WO1996041871A1 - Procede de production de l-lysine par fermentation - Google Patents

Procede de production de l-lysine par fermentation Download PDF

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WO1996041871A1
WO1996041871A1 PCT/JP1996/000648 JP9600648W WO9641871A1 WO 1996041871 A1 WO1996041871 A1 WO 1996041871A1 JP 9600648 W JP9600648 W JP 9600648W WO 9641871 A1 WO9641871 A1 WO 9641871A1
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WO
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residue
lysine
mutation
gene
dna
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PCT/JP1996/000648
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyuki Kojima
Yuri Ogawa
Kazue Kawamura
Konosuke Sano
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present invention relates to the microbial industry, and more particularly, to a method for producing L-lysine by a fermentation method, DNA and a microorganism used in the production method.
  • BACKGROUND ART Conventionally, when producing L-lysine by a fermentation method, a strain isolated from the natural world or an artificial mutant of the strain has been used in order to improve productivity.
  • a number of artificial mutants producing L-lysine are known, many of which are S-2-aminoethylcystin (AEC) resistant mutants, including Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia, or It belongs to the genus Serratia.
  • various techniques for increasing amino acid production have been disclosed, such as using a transformant using recombinant DNA (US Pat. No. 4,278,765).
  • bacteria of the genus Serratia include “Applied molecular genetics” (Kodansha Scientific 1986, ISBN 406-139659-5) and “amino acid fermentation” (Academic Press Center 1986, ISBN 4-7622).
  • -9454-3 it is widely used to produce various amino acids such as L-proline, L-histidine, L-arginine, L-threonine, L-no ⁇ , phosphorus and L-isoleucine. It has excellent properties as an amino acid producing bacterium in various aspects.
  • the yield L-lysine hydrochloride concentration divided by initial carbon source concentration
  • Serratia marcescens a representative strain of the genus Serratia, has a similar gene structure and gene expression regulation mechanism to the bacterium belonging to the genus Escherichia, and is a cloning vector used for recombinant DNA in the genus Escherichia.
  • DDP S dihydrodipicolinate synthase
  • Escherichia bacteria play an important role in L-lysine biosynthesis together with aspartokinase.
  • DDPS of bacteria belonging to the genus Escherichia is subject to feedback inhibition by L-lysine.
  • DDPS is encoded by the gene dapA in Escherichia coli (E. coli). This dapA has been cloned and its nucleotide sequence has been determined (Richaud, F. et al. J. Bacterid., 297 (1986)).
  • aspartokinase is an enzyme that catalyzes the reaction of converting aspartic acid into ⁇ -phosphoaspartic acid. It is the main regulatory enzyme.
  • E. coli AK ⁇ ⁇ , ⁇ , ⁇
  • HD homoserine dehydrogenase
  • One of the complex enzymes is AKI-HDI encoded by the thrA gene, and the other is AKII-HDII encoded by the metLM gene.
  • AKI is concertedly inhibited by threonine and isoloicin and inhibited by threonine, and ⁇ is inhibited by methionine.
  • AKIII is a monofunctional enzyme, a product of a gene named lysC, and is known to be inhibited by L-lysine and inhibited by feedback.
  • the present invention has been made in view of the above, and relates to a DDPS and a ⁇ ⁇ ⁇ , in which the feedback inhibition by L-lysine has been sufficiently released, and in particular, a DDPS derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • An object of the present invention is to provide a method for obtaining L-lysine more efficiently than before by using Serratia bacteria.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, obtained a DN ⁇ ⁇ ⁇ encoding a DD ⁇ S derived from a genus Escherichia bacterium in which feedback inhibition by L-lysine has been sufficiently released. Successful.
  • the DNA encoding DDPS derived from E. coli in which the feedback inhibition by L-lysine has been sufficiently released may be referred to as a mutant dapA or dapA * in the present specification.
  • Serratia spp Bacteria that retain aspartokinase in which feedback inhibition by L-lysine has been released and DDPS in which feed knock inhibition by L-lysine has been sufficiently released.
  • DNA encoding aspartokinase derived from E. coli from which feedback inhibition by L-lysine has been sufficiently released is referred to as mutant 1 s. Or it may be called 1 y s C *.
  • the inventors of the present application have created a bacterium belonging to the genus Serratia that retains mutant dapA and mutant 1ySC. It has been found that by culturing the Serratia bacterium in a suitable medium, a significant amount of L-lysine can be produced and accumulated in the culture.
  • the present invention is a Serratia bacterium transformed by introducing a DNA encoding a dihydrodipicolinate synthase having a mutation that eliminates feedback inhibition by L-lysine into cells.
  • the dihydrodipicolinate synthase include enzymes derived from bacteria belonging to the genus Escherichia. In dihydrodipicolinate synthase derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia, feedback inhibition by L-lysine is inhibited.
  • Mutations to be eliminated include mutations in which the alanine residue at position 81 from the N-terminus is replaced with a valine residue in the amino acid sequence of dihydroxylopicolinate synthase described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. Mutation that replaces the histidine residue at position 8 with a tyrosine residue, mutation that replaces the alanine residue at position 1 with a valine residue, and replaces the histidine residue at position 8 with a tyrosine residue . Further, the dihydrodipicolinate synthase may be specific to Serratia bacteria as long as it has a mutation that releases feedback inhibition by L-lysine.
  • the invention of the present application is the bacterium of the genus Serratia, further characterized by further retaining aspartokinase from which feedback inhibition by L-lysine has been released.
  • a method for retaining aspartokinase in which feedback inhibition by L-lysine has been released in Serratia sp. Is aspartokinase III derived from Escherichia bacteria having a mutation in which feedback inhibition by L-lysine is released.
  • a method of introducing the coding DNA into cells of the genus Serratia is exemplified.
  • Mutations of aspartokinase III derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia whose feedback inhibition by L-lysine is released include the amino acid sequence of Aspartokinase III shown in SEQ ID NO: 8 in the amino acid sequence of N-terminal 3 2 Mutation that replaces the third glycine residue with an aspartic acid residue, 3 2 Replaces the third daricin residue with an aspartic acid residue and replaces the 408th glycine residue with an aspartic acid residue Mutation that replaces the 4th arginine residue with a cysteine residue and 3rd replaces the 3rd glycine residue with an aspartic acid residue.
  • aspartokinase from which feedback inhibition by L-lysine has been released may be specific to Serratia bacteria.
  • DNA encoding dihydrodipicolinic acid synthase having a mutation that eliminates feedback inhibition by L-lysine and aspartokinase having a mutation that eliminates feedback inhibition by L-lysine were used as a control.
  • the DNAs to be transferred may each be maintained on the same or separate plasmids in the cells of the genus Serratia.
  • Serratia spp To which a DNA encoding a dihydrodipicolinate synthase having a mutation that eliminates feedback inhibition by L-lysine is introduced includes Serratia spp. Deficient in lysine decarboxylase.
  • the present invention also provides an L-lysine, which comprises culturing any of the above-mentioned Serratia bacteria in a suitable medium, producing and accumulating L-lysine in the culture, and collecting L-lysine from the culture. And a method for producing the same.
  • a DNA encoding DDPS or ⁇ or a DNA containing a promoter thereof may be referred to as a “DDPS gene” or ⁇ gene.
  • the mutant enzyme from which feedback inhibition by L-lysine has been released is sometimes simply referred to as “mutant enzyme”, and the DNA encoding it or DNA containing a promoter is sometimes referred to as “mutant gene”.
  • the feedback inhibition by L-lysine is released means that the inhibition only needs to be substantially released, and it is not necessary that the inhibition is completely released.
  • the DNA encoding the mutant DDPS used in the method of the present invention is a DNA encoding a wild-type DDPS, which has a mutation that eliminates the L-lysine feedback inhibition of the encoded DDPS. It is.
  • the DDP S include those derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia, particularly DDP S derived from E. coli.
  • Sera DDP S belonging to the genus Thia can be used as long as it has a mutation that releases feedback inhibition by L-lysine.
  • Mutations that release the feedback inhibition of L-lysine of DDPS derived from Escherichia bacterium include those from the 1'-terminus of 00-3 in the amino acid sequence of DDPS described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the DNA encoding wild-type DDPS is not particularly limited as long as it encodes DDPS derived from a genus Escherichia or a genus Serratia.
  • DNA encoding DDPS derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia specifically includes a DNA encoding an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and more specifically, a DNA encoding the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • a sequence represented by base numbers 272 to 1147 is exemplified. In these sequences, those having a mutation in the base sequence that causes the substitution of the amino acid residue are examples of DNA encoding the mutant DDPS used in the present invention.
  • the type of the codon corresponding to the substituted amino acid residue is not particularly limited as long as it encodes the amino acid residue. It is expected that the retained DDPS sequences may differ slightly depending on the type of strain and strain.However, substitution, deletion or insertion of amino acid residues at positions not involved in the activity of such an enzyme is required. Those having the same are also included in the mutant DDPS gene used in the present invention.
  • the method for obtaining such a mutant gene is as follows. First, a DNA containing a wild-type DDPS gene or a DDPS gene having a mutation that does not substantially affect the enzyme activity of DDPS is subjected to in vitro mutagenesis, and the mutagenized DNA and a vector DN compatible with the host are treated. A is ligated to obtain recombinant DNA. A transformant is obtained by introducing the recombinant DNA into a host microorganism, and if a transformant that expresses the mutant DDPS is selected from the transformants, the transformant retains the mutant gene are doing.
  • a wild-type DDPS gene or a DDPS gene having another mutation The contained DNA is ligated with a vector DNA compatible with the host to obtain a recombinant DNA, then the recombinant DNA is subjected to in vitro mutation treatment, and the mutated recombinant DNA is introduced into a host microorganism to transform the DNA. Even if a transformant is obtained and one of the transformants that has expressed mutant DDPS is selected, the transformant retains the mutant gene.
  • a mutant gene may be obtained from the mutant.
  • a transformant into which a recombinant DNA linked to a wild-type gene has been introduced is subjected to mutation treatment to create a mutant strain that produces a mutant enzyme, and then a recombinant DNA is recovered from the mutant strain This will create a mutant gene on the DNA.
  • Examples of the drug for in vitro mutation treatment of DNA include hydroxylamine and the like. Hydroxylamin is a chemical mutation treating agent that changes cytosine to N 4 -hydroxycytosine and thereby changes cytosine to thymine. If the microorganism itself is to be subjected to mutation treatment, it is necessary to use a mutagen that is commonly used for artificial mutations such as ultraviolet irradiation or N-methyl-N'-nitro-1N-nitrosoguanidine (NTG) or nitrite. Is performed.
  • any microorganisms including microorganisms belonging to the genus Escherichia or Serratia, may be used.
  • Specific examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include those listed in the book by Neidhardt et al. (Neidhardt, FC et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington DC, 1208, table 1). it can.
  • Neidhardt et al. Neidhardt, FC et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington DC, 1208, table 1). it can.
  • E. coli JM109 strain, MC1061 strain and the like can be mentioned.
  • microorganisms belonging to the genus Serratia include Serratia marcescens, for example, Serratia marcescens AJ13125 strain (FERM BP-5441) and the like.
  • E. coli having a wild-type dapA is cultured to obtain a culture.
  • the cells may be cultured by an ordinary solid culture method.
  • the medium may include, for example, one or more nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor or soybean or wheat leachate, and potassium (I) potassium phosphate, potassium phosphate (II), magnesium sulfate.
  • One or more inorganic salts such as sodium chloride, sodium chloride, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate are added, and if necessary, saccharide raw materials, vitamins, etc. are appropriately added.
  • the initial pH of the medium is suitably adjusted to 6 to 8. Cultivation is carried out at 30 to 42 ° C, preferably around 37 ° C for 4 to 24 hours, by aeration and agitation deep culture, shaking culture or static culture.
  • the culture thus obtained is centrifuged at, for example, 3,000 rpm for 5 minutes to obtain cells of E. coli MC1061 strain. From these cells, methods such as the method of Saito and Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)) and the method of KS Kirby (Biochem. J., 64, 405, (1956)) Can obtain chromosome DM.
  • chromosomal DNA library is prepared.
  • chromosomal DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various fragments.
  • restriction enzymes can be used by adjusting the degree of cleavage by adjusting the cleavage reaction time and the like.
  • Sau3AI acts on chromosomal DNA at a temperature of 30 ° C or higher, preferably at 37 ° C, at an enzyme concentration of 1 to 10 units / ml for various times (1 minute to 2 hours) to digest it. .
  • the cut chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA that can be autonomously replicated in a bacterial cell belonging to the genus Escherichia, thereby producing a recombinant DNA.
  • a restriction enzyme that generates a terminal base sequence complementary to the restriction enzyme Sau3A I used for cleavage of chromosomal DNA for example, BamHI
  • a temperature of 30 ° C or more and an enzyme concentration of 1 to 100 units Zml under the conditions, it is allowed to act on the vector DNA for 1 hour or more, preferably 1 to 3 hours, to completely digest the vector DNA and cleave it.
  • the chromosomal DNA fragment mixture obtained as described above And the cleaved vector DNA are mixed with DNA ligase, preferably T4 DNA ligase, at a temperature of 4 to L6 ° C, an enzyme concentration of 1 to L00 units / ml. It is allowed to act for 1 hour or more, preferably for 6 to 24 hours to obtain recombinant DNA.
  • DNA ligase preferably T4 DNA ligase
  • a microorganism of the genus Escherichia for example, E. coli K-12 strain, preferably JE7627 strain (ponB704, dacB12, pfv + , tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metBl, ilvH611, leuA371
  • a chromosomal DNA library is prepared by transforming a DDPS-deficient mutant strain such as proA3, lac-3, tsx-76). This transformation can be performed by the method of DM Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or by treating recipient cells with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A. , J. Mo 1. Biol., 53, 159 (1970)).
  • the JE7627 strain is available from the National Institute of Genetics (Mishima, Shizuoka, Japan).
  • a strain having a recombinant DNA of the DDPS gene from a strain having an increased DDPS activity or a strain having complemented auxotrophy due to the DDPS gene deficiency Get.
  • a DDPS-deficient mutant is auxotrophic for diaminopimelic acid
  • a strain capable of growing on a medium that does not contain diaminopimelic acid is used.
  • a candidate strain with a recombinant DNA containing the DDPS gene actually retains the recombinant DNA cloned with the DDPS gene
  • prepare a cell extract from the candidate strain This can be achieved by preparing a crude enzyme solution and confirming that the DDPS activity has increased.
  • the enzyme activity of DDPS can be measured by the method of Yu gari et al. (Yugari, Y. and Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240, 4710 (1962)).
  • the recombinant DNA in which the DNA containing the DDPS gene was inserted into the vector DNA from the above strain was used, for example, by the method of P. Guerry et al. (J. Bacteriol., 116, 1064, (1973)), DB Clewell (J. Bacteriol., 110, 667, (1972)).
  • the wild-type DDPS gene can be obtained from a strain that has the DDPS gene on the chromosome, Chromosomal DNA is prepared by the method of Saito and Miura, etc., and the DDPS gene is synthesized by the polymerase chain reaction (PCR: polymerase chain reaction; White, TJ et al; Trends Genet., 5, 185 (1989)). It can also be done by amplifying the signal.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the DNA primer used for the amplification reaction one that is complementary to both 3 ′ ends of the DNA double-stranded chain containing the entire region or a partial region of the DDPS gene is used.
  • the PCR reaction solution containing the DNA fragment containing the amplified DDPS gene is subjected to agarose gel electrophoresis, and then the target DNA fragment is extracted. As a result, a DNA fragment containing the DDP S gene can be recovered.
  • the DNA primer may be appropriately prepared based on, for example, a sequence known in E. coli (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)).
  • a primer capable of amplifying a region consisting of 1150 bases encoding the DDPS gene is preferable, and the two types of primers shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are suitable.
  • the primer DN DN can be synthesized by a conventional method such as the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)) or a commercially available DNA synthesizer (eg, DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems) ).
  • the PCR reaction was performed using a commercially available PCR reaction device (Takara Shuzo Co., Ltd., DNA Samarucycla PJ2000, etc.) using TaqMA polymerase (supplied by Takara Shuzo Co., Ltd.), This can be done according to the method specified by the supplier.
  • the DDPS gene amplified by the PCR method is connected to vector DNA capable of autonomous replication in Escherichia bacterium cells, and introduced into Escherichia bacterium cells. Operation such as introduction becomes difficult.
  • the vector used, the DNA and the transformation method, and the method for confirming the presence of the DDPS gene are the same as those described above.
  • the DDPS gene derived from the Serratia bacterium can be obtained in the same manner as described above. However, from the Serratia bacterium chromosome DNA library, the hybridization using the E. coli-derived DDPS gene or a part thereof as a probe is performed. It can also be isolated by one shot. Ma In addition, an oligonucleotide prepared based on the base sequence of the DDPS gene derived from E. coli, such as an oligonucleotide having the two types of sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, using Serratia bacterium chromosomal DNA as type III, The DDPS gene derived from Serratia bacteria can also be obtained by the PCR method using a primer.
  • Serratia spp. Is closely related to Escherichia spp., And it is known that the homology of the amino acid sequence of the protein contained in the cells and the base sequence of the gene are high between the two bacteria.
  • genes for example, thrA, thrB, and thrC are known, and the homology is 83%, 73%, and 84%, respectively (L Omori et al. J. Bacteriol. 175, 785-794 (1993)).
  • DnaA is also known as an example of isolating the gene of Serratia sp. Using the gene sequence derived from Escherichia sp. (0. Skovgaard and FG Hansen J. Bacteriol.
  • the DDPS gene of the genus Serratia can be isolated by the hybridization method ⁇ PCR method based on the nucleotide sequence of the DDPS gene of the genus Escherichia bacterium.
  • Methods for performing mutations such as amino acid residue substitution, insertion and deletion in the DDPS gene obtained as described above include recombinant PCR (Higuchi. R., 61, in PCR Technology (Erlich. , HA Eds., Stockton press (1989))), site-directed mutagenesis (Kramer, W. and Frits, HJ, Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987)); Kunk el, TA et al., Meth. In Enzymol., 4, 367 (1987)). Using these methods, the desired mutation can be made at the target site.
  • a mutation at a target site or a random mutation can be introduced.
  • DDPS gene on a chromosome or plasmid is directly treated with hydroxylamine (Hashimoto, T. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039 (1984)). Further, a method of irradiating the bacterium belonging to the genus Escherichia having the DDPS gene with ultraviolet light or a method of treating with a chemical agent such as N-methyl-N'-nitrosogazine or nitrite may be used. According to these methods, random mutation Can be introduced.
  • a recombinant DNA consisting of a DNA fragment containing the DDPS gene and vector DNA is directly subjected to mutation treatment with hydroxylamine or the like, and this is used, for example, to transform E. coli W3110 strain. Convert.
  • the transformant is cultured in a minimal medium containing S-2-aminoethylcysteine (AEC), an analog of L-lysine, for example, M9.
  • AEC S-2-aminoethylcysteine
  • Strains harboring the recombinant DNA containing the wild-type DDPS gene are not capable of synthesizing L-lysine and diaminopimelic acid (DAP) because ADP inhibits DDPS expressed by the recombinant DNA.
  • the mutant gene thus obtained is introduced as recombinant DNA into a bacterium of the genus Serratia and expressed, so that DPS that has been released from feedback inhibition can be retained.
  • a mutant DDPS gene fragment obtained from a recombinant DNA and inserted into another vector DNA may be used.
  • the vector DNA that can be used in the present invention is preferably a plasmid vector DNA, such as pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHS G398, RSF1010, pMW119, pM ⁇ 118 pMff219, pMW218, etc. Is mentioned.
  • Other phage DNA vectors can also be used.
  • mutant DDPS gene in order to efficiently carry out the expression of the mutant DDPS gene, other promoters, such as lac, trp, and PL, that function in Serratia sp. Cells, are upstream of the DNA sequence encoding the mutant DDPS. They may be ligated, and the promoter contained in the DDPS gene may be used as it is or after amplification.
  • the DNA encoding the mutant AK used in the present invention has a mutation in DNA that encodes wild-type AK so that the feedback inhibition of L-lysine of the encoded AK is released.
  • AK include AKIII derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia, and particularly AKIII derived from E. coli.
  • aspartokinase of the Serratia bacterium itself can be used as long as it has a mutation that eliminates feedback inhibition by L-lysine.
  • Mutations that eliminate the feedback inhibition of L-lysine derived from Escherichia bacteria include the amino acid sequence of AKIII shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing from the N-terminal of AKIII.
  • DNA encoding wild-type AKIII examples include AKIII derived from E. coli.
  • DNA specifically, the DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and further the sequence represented by base numbers 584 to 1930 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 .
  • the E. coli ⁇ is encoded by the lysC gene.
  • those having a nucleotide sequence variation that causes the substitution of the above amino acid residues are examples of the DNA encoding the mutant AKIII used in the present invention (where the substituted amino acid residue is substituted).
  • the type of codon corresponding to the group is not particularly limited as long as it encodes the amino acid residue, and the amino acid sequence of wild-type AKIII is slightly different depending on the species and strain.
  • the mutant AKIII gene used in the present invention also has a substitution, deletion or insertion of an amino acid residue at a position not involved in the activity of such an enzyme.
  • the nucleotide sequence of the wild-type lysC gene (SEQ ID NO: 7) obtained in (1) is the previously published sequence of lysC from E.
  • coli K-12 JC411 (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, GN, and Patte, JC, J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986))
  • the lysC of the JC411 strain has a cysteine residue at the 58th glycine residue from the N-terminus in the amino acid sequence of lysC shown in SEQ ID NO: 8).
  • the glycine residue at position 401 has been replaced with an alanine residue.
  • Even if the lysC has the same sequence as the lysC of this E. coli K-12 JC411 strain, the above (a) ⁇ ( ⁇ It is expected that lysC having a mutation in which the feedback inhibition by L-lysine has been released will be obtained by introducing any of the mutations in (1).
  • the method for obtaining DNA encoding mutant AK in which feed knock inhibition by lysine has been released is as follows. First, a DNA containing a wild-type AK gene or an AK gene having another mutation is subjected to in vitro mutagenesis, and the mutagenized DNA and a vector DNA compatible with the host are ligated to obtain a recombinant DNA. . A transformant is obtained by introducing the recombinant DNA into a host microorganism, and if a transformant that has led to the expression of mutant AK is selected from the transformants, the transformant retains the mutant gene and ing.
  • a DNA containing a wild-type AK gene or an AK gene having another mutation is ligated to a vector DNA compatible with the host to obtain a recombinant DNA, and then the recombinant DNA is subjected to in vitro mutation treatment, Use the recombinant DNA after mutation Even if a transformant is obtained by introducing into a transformant, and a transformant that has expressed mutant AK is selected from the transformant, the transformant retains the mutant gene.
  • a microorganism that produces a wild-type enzyme may be subjected to mutation treatment to create a mutant strain that produces the mutant enzyme, and then a mutant gene may be obtained from the mutant strain.
  • the drug for directly mutagenizing DNA include hydroxyylamine. Hydrate port hexylamine is cytosine N 4 - is a chemical mutation treatment agent which causes mutation from cytosine to thymine by changing the hydroxy cytosine.
  • irradiation with ultraviolet light or treatment with a mutagen commonly used for artificial mutation such as N-methyl-N'-two-row N-nitrosogazine (NTG) is performed.
  • any microorganisms belonging to the genus Escherichia or Serratia may be used. More specifically, Nai Toharuto et al book (Neidhardt, FC et. Al. , Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington DC, 1208, table 1) c , for example, which may be mentioned is available to, E. coli JM109 strain and MC1061 strain. Examples of microorganisms belonging to the genus Serratia include Serratia marcescens, such as Serratia marcescens AJ I3125 strain (FERM BP-5441).
  • the preparation of the chromosomal DNA, the preparation of the chromosomal DNA library, and the like may be performed in the same manner as the above-described obtaining of the DPS gene.
  • the host used for library production it is preferable to use AKI, II, and III-deficient strains, such as the E. coli GT3 strain (available from the E. coli Genetic Stock Center (Connecticut, USA)).
  • a strain having recombinant DNA of the AK gene is obtained as a strain with increased AK activity or a strain with complemented auxotrophy.
  • the enzyme activity of AK can be measured by the method of Stadtmann et al. (Stadtman, ER, Cohen, GN, LeBras, and Robichon-Szulma jster, h., J. Biol. Chem., 236, 2033 (1961)).
  • L-lysine L-threo
  • a DNA fragment containing the AK gene can be obtained.
  • AK gene is amplified from chromosomal DNA by the PCR method
  • a sequence known in E. coli (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, GN, and Patte, JC, J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986))
  • primers capable of amplifying a region consisting of 1347 bases encoding the lysC gene are suitable.
  • two types of primers having the sequences shown in SEQ ID NOS: 5 and 6 are suitable.
  • the AK gene derived from the Serratia bacterium can be obtained by the same method as above. It can also be isolated by chillon.
  • the AK gene derived from the genus Serratia can also be obtained by PCR using the chromosome DNA of the Serratia bacterium as type III and an oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence of the AK gene derived from E. coli as the primer.
  • the AK gene obtained as described above can be mutated such as amino acid residue substitution, insertion, or deletion by a recombinant PCR method, site-specific Mutation method and the like.
  • a mutation at a target site or a random mutation can be introduced.
  • a method of directly treating the AK gene DNA on the chromosomal or extrachromosomal recombinant DNA with hydroxylamine (Hashimoto, T. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039 (1984)) is there. Also, a method of irradiating a bacterium belonging to the genus Escherichia carrying the AK gene on chromosomal or extrachromosomal recombinant DNA with ultraviolet light, or a method of treating the bacterium with a chemical agent such as N-methyl-N'-ditrosoguanidine or nitrite. May be used.
  • a recombinant DNA containing the mutated AK gene is transformed into a completely AK-deficient strain, for example, an E. coli GT3 strain.
  • a minimal medium containing significant amounts of L-lysine for example, M9.
  • Strains harboring recombinant DNA containing the wild-type AK gene are characterized by L-threonine, L-isoleucine, L-methionine, and diaminopimelic acid (DAP) because only AK is inhibited by L-lysine. Synthesis is not possible and growth is suppressed.
  • a recombinant DNA-bearing strain containing a mutant AK gene that has been de-inhibited by L-lysine should be able to grow on minimal media supplemented with significant amounts of L-lysine. .
  • an analog of L-lysine that is, a strain carrying a recombinant DNA containing a mutant AK gene whose inhibition has been released can be used. You can choose.
  • the mutated gene thus obtained is introduced as recombinant DNA into a bacterium of the genus Serratia and expressed, whereby AK from which feedback inhibition has been released can be retained.
  • a mutant AK gene fragment that has been extracted from the recombinant DNA and inserted into another vector may be used.
  • the vector DNA that can be used in the present invention is preferably a plasmid vector DNA, for example, pUC19, pUC18, pBR322 pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119.pMW118 pMW219 pMW218, etc.
  • Can be Other vectors for phage DNA can also be used.
  • the mutant AK gene in order to efficiently carry out the expression of the mutant AK gene, another promoter, such as lac, trp, or PL, that works in Serratia bacterium cells upstream of the DNA encoding the mutant AK.
  • the AK gene may be ligated, and the promoter contained in the AK gene may be used as it is or after amplification.
  • a Serratia genus bacterium which is transformed by introducing the mutant DDPS gene obtained as described above and retains AK which has been released from feedback inhibition by L-lysine, is cultured in a suitable medium.
  • L-lysine By producing and accumulating L-lysine in a product and collecting L-lysine from the culture, L-lysine can be efficiently produced. More specifically, it is possible to efficiently produce L-lysine by retaining mutant DDP S and mutant AK together in Serratia bacteria. it can.
  • the Serratia bacterium carrying AK whose feedback inhibition by L-lysine has been released includes DNA encoding AK with a mutation that releases feedback inhibition by L-lysine and autonomous replication in Serratia bacteria cells Bacteria belonging to the genus Serratia transformed by introducing a recombinant DNA obtained by linking with a possible vector DNA into a cell.
  • the AK from which feedback inhibition by L-lysine has been released may be a wild-type AK that is not subject to feedback inhibition by L-lysine, and such a wild-type AK gene is similarly introduced into a Serratia bacterium. May be.
  • a Serratia bacterium mutant which has become capable of producing mutant AK by mutating Serratia bacterium cells may be used.
  • a recombinant DNA obtained by linking the mutant DDPS gene and vector DNA capable of autonomous replication in Serratia cells is used. Transformation can be achieved by introducing the DNA into cells.
  • both the mutant DDPS gene and the mutant AK gene are introduced into the genus Serratia, these genes may be maintained on a single plasmid in the cell or on separate plasmids. It may be held. When different plasmids are used, it is preferable to use a plasmid having a stable distribution mechanism such that each of them is stably retained in cells.
  • the mutant DDPS gene and the mutant AK gene are introduced into Serratia bacteria using separate plasmids, the order of introduction of both genes does not matter.
  • L-lysine productivity can be further improved by enhancing the dihydrodipicolinate reductase gene (dapB) in a Serratia bacterium into which a mutant DDPS gene and a mutant AK gene have been introduced. Furthermore, by introducing a diaminopimelate dehydrogenase gene (DDH) derived from a coryneform bacterium into a bacterium of the genus Serratia that retains the mutant AK gene and the mutant DDPS gene and has an enhanced dihydrodipicolinate reductase gene. However, L-lysine productivity can be further improved. This diaminopimelate dehydrogenase gene is enhanced Must have been.
  • DDH diaminopimelate dehydrogenase gene
  • the succinildialaminopimelate transaminase gene (dapD) and the succinyldiaminopimelate deacylase gene (dapE) were enhanced. Also, L-lysine productivity can be improved to the same extent.
  • the enhancement of a gene means enhancing the activity per cell of an enzyme which is an expression product of the gene. Specifically, for example, increasing the intracellular copy number of the gene, increasing the expression level per gene using a promoter with high expression efficiency, introducing a mutation that enhances the enzyme activity into the gene, etc. Is mentioned.
  • the gene may be inserted into a vector capable of autonomous replication in the cell of the genus Serratia, and the vector may be used to transform the bacterium of the genus Serratia.
  • This vector is preferably a multicopy plasmid.
  • the copy number may be increased by amplifying DNA integrated into chromosome DNA using Mu phage or the like.
  • a stable partitioning mechanism is provided so that both of these plasmids can be stably retained in cells. It is preferable to use a plasmid having the same. The order of introduction of each gene does not matter.
  • the L-lysine biosynthesis system gene of E. coli and the coryneform bacterium DDH gene can be obtained as follows.
  • the DDH gene was created based on the known nucleotide sequence of the DDH gene of Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)). It can be obtained by amplifying chromosomal DNA of a coryneform bacterium such as Brevipacterium lactofermentum by a PCR method using two kinds of oligonucleotide primers (for example, SEQ ID NOS: 9 and 10).
  • the dapD gene is composed of two types of oligonucleotide primers (for example, those based on the nucleotide sequence of a known dapD gene (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984))). It can be obtained by amplifying chromosomal DNA of E. coli 13110 strain by a PCR method using SEQ ID NOs: 11 and 12).
  • the dapE gene is composed of two oligonucleotide primers (SEQ ID NOS: 13 and 14) based on the nucleotide sequence of a known dapE gene (Bouvier, J. et al., J.
  • the Serratia bacterium used as a host in the present invention includes a mutant DDPS gene and a mutant AK111 gene, a promoter of another L-lysine biosynthesis gene, or other gene for expressing these genes in the cell. If the promoter functions, and the mutant DDPS gene, mutant ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ gene, or other L-lysine biosynthesis gene is to be introduced into plasmid as extrachromosomal DNA, it is used for introduction. It can be used if the origin of replication of the vector DNA can function and replicate in cells.
  • Examples of the Serratia bacterium that can be used in the present invention include L-threonine-producing bacteria. This is because L-threonine-producing bacteria generally have their L-threonine inhibition of aspartokinase released.
  • L-threonine-producing bacteria of Serratia marcessens bacteria that are resistant to the threonine analog AHV ( ⁇ -amino, 3-hydroxyvaleric acid) are known (S. Komatsubara, M. Kisumi and I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834 (1978)).
  • AHV ⁇ -amino, 3-hydroxyvaleric acid
  • the strain has been sent to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Ministry of International Trade and Industry (ZIP code 1-35, Higashi 1-3-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan) since June 12, 1995. Deposited under accession number FERM P-14983, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on March 4, 1996, and given accession number FE RM BP-5441.
  • Serratia genus bacteria that can be used in the present invention include Serratia marcescens deficient in lysine decarboxylase (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 50-53589).
  • Lysine decarboxylase is an enzyme that catalyzes the reaction of producing cadaverine by decarboxylation of L-lysine as an L-lysine degrading enzyme, and a strain lacking this inhibits L-lysine degradation.
  • L-threonine producing bacteria and lysine decarboxylase as described above are deficient Serratia bacteria are exposed to ultraviolet light or treated with a mutagen commonly used for artificial mutation, such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosogazine (NTG) or nitrite. Can be obtained.
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosogazine
  • the medium used for culturing the transformant having the mutant gene according to the present invention is a usual medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and other organic components as required.
  • Examples of the carbon source include saccharides such as sucrose, glucose, lactose, galactose, fructose and starch hydrolysates, alcohols such as glycerol and sorbitol, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid. Can be used.
  • saccharides such as sucrose, glucose, lactose, galactose, fructose and starch hydrolysates
  • alcohols such as glycerol and sorbitol
  • organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid. Can be used.
  • inorganic ammonium salts such as urea, ammonium sulfate, ammonium chloride or ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and ammonia water can be used.
  • organic trace nutrients it is desirable to contain required substances such as vitamin L-isoleucine or an appropriate amount of yeast extract.
  • required substances such as vitamin L-isoleucine or an appropriate amount of yeast extract.
  • small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions, etc. are added as necessary.
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions for 16 to 96 hours, and the culture temperature is controlled at 25 to 45 ° C, and the pH is controlled at 5 to 8 during the culture.
  • the culture temperature is controlled at 25 to 45 ° C
  • the pH is controlled at 5 to 8 during the culture.
  • inorganic or organic acidic or alkaline substances, as well as ammonia gas, etc. can be used.
  • FIG. 1 is a diagram showing a manufacturing process of pdapAl and pdapA2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the inhibition of wild-type and mutant DDPS by L-lysine.
  • Figure 3 is a view to view the manufacturing process of the plasmid pda P AS824 having a double mutation type dapA * gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing a process for producing pLYSCl and pLYSC2.
  • FIG. 5 is a diagram showing the appearance rate and mutation rate of transformants after treatment with hydroxylyamine.
  • FIG. 6 is a diagram showing the inhibition of wild-type and mutant AKIII by L-lysine.
  • FIG. 7 is a diagram showing a process for producing RSF10P-derived plasmid RSF24P having dapA * 24.
  • FIG. 8 is a diagram showing a production process of plasmid pLLC * 80.
  • FIG. 9 is a diagram showing a production process of a plasmid RSFD80 derived from RSF1010 having dapA * 24 and lysC * 80.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION the present invention will be described more specifically with reference to examples.
  • Example 1 Obtaining Mutant D DPS Gene
  • the nucleotide sequence of the dapA gene of E. coli has already been reported (Richaud, F. et al., J. BacterioL, 297 (1986)), and the open reading frame (ORF) has 876 base pairs and 292 amino acids remaining. It is known to encode a basic protein. Since it is unknown how this dapA gene is regulated, a region containing only the SD sequence and 0RF, except for the promoter region, was amplified by PCR and cloned.
  • the total genomic DNA of E. coli K-12 MC1061 strain was obtained by the method of Saito and Miura (Biochem. Bioph. ys. Acta., 72, 619 (1963)) to prepare two primers having the sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, and use them to perform the method of Erlitsch et al. (PCR Technology, Stockton press (1989)) to amplify the target DNA.
  • the obtained DNA was directly inserted into a commercially available PCR fragment-cloning vector pCR100 (purchased from Invitrogen, Calif., USA).
  • pCR100 contains the lacZ promoter (Placz) and is commercially available cut at the downstream site of the lacZ promoter.
  • the PCR fragment is transcribed under the control of the lacZ promoter.
  • the plasmid ligated so that the transcription direction of dapA is in the forward direction with respect to the transcription direction by this lacZ promoter Two plasmids, pdapA2, were obtained as plasmids ligated to (Fig. 1).
  • Transformants obtained by introducing pdapAl into a wild-type E. coli W3110 strain were used to transform W3110 / pdapAl and pdapA2 into E. coli ff3110 strain. They were named respectively transformants obtained by introducing the W3110 / pda P A2.
  • AEC a lysine analog
  • W3110 strain into which no plasmid was introduced was also cultured in the same medium. Both the two transformants and the W3110 strain, which had no plasmid, were inhibited by AEC, but their growth inhibition was restored by the addition of L-lysine.
  • a strain containing a plasmid containing dapA * which encodes DDPS desensitized to L-lysine, is expected to be able to grow on minimal medium M9 supplemented with a significant amount of AEC. Decided to select a plasmid-bearing strain containing dapA * by selecting a strain resistant to AEC.
  • dapA * efficiently, dapA on pdapAl and pdapA2 prepared in ⁇ 1> was mutated.
  • the W3110 / pdapAl strain and the W3110 / pdapA2 strain obtained above were cultured on M9 agar plates containing various concentrations of AEC. Then, the growth inhibitory concentration by AEC was examined, and the selection conditions for a plasmid-containing strain containing dapA * were examined. Table 1 shows the growth of the transformants on M9 medium containing AEC at various concentrations. In the table, + indicates that the transformed strain grew, and 1 indicates that it did not grow.
  • the direction of transcription of the dapA gene on pdapAl matches the direction of transcription by the lacZ motor ( Figure 1). Therefore, since the expression level of the dapA gene on pdapAl was amplified by the lacZ promoter, the dapA gene on pdapA2 was resistant to fairly high concentrations of AEC even when it was wild-type, but the transcription direction of the dapA gene on pdapA2 was lacZ promoter It was found that the expression level was low due to the deletion of the promoter of dapA itself, and the growth was inhibited by lower concentrations of AEC (30 mM, W3110 for the W3110 / pdapAl strain). In the case of the / pdapA2 strain, the growth was suppressed by the addition of 15 mM). It was confirmed that this growth inhibition was eliminated by simultaneous addition of L-lysine.
  • pdapA2 was used as a mutagenesis target, and a minimal medium M9 supplemented with 60 mM AEC was used for selection of a dapA * -containing plasmid-containing strain.
  • this medium is referred to as a selective medium.
  • the mutation was introduced into pdapA2 plasmid using the in-vitro mutation treatment method in which the plasmid was directly treated with hydroxylamine.
  • Mutant pdapA2 was recovered from the above 36 strains, and these and wild-type pdapA2 were used to transform daPA-deficient strain JE7627, cell-free extracts were prepared from each transformant, and the enzyme activity of DDP S was measured. .
  • a cell-free extract (crude enzyme solution) was prepared as follows. Transformants 2 XTY culture areas (1.6% Bacto trypton, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl) were cultured in turbidity at 660 nm (OD 66.) I was harvested upon reaching about 0.8. Wash the cells with 0.85% NaCl under 0 conditions, suspend in 20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5-400 mM KC1, and disrupt the cells by sonication (0 ° C, 200W, 10 minutes) did.
  • the cell lysate was centrifuged at 33krpm for 1 hour at 0 ° C, and the supernatant was added, ammonium sulfate was added to the solution to 80% saturation, stored at 0 ° C overnight, and centrifuged. The pellet was dissolved in 20 mM potassium phosphate buffer pH 7.5-400 mM KC1.
  • the DDPS enzyme activity was measured by the method of Yugari et al. (Yugari, Y. and Gilvarg, CJ Biol. Chem. 240, 4710 (1962)). That is, the absorbance of the reaction solution having the following composition was measured over time in a spectrophotometer at 37 ° C. at a wavelength of 270 nm, and the resulting dihydrodipicolinic acid was measured. As a blank, sodium pyruvate was removed from the reaction system. (Reaction liquid composition)
  • L-lysine inhibited the inhibition of the three mutant DDPSs encoded by dapA * on pdapAS8, pdapAS9, and pdapAS24 at varying degrees, but all three inhibited L-lysine inhibition.
  • the specific activity of the enzyme was affected by the growth of the cells and the preparation of the sample, but in all cases, the activity was slightly lower than that of the wild type. However, it was judged that the breeding material was not practically problematic.
  • the nucleotide sequence of the mutant dapA gene was determined according to a conventional method.
  • PdapAS8 and pdapAS9 is a 4 8 7 th C is Ding
  • pda P AS24 be 5 9 7 th C is changed to T Was revealed.
  • the DDPS encoded by pdapAS8 and pdapAS9 are: the alanine residue at position 1 is a valine residue, and the DDPS encoded by pdapAS24 is 118 It became clear that a histidine residue was changed to a tyrosine residue. (1-2-5) Preparation of double mutant dapA
  • the nucleotide sequence of the AKI II gene (lysC) of E. coli has already been reported (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, GN, and Patte, JC, J. Biol. Chem., 261, 1052). (1986)), it has been shown that the open reading frame (0RF) consists of 1347 base pairs and encodes a protein consisting of 449 amino acid residues. Since this gene has an operator and is suppressed by L-lysine, to remove this operator region, a region containing only the SD sequence and 0RF was amplified by PCR and cloned. did.
  • PCR was performed according to Stockton press (1989)) to amplify the lysC gene.
  • the resulting DNA was digested with BamHI and Asel, blunt-ended, and inserted into the multi-copy vector-Smal site of PUC18.
  • This Smal site is located in the lacZ promoter Isseki one downstream present in base click evening in one, introduce is that recombinant DNA obtained by inserting a DNA fragment into Smal site of P UC18 in E. coli Then, read over by lacZ promoter control
  • a transformant obtained by introducing pLYSCl into an AK completely deficient strain E. coli GT3 was named GT3 / pLYSC1
  • a transformant obtained by introducing pLYSC2 into E. coli GT3 was named GT3 / pLYSC2.
  • a remarkable amount of L-lysine was added to the minimal medium M9, and the GT3 / PLYSC1 strain and the GT3 / PLYSC2 strain were cultured respectively.
  • Both the GT3 / pLYSCl strain and the GT3 / pLYSC2 strain have a plasmid containing wild-type lysC, and ⁇ encoded by lysC on the plasmid is the only AK.
  • Plasmid-bearing strains containing lys encoding AK de-inhibited by L-lysine are expected to be able to grow on minimal medium M9 supplemented with significant amounts of L-lysine.
  • a plasmid-containing strain containing lysC * was selected.
  • the GT3 / pLYSCl strain and the GT3 / pLYSC2 strain were cultured on M9 agar plates containing various concentrations of L-lysine or AEC, respectively. Then, the growth inhibitory concentration of L-lysine or AEC was examined, and the selection conditions for the plasmid-containing strain containing lysC * were examined.
  • Table 2 shows the growth of transformants on M9 medium containing L-lysine or AEC at various concentrations. In the table, + indicates that the transformed strain grew. Indicates that it did not grow
  • pLYSCl was used for the mutagenesis experiment, and a minimal medium M9 supplemented with L-lysine 10 mM or AEC 0.2 mM was used for selection of a lys-containing plasmid-containing strain.
  • this medium is referred to as selection medium.
  • plasmid is directly treated with hydroxylamine, and a mutation other than cytosine to thymine due to hydroxylamine to give diversity to the mutation.
  • two methods were used: an in vivo mutation treatment method in which the cells retaining the plasmid were treated with nitrosoguanidine (NTG), and then plasmid was extracted.
  • NTG nitrosoguanidine
  • pLYSCl was introduced into E. coli MC1061, and the whole cells were subjected to NTG treatment. After treatment, the cells were cultured overnight to fix the mutation, and then plasmid was extracted and introduced into E. coli GT3. That is, the transformed strain 2 XTY medium (1.6% Bacto trypton, 1% Yeast e xtract, 0.5% NaCl) and cultured at 00 66. The cells were harvested when the pH was about 0.3, washed with the TM buffer (TM buffer) shown below, and then NTG solution (prepared by dissolving NTG in the TM buffer at a concentration of 0.2 mg / ml) And treated at 37 ° C. for 0 to 90 minutes.
  • TM buffer TM buffer
  • NTG solution prepared by dissolving NTG in the TM buffer at a concentration of 0.2 mg / ml
  • pLYSCl * 80 pLYSCl * 117, pLYSCl * 126, pLYSCl * 149, pLYSCl * 150, pLYSCl * 156, pLYSCl * 158, pLYSCl * 167, pLYSCl * 169, pLYSCl * 172.
  • AK completely deficient strain GT3 was transformed, cell-free extracts were prepared from each transformant, and the AKIII enzyme activity was measured.
  • a cell-free extract (crude enzyme solution) was prepared as follows.
  • the transformed strain was cultured in 2 XTY culture areas, OD 66. When the concentration reached about 0.8, cells were collected. Conditions of the cells 0 ° C, 0.02M KH 2 P0 4 (pH6.75) - 0.03M - washed with mercaptoethanol, disrupted by sonication (0 ° C, 100W, 30 sec X4) did.
  • nucleotide sequence was determined for each of the 14 lys on the mutant pLYSCl, and the mutation points were identified. Table 4 shows the results. In the table, parentheses indicate amino acid residue mutations based on nucleotide mutations. Of the 14 species, two identical variants were found (No. 48 and No. 167, and No. 24 and No. 80), so there were 12 variants. Nos. 149, 150, 156, 158, 167, 169 and 172 are mutants obtained by treatment with hydroxyamine, and Nos. 24, 43, 48, 60, 80, 117 and 126 are mutants obtained by NTG treatment. In each case, the pattern was a mutation from cytosine to thymine, or a mutation from guanine to T-denine in the front chain due to a mutation from cytosine to thymine in the back chain.
  • Such strains include, for example, L-threonine-producing bacteria.
  • Serratia marcescens L-threonine-producing bacteria bacteria that are resistant to the threonine analog AHV ( ⁇ -amino-hydroxyvaleric acid) are known (S. Komatsubara, M. Kisumi and I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834 (1978)).
  • AHV ⁇ -amino-hydroxyhydroxyvaleric acid
  • the strain was sent to the Institute of Life Science and Industrial Technology, the Ministry of International Trade and Industry of Japan (zip code: 1-3 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) from FERM on June 12, 1995. Deposited under the accession number P-14983, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on March 4, 1996, and given the accession number FERM BP-5441.
  • the dapA * to be introduced into Serratia marcescens was determined from the degree of enzyme release and specific activity, and the dapA * contained in pdapAS24 (the histidine residue at position 18 was mutated to a tyrosine residue. Is selected).
  • the mutant dapA * on pdapAS24 (hereinafter referred to as “dapA * 24”) was transformed into pVIC40 tetracycline resistance. It was ligated downstream of the gene promoter to obtain RSF24P as shown in FIG.
  • RSF24P plasmid was introduced into AJ13125 strain according to a conventional method to obtain AJ13125 / RSF24P.
  • AJ13125 / RSF24P was evaluated for L-lysine productivity.
  • RSFP was constructed as a control plus. That is, a large fragment was selected from a double digest of BamHI and Dral of pV IC40 shown in FIG. 7, and this was blunt-ended with DNA polymerase Klenow 'fragment. The blunt-ended large fragment was self-ligated to obtain plasmid RSFP.
  • RSFP was introduced into 5 AJ13125 strains according to a conventional method to obtain AJ13125 / RSFP.
  • AJ13125 / RSFP was also evaluated for L-lysine productivity.
  • the cultivation was performed using the following medium at a culturing time of 72 hours and a temperature of 30 ° C. with stirring at 114 to 116 rpm. Table 5 shows the results. Lysine production medium
  • Example 4 Fermentative production of L-lysine by dapA 'and lysC * -introduced strains
  • Example 3 showed the effect of mutant DDPS on L-lysine production, but in order to further improve this,
  • the mutant ⁇ gene obtained in 2 was coexisted with the mutant DDPS gene.
  • the mutant A Kill gene coexisting with the mutant DDP S gene was selected from the No. 80 strain (lys C * 80) in terms of enzyme activity, heat stability and the like.
  • lysC * 80 is a vector pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) having an inverted insertion site with respect to pUC18 by replacing lysC * (hereinafter referred to as “lysC * 80”) on P LYSCr80 to increase the expression level of lysC *.
  • the plasmid pLLC * 80 (Fig. 8), which was created by reconnecting to the downstream of the lacZ promoter of (1), was used. Since lysC * 80 on pLYSCl * 80 is located in the transcription direction opposite to that of lacZ promoter, pLLC * 80 is transcribed to lacZ promoter to improve L-lysine productivity. This is a plasmid created to place lys 80 so that the shooting direction is the positive direction.
  • Plasmid RS FD 80 having dapA * and lysC * was produced from pLLC'80 and the RS F 24 P obtained in Example 3 as shown in FIG.
  • dapA * 24 and lys80 are arranged in this order downstream of the promoter of the tetracycline resistance gene (tetP) so that the transcription direction is forward with respect to tetP.
  • AJ12396 The product obtained by introducing RSFD 80 plasmid into E. coli JM109 strain was named AJ12396.
  • AJ 12396 was deposited on October 28, 1993 with the Research Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry (zip code: 1-3, Higashi 1-3-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under the accession number FERM P-13936.
  • FERM P-13936 was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on January 1, 1994, and is deposited under the accession number of FERM BP-4859.
  • RSFD80 was introduced into AJ13125 strain according to a conventional method to obtain AJ13125 / RSFD80.
  • AJ 13125 / RSF D80 was evaluated for L-lysine productivity.
  • L-lysine productivity was also evaluated for AJ13125 / RSFP.
  • the cultivation was carried out using the same L-lysine production medium as in Example 3, with a culturing time of 72 hours and a temperature of 30 ° C. with stirring of 114 to 116 rpni.
  • Table 6 shows the results.
  • DDPS mutant gene derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia in which feedback inhibition by L-lysine has been sufficiently released has been obtained.
  • Serratia bacteria carrying this gene produce significant amounts of L-lysine.
  • introducing the DDPS mutant gene into a Serratia genus bacterium that retains Asbart kinase whose feedback inhibition by L-lysine has been released it is possible to further increase L-lysine production.
  • AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG 676 Lys Ala lie Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gin lie Leu Tyr Asn Val
  • Gly Leu Val lie Thr Gin Gly Phe lie Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
  • Asp Glu lie Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala

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Description

明細書 発酵法による Lーリジンの製造法 技術分野 本発明は微生物工業に関連したものであり、 詳しくは、 発酵法による Lーリジ ンの製造法、 この製造法に用いる D N A及び微生物に関するものである。 背景技術 従来、 発酵法により L一リジンを製造する場合、 生産性を向上させるために、 自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。 Lーリジ ンを生産する人工変異株は数多く知られており、 その多くは S— 2—アミノエチ ルシスティン （A E C ) 耐性変異株であり、 ブレビバクテリウム属、 コリネバク テリゥム属、 バチルス属、 ェシヱリヒア属、 またはセラチア属に属している。 ま た、 組換え D N Aを使用した形質転換体を用いる （米国特許第 4278765号） 等、 ァ ミノ酸の生産を増加させる種々の技術が開示されている。
例えばセラチア属細菌は、 「応用分子遺伝学」 （講談社サイエンティフィ ック 1 9 8 6年、 ISBN4 06- 139659-5) や 「アミノ酸発酵」 （学会出版センター 1 9 8 6年、 ISBN4- 7622- 9454- 3) に示されるように、 L一プロリン、 L—ヒスチジン、 L一アルギニン、 Lースレオニン、 L—ノ《、リン、 L—イソロイシン等の各種アミ ノ酸の生産菌として広く用いられ、 種々の面でアミノ酸生産菌として優れた性質 を有している。 セラチア属細菌を用いた多種のァミノ酸生産が報告されているカ、 L一リジンを生産するようになった報告 （特公昭 5 1— 9 3 9 3号公報） による と、 収率 （生成した L一リジン塩酸塩の濃度を初発の炭素源濃度で割った値） は 5 . 4 %と計算される。
セラチア属細菌の代表的菌株であるセラチア ·マルセッセンス （Seratia marc escens) はェシエリヒア属細菌と遺伝子構造、 遺伝子発現調節機構が類似してお り、 さらにェシエリヒア属細菌で組換え D N Aに用いられるクローニングベクタ 一がセラチア属細菌にも用いる事ができる （特開平 2— 27980号公報、 特開 平 5 - 10076号広報） 。
ところで、 ジヒドロジピコリン酸合成酵素 （DDP S) は、 ァスパルトセミア ルデヒドとピルビン酸を脱水縮合させ、 ジヒ ドロジピコリン酸を合成する酵素で あり、 この反応はァスパラギン酸系アミノ酸の生合成において、 L—リジン生合 成系への分岐の入口となっている。 ェシヱリヒア属細菌においてはァスパルトキ ナ一ゼとともに Lーリジン生合成の重要な調節部位を担っている事が知られてい る。 ェシヱリヒア属細菌の DDP Sは、 Lーリジンによるフィードバック阻害を 受けることが知られている。
DDP Sはェシヱリヒア ' コリ （Escherichia coli(E. coli)：大腸菌） では d apAという遺伝子にコードされている。 この dapAはすでにクローニングされており, 塩基配列も決定されている (Richaud, F. et al. J. Bacterid. , 297 (1986)) 。
—方、 ァスパルトキナ一ゼ （以下、 「AK」 と略すことがある） は、 ァスパラ ギン酸を^一ホスホアスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、 ァスパ ラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素となっている。 E. coliの A Kは 3種あり （ΑΚ Ι, ΑΚΙΙ，ΑΚΠΙ) 、 うち 2つはホモセリンデヒドロゲナーゼ (以下、 「HD」 と略すことがある） との複合酵素である。 複合酵素の内のひと つは thrA遺伝子にコードされる AK I -HD Iであり、 もう一方は metLM遺伝子 にコードされる AKII— HDIIである。 AK Iはスレオニンとィソロイシンによ る協奏的抑制及びスレオニンによる阻害を受け、 ΑΚΠはメチォニンによる抑制 を受ける。
これらに対し、 AKIIIのみは単機能酵素であり、 lysCと名付けられた遺伝子の 産物であって、 L -リジンによる抑制及びフィ一ドバック阻害を受けることが知 られている。 菌体内でのこれらの活性の割合は、 AK I： ΑΚΙΙ: ΑΚΠΙ=約 5： 1： 4となっている。
上述したように、 DDP S及び ΑΚΙΙΙは Lーリジンによるフィ一ドバック阻害 を受けるため、 L—リジンを効率よく生産させるための障害となっている。 した がって、 L—リジンによるフィ一ドバック阻害を受けない DDP Sあるいは ΑΚ ΠΙの変異酵素及びそれらの遺伝子を取得することができれば、 セラチア属細菌を 用いて効率の良い L—リジンの発酵生産を行うことができることが期待されるが、 D D P Sの変異酵素を示した先行文献はなく、 また、 Α Κ Π Ιの変異酵素について も報告はあるものの （Boy, E. et al. , J. Bacteriol. , 112， 84 (1972)) 、 同変 異酵素が Lーリジンの生産性を改善できることを示唆した例は知られていない。 さらに、 セラチア属細菌の L一リジン生合成系遺伝子についても知られていない。 発明の開示 本発明は、 上記観点からなされたものであり、 L一リジンによるフィードバッ ク阻害が十分に解除された D D P Sと Α Κ：、 特にェシヱリヒア属細菌由来の D D P Sと Α Κ Ι Ι Ιを取得し、 セラチア属細菌を用いて従来よりも効率よく L一リジン を製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 L一リジン によるフィードバック阻害が十分に解除されたェシヱリヒァ属細菌由来の D D Ρ Sをコードする D N Αを取得することに成功した。 尚、 L一リジンによるフィ一 ドバック阻害が十分に解除された E. coli由来の D D P Sをコードする D N Aを本 明細書において変異型 d a p Aあるいは d a p A *とよぶことがある。
本願発明者らはまた、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァス パルトキナーゼおよび L一リジンによるフィードノ ック阻害が十分に解除された D D P Sを保持するセラチア属細菌を創製した。 尚、 L—リジンによるフィード バック阻害が十分に解除された E. coli由来のァスバルトキナーゼをコ一ドする D N Aを本明細書において変異型 1 s。あるいは 1 y s C *とよぶことがある。 さらに本願発明者らは、 変異型 d a p A及び変異型 1 y s Cを保持するセラチ ァ属細菌を創製した。 そして同セラチア属細菌を好適な培地で培養することによ り、 該培養物中に Lーリジンを著量生産蓄積させ得ることを見出し/こ。
すなわち本願発明は、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除される変異 を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする D N Aが細胞内に導入され て形質転換されたセラチア属細菌である。 ジヒドロジピコリン酸合成酵素として は、 エシ リヒア属細菌由来の酵素が挙げられる。 ェシエリヒア属細菌由来のジ ヒドロジピコリン酸合成酵素において、 L一リジンによるフィ一ドバック阻害が 解除される変異としては、 配列表の配列番号 4に記載されるジヒ ドロジピコリン 酸合成酵素のアミノ酸配列中、 N—末端から 8 1番目のァラニン残基をバリン残 基に置換させる変異、 1 1 8番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる 変異、 8 1番目のァラニン残基をバリン残基に置換させかつ 1 1 8番目のヒスチ ジン残基をチロシン残基に置換させる変異が挙げられる。 また、 ジヒドロジピコ リン酸合成酵素は、 Lーリジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有 していれば、 セラチア属細菌固有のものでもよい。
本願発明はさらに、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスパ ルトキナ一ゼをさらに保持することを特徴とする前記セラチア属細菌である。 L 一リジンによるフィ一ドバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼをセラチア 属細菌に保持させる方法としては、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除 される変異を有するェシヱリヒア属細菌由来のァスパルトキナ一ゼ I I Iをコ一ドす る D N Aをセラチア属細菌細胞内に導入する方法が挙げられる。
L—リジンによるフィードバック阻害が解除されるェシヱリヒア属細菌由来の ァスバルトキナーゼ I I Iの変異としては、 配列表の配列番号 8に記載されるァスパ ルトキナ一ゼ I I Iのアミノ酸配列中、 N—末端から 3 2 3番目のグリシン残基をァ スパラギン酸残基に置換させる変異、 3 2 3番目のダリシン残基をァスパラギン 酸残基に置換させかつ 4 0 8番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換さ せる変異、 3 4番目のアルギニン残基をシスティン残基に置換させかつ 3 2 3番 目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、 3 2 5番目の口イシ ン残基をフエ二ルァラニン残基に置換させる変異、 3 1 8番目のメチォニン残基 をイソロイシン残基に置換させる変異、 3 1 8番目のメチォニン残基をイソロイ シン残基に置換させかつ 3 4 9番目のバリン残基をメチォニン残基に置換させる 変異、 3 4 5番目のセリン残基をロイシン残基に置換させる変異、 3 4 7番目の バリン残基をメチォニン残基に置換させる変異、 3 5 2番目のスレオニン残基を イソ口イシン残基に置換させる変異、 3 5 2番目のスレオニン残基をィソロイシ ン残基に置換させかつ 3 6 9番目のセリン残基をフヱニルァラニン残基に置換さ せる変異、 1 6 4番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、 4 1 7番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 4 1 9番目のシステ イン残基をチロシン残基に置換させる変異が挙げられる。
もちろん、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスパルトキナ —ゼは、 セラチア属細菌固有のものであってもよい。
尚、 L—リジンによるフィ一ドバック阻害が解除される変異を有するジヒドロ ジピコリン酸合成酵素をコードする DNA及び Lーリジンによるフィ一ドノ ック 阻害が解除される変異を有するァスバルトキナーゼをコ一ドする DNAは、 各々 セラチア属細菌の細胞内で同一または別々のプラスミ ド上に保持されていてもよ い。
また、 L—リジンによるフィ一ドバック阻害が解除される変異を有するジヒ ド ロジピコリン酸合成酵素をコードする DNAが導入されるセラチア属細菌として は、 リジンデカルボキシラーゼを欠損するセラチア属細菌が挙げられる。
本発明はまた、 上記のセラチア属細菌のいずれかを好適な培地で培養し、 該培 養物中に Lーリジンを生産蓄積せしめ、 該培養物から Lーリジンを採取すること を特徴とする Lーリジンの製造法を提供する。
尚、 本明細書において、 DD P S又は ΑΚΙΠをコードする DNA、 あるいはこ れらにプロモーターを含む DNAを、 「DDP S遺伝子」 又は ΓΑΚΙΙΙ遺伝子」 ということがある。 また、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除された変 異酵素を単に 「変異型酵素」 、 これをコードする DNAあるいはこれにプロモー ターを含む DN Aを 「変異型遺伝子」 ということがある。 さらに、 「L—リジン によるフィードバック阻害が解除される」 とは、 実質的に阻害が解除されていれ ばよいことを意味し、 完全に解除されている必要はない。
以下、 本発明について詳細に説明する。 く 1 >本発明の方法に用いる変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素 （DDP S) をコードする DNA
本発明の方法に用いる変異型 DDP Sをコードする DNAは、 野生型 DDP S をコ一ドする DN Aにおいて、 コードされる DD P Sの L一リジンによるフィー ドバック阻害が解除される変異を有するものである。 DDP Sとしては、 ェシェ リヒア属細菌由来のもの、 特に E. coli由来の DDP Sが挙げられる。 また、 セラ チア属細菌自体の DDP Sであっても、 Lーリジンによるフィ一ドバック阻害が 解除される変異を有するものであれば、 用いることができる。
ェシヱリヒア属細菌由来の DDP Sの L—リジンによるフィ一ドバック阻害を 解除する変異としては、 配列表の配列番号 4に記載される DDP Sのアミノ酸配 列中、 00? 3の1^ー末端から
① 81番目のァラニン残基をバリン残基に置換させる変異、
② 118番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、
③ 81番目のァラニン残基をバリン残基に置換させかつ 118番目のヒスチジン残基を チロシン残基に置換させる変異、
が挙げられる。
野生型 DDP Sをコ一ドする DNAとしては、 ェシヱリヒア属細菌またはセラ チア属細菌由来の DDP Sをコードするものであれば特に制限されない。 ェシェ リヒア属細菌由来の DDP Sをコ一ドする DN Aとして、 具体的には配列番号 4 に示すァミノ酸配列をコードする D N Aが挙げられ、 さらに具体的には配列番号 3に示す塩基配列のうち、 塩基番号 272〜1 147で表される配列が挙げられ る。 これらの配列において、 上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の 変異を有するものが、 本発明に用いる変異型 DD P Sをコ一ドする DN Aの例で ある。 尚、 置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、 そのアミノ酸残基をコ ードするものであれば種類は特に問わない。 また、 菌種ゃ菌株の違いにより保持 する D D P Sの配列がわずかに相異することが予想されるが、 このような酵素の 活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、 欠失あるいは挿入を有するもの も本発明に用いる変異型 DDP S遣伝子に含まれる。
このような変異型遺伝子を取得する方法は以下の通りである。 まず、 野生型 D D P S遺伝子又は D D P Sの酵素活性に実質的に影響を与えない変異を有する D DP S遺伝子を含有する DN Aをインビトロ変異処理し、 変異処理後の DN Aと 宿主に適合するベクター DN Aとを連結して組換え DN Aを得る。 組換え DNA を宿主微生物に導入して形質転換体を得、 同形質転換体のうちで変異型 DD P S を発現するように至ったものを選択すれば、 同形質転換体が変異型遺伝子を保持 している。 また、 野生型 D DP S遺伝子又は他の変異を有する D DP S遺伝子を 含有する DN Aを、 宿主に適合するベクター DN Aと連結して組換え DN Aを得 て、 その後組換え DNAをインビトロ変異処理し、 変異処理後の組換え DNAを 宿主微生物に導入して形質転換体を得、 同形質転換体のうちで変異型 DDP Sを 発現するように至ったものを選択しても、 同形質転換体は変異型遺伝子を保持し ている。
野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、 変異型酵素を生産する変異株を創 成した後、 該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。 もしくは、 野生型遺伝 子が連結されている組換え D N Aが導入されている形質転換体を変異処理し、 変 異型酵素を生産する変異株を創成した後、 該変異株から組換え DN Aを回収すれ ば、 同 DNA上に変異型遺伝子が創成される。
DNAをィンビトロ変異処理するための薬剤としては、 ヒ ドロキシルァミン等 が挙げられる。 ヒ ドロキシルァミ ンは、 シトシンを N4—ヒ ドロキシシトシンに変 えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。 ま た、 微生物自体を変異処理する場合は、 紫外線照射または N—メチルー N'—二トロ 一 N—二トロソグァ二ジン （NTG) もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いら れている変異剤による処理を行う。
上記野生型 DDP S遺伝子あるいは他の変異を有する DDP S遺伝子を含有す る DNAの供与菌としては、 ェシエリヒア属又はセラチア属に属する微生物をはじめ としていかなるものを用いてもかまわない。 エシュリヒア属に属する微生物とし て具体的にはナイ トハルトらの著書 (Neidhardt, F. C. et. al. , Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C. , 1208, table 1) にあげられるものが利用できる。 たとえば、 E. coli JM10 9株や、 MC1061 株などがあげられる。 DDP S遺伝子を含有する DMの供与菌と して野生株を用いた場合、 野生型の D DP S遺伝子を含む DNAが取得できる。 一方、 セラチア属に属する微生物としては、 セラチア 'マルセッセンス、 例え ばセラチア ·マルセッセンス AJ13125株 （FERM BP- 5441) 等が挙げられる。
(1) 野生型 D DPS遺伝子の取得
以下に、 DDP S遺伝子を含有する MAの調製例について述べる。 ここでは主と して E. coliについて具体的に説明するが、 他のェシヱリヒア属細菌及びセラチア 属細菌についても同様にしてして D D P S遺伝子を取得することができる。
まず、 野生型の dapAをもつ E. coli例えば MC1061株を培養して培養物を得る。 上 記微生物を培養するには、 通常の固体培養法で培養しても良いが、 集菌の際の効 率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好ましい。 また、 培地として は、 例えば酵母エキス、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスティープリカ一または大 豆もしくは小麦の浸出液等の 1種類以上の窒素源に、 リン酸第 1カリウム、 リン 酸第 2カリゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリゥム、 塩化マグネシウム、 塩化 第 2鉄、 硫酸第 2鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の 1種以上を添加し、 更に 必要に応じて糖質原料、 ビタミン等を適宜添加した物が用いられる。 なお、 培地 の初発 p Hは、 6〜8に調製するのが適当である。 また培養は 3 0〜4 2 °C、 好 ましくは 3 7 °C前後で 4〜2 4時間、 通気撹拌深部培養、 振盪培養または静置培 養等により行う。
このようにして得られた培養物を、 例えば 3， 000 r. p. m.で 5分間遠心分離して E. coli MC1061株の菌体を得る。 この菌体より、 例えば斎藤、 三浦の方法 （Bioc hem. Biophys. Acta. , 72, 619, (1963))、 K. S. Kirbyの方法 (Biochem. J. , 64, 405, (1956)) 等の方法により染色体 DMを得ることができる。
こうして得られた染色体 D N Aから D D P S遺伝子を単離するために、 染色体 D N Aライブラリ一を作製する。 まず、 染色体 D N Aを適当な制限酵素で部分分 解して種々の断片混合物を得る。 切断反応時間等を調節して切断の程度を調節す れば、 幅広い種類の制限酵素が使用できる。 例えば、 Sau3AIを、 温度 3 0 °C以上、 好ましくは 3 7 °C、 酵素濃度 1〜1 0ュニッ ト /mlで様々な時間 （1分〜 2時間） 染色体 D N Aに作用させてこれを消化する。
ついで、 切断された染色体 D N A断片を、 ェシエリヒア属細菌細胞内で自律複 製可能なベクター DNAに連結し、 組換え D N Aを作製する。 具体的には、 染色体 D N Aの切断に用いた制限酵素 Sau3A Iと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限 酵素、 例えば BamH Iを、 温度 3 0 °C以上、 酵素濃度 1〜100ュニッ ト Zmlの条件下 で 1時間以上、 好ましくは 1〜3時間、 ベクター D N Aに作用させてこれを完全 消化し、 切断開裂する。 次いで、 上記のようにして得た染色体 D N A断片混合物 と切断開裂されたべクタ一 DNAを混合し、 これに DNAリガーゼ、 好ましくは T 4 D N Aリガーゼを、 温度 4〜； L 6 °C、 酵素濃度 1〜； L 00ユニッ ト /mlの条 件下で 1時間以上、 好ましくは 6〜 24時間作用させて組換え D N Aを得る。
得られた組換え DNAを用いて、 ェシエリヒア属の微生物、 例えば大腸菌 K - 1 2株、 好ましくは JE7627株 (ponB704, dacB12, pfv+, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metBl, ilvH611, leuA371, proA3, lac- 3, tsx-76) のような DDP S欠損変異株を形 質転換して染色体 DN Aライブラリーを作製する。 この形質転換は、 D.M. Morris onの方法 (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) あるいは受容菌細胞を塩化 カルシウムで処理して DN Aの透過性を増す方法 （Mandel，M. and Higa, A. , J. Mo 1. Biol. ,53, 159(1970)) 等により行うことができる。 なお、 JE7627株は国立遺伝 学研究所 （日本国静岡県三島市） より入手可能である。
得られた染色体 DNAライブラリーの中から、 DDP S活性が増大した株ある いは D DP S遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株より DDP S 遺 伝子の組換え DNAをもつ菌株を得る。 例えば、 DDP S欠損変異株はジァミノ ピメ リン酸要求性であるので、 DDP S欠損変異株を宿主に用いた場合は、 ジァ ミノピメ リン酸を含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、 該菌株か ら組換え DNAを回収することにより、 DDP S遺伝子を含有する DNA断片を 得ることができる。
DDP S遺伝子を含有する組換え DNAをもつ候補株が、 実際に DDP S遺伝 子がクローニングされた組換え DN Aを保持するかどうかを確認するには、 候補 株から細胞抽出液を調製し、 それより粗酵素液を調製して D DP S活性が増大し ていることを確認することにより達成できる。 DDP Sの酵素活性測定法は、 Yu gariらの方法により行うことができる （Yugari，Y. and Gilvarg, C. , J. Biol. Che m.， 240, 4710(1962)) 。
そして、 上記菌株より、 DDP S遺伝子を含有する DNAがベクター DNAに 挿入された組換え DNAを、 例えば P. Guerry らの方法 （J. Bacteriol. , 116, 1 064, (1973)) 、 D. B. Clewell の方法 (J. Bacteriol. , 110, 667, (1972)) などによ り単離することができる。
野生型 DDP S遺伝子の取得は、 染色体上に DDPS遺伝子を有する株から、 斎藤、 三浦の方法等により染色体 DNAを調製し、 ポリメラ一ゼチヱインリアク シ 3ン法 ( P C R ： polymerase chain reaction； White, T. J. et al ； Trends G enet., 5， 185 (1989)参照） により、 D D P S遺伝子を増幅することによつても行 える。 増幅反応に用いる DNAプライマ一は、 DDPS 遺伝子の全領域あるいは 一部領域を含有する DN A二重鎖の両 3' 末端に相補するものを用いる。 DDP S遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、 該 DNA断片をプライマーとして 全領域を含む DNA断片を染色体 D N Aライブラリーよりスクリーニングする必 要がある。 DDP S遺伝子の全領域を増幅した場合には、 増幅された D DP S遺 伝子を含有する DN A断片を含む P CR反応液をァガロースゲル電気泳動に供し た後、 目的の DNA断片を抽出することによって DDP S 遺伝子を含有する D NA断片を回収できる。
DN Aプライマーとしては、 例えば E. coliにおいて既知となっている配列 （R ichaud, F. et al. , J. Bacteriol. , 297(1986)) を基にして適宜作成すればよいが、 具体的には、 DDP S遺伝子をコードする 1150塩基からなる領域を増幅できるプ ライマ一が好ましく、 配列番号 1及び 2に示した 2種のブライマ一が適当である。 プライマ一 DN Αの合成は、 ホスホアミダイ ト法 （Tetrahedron Letters, 22, 185 9(1981)参照） 等の常法により、 市販の DN A合成装置 （例えば、 Applied Biosy stems社製 DNA合成機 model 380B等） を用いて行うことができる。 また、 PCR反 応は、 市販の P C R反応装置 （宝酒造 （株） 製 DN Aサ一マルサイクラ一 PJ200 0型等） を使用し、 TaqMAポリメラーゼ （宝酒造 （株） より供給されている） を用 、、 供給者により指定された方法に従って行うことができる。
P CR法により増幅された D DP S遺伝子は、 ェシェリヒア属細菌細胞内にお いて自律複製可能なべクター D N Aに接続し、 エシ リヒァ属細菌細胞に導入す ることによって、 DDP S遺伝子への変異の導入などの操作がしゃすくなる。 用 いられるベクタ一 DN Aと形質転換法、 さらに DD P S遺伝子の存在の確認方法 は上述した方法と同じである。
セラチア属細菌由来の D DP S遺伝子は、 上記と同様にしても取得できるが、 セラチア属細菌染色体 DN Aライブラリ一から、 E. coli由来の D DP S遺伝子又 はその一部をプローブとするハイブリダィゼ一シヨンによっても単離できる。 ま た、 セラチア属細菌染色体 D N Aを铸型とし、 E. coli由来の D D P S遺伝子の塩 基配列に基づいて作製したォリゴヌクレオチド、 例えば配列番号 1及び 2に示し た 2種の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一とする P C R法によって もセラチア属細菌由来の D D P S遺伝子が得られる。
セラチア属細菌はェシエリヒア属細菌と近縁であり、 両細菌の間では、 細胞に 含まれるタンパク質のァミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列の相同性が高いことが 知られている。 このような遺伝子としては、 例えば、 thrA、 thrB、 thrCが知られ ており、 相同性は各々 8 3 %、 7 3 %及び 8 4 %である （L Omori et al. J. Bac teriol. 175, 785-794(1993)) 。 また、 ェシヱリヒア属細菌由来の遺伝子配列を利 用してセラチア属細菌の遺伝子を単離した例としては、 dnaAが知られている （0. Skovgaard and F. G. Hansen J. Bacteriol. 169, 3976-3981(1987)) 。 したがって、 ェシヱリヒア属細菌の D D P S遺伝子の塩基配列を基に、 ハイブリダィゼーショ ン法ゃ P C R法によってセラチア属細菌の D D P S遺伝子を単離できる可能性は 極めて高い。
( 2 ) D D P S遺伝子への変異の導入
上記のようにして得られた D D P S遺伝子に、 アミノ酸残基の置換、 挿入およ び欠失等の変異を実施する方法としては、 リコンビナント P C R法 （Higuchi. R. , 61, in PCR Technology (Erlich, H. A. Eds. , Stockton press(1989))) 、 部位特異的 変異法 (Kramer, W. and Frits, H. J. , Meth. in Enzymol. , 154, 350 (1987)) ; Kunk el, T. A. et al. , Meth. in Enzymol. , 4, 367(1987)) などがある。 これらの方法 を用いると、 目的部位に目的の変異を起こすことができる。
また、 目的遺伝子を化学合成する方法によれば、 目的部位への変異、 あるいは ランダムな変異を導入することができる。
さらに、 染色体もしくはプラスミ ド上の D D P S遺伝子を直接ヒドロキシルァ ミンで処理する方法 (Hashimoto, T. and Sekiguchi, M.， J. Bacteriol. , 159, 1039 (1984)) がある。 また、 D D P S遺伝子を保有するェシエリヒア属細菌を紫外線 照射する方法または N-メチルー N' —二トロソグァ二ジンもしくは亜硝酸などの化 学薬剤処理による方法を用いてもよい。 これらの方法によれば、 ランダムに変異 を導入できる。
変異型遺伝子の選択方法としては、 まず D DP S遺伝子を含有する DN A断片 とベクター DNAからなる組換え DNAを、 直接ヒ ドロキシルァミン等で変異処 理し、 これで例えば E. coli W3110株を形質転換する。 次に L一リジンのアナ口 グである、 S— 2—アミノエチルシスティン （AEC) を含む最少培地、 例えば M9に形質転換株を培養する。 野生型の D DP S遺伝子を含有する組換え DN Aを 保持する株は、 その組換え DNAにより発現される DDP Sが AECにより阻害 されるために、 Lーリジン及びジァミノピメリン酸（DAP)の合成が出来なくなり生 育が抑えられる。 これに対し、 L一リジンによる阻害の解除された D DP S遺伝 子を含有する組換え DN Aを保持する株は、 同組換え DNA中の DDP S遺伝子 にコードされる変異酵素が A E Cによる阻害を受けないので、 A E Cが添加され た最少培地上での生育が可能になるはずである。 この現象を利用し、 生育が、 L 一リジンのアナログである AE Cに耐性となっている株、 すなわち阻害の解除さ れた変異型 D D P S遺伝子を含有する組換え D N Aを保持する株を選択すること ができる。
こうして得られた該変異型遺伝子を、 組換え DN Aとしてセラチア属細菌に導 入し、 発現させることによりフィードバック阻害が解除された D D P Sを保有さ せることができる。 また、 組換え DNAから変異型 DDP S遺伝子断片を取り出 し、 他のベクター DNAに挿入したものを使用してもよい。 本発明において用い ることのできることのできるベクター DNAとしては、 プラスミ ドベクター DN Aが好ましく、 例えば pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHS G398、 RSF1010、 pMW119、 pM¥118 pMff219、 pMW218等が挙げられる。 他にもファー ジ DNAのべクタ一も利用できる。
さらに、 変異型 DDP S遺伝子の発現を効率的に実施するために、 変異型 DD P Sをコードする DNA配列の上流に、 l a c、 t r p、 PL等のセラチア属細 菌細胞内で働く他のプロモーターを連結してもよく、 DDP S遺伝子に含まれる プロモーターをそのまま、 あるいは増幅して用いてもよい。 < 2 >本発明に用いる変異型ァスパルトキナ一ゼをコ一ドする DNA
本発明に用いる変異型 AKをコードする DNAは、 野生型 AKをコ一ドする D NAにおいて、 コードされる AKの L—リジンによるフィ一ドバック阻害が解除 される変異を有するものである。 AKとしては、 ェシヱリヒア属細菌、 由来のも の、 特に E. coli由来の AKIIIが挙げられる。 また、 セラチア属細菌自体のァス パルトキナーゼであっても、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除される 変異を有するものであれば、 用いることができる。
ェシヱリヒア属細菌由来の ΑΚΠΙの L—リジンによるフィードバック阻害を解 除する変異としては、 配列表の配列番号 8に示す AKIIIのアミノ酸配列中、 AK IIIの N—末端から
(ィ） 323番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、
(口） 323番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させかつ 408番目のグリシ ン残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、
(ハ） 34番目のアルギニン残基をシスティン残基に置換させかつ 323番目のグリシン 残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、
(ニ）325番目の口イシン残基をフヱニルァラ二ン残基に置換させる変異、
(ホ） 318番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、
(へ) 318番目のメチォニン残基をィソロイシン残基に置換させかつ 349番目のバリン 残基をメチォニン残基に置換させる変異、
(ト） 345番目のセリン残基をロイシン残基に置換させる変異、
(チ) 347番目のバリン残基をメチォニン残基に置換させる変異、
(リ） 352番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、
(ヌ） 352番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 369番目のセリン 残基をフェニルァラ二ン残基に置換させる変異、
(ル） 164番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、
(ヲ） 417番目のメチォニン残基をイソ口イシン残基に置換させかつ 419番目のシステ ィン残基をチロシン残基に置換させる変異、
が挙げられる。
野生型 AKIIIをコードする DNAとしては、 例えば E. coli由来の AKIIIをコ 一ドする DNAが挙げられ、 具体的には配列番号 8に示すアミノ酸配列をコード する DNA、 さらには配列番号 7に示す塩基配列のうち、 塩基番号 584〜19 30で表される配列が挙げられる。 尚、 E. coliの ΑΚΙΠは、 lysC遺伝子にコ一 ドされている。
これらの配列において、 上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変 異を有するものが、 本発明に用いる変異型 AKIIIをコ一ドする DNAの例である ( 尚、 置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、 そのアミノ酸残基をコードす るものであれば種類は特に問わない。 また、 菌種ゃ菌株の違いにより保持する野 生型 AKIIIのァミノ酸配列がわずかに相異するものがある。 このような酵素の活 性に関与しない位置でのァミノ酸残基の置換、 欠失あるいは挿入を有するものも 本発明に用いる変異型 AKIII遺伝子に含まれる。 例えば、 後記実施例 2で得られ た野生型 lysC遺伝子の塩基配列 （配列番号 7) は、 既に発表されている E. coli K-12 JC411株の lysCの配列 (Cassan, M. , Parsot, C. , Cohen, G. N. , and Patte, J. C. , J. Biol. Chem.， 261， 1052(1986)) と 6ケ所相違しており、 そのうち 2ヶ所でコード されるアミノ酸残基が異なっている （JC411株の lysCは、 配列番号 8に示す lysCの アミノ酸配列中、 N—末端から 58番目のグリシン残基がシスティン残基に、 4 01番目のグリシン残基がァラニン残基に置き換わっている）。 この E. coli K- 12 JC411株の lysCと同一の配列を有する lysCであっても、 上記（ィ） ~ (ヲ）のいずれ かの変異を導入すれば、 Lーリジンによるフィ一ドバック阻害が解除された変異 を有する lysCが得られることが予想される。
リジンによるフィードノ ック阻害が解除された変異型 A Kをコードする D N A を取得する方法は以下の通りである。 まず、 野生型 A K遺伝子又は他の変異を有 する AK遺伝子を含有する DN Aをインビトロ変異処理し、 変異処理後の DN A と宿主に適合するべクター D N Aとを連結して組換え D N Aを得る。 組換え D N Aを宿主微生物に導入して形質転換体を得、 同形質転換体のうちで変異型 AKを 発現するように至つたものを選択すれば、 同形質転換体が変異型遺伝子を保持し ている。 また、 野生型 AK遺伝子又は他の変異を有する AK遺伝子を含有する D NAを、 宿主に適合するべクタ一 DNAと連結して組換え DNAを得て、 その後 組換え D N Aをインビトロ変異処理し、 変異処理後の組換え D N Aを宿主微生物 に導入して形質転換体を得、 同形質転換体のうちで変異型 A Kを発現するように 至ったものを選択しても、 同形質転換体は変異型遺伝子を保持している。
あるいは、 野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、 変異型酵素を生産する 変異株を創成した後、 該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。 D N Aを直 接変異処理するための薬剤としては、 ヒ ドロキシルァミン等が挙げられる。 ヒド 口キシルアミンは、 シトシンを N 4—ヒドロキシシトシンに変えることによりシト シンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。 また、 微生物自体を変 異処理する場合は、 紫外線照射または N—メチルー N'—二トロー N—二トロソグァ 二ジン （NTG) 等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。 上記野生型 A K遺伝子あるいは他の変異を有する A K遺伝子を含有する DNAの供 与菌としては、 ェシヱリヒア属又はセラチア属に属する微生物であればいかなる ものを用いてもかまわない。 具体的にはナイ トハルトらの著書 （Neidhardt, F. C. et. al. , Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C. , 1208, table 1) にあげられるものが利用できる c たとえば、 E. coli JM109株や、 MC1061株などがあげられる。 また、 セラチア属に 属する微生物としては、 セラチア ·マルセッセンス、 例えばセラチア ·マルセッ センス AJ I3125株 (FERM BP- 5441) 等が挙げられる。
これらの株から A K遺伝子を取得するに際し、 染色体 D N Aの調製、 染色体 D N Aライブラリ一の作製等は、 上記の D D P S遺伝子の取得と同様に行えばょ 、。 ライブラリー作製に用いる宿主としては、 A K I、 I I、 I I I全欠損株、 例えば E. coli GT3株 （E. coli Genetic Stock Center (米国コネチカッ ト州） 等から入手 できる） 等を用いることが好ましい。
得られた染色体 D N Aライブラリーの内、 A K活性が増大した株あるいは栄養 要求性が相補された株として A K遺伝子の組換え D N Aをもつ菌株を得る。 候補 株から細胞抽出液を調製し、 それより粗酵素液を調製して A K活性を確認する。 A Kの酵素活性測定法は、 スタツ トマンらの方法により行うことができる （Stad tman, E. R.， Cohen, G. N. , LeBras, ， and Robichon-Szulma j ster, h.， J. Biol. Chem. , 236, 2033(1961)) 。
例えば、 A K完全欠損変異株を宿主に用いた場合は、 L一リジン、 L—スレオ ニン、 L一メチニオンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で、 または ホモセリンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった形 質転換株を単離し、 該菌株から組換え DNAを回収することにより、 AK遺伝子 を含有する DN A断片を得ることができる。
尚、 P CR法により染色体 DN Aから AK遺伝子を増幅する場合には、 PCR 反応に用いる DNAプライマーとしては、 例えば E. coliにおいて既知となってい る配列 (Cassan, M. , Parsot, C.， Cohen, G. N.， and Patte, J. C. , J. Biol. Chem. , 261, 1 052(1986)) を基にして適宜作成できるが、 lysC遺伝子をコードする 1347塩基から なる領域を増幅できるプライマーが適当であり、 例えば配列番号 5及び 6に示す 配列を有する 2種のプライマーが適当である。
また、 セラチア属細菌由来の A K遺伝子は、 上記と同様にしても取得できる力^ セラチア属細菌染色体 DN Aライブラリ一から、 E. coli由来の AK遺伝子又はそ の一部をプローブとするハイプリダイゼーシヨンによっても単離できる。 また、 セラチア属細菌染色体 DN Aを铸型とし、 E. coli由来の AK遺伝子の塩基配列に 基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマ一とする P CR法によってもセ ラチア属細菌由来の A K遺伝子が得られる。
上記のようにして得られた AK遺伝子に、 アミノ酸残基の置換、 挿入および欠 失等の変異を実施する方法としては、 前記 D DP S遺伝子の変異処理と同様に、 リコンビナント P C R法、 部位特異的変異法などがある。
また、 目的遺伝子を化学合成する方法によれば、 目的部位への変異、 あるいは ランダムな変異を導入することができる。
さらに、 染色体もしくは染色体外の組換え DN A上の AK遺伝子 DN Aを直接 ヒドロキシルアミンで処理する方法 （Hashimoto, T. and Sekiguchi, M. , J. Bacter iol., 159, 1039(1984)) がある。 また、 染色体もしくは染色体外の組換え DNA上 に AK遺伝子を保持するェシエリヒア属細菌を紫外線照射する方法、 または N—メ チル— N'—二トロソグァ二ジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法を 用いてもよい。
変異型 AK遺伝子の選択方法としては、 まず変異処理した AK遺伝子を含有す る組換え DNAを AK完全欠損株、 例えば E. coli GT3株に形質転換する。 次に 著量の L一リジンを含む最少培地、 例えば M9で形質転換株を培養する。 野生型の AK遺伝子を含有する組換え DNAを保持する株は、 唯一の AKが Lーリジンに より阻害されるために、 Lースレオニン、 L一イソロイシン、 L一メチォニン、 及びジアミノピメ リン酸（DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。 これに対 し L一リジンによる阻害の解除された変異型 A K遺伝子を含有する組換え D N A 保持株は、 著量の L—リジンが添加された最少培地上での生育が可能になるはず である。 この現象を利用し、 生育が、 L一リジンあるいは L一リジンのアナログ である AE Cに耐性となっている株、 すなわち阻害の解除された変異型 AK遺伝 子を含有する組換え D N A保持株を選択することができる。
こうして得られた該変異型遺伝子を、 組換え DNAとしてセラチア属細菌に導 入し、 発現させることによりフィ一ドバック阻害が解除された A Kを保有させる ことができる。 また、 組換え DNAから変異 AK遺伝子断片を取り出し、 他のベ クタ一に挿入したものを使用してもよい。 本発明において用いることのできるこ とのできるベクタ一 DNAとしては、 プラスミ ドベクター DNAが好ましく、 例 えば pUC19、 pUC18、 pBR322 pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010、 p MW119. pMW118 pMW219 pMW218等が挙げられる。 他にもファージ D N Aのべクタ 一も利用できる。
さらに、 変異型 AK遺伝子の発現を効率的に実施するために、 変異型 AKをコ ードする DNAの上流に、 l a c、 t r p、 P L等のセラチア属細菌細胞内で働 く他のプロモータ一を連結してもよく、 AK遺伝子に含まれるプロモーターをそ のまま、 あるいは増幅して用いてもよい。
< 3 >本発明による Lーリジンの製造
上記のようにして得られる変異型 D D P S遺伝子を導入することによって形質 転換され、 さらに L一リジンによるフィードバック阻害が解除された A Kを保持 するセラチア属細菌を、 好適な培地中で培養し、 該培養物中に L一リジンを生産 蓄積させ、 該培養物から L—リジンを採取することにより、 L一リジンを効率よ く製造することができる。 詳しくは、 変異型 DDP Sと変異型 AKをともにセラ チア属細菌に保持させることによって、 Lーリジンを効率よく製造させることが できる。
Lーリジンによるフィ一ドバック阻害が解除された A Kを保持するセラチア属 細菌としては、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有する A Kをコ一ドする D N Aとセラチア属細菌細胞内で自律複製可能なベクター D N Aとを連結してなる組換え D N Aが細胞内に導入され'ることによつて形質転換さ れたセラチア属細菌が挙げられる。 また、 L—リジンによるフィードバック阻害 が解除された A Kは、 Lーリジンによるフィードバック阻害を受けない野生型 A Kであってもよく、 このような野生型 A K遺伝子を同様にしてセラチア属細菌に 導入したものでもよい。 さらに、 セラチア属細菌細胞を変異処理することにより、 変異型 A Kを産生するようになったセラチア属細菌変異株であつてもよい。
一方、 変異型 D D P S遺伝子をセラチア属細菌に導入することによって形質転 換するには、 変異型 D D P S遺伝子とセラチア属細菌細胞内で自律複製可能なベ クタ一 D N Aとを連結してなる組換え D N Aを細胞内に導入することによって形 質転換すればよい。
変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K遺伝子の両方をセラチア属細菌に導入す る場合には、 これらの遺伝子は細胞内で単一のプラスミ ド上に保持されていても よく、 別々のプラスミ ド上に保持されていてもよい。 別々のプラスミ ドを用いる 場合には、 各々が安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を有するブラ スミ ドを用いることが好ましい。 変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K遺伝子を 別々のプラスミ ドを用いてセラチア属細菌に導入するに際しては、 両遺伝子の導 入の順序は問わない。 変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K遺伝子を導入されたセラチア属細菌にお いてジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子 （dapB) を増強することにより、 L一リジン生産性を一層向上させることができる。 さらに、 変異型 A K遺伝子及 び変異型 D D P S遺伝子を保持し、 ジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼ遺伝子が 増強されたセラチア属細菌に、 コリネ型細菌由来のジァミノピメリン酸デヒドロ ゲナーゼ遺伝子 （DDH) を導入することによって、 より一層 L一リジン生産性を向 上させることができる。 このジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は増強 されている必要がある。 また、 ジアミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子を導 入する代わりに、 スクシ二ルジァミノピメリン酸トランスァミナーゼ遺伝子 （da pD) 及びスクシ二ルジアミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝子 （dapE) を増強する ことによつても、 同程度に Lーリジン生産性を向上することができる。
ここで、 遺伝子の増強とは、 その遺伝子の発現産物である酵素の細胞当たりの 活性を増強することをいう。 具体的には、 例えば、 該遺伝子の細胞内コピー数を 高めること、 発現効率のよいプロモータ一を用いて遺伝子当たりの発現量を高め ること、 酵素活性を高める変異を該遺伝子に導入することなどが挙げられる。 細 胞内の遺伝子のコピー数を高めるには、 セラチア属細菌細胞内で自律複製可能な ベクターに該遺伝子を挿入し、 このべクタ一でセラチア属細菌を形質転換すれば よい。 このベクターはマルチコピー型のプラスミ ドであることが好ましい。 また、 M uファージ等を用いて染色体 D N Aに組み込んだ D N Aを増幅することにより コピー数を増加させてもよい。
プラスミ ドを用いる際に、 変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K遺伝子の導入 にプラスミ ドを用いた場合には、 これらのプラスミ ドが共に安定して細胞内に保 持されるような安定分配機構を有するプラスミ ドを用いることが好ましい。 尚、 各遺伝子の導入の順序は問わない。
E. coliの L一リジン生合成系遺伝子、 及びコリネ型細菌 DDH遺伝子は、 以下の ようにして取得することができる。
DDH遺伝子は、 コリネバクテリゥム グルタミカム （Corynebacterium glutami cum) の DDH遺伝子の既知のヌクレオチド配列 （Ishino, S. et al. , Nucleic Aci ds Res. , 15, 3917 (1987)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライ マー （例えば、 配列番号 9、 10) を用いた P C R法により、 ブレビパクテリゥム ラク トファ一メンタム等のコリネ型細菌の染色体 D N Aを増幅することによつ て得られる。
dapD遺伝子は、 既知の dapD遺伝子のヌクレオチド配列 （Richaud, C. et al. , J. Biol. Chem. , 259, 14824 (1984)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチ ドプライマ一 （例えば、 配列番号 11、 12) を用いた P C R法により、 E. coli 13 110株染色体 D N Aを増幅することによって得られる。 dapE遺伝子は、 既知の dapE遺伝子のヌクレオチド配列 （Bouvier, J. et al. , J. Bacteriol. , 174, 5265 (1992)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチド プライマー （配列番号 13、 14) を用いた P C R法により、 E. coli D N Aを増幅 することによって得られる。 本発明において宿主として用いるセラチア属細菌としては、 その細胞内で変異 型 D D P S遺伝子及び変異型 A K 111遺伝子、 もしくは他の Lーリジン生合成系遺 伝子のプロモーター又はこれらの遺伝子を発現させるための他のプロモーターが 機能し、 さらに変異型 D D P S遺伝子、 変異型 Α Κ Π Ι遺伝子、 あるいは他の L一 リジン生合成系遺伝子をプラスミ ド上に染色体外 D N Aとして導入する場合には、 導入するのに用いるベクター D N Aの複製起点が細胞内で機能して複製可能なも のであれば利用できる。
本発明に使用できるセラチア属細菌としては、 たとえば Lースレオニン生産菌 が挙げられる。 Lースレオニン生産菌は、 一般的にはそのァスバルトキナーゼの L —スレオニンによる阻害が解除されているからである。 セラチア ·マルセッセ ンスの Lースレオニン生産菌としては、 スレオニンアナログである AHV ( α—アミ ノー；3—ヒドロキシ吉草酸） に耐性な菌が知られている （S. Komatsubara, M. K isumi and I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol. , 35, 834 ( 1978)) 。 そのよう な株として、 セラチア 'マルセッセンス AJ13125株がある。 当該菌株は、 通商産 業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市 東一丁目 1番 3号） に、 1 9 9 5年 6月 1 2日より FERM P-14983の受託番号で寄 託され、 1 9 9 6年 3月 4日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FE RM BP- 5441の受託番号が付与されている。
また、 本発明に使用できるセラチア属細菌として、 リジンデカルボキシラーゼ が欠損したセラチア ·マルセッセンス （特開昭 5 0 - 5 3 5 8 9号公報参照） が 挙げられる。 リジンデカルボキシラーゼは、 L一リジン分解酵素として、 Lーリ ジンの脱炭酸によりカダベリンを生成する反応を触媒する酵素であり、 これを欠 損する株は L—リジンの分解が抑制される。
上記のような L—スレオニン生産菌及びリジンデカルボキシラーゼを欠損する セラチア属細菌は、 紫外線照射または N—メチルー N'—二トロ— N—二トロソグァ 二ジン （NTG) もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によ る処理を行うことによって取得できる。
セラチア属細菌への組換えプラスミ ドの導入は、 大腸菌の形質転換法として知 られている方法、 例えば D. M. Morrisonの方法 (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) あるいは受容菌細胞を塩化カルシゥムで処理して D N Aの透過性を増す 方法 (Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol. Biol. , 53, 159(1970)) 等と同様にして行う ことができる。
本発明による変異型遺伝子を保持する形質転換体の培養に使用する培地は、 炭 素源、 窒素源、 無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培 地である。
炭素源としては、 スクロース、 グルコース、 ラク トース、 ガラク トース、 フラ ク トースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、 グリセロールもしくはソル ビトールなどのアルコール類、 またはフマール酸、 クェン酸もしくはコハク酸等 の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、 尿素、 硫酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥムもしくはリン酸 アンモニゥム等の無機アンモニゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモ ニァガス、 またはアンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、 ビタミン L—イソロイシンなどの要求物質また は酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。 これらの他に、 必要に応じて、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガンイオン等が少量添加さ れる。
培養は、 好気的条件下で 1 6〜 9 6時間実施するのがよく、 培養温度は 2 5 °C 〜4 5 °Cに、 培養中 p Hは 5〜8に制御する。 尚、 p H調整には無機あるいは有 機の酸性あるいはアル力リ性物質、 更にァンモニァガス等を使用することができ る。
発酵液からの L—リジンの採取は通常イオン交換樹脂法、 沈澱法その他の公知 の方法を組み合わせることにより実施できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 pdapAlと pdapA2の製造工程を示す図である。
図 2は、 野生型及び変異型 D D P Sの Lーリジンによる阻害を示す図である。 図 3は、 二重変異型 dapA*遺伝子を有するプラスミ ド pdaPAS824の製造工程を示 す図である。
図 4は、 pLYSClと pLYSC2の製造工程を示す図である。
図 5は、 ヒ ドロキシルァミン処理後の形質転換体の出現率と変異率を示す図で ある。
図 6は、 野生型及び変異型 A K I I Iの L —リジンによる阻害を示す図である。 図 7は、 dapA*24を有する RSF1010由来のプラスミ ド RSF24Pの製造工程を示す図 である。
図 8は、 プラスミ ド p L L C * 8 0の製造工程を示す図である。
図 9は、 dapA*24及び lysC*80を有する RSF1010由来のプラスミ ド RSFD80の製造ェ 程を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 以下に、 実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。 実施例 1 変異型 D D P S遺伝子の取得
< 1 >野生型 dapA遺伝子のクローニング
E. coliの dapA遺伝子の塩基配列は既に報告されており （Richaud, F. et al. , J. BacterioL , 297(1986)) 、 オープンリーディングフレーム（ORF)は 876塩基対で あり、 292アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわかっている。 こ の dapA遺伝子がどのように調節されているか不明であるため、 プロモータ一領域 を除き、 S D配列と 0RFのみを含む領域を PCR法を用いて増幅し、 クローニングす とにした。
E. coli K- 12 MC1061株の全ゲノム D N Aを斎藤、 三浦の方法 （Biochem. Bioph ys. Acta. , 72, 619(1963)) により回収し、 配列番号 1及び 2に示す配列を有する 2 種のプライマ一を作製し、 これらを用いて、 エルリツチらの方法 （PCR Technolo gy, Stockton press (1989)) に従って P C R反応を行い、 目的 D N Aの増幅を行 つた。 得られた D N Aをそのまま市販の P C R断片用クロ一ニングベクター p C R 1 0 0 0 ( Invitrogen社 （米国カルホルニァ州） より購入） に挿入した。 p C R 1 0 0 0は lacZプロモータ一 （Placz) を含有しており、 lacZプロモーターの下 流の部位で切断した状態で市販されている。 この p C R 1 0 0 0の両切断末端の 間に P C R断片を連結して得られる組換え D N Aを E. coliに導入すると、 lacZプ 口モーター制御下で P C R断片が転写される。 P C R断片を p C R 1 0 0 0に連 結する際、 この lacZプロモータ一による転写方向に対して dapAの転写の向きが正 方向となるように連結されたプラスミ ドとして pdapAl、 逆方向となるように連結 されたプラスミ ドとして pdapA2の 2種のプラスミ ドを得た （図 1 ) 。
これらのプラスミ ドを D D P S欠損株である E. coli JE7627に導入したところ、 プラスミ ドを導入された株は宿主である JE7627のジァミノピメ リン酸の要求性が 相補されたので、 両プラスミ ドに挿入された D N A断片は、 活性のある D D P S をコードする遺伝子 dapAを含有すると確認した。
pdapAlを野生型 E. coli W3110株 （国立遺伝学研究所 （日本国静岡県三島市） か ら入手） に導入して得られる形質転換株を W3110/pdapAl、 pdapA2を E. coli ff311 0株に導入して得られる形質転換株を W3110/pdaPA2とそれぞれ命名した。 そして以 下の組成を有する最少培地 M9にリジンのアナログである A E Cを加え、 これら 2 種の形質転換株をそれぞれ培養した。 コントロールとしてプラスミ ドを導入して いない W3110株も同培地で培養した。 2種の形質転換株もプラスミ ドを持たない W 3110株も、 A E Cにより生育が抑えられたが、 その生育阻害は L —リジンの添加 によって回復した。 (最小培地 M 9 )
A： (20 M9)
Figure imgf000026_0001
NaCl 10 g/L
Figure imgf000026_0002
B 1M MgS04
C 50% Gulcose
D lg/L Thiamine
上記 A、 B、 C、 Dを別々に滅菌し、 A： B ： C ： D ：水 = 5:0.1:1:0.1:95 の 割合で混合する。
< 2 >変異型 DDP S遺伝子 （dapA*) の取得
L—リジンによる阻害が解除された D D P Sをコードする dapA*を含有するブラ スミ ド保持株は、 著量の AE Cが添加された最少培地 M9上での生育が可能になる と予想し、 生育が AE Cに耐性となっている株を選択することによって、 dapA*を 含有するプラスミ ド保持株を選択することにした。
dapA*を効率よく取得するために、 く 1 >で作製した pdapAlおよび pdapA2上の d apAに変異処理を行なうことにした。
(1-2-1) dapA*を含有するプラスミ ド保持株の選択条件の検討
上記で得られた W3110/pdapAl株および W3110/pdapA2株を、 それぞれ種々の濃度 の A E Cを含有する M 9寒天平板培地上で培養した。 そして A E Cによる生育阻 止濃度を調べ、 dapA*を含有するプラスミ ド保持株の選択条件の検討を行なった。 各種濃度で A E Cを含む M 9培地での形質転換体の生育を表 1に示す。 尚、 表 中の +は形質転換株が生育することを示し、 一は生育しなかったことを示す。 AEC濃度（mM) W3110/pdapAl W3110/pdapA2
250
125
60
30
15 +
8 + +
4 + +
2 + +
pdapAl上の dapA遺伝子の転写方向は lacZプ口モーターによる転写の方向と一致 している （図 1 ) 。 よって pdapAl上の dapA遺伝子は lacZプロモータ一により発現 量が増幅されているため、 dapAが野生型のままでもかなり高濃度の A E Cに耐性 であつたが、 pdapA2上の dapA遺伝子は転写方向が lacZプロモーターに対して逆方 向であり、 dapA自身のプロモーターも欠失しているため発現量が少なく、 より低 濃度の A E Cで生育が阻害されることがわかった （W3110/pdapAl株では 30mM、 W3 110/pdapA2株では 15mMの添加区で生育が抑えられた） 。 なお、 この生育阻害は L 一リジンの同時添加により消去されることを確認した。
したがって、 変異導入対象には pdapA2を用い、 最少培地 M 9に A E Cを 60mM添 加したものを、 dapA*を含有するプラスミ ド保持株の選択に用いた。 以下、 実施例 1においてこの培地を選択培地という。
( 1-2-2) ヒ ドロキシルアミンによる pdapA2のインビトロ変異処理
pdapA2プラスミ ドへの変異の導入には、 プラスミ ドを直接ヒドロキシルアミン で処理するインビト口変異処理法を用いた。
2 の D N Aを 0. 4Mヒ ドロキシルアミン中 （0. 1M KH2P04 -lmM EDTA (pH6. 0) 100 ^ 1、 1M ヒドロキシルアミン- ImM EDTA (pH6. 0) 80 ^ 1、 DNA βも、 水を加え て計 200 1とする） で、 75°Cで 1 ~ 4時間処理した。 処理後の D N Aをガラスパ ウダ一で精製後、 E. coli W3110に導入し、 完全培地 （L- broth： 1% Bacto tryp ton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar) に撒き、 コロニーを形成 させた。 これらを （1-2-1) で述べた選択培地にレプリカし、 選択培地上でコロニ 一を形成するものを選択した。 2度の実験で合計 36株の変異プラスミ ドの候補 が得られた。
こうして得られた候補株合計 36株を、 再度選択培地にスポッ 卜し、 AEC耐性を確 認した。
(1-2-3) dapA*遺伝子の単離及び dapA*産物の検討
上記 36株から変異型 pdapA2を回収し、 これらと野生型 pdapA2のそれぞれで da pA欠損株 JE7627を形質転換し、 各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、 DDP Sの酵素活性を測定した。
無細胞抽出液 （粗酵素液） は次のようにして調製した。 形質転換株を 2 XTY培 地 （1.6% Bacto trypton, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl) で培養し、 660 nmにおける濁度 （OD66。） が約 0.8になったところで集菌した。 菌体を 0 の 条件下で、 0.85%NaClで洗浄し、 20mMリン酸カリゥム緩衝液 pH7.5— 400mM KC1に 懸濁し、 超音波処理 （0°C,200W, 10分） で菌体を破砕した。 菌体破砕液を 0°Cの条 件下で、 33krpmで 1時間遠心し、 上清をとつてこれに 80%飽和になるよう硫安を 添加し、 0°Cで一夜保存した後遠心し、 ペレツ トを 20mMリン酸カリウム緩衝液 p H7.5-400mM KC1に溶解した。
DDP S酵素活性の測定は、 Yugariらの方法 (Yugari, Y. and Gilvarg, C. J. B iol.Chem.240,4710(1962)) で行った。 即ち下記組成の反応液の吸光度を、 37°Cで 分光光度計中で経時的に 270nmの波長で測定し、 生じるジヒドロジピコリン酸を測 定した。 ブランクとしては反応系からピルビン酸ナトリゥムを除いたものとした。 (反応液組成)
50mM ィミダゾ一ルー HC1 pH7. 4
20mM L—ァスパラギン酸セミアルデヒド
20mM ピルビン酸ナトリウム
酵素液
水 （バランス）
計 1. 0ml
D D P Sの酵素活性を測定する際、 酵素反応液中に種々の濃度の Lーリジンを 加え、 L一リジンによる阻害の度合を調べた。 図 2に示す様に、 野生型 D D P S は Lーリジンによる阻害を受けた。 野生型に比べて L—リジンによる阻害を受け にく くなつた D D P Sを有する形質転換株由来の変異プラスミ ドは、 候補プラス ミ ド 3 6種中 3種類であつた。 これらをそれぞれ、 pdapAS8、 pdapAS9および pdap AS24と命名した。 後の塩基配列の決定で pdapAS8と pdapAS9は同一変異を有するこ とが判明した。
pdapAS8、 pdapAS9および pdapAS24上の dapA*にコ一ドされる 3種の変異型 D D P Sの Lーリジンによる阻害の解除の度合は様々ではあつたが、 3種とも L—リジ ンによる阻害が解除されていた。 酵素の比活性は、 菌体の生育状況や試料の調製 に影響されるが、 いずれも野生型より若干の低下が見られた。 しかし、 育種素材 としては実質的に問題となる程ではないと判断した。
(1-2-4) 変異型 dapA遺伝子の塩基配列の決定
DNAシークェンサ一 ABI Model 373A (Applied Biosystems社製） を使用して、 常法に従い、 変異型 dapA遺伝子の塩基配列の決定を行った。 その結果、 配列番号 3に示す野生型 dapA遺伝子の配列上で、 pdapAS8及び pdapAS9は、 4 8 7番目の C が丁に、 pdaPAS24は 5 9 7番目の Cが Tに変化していることが明かとなった。 従 つて配列番号 4に示す D D P Sのァミノ酸配列において、 pdapAS8及び pdapAS9の コードする D D P Sは、 8 1番目のァラニン残基がバリン残基に、 pdapAS24のコ ードする D D P Sは、 1 1 8番目のヒスチジン残基がチロシン残基に変化してい ることが明かとなった。 (1-2-5) 二重変異型 dapAの作製
上述のように 2種類の変異型 dapA遺伝子が得られた。 これらの変異は阻害の解 除が相加的に働くかどうかを検証するために、 2つの変異を同時に持つ変異型 da pAを含有するプラスミ ドを作成した。 作成の手順は図 3に示す通りである。 得ら. れた二重変異プラスミ ドを pdapAS824と命名した。 実施例 2 変異型 A K 111遺伝子の取得
< 1〉野生型 lysC遺伝子のクローニング
E. coliの A KI I I遺伝子 (lysC) の塩基配列は既に報告されており (Cassan, M. , Parsot, C. , Cohen, G. N.， and Patte, J. C.， J. Biol. Chem.， 261， 1052(1986)) 、 オーブ ンリ一ディングフレーム（0RF)は 1347塩基対よりなり、 449ァミノ酸残基からなる 蛋白質をコ一ドしていることがわかっている。 この遺伝子にはオペレーターが存 在し L—リジンによる抑制を受けるため、 このオペレーター領域を除くために、 SD配列と 0RFのみを含む領域を、 P C R法を用いて増幅し、 クロ一ニングすること にした。
E. coli K-12 MC1061 株の全ゲノム D N Aを斎藤、 三浦の方法 （Biochem. Bioph ys. Acta. , 72, 619(1963)) により調製し、 配列番号 5及び 6に示す配列を有する 2 種のプライマーを作製し、 これらを用いてエルリツチらの方法 （PCR Technology,
Stockton press (1989)) に従って P C R反応を行い、 lysC遺伝子の増幅を行つ た。 得られた D N Aを BamHIと Aselで消化した後、 平滑末端にし、 多コピーべクタ — PUC18の Smal部位に挿入した。 この Smal部位はべク夕一内に存在する lacZプロモ 一夕一の下流側に位置しており、 PUC18の Smal部位に D N A断片を挿入して得られ る組換え D N Aを E. coliに導入すると、 lacZプロモーター制御による読み越し
(リードスルー） 転写により、 挿入された D N A断片が転写される。 pUC18の Sma I部位に P C R断片を挿入する際、 pUC18に含まれている lacZプロモーターによる 転写方向に対して lysCの転写の向きが逆方向となるように挿入されたプラスミ ド として pLYSClと、 正方向となるように挿入されたプラスミ ドとして pLYSC2の 2種 のプラスミ ドを得た （図 4 ) 。 これらのプラスミ ドで AKI、 II、 III完全欠損株である E. coli GT3 (thrAlOl 6b, metLM1005, lysC1004) を形質転換したところ、 GT3のホモセリンおよびジアミ ノピメリン酸の要求性が相補されたので、 両プラスミ ドに揷入された DNA断片 は、 活性のある AKIIIをコードする遺伝子 lysCを含有すると確認した。
pLYSClを AK完全欠損株 E. coli GT3に導入して得られる形質転換株を GT3/pLY SC1、 pLYSC2を E. coli GT3に導入して得られる形質転換株を GT3/pLYSC2と命名し た。 最少培地 M 9に著量の L—リジンを加え、 GT3/PLYSC1株および GT3/PLYSC2株 をそれぞれ培養した。 GT3/pLYSCl株および GT3/pLYSC2株ともに野生型の lysCを含 有するプラスミ ドを保持し、 同プラスミ ド上の lysCにコードされる ΑΚΙΠが唯一 の AKである。 著量の L一リジン存在下では唯一の AKである野生型 AKIIIが L —リジンにより阻害されるために、 両株とも Lースレオニン、 L一イソロイシン、 L一メチォニン、 及びジァミノピメリン酸（DAP)の合成ができなくなり生育が抑え られた。
< 2 >変異型 ΑΚΙΠ遺伝子 （lysC) の取得
Lーリジンによる阻害の解除された AKをコ一ドする lys を含有するプラスミ ド保持株は、 著量の L -リジンが添加された最少培地 M9上での生育が可能になる と予想し、 生育が L—リジンあるいは L一リジンのアナログである AE Cに耐性 となっている株を選択することによって、 lysC*を含有するプラスミ ド保持株を選 択することにした。
lys を効率よく取得するために、 く 1 >で作製した pLYSClおよび pLYSC2上の 1 ysCに変異処理を行なうことにした。
(2 - 2-1) lysC*を含有するプラスミ ド保持株の選択条件の検討
GT3/pLYSCl株および GT3/pLYSC2株をそれぞれ種々の濃度の L—リジンあるいは AECを含有する M 9寒天平板培地上で培養を行なった。 そして Lーリジンあるいは AECによる生育阻止濃度を調べ、 lysC*を含有するプラスミ ド保持株の選択条件の 検討を行なった。
各種濃度で Lーリジンあるいは AECを含む M9培地での形質転換体の生育を表 2 に示す。 尚、 表中の +は形質転換株が生育したことを示し、 士はやや生育したこ とを示し、 一は生育しなかったことを示す
L—リジン濃度と生育
0 0. 2 0. 4 0. 8 1. 5 3 6 12 25 50 100 200 (mil)
GT3/pLYSCl + - - - - - - - - - - - GT3/pLYSC2 + + + + + + + + + + 土 一
A E C濃度と生育
Figure imgf000032_0001
PLYSC2上の lysC遺伝子の転写は lacZプ口モータ一による転写の方向と一致して いる （図 4 ) 。 よって pLYSC2上の lysC遺伝子は lacZプロモーターで発現量が増幅 されているため lysCが野生型のままでもかなり高濃度の Lーリジン、 AECに耐性で あつたが、 pLYSCl上の lysC遺伝子は転写方向が lacZプロモータ一に対して逆方向 であり、 自身のプロモーターも欠失しているため発現量が少なく、 より低濃度の L一リジン、 AECで生育が阻害されることがわかつた （GT3/pLYSC2株では Lーリジ ンについては lOOmMの添加区まで、 AECについては 3mMの添加区まで生育が抑えられ なかったのに対し、 GT3/PLYSC1株では L一リジン、 AECとも 0. 2mMの添加区で生育 が完全に抑えられた） 。 なお、 この生育阻害はホモセリン及びジアミノピメ リン 酸の同時添加により消去されることを確認した。
したがって、 変異導入実験には pLYSClを用い、 最少培地 M 9に L一リジン 10mM、 もしくは A E C 0. 2mMを添加したものを、 lys を含有するプラスミ ド保持株の選 択に用いた。 以下、 実施例 2においてこの培地を選択培地という。 (2- 2- 2) ヒドロキシルァミンによる pLYSClのインビトロ変異処理
pLYSClプラスミ ドへの変異の導入には、 プラスミ ドを直接ヒ ドロキシルアミン で処理するインビトロ変異処理法に加え、 変異に多様性を与えるため、 即ちヒド ロキシルァミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異を期待して、 ブラ スミ ドを保持した菌体をニトロソグァ二ジン （NTG) で処理した後プラスミ ドを抽 出するィンビボ変異処理法の 2種の方法を用いた。
(ヒ ドロキシルァミンによるインビト口変異処理）
2αgのDNAを 0.4M ヒドロキシルアミン中 （0.1M Η2Ρ04-1ιηΜ EDTA (ρΗ6.0) lOOywU 1M ヒ ドロキシルアミン- lmM EDTA (pH6.0) 80〃 1、 MA 2β 、 水を加え て計 200^1とする） で 、 75°Cの条件下で、 1〜4時間処理した。 処理後の DNA をガラスパウダーで精製後、 A K完全欠損株 E. coli GT3株に導入し、 完全培地 ( L- broth： 1% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% ag ar) に撒きコロニーを形成させた。 これを （2-2-1) で設定した選択培地にレプリ 力し、 選択培地上に生育可能な株を選択し候補株とした。 形質転換体の出現率と 変異率は図 5のような推移がみられた。 4時間処理では 0.5〜0.8%とかなり高率 で変異株が得られた。
(NTGによるインビボ変異処理）
pLYSClを E. coli MC1061に導入し、 菌体ごと N T G処理をおこなった。 処理後 の菌体を一夜培養して変異を固定した後プラスミ ドを抽出し、 E. coli GT3に導入 した。 すなわち、 形質転換株を 2 XTY培地 （1.6% Bacto trypton, 1% Yeast e xtract, 0.5% NaCl) で培養し、 0066。が約0. 3になったところで集菌し、 下 記に示す TM緩衝液 （TM buffer) で洗浄した後、 NTG液 （0.2mg/mlの濃度で N TGを TM bufferに溶解させて調製） に懸濁し、 37°Cで 0〜9 0分処理した。 菌体 を TM buffer及び 2 XTY培地で洗浄後、 2 xTY培地で一夜培養して変異を固定した 後、 菌体よりプラスミ ド DN Aを抽出し、 E. coli GT3株に導入し、 候補株のスク リーニングをインビトロ変異と同様に行い、 リジン耐性 （Lysf) 、 AE C耐性 (AEC の変異体を得た。 (TM buffer)
Tris 50mM
マレイン酸 50mM
(NH4)2S04 lg/L
MgS( H20 0. lg/L
Ca(N03)2 5mg/L
FeS04«7H20 0.25mg/L
NaOHを用いて pH6.0に調整 上記で得られた候補株合計 180株（ヒドロキシルアミン処理 48株、 NTG処理 132株） を再度選択培地にスポッ 卜し、 AEC及び L一リジン耐性を確認し 153株を得た。 培 地中のァミノ酸蓄積パターンの違いに注目して、 この 153株を 14群に分け各群の代 表株を選んで AK活性を測定することにした。 なお、 ヒドロキシルァミン処理に よる変異株と、 NTG処理による変異株との間では A Kの活性に大きな差はなかった ので、 それぞれを区別することなく以降の実験を行なった。
(2-2-3) lysC*遺伝子の単離及び lys(T産物の検討
上記 14群の代表株として、 No.24, No.43, No.48， No.60， No.80, No.117, No. 126, No.149， No.150， No.156， No.158, No.167, No.169, No.172を選び、 おのお のから pLYSClに由来する変異型プラスミ ドを回収し、 それぞれ pLYSCl*24， pLYSC 1*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl*80, pLYSCl*117, pLYSCl*126， pLYSCl*14 9, pLYSCl*150, pLYSCl*156, pLYSCl*158, pLYSCl*167, pLYSCl*169, pLYSCl*17 2と命名した。 これらと野生型 pLYSClで AK完全欠損株 GT3を形質転換し、 各形質 転換株から無細胞抽出液を調製し、 AKIIIの酵素活性を測定した。
無細胞抽出液 （粗酵素液） は次のようにして調製した。 形質転換株を 2 XTY培 地で培養し、 OD 66。が約 0.8になったところで集菌した。 菌体を 0°Cの条件下、 0.02M KH2P04(pH6.75)- 0.03M —メルカプトエタノールで洗浄し、 超音波処理 (0°C, 100W,30秒 X4) で菌体を破砕した。 菌体破砕液を 0°Cの条件下、 33krpmで 1時間遠心し、 上清をとりこれに 80%飽和になるよう硫安を添加し、 遠心後ペレ ッ トを 0.02M KH2P04(pH6.75)- 0.03M ;3—メルカプトエタノールに溶解し、 0 °Cで 一夜保存した。 ΑΚΠΙ酵素活性の測定は、 スタツ トマンらの方法にしたがった（Stadtman.E.R. , Cohen, G. N. , LeBras, G.， and Robichon-Szulmajster, H. , J. Biol. Chem. , 236, 2033(1 961))。 すなわち、 下記組成の反応液を 27°Cで 45分インキュベートし、 FeCl3溶液 (2.8N HC1 0.4ml + 12%TCA 0.4ml + 5%FeCl3，6H2O/0. IN HCl 0.7ml) を加え発 色させ、 これを遠心後、 上清の 540nmでの吸光度を測定した。 活性は 1分間に生成 するヒドロキサム酸の量で表示 （lU=l〃mol/min) した。 モル吸光係数は 600とし た。 尚、 反応液からァスパラギン酸カリウムを除いたものをブランクとした。
(反応液組成）
reaction mixture *1 0.3ml
ヒに πキシル了ミン溶液 *2 0.2ml
0.1M了スハ。ラキ"ン酸カリ（pH7.0) 0.1ml
酵素液
水 （バランス）
計 1.0ml
*1; 1M Tris-HCl(pH8. l)9ml + 0.3M MgS04 0.5ml + 0.2M ATP(pH7.0) 5ml *2; 8M ヒ ドロキシルアミン溶液を直前に K0Hで中和したもの
AKの酵素活性を測定する際、 酵素反応液中に種々の濃度の L-リジンを加え、 L一リジンによる阻害の度合を調べた。 結果を、 図 6及び表 3に示した。 尚、 野 生型及び No.24， 43, 48, 60, 80, 117， 126については図 6 Aに、 No.149, 150, 156, 158, 167, 169， 172については図 6 Bに示した。
この結果が示すように、 野生型 AKIIIは Lーリジンによる阻害を非常に強く受 け、 L—リジン約 0.45mMで 50%阻害され、 5mMになるとほぼ 100%阻害された。 そ れに対し、 今回得られた変異型 AKIIIは、 解除の度合は様々ではあつたが、 14種 とも L—リジンによる阻害が解除されていた。 特に No.24、 80、 117、 169、 172で は、 L一リジン 100mMでも阻害はほとんどみられず、 50%阻害濃度は野生型のそれ と比較して 200倍以上であった。 また総蛋白当りの比活性は、 菌体の生育状況や試 料の調製に影響されるが、 いずれもほとんどが野生型と同等もしくはそれ以上の ものであり、 変異導入による活性低下の問題はほとんどなかった （表 3) 。 この ことより、 AKIIIの活性中心と Lーリジンによる調節部位がそれぞれ独立してい ることが予想された ό 尚、 表 3中、 阻害解除度 （％) とは、 反応液中 L一リジン 非存在下での Α Κ活性に対する L—リジン 100 mM存在下での Α Κ活性である。 熱 安定性 （％) とは 55°Cで 1. 5時間処理後の活性保持率である。 表 3
Figure imgf000036_0001
* 1： L -リシ"ン非存在下での AK活性に対する L-リシ"ン 100 mM 存在下での AK活性（％) *2： 55°Cで 1. 5時間処理後の活性保持率 ( ) 続いて変異型酵素の熱安定性を調べた。 ある酵素を改良し活性を上げようとす る場合、 創成される酵素が細胞內で安定に保持されることが重要である。 細胞内 外でのプロテアーゼの活動の違いや、 酵素をインビトロ保存するための保存用バ ッファーの影響などもあるため、 インビトロの測定には問題もあるが、 簡便のた め 1つのパラメータ一として変異型 Α Κ Ι Πの熱安定性についてィンビト口で検討 した。 A K I I Iの失活温度を種々の条件で検討した結果から、 55°C、 90分処理後の活性 保持率を測定することにした。 表 3に示すように、 半数がむしろ野生型よりも優 れていた。 通常変異型酵素は野生型に比べ不安定なものが多いが、 今回得られた 変異型 Α Κ Π Ιには安定性が野生型を上回るものもあり、 L—リジン生産の実用面 でかなり有力と思われるものが多かった。
(2-2-4) 野生型 lysCおよび変異型 lysCの塩基配列の決定
DNA シークェンサ一 ABI Model 373A ( Applied Biosystems社製） を使用して、 常法に従い、 今回取得した野生型 lysC遺伝子の塩基配列の決定を行なった （配列 番号 7 ) 。 その結果、 既に発表されている E. coli K-12 JC411株の lysCの配列
(Cassan, M.， Parsot, C.， Cohen, G. N. , and Patte, J. C.， J. Biol. Chem.， 261, 1052(19 86)) と 6ケ所 （アミノ酸レベルでは 2ケ所） の相違があった。 この 6ケ所の相違 は使用菌株の違いによるものであると考えられる。
同様に、 14種の変異型 pLYSCl上にある lys それぞれについて塩基配列を決定し、 変異点を明らかにした。 結果を表 4に示す。 表中、 （） 内はヌクレオチドの変異 に基づくアミノ酸残基の変異を示す。 14種のうち全く同一の変異型が 2組 （No. 4 8と No. 167、 及び No. 24と No. 80) あつたので、 変異の種類は 12種類であった。 尚、 No. 149, 150, 156， 158, 167, 169， 172 はヒ ドロキシルァミン処理、 No. 24、 43、 48、 60、 80、 117、 126は N T G処理によって得た変異型であるが、 変異のパターンは いずれもシトシンからチミンへの変異、 あるいは裏鎖のシトシンからチミンへの 変異による表鎖のグァニンから Tデニンへの変異であった。
表 4 lysC*の変異点の特定
Figure imgf000038_0001
* H ； ヒドロキシルァミン処理 N ; N T G処理 実施例 3 dapA*を導入した株による L —リジンの発酵生産 ェシヱリヒア属細菌で Lーリジンを生産させるためには、 特開昭 56- 18596号公 報、 及び米国特許第 4, 346， 170公報及び Applied Microbiology and Biotechnolog y, 15, p227- 231(1982)に示されるように、 D D P Sを増強する宿主としては、 ァス バルトキナーゼが Lーリジンによる阻害を受けなくなっているように変化してい る事が必須であるとされている。 セラチア属細菌においても、 ェシヱリヒア属細 菌と同様であるものと推定される。 そのような株として、 たとえば Lースレオニ ン生産菌がぁげられる。 セラチア ·マルセッセンスの Lースレオニン生産菌とし ては、 スレオニンアナログである AHV ( α—アミノー^ーヒドロキシ吉草酸） に耐 性な菌が知られている （S. Komatsubara, M. Kisumi and I. Chiba, Appl. Envi ron. Microbiol. , 35, 834 (1978)) 。 そのような株として具体的には、 セラチア 'マルセッセンス AJ13125株がある。 当該菌株は、 通商産業省工業技術院生命ェ 学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に、 1 9 9 5年 6月 1 2日より FERM P-14983の受託番号で寄託され、 1 9 9 6年 3月 4日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP- 5441の受託番号が 付与されている。
また、 セラチア 'マルセッセンスに導入する dapA*としては、 酵素の阻害解除度、 比活性より判断して、 pdapAS24に含まれている dapA* ( 1 1 8番目のヒスチジン残 基がチロシン残基に変異しているもの） を選択した。 まず、 dapA*の発現量を増す ためと、 プラスミ ドの安定性を増すために、 pdapAS24上にあった変異型 dapA* (以 下、 「dapA*24」 という） を p V I C 4 0のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモー ターの下流に連結し、 図 7に示す様にして R S F 2 4 Pを得た。
R S F 2 4 Pプラスミ ドを E. coli JM109株に導入したものは、 A J 1 2 3 9 5と命名され、 1 9 9 3年 1 0月 2 8日に通商産業省工業技術院生命工学工業技 術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 F E R M P— 1 3 9 3 5として寄託され、 1 9 9 4年 1 1月 1 日にブダペスト 条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP-4858の受託番号のもとで寄託されて いる。 pdapAS8および pdaPAS9を保持する株は寄託しなかったが、 各プラスミ ド上 の dapA *の変異点は前述の通りすべて明らかになっているので、 上記寄託菌よりプ ラスミ ドをマニアテイスらの方法 (Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , Maniatis, T. , Mol ecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1. 21(1989)) により回 収し、 サイ ト ·ダイレクテッ ド ' ミュータジエネシス法 （Sambrook, J.， Fritsch, E. F.， Maniatis, T.， Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15. 63(1989)) により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容易である。
R S F 2 4 Pプラスミ ドを常法にしたがい AJ 13125株に導入し、 AJ 13125/RSF24 Pを得た。 AJ 13125/RSF24Pの L -リジン生産性について評価を行なった。 一方、 コントロールのプラスミ ドとして R S F Pを構築した。 すなわち、 図 7 に示す pV I C 40の BamHIおよび Dralによる二重消化物より大断片を選択し、 こ れを DNAポリメラーゼ クレノー ' フラグメン卜によって平滑末端化処理した。 平滑末端化処理した大断片を自己連結させてプラスミ ド RS FPを得た。 AJ1312 5株に R S F Pを常法に従い導入し、 AJ13125/RSFPを得た。 AJ13125/RSFPについて も Lーリジン生産性の評価を行った。
培養は、 以下の培地を用い、 培養時間 72時間、 温度 30°Cの条件下、 攪拌 114〜1 16rpmで行った。 結果を表 5に示す。 リジン生産培地）
(NH4)2S04 16 g/L
Figure imgf000040_0001
FeS04'7H20 0.01 g/L
MnS04»5H20 0.01 g/L
Yeast Ext. (Difco) 2 g/L
L一メチォニン 0.5 g/L
Lースレオニン 0.1 g/L
L一イソ σイシン 0.05 g/L
KOHで pH7.0に調整し、 115°Cで 10分
オートクレープ （16/20容）
B ： 20% スクロース
(115。Cで 10分ォ-トクレ-フ "）（4/20容）
C ：局方 CaC03
(180°Cで 2日間乾熱滅菌）（30g/L)
A ： Bを 4 ： 1で混合し、 1 Lに対して Cを 30 g加えて溶解し、 抗生物質 (ストレフ。トマイシン 200/zg/ml) を加える。 表 5
W 株 Lーリジン塩酸塩の生産量
AJ13125/RSF24P 3. 5 g/L
AJ13125/RSFP 0 g/L 実施例 4 dapA'及び lysC*を導入した株による L -リジンの発酵生産 実施例 3で変異型 DD P Sの L一リジン生産に対する効果が示されたが、 これ をさらに改良するために、 実施例 2で得られた変異型 ΑΚΠΙ遺伝子を変異型 DD P S遺伝子と共存させる事とした。 変異型 DDP S遺伝子と共存させる変異型 A Kill遺伝子としては、 酵素活性、 熱安定性等から No. 80株由来のもの （lys C*80) を選択した。
lysC*80は、 lysC*の発現量を増すために PLYSCr80上にあった lysC* (以下、 「lysC*80」 という） を pUC18に対して逆位の挿入部位を有するベクター pHSG399 (宝酒造社製） の lacZプロモーターの下流につなぎかえることにより作成された プラスミ ド pLLC*80 (図 8) から切り出したものを使用した。 pLLC*80は、 pLYSCl *80上の lysC*80が、 転写方向が lacZプロモーターに対して逆方向に配置されてい るので、 L—リジンの生産性を向上させるために、 lacZプロモーターに対して転 写方向が正方向となるように lys 80を配置させるために作成されたプラスミ ドで ある。
pLLC'80と、 実施例 3で得られた R S F 24 Pから、 dapA*及び lysC*を有するプ ラスミ ド RS FD 80を図 9の様にして作製した。 RS FD 80は、 テトラサイ クリン耐性遺伝子のプロモーター （tetP) の下流に、 tetPに対して転写方向が正 方向となるように dapA*24及び lys 80がこの順序で配置されている。
RSFD 80プラスミ ドを E. coli JM109株に導入したものを、 A J 12396 と命名した。 A J 12396は、 1993年 10月 28日に通商産業省工業技術 院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM P— 13936として寄託され、 1994年 1 1月 1日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP- 4859の受託番号の もとで寄託されている。 pLYSCl*24, LYSC 1*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl* 117, pLYSCl* 126, pLYSCl* 149, pLYSCl* 150, pLYSCl* 156, pLYSCl* 158, pLYSCl* 167， pLYSCl* 169, pLYSCl*172を保持する株は寄託しなかったが、 各プラスミ ド上 の lysC*の変異点は前記の通りすベて明らかになっているので、 上記寄託菌よりプ ラスミ ド マニアテイスらの方法 （Sambrook, J.， Fritsch, E. F.， Maniatis, T. , Mol ecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1. 21(1989)) により回 収し、 サイ ト ·ダイレクテツ ド · ミュータジエネシス法 （Sambrook, J.， Fritsch, E. F. , Maniatis, T. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15. 63(1989)) により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容易である。 R S F D 8 0を常法にしたがい AJ13125株に導入し、 AJ13125/RSFD80を得た。 AJ 13125/RSF D80の L一リジン生産性について評価を行なった。 コントロールとして、 AJ13125 /RSFPについても L一リジン生産性の評価を行った。
培養は、 実施例 3と同様の L一リジン生産培地を用い、 培養時間 72時間、 温度 30°Cの条件下、 攪拌 114〜116rpniで行った。 結果を表 6に示す。 表 6
Figure imgf000042_0001
産業上の利用可能性 本発明により、 L一リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたェシ ェリヒア属細菌由来の D D P S変異遺伝子が得られた。 この遺伝子を保持するセ ラチア属細菌は、 L一リジンを著量生産する。 また、 前記 D D P S変異遺伝子を、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼを保持す るセラチア属細菌に導入することにより、 さらに L—リジン生産量を増加させる ことができる。 配列表
(1)一般情報
(i) 出願人： 味の素株式会社
(ii) 発明の名称： 発酵法による L リジンの製造法
(iii) 配列数： 14
(iv) 連絡先：
(A)宛名 味の素株式会社
(B)番地 京橋 1丁目 1 5 - 1
(C)市 中央区
(D)州 東京都
(E)国 日本国
(F)ZIP 1 0 4
(V) コンビュ一夕読取り可能形式
(A)媒体 フロッピーディスク
(B)コンピュータ ： IBM PC互換
(C)操作システム ： PC- DOS/MS- DOS
(D)ソフトウヱァ ： Patentln
(vi) 現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人ノ事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミ リ番号： (2) 配列番号 1に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー ：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 1
CCGCAACTAC TGACATGACG 20
(2) 配列番号 2に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎮
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 2
AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20
(2) 配列番号 3に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 1197
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：二本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ： genomic DNA
(vi)起源
(A) 生物名 ：ェシヱリヒア コリ CEscherichis coli)
(B) 株名 ： MC1061 配列の特徴：
特徴を表わす記号： rim transcript
存在位置： 248
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： CDS
存在位置： 272. . 1150
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： primer bind
存在位置： 27. . 46
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： primer bind
存在位置： 1156. . 1175
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： RBS
存在位置： 261. . 265
特徴を決定した方法： S
(xi) 配列の説明：配列番号 3
配列
CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60 CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG 120 TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA 180 TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA 240 TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292
Met Phe Thr Gly Ser l ie Val
1 5
GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340 Ala l ie Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser
10 15 20
TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388 Leu Lys Lys Leu l ie Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala l ie
25 30 35
GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436 Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu
40 45 50 55
CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484 His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg l ie
60 65 70
CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532 Pro Val l ie Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala l ie Ser
75 80 85
CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 580 Leu Thr Gin Arg Phe Asn Asp Ser Gly l ie Val Gly Cys Leu Thr Val
90 95 100
ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628 Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gin Glu Gly Leu Tyr Gin His Phe
105 110 115
AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG 676 Lys Ala l ie Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gin l ie Leu Tyr Asn Val
120 125 130 135
CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724 Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu
140 145 150 6ΐΐ 00X339303 I0VVVV3XI0 X3I0VII300 IVOlllVOVO
062 982 082 naq Π9ΐ ii sAq ns S ュ ηχο
89Π 09VXII0VVV X 0X3 Oil XGO 330 IVO GVV 110 933 009 VOV 010 03V 0V9
0Z2 99Z
^ΐθ -I3S dsy jqx d\ \ 〇■¾ ュ 3W 0Jd n31 V η3Ί J dsy -till
80Π 103 XGO IOV OVO 33V OXV V30 VOV OIV V33 0X3 303 013 03V XVO 33V
092 992 092
BTV ΐΒΛ ^ΐθ nio sA siQ sA OJJ an OJJ usy
090Ϊ 030 910 113 190 310 VV9 OVV XiX V30 001 VVV 3X0 933 OXV V33 IVV
5^
OJJ 3Md usy sig naq OJJ ^spj nsq Sjy usy sn
2Ϊ0Ϊ 333 VVO 319 IIX VI3 VVV OVV 3V3 VXX VOO OIV 9X3 193 OVO IVV XIV
0£2 922 022
nig sqd nig n^g Βχν ns sAq dfi ui f96 110 303 VOO GV3 300 111 IVO VV9 VVO VOO VOO 010 VVV 30X OIV OVO
902 002
Figure imgf000047_0001
916 030 OIV XV9 133 930 V30 310 OVV I3V 03V XXO DDI XXV IIG 090 IVO
961 061 Q8T
^10 τ na ufo siy dsy naq dsy dsy n3l
898 XOG 300 Oil VVO OXV Oil OVO 0X3 930 30V 030 IV9 XVO 300 30V 0X3
081 9Zt 0Π
ΐ^Λ 3Ud dsy dsy J T^A sA uig usy T^A 3ュ V ュ1 U
028 910 IXO XIX XVO XVG VOX IXO 9X3 OVO VVV OIV OVO 3VV VIO 193 93V
59Ϊ 09ΐ 551
Π31 usy ΐ9 Jqi eiv nig sAq 3\ \ 9\ { 9\ [ usy sA ェ s q
UL VXX OVV 000 VOV VOO OVO VVV OIV VOO 3IV XXV IVV VVV VIO VVV 339 一 ς卜
8t-900/96Jf/13d 8 /96 ΟΛ\ (2) 配列番号 4に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 292
(B) 種類：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：ぺプチド
(xi) 配列の説明：配列番号 4
Met Phe Thr Gly Ser l ie Val Ala He Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1 5 10 15
Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu He Asp Tyr His Val
20 25 30
Ala Ser Gly Thr Ser Ala lie Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser
35 40 45
Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Gly Arg He Pro Val l ie Ala Gly Thr Gly Ala Asn 65 70 75 80
Ala Thr Ala Glu Ala l ie Ser Leu Thr Gin Arg Phe Asn Asp Ser Gly
85 90 95 lie Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gin
100 105 110
Glu Gly Leu Tyr Gin His Phe Lys Ala l ie Ala Glu His Thr Asp Leu
115 120 125
Pro Gin He Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu
130 135 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn lie lie Gly He 145 150 155 160
Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gin l ie Lys Glu Leu
165 170 175 Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Phe Met Gin Leu Gly Gly His Gly Val l ie Ser Val Thr Thr Asn
195 200 205
Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gin Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu
210 215 220
His Phe Ala Glu Ala Arg Val lie Asn Gin Arg Leu Met Pro Leu His 225 230 235 240
Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro l ie Pro Val Lys Trp Ala Cys
245 250 255
Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
260 265 270
Pro l ie Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His
275 280 285
Ala Gly Leu Leu
290
(2) 配列番号 5に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 5
CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20
(2) 配列番号 6に関する情報
(i) 配列の特徴
(A)長さ ： 18 (B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 6
GAATTCCTTT GCGAGCAG 18
(2) 配列番号 7に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 2147
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：二本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ： genomic DNA
(vi)起源
(A) 生物名：ェシヱリヒア ' コリ（Escherichia coli)
(B) 株名 ： MC1061 配列の特徴：
特徴を表わす記号： -35 signal
存在位置： 242. . 249
特徴を決定した方法： S 配列の特徴：
特徴を表わす記号： -10 signal
存在位置： 265. . 273
特徴を決定した方法： S 配列の特徴：
特徴を表わす記号： rimer bind 存在位置： 536. . 555
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： primer bind
存在位置： 2128. . 2147
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： RBS
存在位置： 575. . 578
特徴を決定した方法： S 配列の特徴：
特徴を表わす記号： CDS
存在位置： 584. . 1933
特徴を決定した方法： S 配列の特徴：
特徴を表わす記号： terminator
存在位置： 1941. . 1968
特徴を決定した方法： S
(xi) 配列の説明：配列番号 7
TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60 AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120 AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180
AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240
CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300
CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595
Met Ser Glu l ie
1
GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643 Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met
5 10 15 20
AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691 Asn Arg Ser Ala Asp l ie Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val
25 30 35
GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739 Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly He Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala
40 45 50
GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787 Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala l ie Arg
55 60 65
AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835 Asn l ie Gin Phe Ala l ie Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val l ie
70 75 80
CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883 Arg Glu Glu l ie Glu Arg Leu Leu Glu Asn l ie Thr Val Leu Ala Glu
85 90 95 100
GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser
105 110 115
CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979 His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu lie Leu Arg Glu
120 125 130 CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027 Arg Asp Val Gin Ala Gin Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr
135 140 145
AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075 Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp l ie Ala Ala Leu Ala Glu
150 155 160
CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123 Leu Ala Ala Leu Gin Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val l ie
165 170 175 180
ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171 Thr Gin Gly Phe He Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu
185 190 195
GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219 Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu
200 205 210
CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267 His Ala Ser Arg Val Asp He Trp Thr Asp Val Pro Gly l ie Tyr Thr
215 220 225
ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315 Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg He Asp Glu He Ala
230 235 240
TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363 Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His
245 250 255 260
CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411 Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp He Pro Val Phe Val
265 270 275
GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459 Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys
280 285 290 ηΐ3 SMd 。 usy Jas STH η3Ί sAq ui Λ ΐ UT9 ηχο 0^6ΐ I013VXVVVI OVO XXX Oil IVV I3V IV3 0X0 VVV VVO 9X0 9X0 OVO OVO
^z
BTV dsy ηχο Α θ OJJ 八 ns aqj SAQ naq usy STH J3S S ^TV ^τ ΐ68ΐ 330 XVO VVO 090 333 019 013 Oil 391 0X0 OVV IVO OOV 331 V30 000
02 5 0
ュ SAQ an law USV o d η ^ na \^ Aj^ aqj ΪΒΛ ηχ9 ε^8ΐ XVI I3X XIV GIV 333 XIV OVV Oil 033 VV3 3X3 VIO 390 Oil VXO 9V0
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- 29 -
8t'900/96d /X3d 8ひ /96 OAV ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000 ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060 ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120
TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147
(2) 配列番号 8に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 449
(B) 種類：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：ぺプチド
(xi) 配列の説明：配列番号 8
Met Ser Glu lie Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp
1 5 10 15
Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp He Val Leu Ser Asp Ala Asn
20 25 30
Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly He Thr Asn Leu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50 55 60
Asp Ala l ie Arg Asn l ie Gin Phe Ala l ie Leu Glu Arg Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Pro Asn Val lie Arg Glu Glu lie Glu Arg Leu Leu Glu Asn lie Thr
85 90 95
Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100 105 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu
115 120 125
lie Leu Arg Glu Arg Asp Val Gin Ala Gin Trp Phe Asp Val Arg Lys
130 135 140 Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp l ie Ala 145 150 155 160
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gin Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu
165 170 175
Gly Leu Val lie Thr Gin Gly Phe l ie Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
180 185 190
Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu
195 200 205
Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp lie Trp Thr Asp Val Pro
210 215 220
Gly l ie Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg He 225 230 235 240
Asp Glu l ie Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp l ie
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275 280 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Arg Asn Gin Thr Leu Leu - Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His 305 310 315 320
Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly lie Leu Ala Arg His Asn
325 330 335 lie Ser Val Asp Leu l ie Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr
340 345 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gin
355 360 365
Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu 370 375 380 Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu lie Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys 385 390 395 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn He Arg
405 410 415
Met lie Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
420 425 430
Gly Glu Asp Ala Glu Gin Val Val Gin Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
(2) 配列番号 9に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 9
CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20
(2) 配列番号 10に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 10
TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20 (2) 配列番号 11に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ : 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 11
TTTATTCATA ATTGCCACCG 20
(2) 配列番号 12に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 12
CACGGTAATA CATATAACCG 20
(2) 配列番号 13に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎮
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 13
CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20 (2) 配列番号 14に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 14
GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20

Claims

請求の範囲
1 . L一リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するジヒ ド ロジピコリン酸合成酵素をコードする D N Aが細胞内に導入されて形質転換され たセラチア属細菌。
2 . 前記ジヒ ドロジピコリン酸合成酵素がエシ リヒア属細菌由来である請求 項 1記載の D N A。
3 . L一リジンによるフィードバック阻害が解除される変異が、 配列表の配 列番号 4に記載されるジヒ ドロジピコリン酸合成酵素のアミノ酸配列中、 N—末 端から 8 1番目のァラニン残基をバリン残基に置換させる変異、 1 1 8番目のヒ スチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、 8 1番目のァラニン残基をバリ ン残基に置換させかつ 1 1 8番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる 変異よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項 2記載のセラチア属細菌。
4 . さらに、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルト キナーゼを保持することを特徴とする請求項 1記載のセラチア属細菌。
5 . Lーリジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するァスパ ルトキナーゼをコードする D N Aが細胞内に導入されたことにより、 L—リジン によるフィ一ドバック阻害が解除されたァスパルトキナーゼを保持することを特 徴とする請求項 4記載のセラチア属細菌。
6 . 前記ァスパルトキナ一ゼが、 ェシヱリヒア属細菌由来のァスパルトキナ —ゼ I I Iである請求項 5記載のセラチア属細菌。
7 . ァスパルトキナ一ゼ I I Iの L一リジンによるフィ一ドバック阻害が解除さ れる変異が、 配列表の配列番号 8に記載されるァスパルトキナ一ゼ I I Iのアミノ酸 配列中、 N—末端から 3 2 3番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換さ せる変異、 3 2 3番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させかつ 4 0 8番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、 3 4番目のアル ギニン残基をシスティン残基に置換させかつ 3 2 3番目のダリシン残基をァスパ ラギン酸残基に置換させる変異、 3 2 5番目のロイシン残基をフヱニルァラニン 残基に置換させる変異、 3 1 8番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換 させる変異、 3 1 8番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 3 4 9番目のバリ ン残基をメチォニン残基に置換させる変異、 3 4 5番目のセリ ン 残基をロイシン残基に置換させる変異、 3 4 7番目のバリン残基をメチォニン残 基に置換させる変異、 3 5 2番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換さ せる変異、 3 5 2番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 3 6 9番目のセリン残基をフエ二ルァラニン残基に置換させる変異、 1 6 4番目のグ ル夕ミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、 4 1 7番目のメチォニン残基を イソロイシン残基に置換させかつ 4 1 9番目のシスティン残基をチロシン残基に 置換させる変異、 よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項 6記載のセラ チア属細菌。
8 . リジンデカルボキシラーゼを欠損した請求項 1記載のセラチア属細菌。
9 . 請求項 1〜8のいずれか一項に記載のセラチア属細菌を好適な培地で培 養し、 該培養物中に L —リジンを生産蓄積せしめ、 該培養物から L—リジンを採 取することを特徴とする L —リジンの製造法。
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