikálódni képes vektor-DNS-sel történő ligálásával rekombináns DNS-t vezetünk be.
Amikor a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumba mind a mutáns DDPS gént, mind a mutáns AK gént bevezetjük, a két mutáns gén azonos plazmidon vagy különálló plazmidokon helyezkedhet el a sejtben. Amikor különálló plazmidokat alkalmazunk, előnyösen olyan plazmidokat választunk, amelyek stabil megoszlási mechanizmussal rendelkeznek, amely lehetővé teszi, hogy ezek stabilan legyenek jelen a sejtben. Amikor a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumba a mutáns DDPS gént és a mutáns AK gént különálló plazmidok alkalmazásával vezetjük be, a két gén bevezetésének sorrendje nem kritikus.
Az L-lizin-termelést tovább javíthatjuk azáltal, hogy a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumba, amelybe egy mutáns DDPS gént és egy mutáns AK gént már bevezettünk, bevezetünk egy dihidropikolinát-reduktáz gént (dapB) is. Az L-lizin-termelést még tovább növelhetjük azáltal, hogy a mutáns AK gént és mutáns DDPS-t tartalmazó, Serratia nemzetségbe tartozó baktériumba, amelybe a dihidropikolinát-reduktáz gént már bevezettük, egy Coryne típusú baktériumból származó diamino-pimelát-dehidrogenáz gént (DDH) vezetünk be. Ezt a diamino-pimelát-dehidrogenáz gént fel kell erősíteni. Alternatív módon az L-lizin-termelést hasonló mértékben azáltal is javíthatjuk, hogy a diamino-pimelát-dehidrogenáz bevezetése helyett egy szukcinil-diamino-pimelát-transzamináz gént (dapD) és egy szukcinil-diamino-pimelát-dezaciláz gént (dapE) erősítünk fel.
A gén felerősítése alatt a gén expressziós termékeként keletkező enzim aktivitásának fokozását értjük a sejtben. Konkrét példaként említhetjük a gén kópiaszámának növelését a sejtben, a gén általi expresszió mennyiségének fokozását egy nagy expressziós hatékonyságú promoter alkalmazásával, és egy mutáció bevezetését a génbe az enzimaktivitás fokozására. A gén kópiaszámának növelésére egy sejtben a gént egy, a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumban autonóm módon replikálódni képes vektorba inszertáljuk, és a vektorral egy Serratia nemzetségbe tartozó baktériumot transzformálunk. Ez a vektor előnyösen egy többkópiás típusú plazmid. Alternatív módon a kópiaszámot növelhetjük azáltal is, hogy a kromoszomális DNS-be integrált DNS-t Mu fág vagy hasonló alkalmazásával felerősítjük.
Ami a plazmidok alkalmazását illeti, amikor a mutáns DDPS gén és a mutáns AK gén bevezetésére plazmidokat alkalmazunk, előnyösen olyan stabil eloszlási mechanizmussal rendelkező plazmidokat alkalmazunk, amelyek a sejtben együtt stabilan megmaradnak. A gének bevezetésének sorrendje nem kritikus.
Az alábbiakban ismertetjük az E. coli L-lizin-bioszintézis-rendszer génjeinek és a Coryne típusú baktérium DDH génjének előállítására szolgáló eljárást.
A DDH gén előállítására egy Coryne típusú baktérium, például Brevibacterium lactofermentum kromoszomális DNS-ét PCR-eljárással megsokszorozzuk, kétfajta oligonukleotidprimer (például 9. és 10. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával, amelyeket a Corynebacterium glutamicum DDH génje ismert nukleotidszekvenciája [Ishino S. és munkatársai, Nucleic Acids Rés. 15, 3917 (1987)] alapján állítunk elő.
A dapD gént úgy állítjuk elő, hogy az E. coli W3110 törzs kromoszomális DNS-ét PCR-módszerrel megsokszorozzuk, két speciális oligonukleotidprimer (például 11. és 12. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával, amelyeket egy dapD gén ismert nukleotidszekvenciája [Richaud C. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 259, 14824 (1984)] alapján állítunk elő.
A dapE gént úgy állítjuk elő, hogy az E. coli DNS-t megsokszorozzuk PCR-módszerrel, kétfajta oligonukleotidprimer (13. és 14. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával, amelyeket a dapE gén ismert nukleotidszekvenciájának [Bouvier J. és munkatársai, J. Bacteriol. 174, 5265 (1992)] alapján állítunk elő.
A találmány értelmében gazdaként bármely Serratia nemzetségbe tartozó baktérium alkalmazható, azzal a megkötéssel, hogy annak sejtjébe bevezethető a mutáns DDPS gén promotere, a mutáns AK gén vagy az L-lizin bioszintézis-rendszerének másik génje, vagy egy másik promoter, a fenti génfunkciók expresszálására, és az alkalmazandó vektor-DNS valamely replikációs origója úgy, hogy a sejtek szaporodni tudjanak, amikor a mutáns DDPS gént, a mutáns AK gént vagy az L-lizin-bioszintézis-rendszer más génjét extrakromoszomális DNS-ként egy plazmidba bevezetjük.
A Serratia nemzetségbe tartozó baktériumra példaként említjük az L-treonint termelő mikroorganizmusokat, mivel az aszpartokináz L-lizin általi gátlása általában érzéketlenné van téve az L-treonint termelő mikroorganizmusokban. Az S. marcescenshez tartozó baktériumok közül egy L-treonint termelő baktérium egy treoninanalógra, az AHV-re (a-amino-p-hidroxi-valeriánsav) rezisztens [S. Komatsubara, M. Kisumi és I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol. 35, 834 (1978)]. Ilyen törzs például a Serratia marcescens AJ13125 törzs. Ezt a törzset FERM P-14983 számon 1995. június 12-én helyeztük letétbe a National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technologynál (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japán), és 1996. március 4-én alakítottuk át nemzetközi letétté a Budapesti Egyezménynek megfelelően, nemzetközi letéti száma FERM BP-5441.
A találmány értelmében alkalmazható, Serratia nemzetségbe tartozó baktérium másik példájaként az L-lizin-dekarboxiláz-hiányos Serratia marcescenst említjük [JP 50-53589 számon publikált japán szabadalmi leírás (1975)]. A lizin-dekarboxiláz egy L-lizint lebontó enzim, amely a kadaverin keletkezését katalizálja az L-lizin dekarboxilezésével, és az ebben deficiens törzs az L-lizin lebontásában szuppresszált.
Az L-treonin-termelő baktériumokat és a lizin-dekarboxiláz-hiányos Serratia nemzetségbe tartozó baktériumokat a mesterséges mutációk előidézésére szo9
HU 224 158 Β1 kásosan alkalmazott módszerekkel, például ultraibolya-besugárzással, vagy mutagénekkel, például N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel és salétromossawal történő kezeléssel állíthatjuk elő.
A találmány szerinti mutáns gént hordozó transzformánsok tenyésztésére alkalmazott tápközeg egy szokásos tápközeg, amely szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen ionokat és adott esetben egyéb szerves komponenseket tartalmaz.
Szénforrásként alkalmazhatunk cukrokat, például szacharózt, glükózt, laktózt, galaktózt, fruktózt és keményítőhidrolizátumot; alkoholokat, például glicerint vagy szorbitot; és szerves savakat, például fumársavat, citromsavat és borostyánkősavat.
Nitrogénforrásként például szervetlen ammóniumsókat, például karbamidot, ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot vagy ammónium-foszfátot; szerves nitrogéneket, például szójabab-hidrolizátumot; ammóniagázt vagy vizes ammóniát alkalmazhatunk.
Előnyösen egyéb szükséges anyagokat, például B-i-vitamint és L-izoleucint vagy élesztőextraktumot is alkalmazhatunk megfelelő mennyiségben nyomnyi szerves tápanyagként. Szükség esetén a fentieken kívül kálium-foszfátot, magnézium-szulfátot, vasionokat, mangánionokat és hasonlókat is adhatunk kis mennyiségben. A tenyésztést előnyösen aerob körülmények között végezzük, 16-96 órán keresztül. A tenyésztési hőmérsékletet 25-45 °C-on, és a pH-t 5-8 értéken tartjuk a tenyésztés során. A pH beállítására szervetlen vagy szerves, savas vagy lúgos anyagokat, valamint ammóniagázt alkalmazhatunk.
A fermentált folyadékból az L-lizint rendszerint ioncserélő gyantás eljárás, kicsapásos eljárás és egyéb ismert eljárások kombinálásával gyűjtjük össze.
A leírás ábráit röviden az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. ábrán láthatók a pdapAI és pdapA2 előállítási lépései.
A 2. ábrán látható az L-lizin általi gátlás vad típusú és mutáns DDPS esetén.
A 3. ábrán láthatók a kettős mutációs típusú dapA* gént tartalmazó pdapAS824 plazmid előállításának lépései.
A 4. ábrán láthatók a pLYSCI és pLYSC2 előállításának lépései.
Az 5. ábra mutatja a transzformánsok megjelenési arányát és mutációs arányát hidroxil-aminnal végzett kezelés után.
A 6. ábrán látható az L-lizin általi gátlás vad típusú és mutáns AKIII esetén.
A 7. ábrán láthatók az RSF1010-ből származó, dapA*24-et tartalmazó RSF24P plazmid előállításának lépései.
A 8. ábra mutatja a pLLC*80 plazmid előállításának lépéseit.
A 9. ábra mutatja az RSF1010-ből származó, dapA*24 és lysC*80-at tartalmazó RSFD80 plazmid előállításának lépéseit.
A találmányt részleteiben az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni.
1. példa
Mutáns DDPS gén előállítása <1> Vad típusú dapA gén klónozása
Az E. coli dapA génjének bázisszekvenciája már ismert [Richaud F. és munkatársai, J. Bacteriol., 297 (1986)], és ismert az is, hogy annak nyitott leolvasási kerete (ORF) 876 bázispárt tartalmaz, és egy 292 aminosavmaradékból álló proteint kódol. Mivel azt nem tudtuk, hogy ez a dapA gén hogyan van szabályozva, csak egy SD-szekvenciát és egy promoterrégió nélküli ORF-et tartalmazó régiót erősítettünk fel PCR-eljárás alkalmazásával, és klónoztuk.
Az E. coli K-12 MC1061 törzs teljes genomeredetű DNS-ét extraháltuk Saito és Miura módszerével [Biochem. Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)]. Kétfajta prímért állítottunk elő, amelyek szekvenciáját az
1. és 2. azonosító számú szekvencia mutatja, és ezeket alkalmaztuk a PCR-reakcióban Erlich és munkatársai módszere szerint [PCR Technology, Stockton press (1989)], a cél DNS megsokszorozására. A kapott DNS-t PCR-fragmentumokhoz illő, kereskedelmi forgalomból beszerezhető pCR1000 klónozóvektorba [Invitrogen, Ltd., (California, US)] inszertáltuk. A pCR1000 egy lacZ promotert (Placz) tartalmaz, és úgy kerül forgalomba, hogy a lacZ promotertől lefelé egy helyen vágva van. Amikor egy PCR-fragmens pCR1000 mindkét vágott vége közé történő ligálásával előállított rekombináns DNS-t vezetünk be E. coliba, a PCR-fragmens a lacZ promoter kontrollja alatt íródik át. A PCR-fragmens pCR1000-rel történő ligálása közben kétfajta plazmidot kapunk a dapA transzkripciójának irányára, a lacZ általi transzkripció irányát tekintve egyik a pozitív orientációban ligálódott pdapAI plazmid, másik a fordított orientációban ligálódott pdapA2 plazmid (1. ábra).
Amikor ezeket a plazmidokat E. coli JE7627 törzsbe vezetjük be, amely DDPS-hiányos törzs, a bevezetett plazmidokkal rendelkező törzs kiegészül a gazda JE7627 diamino-pimelinsawal szembeni auxotrófiájával. Ezzel megerősítettük, hogy a két plazmidba inszertált DNS-fragmensek tartalmazzák az aktív DDPS-et kódoló dapA gént.
A pdapAI vad típusú E. coli W3110 törzsbe [beszerezhető a National Institute of Geneticstől (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japán)] történő bevezetésével kapott transzformált törzset W3110/pdapA1-nek, és a pdapA2 E. coli W3110 törzsbe való bevezetésével kapott transzformált törzset W3110/pdapA2-nek nevezzük. A két transzformált törzset AEC-vel, a lizin analógjával kiegészített M9 minimáltápközegben tenyésztjük. A bevezetett plazmiddal nem rendelkező W3110 törzset hasonló körülmények között tenyésztjük kontrollként. A két transzformált törzs és a plazmiddal nem rendelkező W3110 törzs szaporodását is szuppresszálta az AEC azonban szaporodásgátlásuk helyreállt L-lizin hozzáadásával.
M9 minimáltápközeg összetétele:
A: (20χΜ9)
Na2HPO4.12H2O 303 g/l KH2PO4 60 g/l
HU 224 158 Β1
NaCI 10 g/l
NH4CI 20 g/l
B: 1 mol/l MgSO4
C: 50% glükóz
D: 1 g/l tiamin
Az A, B, C és D komponenseket külön-külön sterilizáljuk, majd A/B/C/D/víz=5/0,1/1/0,1/95 arányban összekeverjük.
<2> Mutáns DDPS gén (dapA*) előállítása
Feltételezzük, hogy az L-lizin általi gátlásra érzéketlenné tett DDPS-t kódoló dapA*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzs képes olyan M9 minimáltápközegen szaporodni, amelyhez jelentős mennyiségű AEC-t adtunk. A dapA*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzset AEC-vel szembeni rezisztenciája alapján szelektáltuk.
A dapA* hatékony előállítására az <1> lépés szerint előállított pdapA1-ben és pdapA2-ben lévő dapA-t mutációs kezelésnek vetettük alá.
(1-2-1) dapA*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelekciós körülményeinek vizsgálata A fentiek szerint előállított W3110/pdapA1 törzset és W3110/pdapA2 törzset M9 agaros lemezen tenyésztettük, amely különböző koncentrációkban AEC-t tartalmazott. Vizsgáltuk az AEC szaporodásgátló koncentrációit és a dapA*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelekciós körülményeit.
A transzformánsok szaporodását különböző koncentrációkban AEC-t tartalmazó M9 tápközegen az 1. táblázatban foglaljuk össze. Ebben a táblázatban + jelzi a transzformáns szaporodását, míg a - a szaporodás hiányát mutatja.
1. táblázat
| AEC koncentrációja (mmol/l) | W3110/pdapA1 | W3110/pdapA2 |
| 250 | - | - |
| 125 | - | - |
| 60 | - | - |
| 30 | - | - |
| 15 | + | - |
| 8 | + | + |
| 4 | + | + |
| 2 | + | + |
A dapA gén transzkripciójának iránya a pdapA1-en megegyezik a lacZ promoter általi transzkripció irányával (1. ábra). így azt találtuk, hogy a dapA gén a pdapA1-ben rezisztenciát biztosított AEC ellen meglehetősen nagy koncentrációk esetén is, még akkor is, ha a dapA vad típusú maradt, mivel expressziójának mértékét a lacZ promoter megsokszorozta, míg a dapA gén expressziója a pdapA2-ben kisebb mértékű volt, és alacsonyabb AEC-koncentrációk esetén is biztosította a szaporodásgátlást, mivel a transzkripció iránya fordított volt a lacZ promoterhez viszonyítva, és a dapA saját promotere is hiányzott (a W3110/dapA1 törzs esetén 30 mmol/l hozzáadása esetén, míg a W3110/dapA2 törzs esetében 15 mmol/l hozzáadása esetén volt a szaporodás szuppresszálva). Kimutattuk, hogy a szaporodásgátlás megszüntethető L-lizin szimultán hozzáadásával.
Fentiek miatt a pdapA2-t választottuk ki a mutáció bevezetésére. A dapA*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelektálására 60 mmol/l AEC-t tartalmazó M9 minimáltápközeget alkalmaztunk. Ezt a közeget nevezzük az 1. példában a továbbiakban szelekciós közegnek. (1-2-2) pdapA2 in vitro mutációs kezelése hidroxilaminnal
A pdapA2 plazmidba mutáció bevezetésére egy in vitro mutációs kezelési eljárást alkalmaztunk, amelyben a plazmidokat közvetlenül hidroxil-aminnal kezeljük.
pg DNS-t 75 °C-on 1-4 órán keresztül 0,4 mol/l hidroxil-aminnal kezeltünk [0,1 mol/l KH2PO4- 1 mmol/l EDTA (pH 6,0): 100 μΙ, 1 mol/l hidroxil-amin - 1 mmol/l EDTA (pH 6,0): 80 μΙ, DNS: 2 μg, összesen: 200 μΙ, vízzel feltöltve]. A DNS-t a kezelés után üvegporral tisztítottuk, és E. coli W3110-be vezettük be, majd a baktériumot komplett tápközegen (L-tápközeg: 1% Bacto tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% nátrium-klorid, 1,5% agar) szélesztettük kolóniaképzés céljából. A baktériumokat ezután az (1-2-1) pontban fent ismertetett szelekciós közegre replikáztuk, és kiválasztottuk azokat, amelyek a szelekciós közegen telepeket képeztek. Kétszeri kísérlet után összesen 36 törzsben találtunk feltételezetten mutáns plazmidokat.
A fenti módon kapott 36 törzset ismét szelekciós közegre oltottuk le, és megerősítettük az AEC-rezisztenciát.
(1-2-3) pdapA* izolálása és a dapA*-termék vizsgálata
A fent ismertetett 36 törzsből visszanyertük a mutáns pdapA2-ket. Egy dapA-hiányos törzset, a JE7627-et transzformáltuk ezekkel, és a vad típusú pdapA2-vel. A transzformált törzsek mindegyikéből sejtmentes extraktumot állítottunk elő, és a DDPS enzimaktivitást mértük.
A sejtmentes extraktumot (nyers enzimoldatot) az alábbiak szerint állítottuk elő. Egy transzformált törzset 2*TY közegben tenyésztettünk (1,6% Bacto tripton, 1% élesztőkivonat, 0,5% NaCI), és 660 nm-en körülbelül 0,8 optikai sűrűségnél (OD660) összegyűjtöttük a tenyészetet. A sejtüledéket 0,85%-os nátrium-kloriddal mostuk 0 °C-on, és 400 mmol/l kálium-kloridot tartalmazó 20 mmol/l koncentrációjú kálium-foszfát-pufferben (pH 7,5) szuszpendáltuk. A sejteket ultrahangos kezeléssel feltártuk (0 °C, 200 W, 10 perc). A feltárt sejtoldatot 33 000 fordulat/perc mellett 1 órán keresztül centrifugáltuk 0 °C-on, a kapott felülúszóhoz 80%-os telítettségig ammónium-szulfátot adtunk, és 0 °C-on egy éjszakán keresztül tároltuk, majd centrifugáltuk. A sejtüledéket 400 mmol/l kálium-kloridot tartalmazó 20 mmol/l koncentrációjú kálium-foszfát-pufferben (pH 7,5) oldottuk.
A DDPS enzimaktivitást Yugari és munkatársai módszere szerint mértük [Yugari Y. és Gilvarg C„ J. Bioi. Chem. 240, 4710 (1962)]. Közelebbről, mértük az alábbi összetételű reakcióelegy abszorpcióját 270 nm-en, spektrofotométerben, 37 °C-on az idő függvényében, és meghatároztuk a keletkezett dihidrodipikolinát mennyi11
HU 224 158 Β1 ségét. A nátrium-piruvátot a vakpróbaként alkalmazandó reakciórendszerből elhagytuk.
A reakcióoldat összetétele:
mmol/l imidazol-hidroklorid pH 7,4 mmol/l L-aszparto-szemialdehid mmol/l nátrium-piruvát enzimoldat víz (100%-ra) összesen 1,0 ml
A DDPS enzimaktivitás meghatározására a fenti reakcióoldathoz különféle koncentrációkban L-lizint adtunk, és meghatároztuk az L-lizin által okozott gátlás mértékét. Amint a 2. ábrán látható, a vad típusú DDPS-t az L-lizin gátolta. A DDPS-t tartalmazó transzformált törzsekből származó mutáns plazmidok között három olyan törzset találtunk a 36 jelölt közül, amelyeket az L-lizin nem gátolt. Ezeket pdapAS8, pdapAS9 és pdapAS24 jelöléssel láttuk el. A bázisszekvencia ezt követő meghatározása szerint kitűnt, hogy a pdapAS8 és pdapAS9 ugyanazzal a mutációval rendelkezett.
Az L-lizin általi gátlásra való érzéketlenség foka a pdapAS8, pdapAS9, illetve pdapAS24 által kódolt három mutáns DDPS-ben eltérő volt, azonban az L-lizin általi gátlásra mindhárom érzéketlen volt. Noha az enzim specifikus aktivitását befolyásolhatták a sejttenyésztési körülmények és a minták előállítása, azt tapasztaltuk, hogy az minden esetben kissé csökkent a vad típuséval összehasonlítva. Azonban úgy ítéltük meg, hogy tenyésztési anyagként ezek nem okoznak alapvető problémát.
(1-2-4) Mutáns dapA gén bázisszekvenciájának meghatározása
A mutáns dapA gének bázisszekvenciáját szokásos módszerrel határoztuk meg, DNS-szekvenátor (ABI modell 373A, gyártja az Applied Biosystem Inc.) alkalmazásával. Ennek eredményeként azt találtuk, hogy a pdapAS8-ban és a pdapAS9-ben az 513. C^T csere, és a pdapAS24-ben a 623. C-»T csere ment végbe a vad típusú dapA gén 3. azonosító számú szekvenciájában. Ebből következik, hogy a 81. alaninmaradék valinmaradékra cserélődött a pdapAS8 és pdapAS9 által kódolt DDPS-ben, míg a 118. hisztidinmaradék tirozinmaradékra cserélődött a pdapAS24 által kódolt DDPS-ben a DDPS 4. azonosító számú aminosavszekvenciájában.
(1-2-5) Kettős mutációt tartalmazó dapA előállítása
Kétfajta mutáns dapA gént állítottunk elő a fent ismertetett módon. Annak meghatározására, hogy ezekben a mutációkban a gátlással szembeni érzéketlenítés additív módon működik-e, előállítottunk egy olyan plazmidot, amely mindkét fenti mutációval rendelkező dapA mutánst tartalmazta. Az előállítási eljárás a 3. ábrán látható. A kettős mutációval rendelkező plazmidot pdapAS824-nek jelöltük.
2. példa
Mutáns AKUi gén előállítása <1 > Vad típusú lysC gén klónozása
Az E. coli AKIII génjének (lysC) bázisszekvenciája már ismert [Cassan M., Parsot C., Cohen G. N. és Patté J. C., J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)], és ismert az is, hogy annak nyitott leolvasási kerete (ORF) 1347 bázispárt tartalmaz, és 449 aminosavmaradékkal rendelkező proteint kódol. Ebben a génben egy operátor van jelen, amelyet az L-lizin szuppresszál. Az operátorrégió eltávolítása érdekében ezért csak az SD-szekvenciát és az ORF-et tartalmazó régiót erősítettük fel PCR-eljárással, és klónoztuk.
Az E. coli K-12 MC1061 törzs teljes genomeredetű DNS-ét előállítottuk Saito és Miura módszerével [Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)]. Előállítottuk az 5. és 6. azonosító számú szekvenciával rendelkező két prímért, amelyeket a PCR-reakcióban alkalmaztunk Erlich és munkatársai módszere szerint [PCR Technology, Stockton press (1989)], és felerősítettük a lysC gént. A kapott DNS-t BamHI-gyel és Asel-gyel emésztettük, majd tompa végűvé tettük, és egy többkópiás vektor, a pUC18 Smal helyére inszertáltuk. Ez az Smal hely a vektorban lévő lacZ promotertől lefelé lokalizálódon, és amikor a DNS-fragmens pUC18 Smal helyére történő inszertálásával kapott rekombináns DNS-t E. coliba vezettük, az inszertált DNS-fragmens átolvasásos transzkripció útján íródott át a lacZ promoter kontrollja alatt. A PCR-fragmens pUC18 Smal helyére történő inszertálásakor kétféle plazmidot kaptunk, egyik a pLYSCI, amely fordított orientációban inszertált plazmid, másik a pLYSC2, amely pozitív orientációban inszertált plazmid a lysC transzkripciójának irányát tekintve a lacZ promoter általi transzkripció irányához képest (4. ábra).
Amikor ezekkel a plazmidokkal az E. coli GT3-at, mint AKI-re, ll-re, lll-ra teljesen deficiens törzset (thrA1016b metLM1005 lysC1004) transzformáltuk, a GT3 homoszerin- és diamino-pimelinsav-auxotrófiára kiegészült. Ezzel megerősítettük, hogy mindkét plazmidba inszertált DNS-fragmens tartalmazta az aktív AKIII-at kódoló lysC gént.
A pLYSCI AK-ra nézve teljesen deficiens törzsbe, az E. coli GT3-ba történő bevezetésével kapott transzformáit törzset GT3/pLYSC1-nek neveztük, és a pLYSC2 E. coli GT3-ba történő bevezetésével kapott transzformált törzset neveztük GT3/pLYSC2-nek. Az M9 minimális tápközeghez jelentős mennyiségű L-lizint adtunk, és a tápközegben tenyésztettük mind a GT3/pLYSC1, mind a GT3/pLYSC2 törzset. Mind a GT3/pLYSC1, mind a GT3/pLYSC2 törzs hordozza a vad típusú lysC gént tartalmazó plazmidokat, ahol a plazmidban lévő lysC által kódolt AKIII az egyetlen AK. A vad típusú AKIII-at, mint egyetlen AK-t, az L-lizin gátolta jelentős mennyiségű L-lizin jelenlétében. így egyik törzs sem tudott L-treonint, L-izoleucint, L-metionint és diamino-pimelinsavat (DAP) szintetizálni, ezért szaporodásuk szuppresszálva volt.
<2> Mutáns AKIII gén (lysC*) előállítása
Feltételeztük, hogy az L-lizin általi gátlásra érzéketlenné tett AK-t kódoló lysC*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzs képes szaporodni olyan M9 minimáltápközegen, amelyhez jelentős mennyiségű L-lizint adtunk. LysC*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzset szelektáltunk olyan törzs kiválasztásával, amelynek
HU 224 158 Β1 szaporodása rezisztens L-lizinre, vagy az L-lizin egy analógjára, az AEC-re.
A lysC* hatékony előállítása érdekében az <1> szerint előállított pLYSC1-ben és pLYSC2-ben lévő lysC-t mutációs kezelésnek vetettük alá. 5 (2-2-1) LysC*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelekciós körülményeinek vizsgálata
A GT3/pLYSC1 törzset és a GT3/pLYSC2 törzset M9 agarlemezeken tenyésztettük, amelyek különböző koncentrációkban L-lizint vagy AEC-t tartalmaztak. Meghatároztuk az L-lizin, illetve AEC szaporodásgátló koncentrációit, és megvizsgáltuk a lysC*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelekciós körülményeit.
A transzformánsok szaporodását L-lizint vagy AEC-t különböző koncentrációban tartalmazó M9 tápközegen a 2. táblázatban ismertetjük. Ebben a táblázatban + jelenti a transzformáns szaporodását, míg ± csekély szaporodást jelent, és a - a szaporodás hiányát jelenti.
2. táblázat
Szaporodás L-lizin-koncentráció függvényében
| L-lizin-koncentráció (mmol/i) | ||||||||||||
| 0 | 0,2 | 0,4 | 0,8 | 1,5 | 3 | 6 | 12 | 25 | 50 | 100 | 200 | |
| GT3/pLYSC1 | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| GT3/pLYSC2 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ± | - |
Szaporodás az AEC-koncentráció függvényében
| AEC-koncentráció (mmol/l) | ||||||||||
| 0 | 0,2 | 0,4 | 0,8 | 1,5 | 3 | 6 | 12 | 25 | 50 | |
| GT3/pLYSC1 | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| GT3/pLYSC2 | + | ± | + | ± | + | ± | - | - | - | - |
A lysC gén transzkripciójának iránya a pLYSC2-n egyezik a lacZ promoter általi transzkripció irányával (4. ábra). Ezért azt találtuk, hogy a lysC gén a pLYSC2-n L-lizinnel és AEC-vel szembeni rezisztenciát biztosított meglehetősen nagy koncentrációk esetén, még akkor is, ha a lysC vad típusként maradt meg, mivel expressziójának mértékét a lacZ promoter felerősítette, míg a lysC gén a pLYSC1-en kisebb mértékben expresszálódott, és alacsonyabb L-lizin- és AEC-koncentrációknál is szaporodásgátlást tapasztaltunk, mivel a transzkripció iránya fordított volt a lacZ promoterhez képest, és maga a promoter is deficiens volt (a szaporodás nem szuppresszálódott 100 mmol/l L-lizin és 3 mmol/l AEC hozzáadásával a GT3/pLYSC2 törzs esetén, míg a szaporodás teljesen szuppresszálódott 0,2 mmol/l L-lizin és AEC hozzáadásával a GT3/pLYSC1 törzs esetében). Kimutattuk, hogy a homoszerin és diamino-pimelinsav együttes hozzáadása megszüntette a szaporodásgátlást.
Ezért a pLysC1-et alkalmaztuk a mutáció bevezetésére szolgáló kísérletekben. A lysC*-ot tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelektálására szolgáló tápközeget úgy állítottunk elő, hogy az M9 minimális tápközeghez 10 mmol/l L-lizint vagy 0,2 mmol/l AEC-t adtunk. Ezt a közeget nevezzük szelekciós közegnek a 2. példában.
(2-2-2) pLYSCI in vitro mutációs kezelése hidroxil-aminnal
A pLYSCI plazmidba mutáció bevezetésére kétféle módszert alkalmaztunk, az egyik egy in vitro mutációs kezelési eljárás volt, amelyben a plazmidokat közvetlenül kezeltük hidroxil-aminnal, és egy további in vivő mutációs kezelési eljárást alkalmaztunk, amelyben a plazmidot hordozó sejtet nitrozo-guanidinnel (NTG) kezeltük, majd a plazmidot extraháltuk annak érdekében, hogy eltérő mutációt kapjunk, vagyis a hidroxil-aminnal okozott citozin->timin mutációtól eltérő mutációt vártunk.
In vitro mutációs kezelés hidroxil-aminnal 2 pg DNS-t 75 °C-on 1-4 órán keresztül 0,4 mol/l hidroxil-aminnal kezeltünk [0,1 mol/l KH2PO4 1 mmol/l EDTA (pH 6,0): 100 pl, 1 mol/l hidroxil-amin 1 mmol/l EDTA (pH 6,0): 80 μΙ, DNS: 2 pg, összesen 200 pl vízzel feltöltve], A DNS-t a kezelés után üvegporral tisztítottuk, majd egy teljesen AK-hiányos törzsbe, az E. coli GT3 törzsbe vezettük be, és komplett tápközegen (L-tápközeg: 1% Bacto tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% NaCI, 1,5% agar) szélesztve telepeket képeztünk. A telepeket a (2-2-1) pontban ismertetett szelekciós közegen replikáltuk, és a szelekciós közegen szaporodni képes törzseket szelektáltuk. A transzformánsok megjelenési aránya és mutációs aránya az 5. ábrán bemutatott módon változott. A mutáns törzseket 4 órán keresztüli kezeléssel lényegesen magasabb arányban (0,5-0,8%) kaptuk.
In vivő mutációs kezelés NTG-vel A pLYSCI-et E. coli MC1061-be vezettük be, és a teljes sejteket NTG-kezelésnek vetettük alá. A kezelés után a sejteket egy éjszakán keresztül tenyésztve fixáltuk a mutációt, majd a plazmidot extraháltuk, és E. coli
HU 224 158 Β1
GT3-ba vezettük be. Közelebbről, a transzformált törzset 2xTY közegen (1,6% Bacto tripton, 1% élesztőkivonat, 0,5% NaCI) tenyésztettük, OD660sO,3 érték elérésénél összegyűjtöttük, TM-pufferrel mostuk (összetételét lásd alább), majd NTG-oldatban szuszpendáltuk (amelyet úgy állítottunk elő, hogy az NTG-t 0,2 mg/ml koncentrációban oldottuk a TM-pufferben), és 37 °C-on 0-90 percen keresztül kezeltük. A sejteket TM-pufferrel és 2*TY közeggel mostuk, majd a mutációt 2*TY közegben egy éjszakán keresztüli tenyésztéssel fixáltuk. Ezután a plazmid-DNS-t a sejtekből extraháltuk, és E. coli GT3 törzsbe vezettük be. A mutáns törzsek szűrővizsgálatát ugyanúgy végeztük, mint az in vitro mutációs kezelés után, és kiválasztottuk a lizinrezisztens mutánsokat (LysR) és AEC-rezisztens mutánsokat (AECr).
TM-puffer összetétele:
Tris-puffer 50 mmol/l
Maleinsav 50 mmol/l (NH4)2SO4 1 g/l
MgSO4-7H2O 0,1 g/l
Ca(NO3)2 5 mg/l
FeSO4-7H2O 0,25 mg/l pH nátrium-hidroxiddal 6,0 értékre állítva.
A fentiek szerint eljárva összesen 180 törzset szelektáltunk (hidroxil-aminos kezelés után 48 törzset, NTG-kezelés után 132 törzset), amelyeket ismét szelekciós közegre oltottunk le, és az AEC- és L-lizin-rezisztenciát megerősítve 153 törzset kaptunk. A közegben az aminosavfelhalmozódási mintában adódó különbségek alapján ezt a 153 törzset 14 csoportra osztottuk, és az AK-aktivitást az egyes csoportok reprezentánsainak szelektálása után mértük. Nem volt nagy különbség az AK-aktivitásban a hidroxil-aminos kezeléssel kapott mutáns törzsek és az NTG-kezeléssel kapott mutáns törzsek között. Ezért az alábbi kísérteteket anélkül hajtottuk végre, hogy ezeket megkülönböztettük volna.
(2-2-3) lysC* gén izolálása és a lysC* termék vizsgálata
A fenti 14 csoport képviselőjeként kiválasztottuk a
24.. 43..48..60..80., 117., 126., 149., 150., 156., 158.,
167., 169. és 172. számú törzset. Ezek mindegyikéből visszanyertük a pLYSC1-ből származó mutáns plazmidokat, és ezeket pLYSC1*24, pLYSC1*43, pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*80, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169, illetve pLYSC1*172 jelöléssel láttuk el. Ezekkel és a vad típusú pLYSC1-gyel transzformáltuk a teljesen AK-hiányos GT3 törzset. A transzformált törzsek mindegyikéből sejtmentes extraktumot állítottunk elő, és mértük az AKIN enzimaktivitást.
A sejtmentes extraktumot (nyers enzimoldatot) az alábbiak szerint állítottuk elő. A transzformált törzset 2*TY tápközegben tenyésztettük, és OD660~0,8 értéknél összegyűjtöttük. A sejteket 0 °C-on 0,02 mol/l KH2PO4 (pH 6,75) - 0,03 mol/l β-merkapto-etanol pufferrel mostuk, majd ultrahanggal feltártuk (0 °C, 100 W, 4*30 perc). A szétroncsolt sejteket tartalmazó oldatot 33 000 fordulat/perccel, 1 órán keresztül centrifugáltuk °C-on, és a kapott felülúszóhoz 80% telítettségig ammónium-szulfátot adtunk. Centrifugálás után az üledéket 0,02 mol/l KH2PO4 (pH 6,75) - 0,03 mol/l β-merkapto-etanol pufferben oldottuk, és egy éjszakán át 0 “C-on tartottuk.
Az AKI II enzimaktivitást Stadtman és munkatársai módszere szerint határoztuk meg [Stadtman E. R., Cohen G. N., LeBras G. és Robichon-Szulmajster H., J. Bioi. Chem. 236, 2033 (1961)]. Közelebbről, az alábbi összetételű reakcióelegyet 27 °C-on, 45 percen keresztül inkubáltuk, majd FeCI3-oldat hozzáadásával színreakciót idéztünk elő (0,4 ml 2,8 n HCI+0,4 ml 12% TCA+0,7 ml 5% FeCI3-6H2O/0,1 n HCI), és az elegyet centrifugáltuk, majd a felülúszóban 540 nm-en mértük az abszorpciót. Az aktivitást a percenként keletkezett hidroxámsav mennyiségével határoztuk meg (1 egység=1 pmol/perc). A moláris abszorpciós koefficiens 600 volt. A reakcióelegyet a kálium-aszpartát nélkül alkalmaztuk vakpróbaként.
| A reakcióelegy összetétele: | |
| reakcióelegy *1 | 0,3 ml |
| hidroxil-amin-oldat *2 | 0,2 ml |
| 0,1 mol/l kálium-aszpartát (pH 7,0) enzimoldat | 0,1 ml |
| víz | 100%-ra |
| összesen 1,0 ml |
*1: 9 ml 1 mol/l Tris-HCI (pH 8,1)+0,5 ml 0,3 mol/l MgSO4+5 ml 0,2 mol/l ATP (pH 7,0) ‘2: 8 mol/l hidroxil-amin-oldat, amelyet közvetlenül alkalmazás előtt kálium-hidroxiddal semlegesítünk.
Az AK enzimaktivitás meghatározására a reakcióoldathoz különböző koncentrációban L-lizint adtunk, és mértük az L-lizin általi gátlás mértékét. Az eredményeket a 6. ábra és a 3. táblázat mutatja. A vad típussal és a 24., 43., 48., 60., 80., 117. és 126. törzzsel kapott eredményeket a 6A. ábrán mutatjuk be. A 6B. ábra mutatja a 149., 150., 156., 158., 167., 169. és 172. törzzsel kapott eredményeket.
Amint a fenti eredményekből látható, a vad típusú
AKIII-at erősen gátolja az L-lizin, a gátlás körülbelül 50% körülbelül 0,45 mol/l L-lizin-koncentráció mellett, és körülbelül 100% 5 mol/l L-lizin-koncentráció mellett. Ezzel szemben, noha a mutáns AKIII-ak érzéketlenségének mértéke eltérő, mind a 14 fajta érzéketlen volt L-lizin általi gátlásra. Különösen a 24., 80., 117., 169. és 172. törzsnél volt a gátlás alig megfigyelhető még 100 mmol/l L-lizin-koncentráció mellett is, és ezek 50%-os inhibitorkoncentrációja legalább 200-szorosa volt a vad típusnál megfigyeltnek. Az összproteinre számított specifikus aktivitás, amelyet befolyásolhatnak a sejt tenyésztésének körülményei és a minta előállításának körülményei, azonos vagy nagyobb volt, mint a vad típusnál majdnem minden esetben, és a mutáció bevezetése következtében észlelt aktivitáscsökkenés csak kis problémát jelentett (3. táblázat). Ebből a tényből következik, hogy várhatóan az AKIN aktív centruma független az L-lizin általi szabályozóhelytől. A 3. táblázatban a gátlással szembeni érzéketlenség foka (%) az AK-aktivitást jelenti 100 mmol/l L-lizin jelenlétében, az L-lizin távollétében mért AK-aktivi14
HU 224 158 Β1 tással összehasonlítva. A hőstabilitás (%) az 55 °C-on 1,5 órán keresztül végzett kezelés után mért aktivitás arányát mutatja.
3. táblázat
| Specifikus aktivitás (egy- ség/mg protein) | Gátlással szembeni érzéket- lenség mértéke (%)'1 | Hőstabili- tás (%)*2 | |
| Vad típus | 0,0247 | 0 | 18 |
| 117. számú törzs | 0,0069 | 120 | 0 |
| 24. számú törzs | 0,0218 | 100 | 30 |
| 80. számú törzs | 0,0244 | 99 | 36 |
| 172. számú törzs | 0,0189 | 97 | 0 |
| 169. számú törzs | 0,0128 | 96 | 2 |
| 150. számú törzs | 0,0062 | 77 | 25 |
| 126. számú törzs | 0,0250 | 61 | 39 |
| 149. számú törzs | 0,0256 | 59 | 9 |
| 167. számú törzs | 0,0083 | 43 | 45 |
| 48. számú törzs | 0,0228 | 38 | 42 |
| 60. számú törzs | 0,0144 | 35 | 9 |
| 158. számú törzs | 0,0224 | 22 | 42 |
| 156. számú törzs | 0,0101 | 18 | 2 |
| 43. számú törzs | 0,0212 | 17 | 0 |
*1: AK-aktivitás (%) 100 mmol/l L-lizin jelenlétében, az L-lizin távollétében mért AK-aktivitással összehasonlítva 2: 55 °C-on 1,5 órán keresztül végzett kezelés után megmaradó aktivitás aránya (%).
Ezt követően megvizsgáltuk a mutáns enzimek hőstabilitását. Ha célunk az, hogy egy enzimet aktivitásának növelésével javítsunk, fontos az, hogy a kialakított enzim stabilan megmaradjon a sejtekben. Az in vitro mérések bizonyos problémával járnak, az intracelluláris és extracelluláris proteázaktivitások különbsége és az enzimek in vitro tárolására szolgáló pufferek hatása miatt. Az egyszerűség kedvéért azonban az AKIN mutáns hőstabilitását in vitro vizsgáltuk egy paraméterként.
Az AKIII inaktiválási hőmérséklete különböző körülmények közötti vizsgálatának eredményeiből kiindulva mértük az enzimaktivitás megmaradását 55 °C-on 90 percen keresztül végzett kezelés után. A 3. táblázat adataiból látható, hogy az enzimek fele sokkal jobb volt, mint a vad típusú enzim. Általában a mutáns enzimek gyakran instabilak a vad típusúakkal összehasonlítva. Azonban a fentiek szerint előállított mutáns AKIII-ak stabilitása jobb volt, mint a vad típusé, és közülük sok megfelelően használhatónak bizonyult gyakorlati alkalmazásra az L-lizin előállítására.
(2-2-4) Vad típusú lysC és mutáns lysC bázisszekvenciájának meghatározása
A fentiek szerint előállított vad típusú lysC gén bázisszekvenciáját szokásos módon határoztuk meg
DNS-szekvenátor (ABI modell 373A, gyártja az Applied Biosystem Inc.) alkalmazásával (7. azonosító számú szekvencia). Ennek eredményeként hat helyen találtunk eltérést (kettőt aminosavszinten) a már ismert E. coli K-12 JC411 törzs lysC génjének szekvenciájától [Cassan M., Rarsot C., Cohen G. N. és Patté J. C., J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)]. Arra gondoltunk, hogy a hat helyen mutatkozó különbség az alkalmazott baktériumtörzsek közötti különbségnek tulajdonítható.
Hasonló módon meghatároztuk a lysC* bázisszekvenciáját mind a 14 fajta mutáns pLYSCI esetén, és meghatároztuk a mutációs pontokat. Az eredmények a
4. táblázatban láthatók. Ebben a táblázatban a zárójelbe tett számok mutatják az aminosavmaradékok mutációit a nukleotidok mutációja alapján. 12 fajta mutációt találtunk, mivel két mutáns (a 48. és 167., illetve a 24. és 80. számú) ugyanazzal a mutációs típussal rendelkezett a 14 mutáns közül. A mutáció típusait tekintve a
149., 150., 156., 158., 167., 169. és 172. számú mutánsokat hidroxil-aminos kezeléssel kaptuk, míg a 24.,
43., 48., 60., 80., 117. és 126. mutánsokat NTG-kezeléssel állítottuk elő. Azonban a mutáció típusát tekintve ezek mindegyike citozin—>timin vagy guanin ->adenin mutáció volt a kódolószálon a nem kódolószálon lévő citozin->timin mutáció következtében.
4. táblázat
LysC* mutációs pontjainak meghatározása
| LysC* mutáció típusa | Muta- gén | Mutációs pont (aminosavcsere) |
| 126. | N | GGT->GA*T (323Gly->Asp) |
| 43. | N | GGT-»GA*T (323Gly->Asp) |
| GGC->GA*C (408Gly->Asp) | ||
| 149. | H | CGT->T*GT (34Arg->Cys) |
| GGC-»GA*C (323Gly-»Asp) | ||
| 48./167. | N/H | CTC->T*TC (325Leu-»Phe) |
| 150. | H | ATG->ATA* (318Met->lle) |
| 172. | H | 775C-»T (néma) |
| ATG->ATA* (318Met->lle) | ||
| GTG-»A*TG (Wal-^Met) | ||
| 117. | N | TCA->TT*A (345Ser->Leu) |
| 158. | H | GTG->A*TG (Wal^Met) |
| 24780. | N/N | ACC->AT*C (352Thr->lle) |
| 169. | H | 923C->T (néma) |
| ACC->AT*C (3S2Thr—>lle) | ||
| 60. | N | 859Q->a (néma) |
| 156. | H | ATG->ATA* (417Met-»lle) |
| TGT-»TA*T (419Cys^Tyr) | ||
| 2014C-»T(néma) |
*: H: hidroxil-amin-kezelés, N: NTG-kezelés
HU 224 158 Β1
3. példa
L-lizin előállítása dapA* gént tartalmazó törzs fermentálásával
L-lizin előállítására Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium alkalmazásával a JP 56-18596 számon publikált szabadalmi leírás, az US 4346170 számú szabadalmi leírás és az Applied Microbiology and Biotechnology 15, 227-231 (1982) irodalmi helyekkel összhangban létfontosságú, hogy a gazdában a DDPS fel legyen erősítve, és az aszpartokinázt az L-lizin ne gátolja. A Serratia nemzetségbe tartozó baktérium várhatóan hasonló az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumhoz. Az L-treonint termelő baktériumokat említhetjük példaként az ilyen törzsre. Ami az L-treonint termelő S. marcescenst illeti, a törzs ismert módon rezisztens AHV-re (a-amino-p-hidroxi-valeriánsav), mint treoninanalógra [S. Komatsubara, M. Kisumi és I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol. 35, 834 (1978)]. Közelebbről ilyen törzsként a Serratia marcescens AJ13125 törzset említhetjük. Ezt a törzset a National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technologynál (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japán) helyeztük letétbe FERM P-14983 számon 1995. június 12-én, és nemzetközi letétté alakítottuk a Budapesti Szerződésnek megfelelően 1996. március 4-én, letéti száma FERM BP-5441.
Másrészről a pdapAS24-ben lévő dapA*-ot (amelyben a 118. hisztidinmaradékot egy tirozinmaradék helyettesíti) választottuk ki dapA*-ként az S. marcescensbe való bevezetés céljából, a gátlásra való érzéketlenség mértékéből és az enzim specifikus aktivitásából kiindulva. Először, a dapA* expressziójának fokozására és a plazmid stabilitásának fokozására a pdapAS24-ben lévő mutáns dapA*-ot (továbbiakban dapA*24) a pVIC40 tetraciklinrezisztencia génjének promoterétől lefelé ligáltuk, így kaptuk az RSF24P-t (lásd 7. ábrát).
Az E. coli JM109 törzsbe RSF24P plazmid bevezetésével kapott törzset AJ 12395-nek jelöltük, ezt a törzset a National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technologynál 1993. október 28-án FERM P-13935 számon helyeztük letétbe, és a Budapesti Szerződésnek megfelelő nemzetközi letétté alakítottuk 1994. november 1-jén, letéti száma FERM BP-4858. A pdapAS8 és pdapAS9 plazmidokat hordozó törzseket nem helyeztük letétbe. Azonban a dapA* összes mutációs pontját meghatároztuk a fent ismertetett módon minden egyes plazmidban. Ezért szakember számára nem jelent problémát a fenti letétbe helyezett baktériumból visszanyerni a plazmidot Maniatis és munkatársai módszerének alkalmazásával [Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1,21 (1989)], és a kívánt gént előállítani helyirányított mutageneziseljárással [Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15,63 (1989)].
Az RSF24P plazmidot szokásos eljárással vezettük be az AJ13125 törzsbe, így kaptuk az
AJ13125/RSF24P-t. Az AJ13125/RSF24P L-lizin-termelését meghatároztuk.
Másrészről kontrollplazmidként megszerkesztettük az RSFP-t. Közelebbről, a pVIC40 BamHI-gyel és Dral-gyel történő kettős emésztésével kapott emésztett termékből szelektáltuk a nagy fragmentumot (lásd 7. ábra), és DNS-polimeráz Klenow-fragmenssel tompa végűvé tettük. A tompa végűvé tett nagy fragmentumot önligálva kaptuk az RSFP plazmidot. Az RSFP plazmidot szokásos módon bevezettük az AJ13125 törzsbe, így kaptuk az AJ13125/RSFP törzset. Az AJ13125/RSFP L-lizin-termelését is meghatároztuk.
A tenyésztést 114-116 fordulat/perccel végzett keverés mellett 72 órán keresztül végeztük 30 °C-on az alábbi összetételű tápközegben. Az eredményeket az
5. táblázat tartalmazza.
L-lizin előállítására szolgáló tápközeg:
A: (NH4)2SO4 16 g/l
KH2PO4 1 g/l
MgSO4-7H2O 1 g/l
FeSO4 7H2O 0,01 g/l
MnSO4-5H2O 0,01 g/l élesztőkivonat (Difco) 2 g/l L-metionin 0,5 g/l
L-treonin 0,1 g/l
L-izoleucin 0,05 g/l pH 7,0 állítva kálium-hidroxiddal,
115 °C-on 10 percen keresztül autoklávozva (16/20 térfogat)
B; 20% glükóz (autoklávozva 115 °C-on 10 percen keresztül) (4/20 térfogat)
C: Kalcium-karbonát (gyógyszerminőségű, száraz állapotban 180 °C-on 2 napon keresztül végzett kezeléssel hősterilizálva) (30 g/l)
Az A és B elegyet 4:1 arányban elegyítjük, és az elegyhez 30 g/l mennyiségben adjuk a C komponenst, majd a kapott oldathoz antibiotikumot (200 pg/ml streptomicin) adunk.
5. táblázat
| Baktériumtörzs | Termelt L-lizin-hidroklorid mennyisége |
| AJ13125/RSF24P | 3,5 g/l |
| AJ13125/RSFP | Og/I |
4. példa
L-lizin előállítása dapA* és lysC* gént tartalmazó törzs fermentálásával
A 3. példából látható a mutáns DDPS hatása az L-lizin-termelésre. További javulás elérése érdekében a 2. példa szerint előállított mutáns AKIN gént is bevittük a mutáns DDPS gén mellé. A 80. törzsből (lysC*80) szelektáltunk egy olyan törzset, amelyben a mutáns AKIII gén a mutáns DDPS génnel együtt jelen volt, erre az enzimaktivitásból, hőstabilitásból és hasonlókból következtettünk.
A lysC*80-at a pLLC*80 plazmidból (8. ábra) történő kivágás után alkalmaztuk, amelyet úgy állítottunk
HU 224 158 Β1 elő, hogy a pLYSC1*80-on lévő lysC*-ot (továbbiakban lysC*80), amely egy fordított irányú inszerciós helyet tartalmaz a pUC18-hoz képest, a pHSG399 vektor (előállítja a Takara Shuzo Co., Ltd.) lacZ promoterétől lefelé ligáltuk, annak érdekében, hogy a lysC* expressziójának mértékét fokozzuk. A pLLC*80 plazmidot azért állítottuk elő, hogy a lysC*80 transzkripciós iránya pozitív orientációban legyen a lacZ promotert tekintve, ezáltal az L-lizin-termelést javítsuk (mivel a pLYSC1*80-on a lysC*80 transzkripciós iránya fordított orientációban van a lacZ promoterhez képest).
A dapA* és lysC* gént tartalmazó RSFD80 plazmidot pLLC*80-ból és a 3. példa szerint előállított RSF24P-ből állítottuk elő a 9. ábra szerint. Az RSFD80 a dapA*24-et és lysC*80-at a fenti sorrendben elhelyezve tartalmazza, hogy a transzkripció iránya pozitív orientációban legyen a tetraciklinrezisztencia gén promoteréhez (tetP) képest, a tetP-től lefelé.
Az RSFD80 plazmidot E. coli JM109 törzsbe vezettük be, így kaptuk az AJ 12396 törzset. Az AJ12396 törzset a National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technologynál 1993. október 28-án helyeztük letétbe, letéti száma FERM P-13936, amelyet a Budapesti Egyezmény szerinti letétté alakítottunk 1994. november 1-jén, letéti száma FERM BP-4859. A pLYSC1*24, pLYSC1*43, PLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169 és pLYSC1*172 plazmidokat hordozó törzseket nem helyeztük letétbe. Azonban a lysC* összes mutációs pontját meghatároztuk a fenti plazmidok mindegyikén. Ezért szakember számára nem jelent problémát a fenti letétbe helyezett baktériumból visszanyerni a plazmidot Maniatis és munkatársai módszerének alkalmazásával [Sambrook J., Fritsch E. F„ Maniatis T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1,21 (1989)], és a kívánt gént előállítani helyirányított mutageneziseljárással [Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15,63 (1989)]. Az RSFD80 plazmidot szokásos eljárással vezettük be az AJ13125 törzsbe, így kaptuk az AJ13125/RSFD80-at. Az AJ13125/RSFD80 L-lizin-termelését meghatároztuk. Kontrollként az AJ13125/RSFP esetén is meghatároztuk az L-lizin-termelést.
A tenyésztést 114-116 fordulat/perc keverés mellett, 72 órán keresztül 30 °C-on végeztük ugyanabban a tápközegben, mint amelyet a 3. példában az L-lizin termelésére alkalmaztunk. Az eredményeket a 6. táblázatban ismertetjük.
6. táblázat
| Baktériumtörzs | Termelt L-lizin-hídroklorid mennyisége |
| AJ13125/RSFD80 | 9,2 g/l |
| AJ13125/RSFP | 0g/l |
A találmány értelmében előállítottunk egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó
DDPS mutáns gént, amely L-lizin általi feed-back gátlása megfelelő mértékben érzéketlenné van téve. Egy, a gént hordozó, Serratia nemzetségbe tartozó baktérium jelentős mennyiségben termel L-lizint. Az L-lizin-termelés javítható azáltal, hogy a Serratia nemzetségbe tartozó baktériumba, amely egy aszpartokinázt hordoz, bevezetünk egy olyan mutáns DDPS gént, amely L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné van téve.
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amely egy L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációt tartalmazó dihidropikolinát-szintázt kódoló DNS baktériumsejtbe történő bevezetésével van transzformálva, ahol a dihidropikolinát-szintáz Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származik.
- 2. Az 1. igénypont szerinti Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amelyben az L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutáció a szekvencialista 4. azonosító számú szekvenciájával definiált dihidropikolinát-szintáz aminosavszekvenciájában az N-terminálistól számított alábbi mutációk valamelyike: a 81. alaninmaradék helyettesítése valinmaradékkal, a 118. hisztidinmaradék helyettesítése tirozinmaradékkal, a 81. alaninmaradék helyettesítése valinmaradékkal és a 118. hisztidinmaradék helyettesítése tirozinmaradékkal.
- 3. Az 1. igénypont szerinti Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amely L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett aszpartokinázt is hordoz.
- 4. A 3. igénypont szerinti Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amely L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tett aszpartokinázt hordoz, amely egy L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációval rendelkező aszpartokinázt kódoló DNS baktériumsejtbe történő bevezetésével van előállítva.
- 5. A 4. igénypont szerinti Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amelyben az aszpartokináz egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumban előforduló aszpartokináz III.
- 6. Az 5. igénypont szerinti Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amelyben az aszpartokináz III L-lizin általi feed-back gátlásra érzéketlenné tevő mutációja a szekvencialista 8. azonosító számú szekvenciájával definiált aszpartokináz III aminosavszekvenciájában az N-terminálistól számított alábbi mutációk valamelyike: 323. glicinmaradék helyettesítése aszparaginsavmaradékkal, a 323. glicinmaradék helyettesítése aszparaginsavmaradékkal és a 408. glicinmaradék helyettesítése aszparaginsavmaradékkal, a 34. argininmaradék helyettesítése ciszteinmaradékkal és a 323. glicinmaradék helyettesítése aszparaginsavmaradékkal, a 325. leucinmaradék helyettesítése fenil-analin-maradékkal, a 318. metioninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal, a 318. metioninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal és a 349. valinmaradék helyettesítése metioninmaradékkal, a 345. szerinmaradék helyettesítése leucinmaradékkal, a 347. valinmaradék helyettesí17HU 224 158 Β1 tése metioninmaradékkal, a 352. treoninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal a 352. treoninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal és a 369. szerinmaradék helyettesítése fenil-alanin-maradékkal, a 164. glutaminsavmaradék helyettesítése lizinmaradék- 5 kai, és a 417. metioninmaradék helyettesítése izoleucinmaradékkal és a 419. ciszteinmaradék helyettesítése tirozinmaradékkal.
- 7. Az 1. igénypont szerinti Serratia nemzetségbe tartozó baktérium, amely lizin-dekarboxiláz-hiányos.
- 8. Eljárás L-lizin előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyikében definiált Serratia nemzetségbe tartozó baktériumot megfelelő közegben tenyésztjük, amelynek során a baktérium a tenyésztőközegben L-lizint termel és halmoz fel, és az L-lizint a tenyészetből összegyűjtjük.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14605495 | 1995-06-13 | ||
| PCT/JP1996/000648 WO1996041871A1 (fr) | 1995-06-13 | 1996-03-14 | Procede de production de l-lysine par fermentation |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9900149A2 HUP9900149A2 (hu) | 1999-05-28 |
| HUP9900149A3 HUP9900149A3 (en) | 2001-08-28 |
| HU224158B1 true HU224158B1 (hu) | 2005-06-28 |
Family
ID=15399054
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9900149A HU224158B1 (hu) | 1995-06-13 | 1996-03-14 | Eljárás L-lizin előállítására fermentálással |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5989875A (hu) |
| EP (1) | EP0834559B1 (hu) |
| JP (1) | JP4004065B2 (hu) |
| CN (1) | CN1117860C (hu) |
| DE (1) | DE69629299T2 (hu) |
| HU (1) | HU224158B1 (hu) |
| SK (1) | SK284047B6 (hu) |
| WO (1) | WO1996041871A1 (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4088982B2 (ja) * | 1996-10-15 | 2008-05-21 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2250266C2 (ru) | 1999-04-09 | 2005-04-20 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения l-аминокислоты |
| JP2001120292A (ja) * | 1999-08-17 | 2001-05-08 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2001120269A (ja) * | 1999-10-22 | 2001-05-08 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
| US6927046B1 (en) * | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
| BR122013017187B1 (pt) * | 2001-02-13 | 2016-03-01 | Ajinomoto Kk | bactéria transgênica produtora de l-aminoácido pertencente ao gênero escherichia, e, método para produzir l-aminoácido |
| BR0304860A (pt) * | 2002-11-11 | 2004-08-31 | Ajinomoto Kk | Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia |
| EP1482055B1 (en) * | 2003-05-26 | 2006-03-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing cadaverine dicarboxylate and its use for the production of nylon |
| KR20090023513A (ko) | 2004-10-07 | 2009-03-04 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 염기성 물질의 제조법 |
| ES2510865T3 (es) | 2008-03-03 | 2014-10-21 | Global Bio-Chem Technology Group Company Limited | Microorganismo recombinante y procedimiento para producir L-lisina |
| DE102009030342A1 (de) | 2009-06-25 | 2010-12-30 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von organisch chemischen Verbindungen |
| DE102011006716A1 (de) | 2011-04-04 | 2012-10-04 | Evonik Degussa Gmbh | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung |
| US9890405B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-02-13 | Bioamber Inc. | Recombinant bacterial cells producing (S)-2-amino-6-hydroxypimelate |
| CN103773745B (zh) * | 2012-10-18 | 2018-03-23 | 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 | 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用 |
| EP2762571A1 (de) | 2013-01-30 | 2014-08-06 | Evonik Industries AG | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren |
| CN107743520A (zh) * | 2015-05-06 | 2018-02-27 | 特雷里斯公司 | 用于甲硫氨酸的生物生产的组合物和方法 |
| CN109295028B (zh) * | 2018-11-05 | 2021-12-17 | 吉林农业大学 | 高酶活天冬氨酸激酶突变体、工程菌及该突变体的制备方法 |
| CN116179375A (zh) * | 2023-01-09 | 2023-05-30 | 天津科技大学 | 高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0746994B2 (ja) * | 1984-10-04 | 1995-05-24 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| US5258300A (en) * | 1988-06-09 | 1993-11-02 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Method of inducing lysine overproduction in plants |
| EP1394257B1 (en) * | 1992-03-19 | 2007-08-08 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Nucleic acid fragments and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants |
| WO1994011517A1 (en) * | 1992-11-10 | 1994-05-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-threonine by fermentation |
| US5545545A (en) * | 1993-04-27 | 1996-08-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase |
| JP3029370B2 (ja) * | 1993-12-03 | 2000-04-04 | 東洋製罐株式会社 | 飲料用消泡剤及びそれを配合してなる陽圧缶入り飲料 |
| JPH07155184A (ja) * | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
-
1996
- 1996-03-14 CN CN96196197A patent/CN1117860C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-14 US US08/973,461 patent/US5989875A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-14 JP JP50288797A patent/JP4004065B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-14 HU HU9900149A patent/HU224158B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-03-14 EP EP96906021A patent/EP0834559B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-14 DE DE69629299T patent/DE69629299T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-14 WO PCT/JP1996/000648 patent/WO1996041871A1/ja active IP Right Grant
- 1996-03-14 SK SK1705-97A patent/SK284047B6/sk not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1117860C (zh) | 2003-08-13 |
| CN1203629A (zh) | 1998-12-30 |
| MX9710044A (es) | 1998-10-31 |
| US5989875A (en) | 1999-11-23 |
| HUP9900149A3 (en) | 2001-08-28 |
| WO1996041871A1 (fr) | 1996-12-27 |
| SK284047B6 (sk) | 2004-08-03 |
| EP0834559A1 (en) | 1998-04-08 |
| DE69629299D1 (de) | 2003-09-04 |
| HUP9900149A2 (hu) | 1999-05-28 |
| SK170597A3 (en) | 1998-07-08 |
| JP4004065B2 (ja) | 2007-11-07 |
| EP0834559A4 (en) | 1999-09-08 |
| EP0834559B1 (en) | 2003-07-30 |
| DE69629299T2 (de) | 2004-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1477565B1 (en) | Method of producing L-lysine by fermentation | |
| JP4088982B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 | |
| EP1253195B1 (en) | Process for producing l-lysine | |
| RU2351653C2 (ru) | Бактерия, продуцирующая l-аминокислоту, и способ получения l-аминокислоты | |
| JP4035855B2 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 | |
| JP4168463B2 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 | |
| HU224158B1 (hu) | Eljárás L-lizin előállítására fermentálással | |
| HU223706B1 (hu) | Új lizin dekarboxiláz gén és eljárás L-lizin termelésére | |
| MXPA97010044A (en) | Method to produce l-lysine by means of fermentation | |
| ZA200204973B (en) | Process for producing L-Lysine. | |
| MXPA97007921A (en) | Procedure for the production of l-aminoacidomediantefermentac |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050415 |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |