JP4004065B2

JP4004065B2 - 発酵法によるｌ−リジンの製造法

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Publication number: JP4004065B2
Application number: JP50288797A
Authority: JP
Inventors: 宏之児島; 由理尾川; 和枝川村; 孝之輔佐野
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-06-13
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2016-03-14
Also published as: DE69629299T2; SK170597A3; MX9710044A; EP0834559A4; SK284047B6; WO1996041871A1; US5989875A; CN1203629A; HU224158B1; EP0834559A1; DE69629299D1; HUP9900149A3; EP0834559B1; HUP9900149A2; CN1117860C

Description

技術分野
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−リジンの製造法、この製造法に用いるＤＮＡ及び微生物に関するものである。
背景技術
従来、発酵法によりＬ−リジンを製造する場合、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ−リジンを生産する人工変異株は数多く知られており、その多くはＳ−２−アミノエチルシステイン（ＡＥＣ）耐性変異株であり、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属、またはセラチア属に属している。また、組換えＤＮＡを使用した形質転換体を用いる（米国特許第4278765号）等、アミノ酸の生産を増加させる種々の技術が開示されている。
例えばセラチア属細菌は、「応用分子遺伝学」（講談社サイエンティフィック１９８６年、ISBN4-06-139659-5）や「アミノ酸発酵」（学会出版センター１９８６年、ISBN4-7622-9454-3）に示されるように、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン等の各種アミノ酸の生産菌として広く用いられ、種々の面でアミノ酸生産菌として優れた性質を有している。セラチア属細菌を用いた多種のアミノ酸生産が報告されているが、Ｌ−リジンを生産するようになった報告（特公昭５１−９３９３号公報）によると、収率（生成したＬ−リジン塩酸塩の濃度を初発の炭素源濃度で割った値）は５．４％と計算される。
セラチア属細菌の代表的菌株であるセラチア・マルセッセンス（Seratia marcescens）はエシェリヒア属細菌と遺伝子構造、遺伝子発現調節機構が類似しており、さらにエシェリヒア属細菌で組換えＤＮＡに用いられるクローニングベクターがセラチア属細菌にも用いる事ができる（特開平２−２７９８０号広報、特開平５−１００７６号公報）。
ところで、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（ＤＤＰＳ）は、アスパルトセミアルデヒドとピルビン酸を脱水縮合させ、ジヒドロジピコリン酸を合成する酵素であり、この反応はアスパラギン酸系アミノ酸の生合成において、Ｌ−リジン生合成系への分岐の入口となっている。エシェリヒア属細菌においてはアスパルトキナーゼとともにＬ−リジン生合成の重要な調節部位を担っている事が知られている。エシェリヒア属細菌のＤＤＰＳは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けることを知られている。
ＤＤＰＳはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli(E. coli)：大腸菌）ではdapAという遺伝子にコードされている。このdapAはすでにクローニングされており、塩基配列も決定されている（Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）。
一方、アスパルトキナーゼ（以下、「ＡＫ」と略すことがある）は、アスパラギン酸をβ−ホスホアスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、アスパラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素となっている。E. coliのＡＫは３種あり（ＡＫＩ，ＡＫII,ＡＫIII）、うち２つはホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下、「ＨＤ」と略すことがある）との複合酵素である。複合酵素の内のひとつはthrA遺伝子にコードされるＡＫＩ−ＨＤＩであり、もう一方はmetLM遺伝子にコードされるＡＫII−ＨＤIIである。ＡＫＩはスレオニンとイソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンによる阻害を受け、ＡＫIIはメチオニンによる抑制を受ける。
これらに対し、ＡＫIIIのみは単機能酵素であり、lysCと名付けられた遺伝子の産物であって、Ｌ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。菌体内でのこれらの活性の割合は、ＡＫＩ:ＡＫII:ＡＫIII＝約５:１:４となっている。
上述したように、ＤＤＰＳ及びＡＫIIIはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けるため、Ｌ−リジンを効率よく生産させるための障害となっている。したがって、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないＤＤＰＳあるいはＡＫIIIの変異酵素及びそれらの遺伝子を取得することができれば、セラチア属細菌を用いて効率の良いＬ−リジンの発酵生産を行うことができることが期待されるが、ＤＤＰＳの変異酵素を示した先行文献はなく、また、ＡＫIIIの変異酵素についても報告はあるものの（Boy, E. et al., J. Bacteriol., 112, 84 (1972)）、同変異酵素がＬ−リジンの生産性を改善できることを示唆した例は知られていない。さらに、セラチア属細菌のＬ−リジン生合成系遺伝子についても知られていない。
発明の開示
本発明は、上記観点からなされたものであり、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたＤＤＰＳとＡＫ、特にエシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳとＡＫIIIを取得し、セラチア属細菌を用いて従来よりも効率よくＬ−リジンを製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳをコードするＤＮＡを取得することに成功した。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたE. coli由来のＤＤＰＳをコードするＤＮＡを本明細書において変異型ｄａｐＡあるいはｄａｐＡ^*とよぶことがある。
本願発明者らはまた、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼおよびＬ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたＤＤＰＳを保持するセラチア属細菌を創製した。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたE. coli由来のアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡを本明細書において変異型ｌｙｓＣあるいはｌｙｓＣ^*とよぶことがある。
さらに本願発明者らは、変異型ｄａｐＡ及び変異型ｌｙｓＣを保持するセラチア属細菌を創製した。そして同セラチア属細菌を好適な培地で培養することにより、該培養物中にＬ−リジンを著量生産蓄積させ得ることを見出した。
すなわち本願発明は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡが細胞内に導入されて形質転換されたセラチア属細菌である。ジヒドロジピコリン酸合成酵素としては、エシェリヒア属細菌由来の酵素が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素において、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異としては、配列表の配列番号４に記載されるジヒドロジピコリン酸合成酵素のアミノ酸配列中、Ｎ−末端から８１番目のアラニン残基をバリン残基に置換させる変異、１１８番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、８１番目のアラニン残基をバリン残基に置換させかつ１１８番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異が挙げられる。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有していれば、セラチア属細菌固有のものでもよい。
本願発明はさらに、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをさらに保持することを特徴とする前記セラチア属細菌である。Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをセラチア属細菌に保持させる方法としては、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼIIIをコードするＤＮＡをセラチア属細菌細胞内に導入する方法が挙げられる。
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されるエシェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼIIIの変異としては、配列表の配列番号８に記載されるアスパルトキナーゼIIIのアミノ酸配列中、Ｎ−末端から３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ４０８番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、３４番目のアルギニン残基をシステイン残基に置換させかつ３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、３２５番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、３１８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、３１８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３４９番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、３４５番目のセリン残基をロイシン残基に置換させる変異、３４７番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３６９番目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、１６４番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、４１７番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ４１９番目のシステイン残基をチロシン残基に置換させる変異が挙げられる。
もちろん、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼは、セラチア属細菌固有のものであってもよい。
尚、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡ及びＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡは、各々セラチア属細菌の細胞内で同一または別々のプラスミド上に保持されていてもよい。
また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡが導入されるセラチア属細菌としては、リジンデカルボキシラーゼを欠損するセラチア属細菌が挙げられる。
本発明はまた、上記のセラチア属細菌のいずれかを好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供する。
尚、本明細書において、ＤＤＰＳ又はＡＫIIIをコードするＤＮＡ、あるいはこれらにプロモーターを含むＤＮＡを、「ＤＤＰＳ遺伝子」又は「ＡＫIII遺伝子」ということがある。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異酵素を単に「変異型酵素」、これをコードするＤＮＡあるいはこれにプロモーターを含むＤＮＡを「変異型遺伝子」ということがある。さらに、「Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される」とは、実質的に阻害が解除されていればよいことを意味し、完全に解除されている必要はない。
以下、本発明について詳細に説明する。
＜１＞本発明の方法に用いる変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素（ＤＤＰＳ）をコードするＤＮＡ
本発明の方法に用いる変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡは、野生型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＤＤＰＳのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものである。ＤＤＰＳとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のＤＤＰＳが挙げられる。また、セラチア属細菌自体のＤＤＰＳであっても、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものであれば、用いることができる。
エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳのＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異としては、配列表の配列番号４に記載されるＤＤＰＳのアミノ酸配列中、ＤＤＰＳのＮ−末端から
▲１▼81番目のアラニン残基をバリン残基に置換させる変異、
▲２▼118番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、
▲３▼81番目のアラニン残基をバリン残基に置換させかつ118番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、
が挙げられる。
野生型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡとしては、エシェリヒア属細菌またはセラチア属細菌由来のＤＤＰＳをコードするものであれば特に制限されない。エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳをコードするＤＮＡとして、具体的には配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、さらに具体的には配列番号３に示す塩基配列のうち、塩基番号２７２〜１１４７で表される配列が挙げられる。これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、本発明に用いる変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡの例である。尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持するＤＤＰＳの配列がわずかに相異することが予想されるが、このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明に用いる変異型ＤＤＰＳ遺伝子に含まれる。
このような変異型遺伝子を取得する方法は以下の通りである。まず、野生型ＤＤＰＳ遺伝子又はＤＤＰＳの酵素活性に実質的に影響を与えない変異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型ＤＤＰＳを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子を保持している。また、野生型ＤＤＰＳ遺伝子又は他の変異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型ＤＤＰＳを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異型遺伝子を保持している。
野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。もしくは、野生型遺伝子が連結されている組換えＤＮＡが導入されている形質転換体を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異株から組換えＤＮＡを回収すれば、同ＤＮＡ上に変異型遺伝子が創成される。
ＤＮＡをインビトロ変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ⁴−ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
上記野生型ＤＤＰＳ遺伝子あるいは他の変異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するDNAの供与菌としては、エシェリヒア属又はセラチア属に属する微生物をはじめとしていかなるものを用いてもかまわない。エシェリヒア属に属する微生物として具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1208, table 1）にあげられるものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株や、MC1061株などがあげられる。ＤＤＰＳ遺伝子を含有するDNAの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のＤＤＰＳ遺伝子を含むDNAが取得できる。
一方、セラチア属に属する微生物として、セラチア・マルセッセンス、例えばセラチア・マルセッセンスAJ13125株（FERM BP-5441）等が挙げられる。
（１）野生型ＤＤＰＳ遺伝子の取得
以下に、ＤＤＰＳ遺伝子を含有するDNAの調製例について述べる。ここでは主としてE. coliについて具体的に説明するが、他のエシェリヒア属細菌及びセラチア属細菌についても同様にしてしてＤＤＰＳ遺伝子を取得することができる。
まず、野生型のdapAをもつE. coli例えばMC1061株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加した物が用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、６〜８に調製するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、通気撹拌深部培養、振盪培養または静置培養等により行う。
このようにして得られた培養物を、例えば3,000r.p.m.で５分間遠心分離してE. coli MC1061株の菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963)）、K. S. Kirbyの方法（Biochem.J.,64,405,(1956)）等の方法により染色体DNAを得ることができる。
こうして得られた染色体ＤＮＡからＤＤＰＳ遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDNAに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Sau3AＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、温度３０℃以上、酵素濃度１〜100ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６℃、酵素温度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはJE7627株（ponB704,dacB12,pfv⁺,tonA2,dapA,lysA,str,malA38,metB1,ilvH611,leuA371,proA3,lac-3,tsx-76）のようなＤＤＰＳ欠損変異株を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この形質転換は、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。なお、JE7627株は国立遺伝学研究所（日本国静岡県三島市）より入手可能である。
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、ＤＤＰＳ活性が増大した株あるいはＤＤＰＳ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株よりＤＤＰＳ遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。例えば、ＤＤＰＳ欠損変異株はジアミノピメリン酸要求性であるので、ＤＤＰＳ欠損変異株を宿主に用いた場合は、ジアミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
ＤＤＰＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、実際にＤＤＰＳ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するには、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してＤＤＰＳ活性が増大していることを確認することにより達成できる。ＤＤＰＳの酵素活性測定法は、Yugariらの方法により行うことができる（Yugari,Y. and Gilvarg,C., J.Biol.Chem.,240,4710(1962)）。
そして、上記菌株より、ＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤＮＡを、例えばP. Guerryらの方法（J. Bacteriol.,116,1064,(1973)）、D. B. Clewellの方法（J.Bacteriol.,110,667,(1972)）などにより単離することができる。
野生型ＤＤＰＳ遺伝子の取得は、染色体上にＤＤＰＳ遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction；White,T.J. et al ;Trends Genet., 5,185 (1989)参照）により、ＤＤＰＳ遺伝子を増幅することによっても行える。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＤＤＰＳ遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ＤＤＰＳ遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプライマーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。ＤＤＰＳ遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅されたＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽出することによってＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を回収できる。
ＤＮＡプライマーとしては、例えばE. coliにおいて既知となっている配列（Richaud, F. et al., J.Bacteriol.,297(1986)）を基にして適宜作成すればよいが、具体的には、ＤＤＰＳ遺伝子をコードする1150塩基からなる領域を増幅できるプライマーが好ましく、配列番号１及び２に示した２種のプライマーが適当である。プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters,22,1859(1981)参照）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機model 380B等）を用いて行うことができる。また、PCR反応は、市販のＰＣＲ反応装置（宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラーPJ2000型等）を使用し、TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
ＰＣＲ法により増幅されたＤＤＰＳ遺伝子は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導入することによって、ＤＤＰＳ遺伝子への変異の導入などの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと形質転換法、さらにＤＤＰＳ遺伝子の存在の確認方法は上述した方法と同じである。
セラチア属細菌由来のＤＤＰＳ遺伝子は、上記と同様にしても取得できるが、セラチア属細菌染色体のＤＮＡライブラリーから、E. coli由来のＤＤＰＳ遺伝子又はその一部をプローブとするハイブリダイゼーションによっても単離できる。また、セラチア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とし、E. coli由来のＤＤＰＳ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチド、例えば配列番号１及び２に示した２種の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によってもセラチア属細菌由来のＤＤＰＳ遺伝子が得られる。
セラチア属細菌はエシェリヒア属細菌と近縁であり、両細菌の間では、細菌に含まれるタンパク質のアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列の相同性が高いことが知られている。このような遺伝子としては、例えば、thrA、thrB、thrCが知られており、相同性は各々８３％、７３％及び８４％である（K.Omori et al. J.Bacteriol.175, 785-794(1993)）。また、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子配列を利用してセラチア属細菌の遺伝子を単離した例としては、dnaAが知られている（O. Skovgaard and F.G.Hansen J.Bacteriol.169,3976-3981(1987)）。したがって、エシェリヒア属細菌のＤＤＰＳ遺伝子の塩基配列を基に、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によってセラチア属細菌のＤＤＰＳ遺伝子を単離できる可能性は極めて高い。
（２）ＤＤＰＳ遺伝子への変異の導入
上記のようにして得られたＤＤＰＳ遺伝子に、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法としては、リコンビナントＰＣＲ法（Higushi,R.,61,in PCR Technology (Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989))）、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350 (1987)）; Kunkel,T.A. et.al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などがある。これらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こすことができる。
また、目的遺伝子を化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導入することができる。
さらに、染色体もしくはプラスミド上のＤＤＰＳ遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,J.Bacteriol.,159,1039(1984)）がある。また、ＤＤＰＳ遺伝子を保有するエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法またはN−メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法によれば、ランダムに変異を導入できる。
変異型遺伝子の選択方法としては、まずＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡからなる組換えＤＮＡを、直接ヒドロキシルアミン等で変異処理し、これで例えばE. coli W3110株を形質転換する。次にＬ−リジンのアナログである、Ｓ−２−アミノエチルシステイン（ＡＥＣ）を含む最少培地、例えばM9に形質転換株を培養する。野生型のＤＤＰＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、その組換えＤＮＡにより発現されるＤＤＰＳがＡＥＣにより阻害されるために、Ｌ−リジン及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。これに対し、Ｌ−リジンによる阻害の解除されたＤＤＰＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、同組換えＤＮＡ中のＤＤＰＳ遺伝子にコードされる変異酵素がＡＥＣにより阻害を受けないので、ＡＥＣが添加された最少培地上での生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育が、Ｌ−リジンのアナログであるＡＥＣに耐性となっている株、すなわち阻害の解除された変異型ＤＤＰＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株を選択することができる。
こうして得られた該変異型遺伝子を、組換えＤＮＡとしてセラチア属細菌に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＤＤＰＳを保有させることができる。また、組換えＤＮＡから変異型ＤＤＰＳ遺伝子断片を取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
さらに、変異型ＤＤＰＳ遺伝子の発現を効率的に実施するために、変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡ配列の上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等のセラチア属細菌細胞内で働く他のプロモーターを連結してもよく、ＤＤＰＳ遺伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いてもよい。
＜２＞本発明に用いる変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ
本発明に用いる変異型ＡＫをコードするＤＮＡは、野生型ＡＫをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＡＫのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものである。ＡＫとしては、エシェリヒア属細菌、由来のもの、特にE. coli由来のＡＫIIIが挙げられる。また、セラチア属細菌自体のアスパルトキナーゼであっても、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものであれば、用いることができる。
エシェリヒア属細菌由来のＡＫIIIのＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異としては、配列表の配列番号８に示すＡＫIIIのアミノ酸配列中、ＡＫIIIのＮ−末端から
(イ)323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、
(ロ)323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ408番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、
(ハ)34番目のアルギニン残基をシステイン残基に置換させかつ323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、
(ニ)325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、
(ホ)318番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、
(ヘ)318番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ349番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、
(ト)345番目のセリン残基をロイシン残基に置換させる変異、
(チ)347番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、
(リ)352番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、
(ヌ)352番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ369番目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、
(ル)164番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、
(ヲ)417番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ419番目のシステイン残基をチロシン残基に置換させる変異、
が挙げられる。
野生型ＡＫIIIをコードするＤＮＡとしては、例えばE. coli由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡが挙げられ、具体的には配列番号８に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、さらには配列番号７に示す塩基配列のうち、塩基番号５８４〜１９３０で表される配列が挙げられる。尚、E. coliのＡＫIIIは、lysC遺伝子にコードされている。
これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、本発明に用いる変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡの例である。尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＡＫIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明に用いる変異型ＡＫIII遺伝子に含まれる。例えば、後記実施例２で得られた野生型lysC遺伝子の塩基配列（配列番号７）は、既に発表されているE. coli K-12 JC411株のlysCの配列（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）と６ヶ所相違しており、そのうち２ヶ所でコードされるアミノ酸残基が異なっている（JC411株のlysCは、配列番号８に示すlysCのアミノ酸配列中、Ｎ−末端から５８番目のグリシン残基がシステイン残基に、４０１番目のグリシン残基がアラニン残基に置き換わっている）。このE. coli K-12 JC411株のlysCと同一の配列を有するlysCであっても、上記(イ)〜(ヲ)のいずれかの変異を導入すれば、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するlysCが得られることが予想される。
リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型ＡＫをコードするＤＮＡを取得する方法は以下の通りである。まず、野生型ＡＫ遺伝子又は他の変異を有するＡＫ遺伝子を含有するＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子を保持している。また、野生型ＡＫ遺伝子又は他の変異を有するＡＫ遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異型遺伝子を保持している。
あるいは、野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。ＤＮＡを直接変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ⁴−ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
上記野生型ＡＫ遺伝子あるいは他の変異を有するＡＫ遺伝子を含有するDNAの供与菌としては、エシェリヒア属又はセラチア属に属する微生物であればいかなるものを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1208, table 1）にあげられるものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株や、MC1061株などがあげられる。また、セラチア属に属する微生物としては、セラチア・マルセッセンス、例えばセラチア・マルセッセンスAJI3125株（FERM BP-5441）等が挙げられる。
これらの株からＡＫ遺伝子を取得するに際し、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製等は、上記のＤＤＰＳ遺伝子の取得と同様に行えばよい。ライブラリー作製に用いる宿主としては、ＡＫＩ、II、III全欠損株、例えばE. coli GT3株（E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）等から入手できる）等を用いることが好ましい。
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの内、ＡＫ活性が増大した株あるいは栄養要求性が相補された株としてＡＫ遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してＡＫ活性を確認する。ＡＫの酵素活性測定法は、スタットマンらの方法により行うことができる（Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,G.,and Robichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236,2033(1961)）。
例えば、ＡＫ完全欠損変異株を宿主に用いた場合は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチニオンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で、またはホモセリンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった形質転換株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ＡＫ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
尚、ＰＣＲ法により染色体ＤＮＡからＡＫ遺伝子を増幅する場合には、ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡプライマーとしては、例えばE. coliにおいて既知となっている配列（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）を基にして適宜作成できるが、lysC遺伝子をコードする1347塩基からなる領域を増幅できるプライマーが適当であり、例えば配列番号５及び６に示す配列を有する２種のプライマーが適当である。
また、セラチア属細菌由来のＡＫ遺伝子は、上記と同様にしても取得できるが、セラチア属細菌染色体ＤＮＡライブラリーから、E. coli由来のＡＫ遺伝子又はその一部をプローブとするハイブリダイゼーションによっても単離できる。また、セラチア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とし、E. coli由来のＡＫ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によってもセラチア属細菌由来のＡＫ遺伝子が得られる。
上記のようにして得られたＡＫ遺伝子に、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法としては、前記ＤＤＰＳ遺伝子の変異処理と同様に、リコンビナントＰＣＲ法、部位特異的変異法などがある。
また、目的遺伝子を化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導入することができる。
さらに、染色体もしくは染色体外の組換えＤＮＡ上のＡＫ遺伝子ＤＮＡを直接ヒドロキシルアミンで処理する方法（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,J.Bacteriol.,159,1039(1984)）がある。また、染色体もしくは染色体外の組換えＤＮＡ上にＡＫ遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法、またはN−メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法を用いてもよい。
変異型ＡＫ遺伝子の選択方法としては、まず変異処理したＡＫ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをＡＫ完全欠損株、例えばE. coli GT3株に形質転換する。次に著量のＬ−リジンを含む最少培地、例えばM9で形質転換株を培養する。野生型のＡＫ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、唯一のＡＫがＬ−リジンにより阻害されるために、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。これに対しＬ−リジンによる阻害の解除された変異型ＡＫ遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株は、著量のＬ−リジンが添加された最少培地上での生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育が、Ｌ−リジンあるいはＬ−リジンのアナログであるＡＥＣに耐性となっている株、すなわち阻害の解除された変異型ＡＫ遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株を選択することができる。
こうして得られた該変異型遺伝子を、組換えＤＮＡとしてセラチア属細菌に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫを保有させることができる。また、組換えＤＮＡから変異ＡＫ遺伝子断片を取り出し、他のベクターに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
さらに、変異型ＡＫ遺伝子の発現を効率的に実施するために、変異型ＡＫをコードするＤＮＡの上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等のセラチア属細菌細胞内で働く他のプロモーターを連結してもよく、ＡＫ遺伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いてもよい。
＜３＞本発明によるＬ−リジンの製造
上記のようにして得られる変異型ＤＤＰＳ遺伝子を導入することによって形質転換され、さらにＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＫを保持するセラチア属細菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造することができる。詳しくは、変異型ＤＤＰＳと変異型ＡＫをともにセラチア属細菌に保持させることによって、Ｌ−リジンを効率よく製造させることができる。
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＫを保持するセラチア属細菌としては、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＡＫをコードするＤＮＡとセラチア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡが細胞内に導入されることによって形質転換されたセラチア属細菌が挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＫは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない野生型ＡＫであってもよく、このような野生型ＡＫ遺伝子を同様にしてセラチア属細菌に導入したものでもよい。さらに、セラチア属細菌細胞を変異処理することにより、変異型ＡＫを産生するようになったセラチア属細菌変異株であってもよい。
一方、変異型ＤＤＰＳ遺伝子をセラチア属細菌に導入することによって形質転換するには、変異型ＤＤＰＳ遺伝子とセラチア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡを細胞内に導入することによって形質転換すればよい。
変異型ＤＤＰＳ遺伝子及び変異型ＡＫ遺伝子の両方をセラチア属細菌に導入する場合には、これらの遺伝子は細胞内で単一のプラスミド上に保持されていてもよく、別々のプラスミド上に保持されていてもよい。別々のプラスミドを用いる場合には、各々が安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を有するプラスミドを用いることが好ましい。変異型ＤＤＰＳ遺伝子及び変異型ＡＫ遺伝子を別々のプラスミドを用いてセラチア属細菌に導入するに際しては、両遺伝子の導入の順序は問わない。
変異型ＤＤＰＳ遺伝子及び変異型ＡＫ遺伝子を導入されたセラチア属細菌においてジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（dapB）を増強することにより、Ｌ−リジン生産性を一層向上させることができる。さらに、変異型ＡＫ遺伝子及び変異型ＤＤＰＳ遺伝子を保持し、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子が増強されたセラチア属細菌に、コリネ形細菌由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（DDH）を導入することによって、より一層Ｌ−リジン生産性を向上させることができる。このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は増強されている必要がある。また、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する代わりに、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ遺伝子（dapD）及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝子（dapE）を増強することによっても、同程度にＬ−リジン生産性を向上することができる。
ここで、遺伝子の増強とは、その遺伝子の発現産物である酵素の細胞当たりの活性を増強することをいう。具体的には、例えば、該遺伝子の細胞内コピー数を高めること、発現効率のよいプロモーターを用いて遺伝子当たりの発現量を高めること、酵素活性を高める変異を該遺伝子に導入することなどが挙げられる。細胞内の遺伝子のコピー数を高めるには、セラチア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターに該遺伝子を挿入し、このベクターでセラチア属細菌を形質転換すればよい。このベクターはマルチコピー型のプラスミドであることが好ましい。また、Ｍｕファージ等を用いて染色体ＤＮＡに組み込んだＤＮＡを増幅することによりコピー数を増加させてもよい。
プラスミドを用いる際に、変異型ＤＤＰＳ遺伝子及び変異型ＡＫ遺伝子の導入にプラスミドを用いた場合には、これらのプラスミドが共に安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を有するプラスミドを用いることが好ましい。尚、各遺伝子の導入の順序は問わない。
E. coliのＬ−リジン生合成系遺伝子、及びコリネ型細胞DDH遺伝子は、以下のようにして取得することができる。
DDH遺伝子は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のDDH遺伝子の既知のヌクレオチド配列（Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)）をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号９、10）を用いたＰＣＲ法により、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム等のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡを増幅することによって得られる。
dapD遺伝子は、既知のdapD遺伝子のヌクレオチド配列（Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号11、12）を用いたＰＣＲ法により、E. coli W3110株染色体ＤＮＡを増幅することによって得られる。
dapE遺伝子は、既知のdapE遺伝子のヌクレオチド配列（Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)）をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号13、14）を用いたＰＣＲ法により、E. coli ＤＮＡを増幅することによって得られる。
本発明において宿主として用いるセラチア属細菌としては、その細胞内で変異型ＤＤＰＳ遺伝子及び変異型ＡＫIII遺伝子、もしくは他のＬ−リジン生合成系遺伝子のプロモーター又はこれらの遺伝子を発現させるための他のプロモーターが機能し、さらに変異型ＤＤＰＳ遺伝子、変異型ＡＫIII遺伝子、あるいは他のＬ−リジン生合成系遺伝子をプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして導入する場合には、導入するのに用いるベクターＤＮＡの複製起点が細胞内で機能して複製可能なものであれば利用できる。
本発明に使用できるセラチア属細菌としては、たとえばＬ−スレオニン生産菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生産菌は、一般的にはそのアスパルトキナーゼのＬ−スレオニンによる阻害が解除されているからである。セラチア・マルセッセンスのＬ−スレオニン生産菌としては、スレオニンアナログであるAHV（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸）に耐性な菌が知られている（S. Komatsubara, M. Kisumi.and I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834 (1978)）。そのような株として、セラチア・マルセッセンスAJ13125株がある。当該菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、１９９５年６月１２日よりFERM P-14983の受託番号で寄託され、１９９６年３月４日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-5441の受託番号が付与されている。
また、本発明に使用できるセラチア属細菌として、リジンデカルボキシラーゼが欠損したセラチア・マルセッセンス（特開昭５０−５３５８９号公報参照）が挙げられる。リジンデカルボキシラーゼは、Ｌ−リジン分解酵素として、Ｌ−リジンの脱炭酸によりカダベリンを生成する反応を触媒する酵素であり、これを欠損する株はＬ−リジンの分解が抑制される。
上記のようなＬ−スレオニン生産菌及びリジンデカルボキシラーゼを欠損するセラチア属細菌は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行うことによって取得できる。
セラチア属細菌への組換えプラスミドの導入は、大腸菌の形質転換法として知られている方法、例えばD.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等と同様にして行うことができる。
本発明による変異型遺伝子を保持する形質転換体の培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、スクロース、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ₁、Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は、好気的条件下で１６〜９６時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのＬ−リジンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、pdapA1とpdapA2の製造工程を示す図である。
図２は、野生型及び変異型ＤＤＰＳのＬ−リジンによる阻害を示す図である。
図３は、二重変異型dapA^*遺伝子を有するプラスミドpdapAS824の製造工程を示す図である。
図４は、pLYSC1とpLYSC2の製造工程を示す図である。
図５は、ヒドロキシルアミン処理後の形質転換体の出現率と変異率を示す図である。
図６は、野生型及び変異型ＡＫIIIのＬ−リジンによる阻害を示す図である。
図７は、dapA^*24を有するRSF1010由来のプラスミドRSF24Pの製造工程を示す図である。
図８は、プラスミドｐＬＬＣ^*８０の製造工程を示す図である。
図９は、dapA^*24及びlysC^*80を有するRSF1010由来のプラスミドRSFD80の製造工程を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１変異型ＤＤＰＳ遺伝子の取得
＜１＞野生型dapA遺伝子のクローニング
E.coliのdapA遺伝子の塩基配列は既に報告されており（Richaud, F. et al., J.Bacteriol.,297(1986)）、オープンリーデイングフレーム(ORF)は876塩基対であり、292アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわかっている。このdapA遺伝子がどのように調節されているか不明であるため、プロモーター領域を除き、ＳＤ配列とORFのみを含む領域をPCR法を用いて増幅し、クローニングすることにした。
E. coli K-12 MC1061株の全ゲノムＤＮＡを斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により回収し、配列番号１及び２に示す配列を有する２種のプライマーを作製し、これらを用いて、エルリッチらの方法（PCR Technology, Stockton press (1989)）に従ってＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡの増幅を行った。得られたＤＮＡをそのまま市販のＰＣＲ断片用クローニングベクターｐＣＲ１０００（Invitrogen社（米国カルホルニア州）より購入）に挿入した。ｐＣＲ１０００はlacZプロモーター（Placz）を含有しており、lacZプロモーターの下流の部位で切断した状態で市販されている。このｐＣＲ１０００の両切断末端の間にＰＣＲ断片を連結して得られる組換えＤＮＡをE. coliに導入すると、lacZプロモーター制御下でＰＣＲ断片が転写される。ＰＣＲ断片をｐＣＲ１０００に連結する際、このlacZプロモーターによる転写方向に対してdapAの転写の向きが正方向となるように連結されたプラスミドとしてpdapA1、逆方向となるように連結されたプラスミドとしてpdapA2の２種のプラスミドを得た（図１）。
これらのプラスミドをＤＤＰＳ欠損株であるE. coli JE7627に導入したところ、プラスミドを導入された株は宿主であるJE7627のジアミノピメリン酸の要求性が相補されたので、両プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片は、活性のあるＤＤＰＳをコードする遺伝子dapAを含有すると確認した。
pdapA1を野生型E. coli W3110株（国立遺伝学研究所（日本国静岡県三島市）から入手）に導入して得られる形質転換株をW3110/pdapA1、pdapA2をE. coli W3110株に導入して得られる形質転換株をW3110/pdapA2とそれぞれ命名した。そして以下の組成を有する最少培地M9にリジンのアナログであるＡＥＣを加え、これら２種の形質転換株をそれぞれ培養した。コントロールとしてプラスミドを導入していないW3110株も同培地で培養した。２種の形質転換株もプラスミドを持たないW3110株も、ＡＥＣにより生育が抑えられたが、その生育阻害はＬ−リジンの添加によって回復した。
（最小培地Ｍ９）
Ａ：（20×M9）
Na₂HPO₄・12H₂O 303g/L
KH₂PO₄ 60g/L
NaCl 10g/L
NH₄Cl 20g/L
Ｂ：1M MgSO₄
Ｃ：50％ Gulcose
Ｄ：1g/L Thiamine
上記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを別々に滅菌し、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：水＝5:0.1:1:0.1:95の割合で混合する。
＜２＞変異型ＤＤＰＳ遺伝子（dapA^*）の取得
Ｌ−リジンによる阻害が解除されたＤＤＰＳをコードするdapA^*を含有するプラスミド保持株は、著量のＡＥＣが添加された最少培地M9上での生育が可能になると予想し、生育がＡＥＣに耐性となっている株を選択することによって、dapA^*を含有するプラスミド保持株を選択することにした。
dapA^*を効率よく取得するために、＜１＞で作製したpdapA1およびpdapA2上のdapAに変異処理を行なうことにした。
（1-2-1）dapA^*を含有するプラスミド保持株の選択条件の検討
上記で得られたW3110/pdapA1株およびW3110/pdapA2株を、それぞれ種々の濃度のＡＥＣを含有するＭ９寒天平板培地上で培養した。そしてＡＥＣによる生育阻止濃度を調べ、dapA^*を含有するプラスミド保持株の選択条件の検討を行なった。
各種濃度でＡＥＣを含むＭ９培地での形質転換体の生育を表１に示す。尚、表中の＋は形質転換株が生育することを示し、−は生育しなかったことを示す。

pdapA1上のdapA遺伝子の転写方向はlacZプロモーターによる転写の方向と一致している（図１）。よってpdapA1上のdapA遺伝子はlacZプロモーターにより発現量が増幅されているため、dapAが野生型のままでもかなり高濃度のＡＥＣに耐性であったが、pdapA2上のdapA遺伝子は転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向であり、dapA自身のプロモーターも欠失しているため発現量が少なく、より低濃度のＡＥＣで生育が阻害されることがわかった（W3110/pdapA1株では30mM、W3110/pdapA2株では15mMの添加区で生育が抑えられた）。なお、この生育阻害はＬ−リジンの同時添加により消去されることを確認した。
したがって、変異導入対象にはpdapA2を用い、最少培地Ｍ９にＡＥＣを60mM添加したものを、dapA^*を含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、実施例１においてこの培地を選択培地という。
（1-2-2）ヒドロキシルアミンによるpdapA2のインビトロ変異処理
pdapA2プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法を用いた。
２μgのＤＮＡを0.4Mヒドロキシルアミン中（0.1M KH₂PO₄-1mM EDTA (pH6.0) 100μl、1Mヒドロキシルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水を加えて計200μlとする）で、75℃で１〜４時間処理した。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで精製後、E. coli W3110に導入し、完全培地（L-broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl, 1.5％ agar）に撒き、コロニーを形成させた。これらを（1-2-1）で述べた選択培地にレプリカし、選択培地上でコロニーを形成するものを選択した。２度の実験で合計３６株の変異プラスミドの候補が得られた。
こうして得られた候補株合計３６株を、再度選択培地にスポットし、AEC耐性を確認した。
（1-2-3）dapA^*遺伝子の単離及びdapA^*産物の検討
上記３６株から変異型pdapA2を回収し、これらと野生型pdapA2のそれぞれでdapA欠損株JE7627を形質転換し、各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、ＤＤＰＳの酵素活性を測定した。
無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにして調製した。形質転換株を２×TY培地（1.6％ Bacto trypton, 1％ Yeast extract, 0.5％ NaCl）で培養し、６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ₆₆₀）が約0.8になったところで集菌した。菌体を０℃の条件下で、0.85%NaClで洗浄し、20mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5−400mM KClに懸濁し、超音波処理（0℃,200W,10分）で菌体を破砕した。菌体破砕液を０℃の条件下で、33krpmで１時間遠心し、上清をとってこれに80％飽和になるよう硫安を添加し、０℃で一夜保存した後遠心し、ペレットを20mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5−400mM KClに溶解した。
ＤＤＰＳ酵素活性の測定は、Yugariらの方法（Yugari,Y. and Gilvarg,C. J.Biol.Chem.240,4710(1962)）で行った。即ち下記組成の反応液の吸光度を、37℃で分光光度計中で経時的に270nmの波長で測定し、生じるジヒドロジピコリン酸を測定した。ブランクとしては反応系からピルビン酸ナトリウムを除いたものとした。
（反応液組成）

ＤＤＰＳの酵素活性を測定する際、酵素反応液中に種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる阻害の度合を調べた。図２に示す様に、野生型ＤＤＰＳはＬ−リジンによる阻害を受けた。野生型に比べてＬ−リジンによる阻害を受けにくくなったＤＤＰＳを有する形質転換株由来の変異プラスミドは、候補プラスミド３６種中３種類であった。これらをそれぞれ、pdapAS8、pdapAS9およびpdapAS24と命名した。後の塩基配列の決定でpdapAS8とpdapAS9は同一変異を有することが判明した。
pdapAS8、pdapAS9およびpdapAS24上のdapA^*にコードされる３種の変異型ＤＤＰＳのＬ−リジンによる阻害の解除の度合は様々ではあったが、３種ともＬ−リジンによる阻害が解除されていた。酵素の比活性は、菌体の生育状況や試料の調製に影響されるが、いずれも野生型より若干の低下が見られた。しかし、育種素材としては実質的に問題となる程ではないと判断した。
（1-2-4）変異型dapA遺伝子の塩基配列の決定
DNAシークエンサーABI Model 373A（Applied Biosystems社製）を使用して、常法に従い、変異型dapA遺伝子の塩基配列の決定を行った。その結果、配列番号３に示す野生型dapA遺伝子の配列上で、pdapAS8及びpdapAS9は、５１３番目のＣがＴに、pdapAS24は６２３番目のＣがＴに変化していることが明かとなった。従って配列番号４に示すＤＤＰＳのアミノ酸配列において、pdapAS8及びpdapAS9のコードするＤＤＰＳは、８１番目のアラニン残基がバリン残基に、pdapAS24のコードするＤＤＰＳは、１１８番目のヒスチジン残基がチロシン残基に変化していることが明かとなった。
（1-2-5）二重変異型dapAの作製
上述のように２種類の変異型dapA遺伝子が得られた。これらの変異は阻害の解除が相加的に働くかどうかを検証するために、２つの変異を同時に持つ変異型dapAを含有するプラスミドを作成した。作成の手順は図３に示す通りである。得られた二重変異プラスミドをpdapAS824と命名した。
実施例２変異型ＡＫIII遺伝子の取得
＜１＞野生型lysC遺伝子のクローニング
E. coliのＡＫIII遺伝子（lysC）の塩基配列は既に報告されており（Cassan, M., Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）、オープンリーディングフレーム(ORF)は1347塩基対よりなり、449アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわかっている。この遺伝子にはオペレーターが存在しＬ−リジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領域を除くために、SD配列とORFのみを含む領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、クローニングすることにした。
E.coli K-12 MC1061株の全ゲノムＤＮＡを斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調製し、配列番号５及び６に示す配列を有する２種のプライマーを作製し、これらを用いて、エルリッチらの方法（PCR Technology, Stockton press (1989)）に従ってＰＣＲ反応を行い、lysC遺伝子の増幅を行った。得られたＤＮＡをBamHIとAseIで消化した後、平滑末端にし、多コピーベクターpUC18のSmaI部位に挿入した。このSmaI部位はベクター内に存在するlacZプロモーターの下流側に位置しており、pUC18のSmaI部位にＤＮＡ断片を挿入して得られる組換えＤＮＡをE. coliに導入すると、lacZプロモーター制御による読み越し（リードスルー）転写により、挿入されたＤＮＡ断片が転写される。pUC18のSmaI部位にＰＣＲ断片を挿入する際、pUC18に含まれているlacZプロモーターによる転写方向に対してlysCの転写の向きが逆方向となるように挿入されたプラスミドとしてpLYSC1と、正方向となるように挿入されたプラスミドとしてpLYSC2の２種のプラスミドを得た（図４）。
これらのプラスミドでＡＫI、II、III完全欠損株であるE. coli GT3（thrA1016b,metLM1005,lysC1004）を形質転換したところ、GT3のホモセリンおよびジアミノピメリン酸の要求性が相補されたので、両プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片は、活性のあるＡＫIIIをコードする遺伝子lysCを含有すると確認した。
pLYSC1をＡＫ完全欠損株E. coli GT3に導入して得られる形質転換株をGT3/pLYSC1、pLYSC2をE. coli GT3に導入して得られる形質転換株をGT3/pLYSC2と命名した。最少培地Ｍ９に著量のＬ−リジンを加え、GT3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株をそれぞれ培養した。GT3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株ともに野生型のlysCを含有するプラスミドを保持し、同プラスミド上のlysCにコードされるＡＫIIIが唯一のＡＫである。著量のＬ−リジン存在下では唯一のＡＫである野生型ＡＫIIIがＬ−リジンにより阻害されるために、両株ともＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成ができなくなり生育が抑えられた。
＜２＞変異型ＡＫIII遺伝子（lysC^*）の取得
Ｌ−リジンによる阻害が解除されたＡＫをコードするlysC^*を含有するプラスミド保持株は、著量のＬ−リジンが添加された最少培地M9上での生育が可能になると予想し、生育がＬ−リジンあるいはＬ−リジンのアナログであるＡＥＣに耐性となっている株を選択することによって、lysC^*を含有するプラスミド保持株を選択することにした。
lysC^*を効率よく取得するために、＜１＞で作製したpLYSC1およびpLYSC2上のlysCに変異処理を行なうことにした。
（2-2-1）lysC^*を含有するプラスミド保持株の選択条件の検討
GT3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株をそれぞれ種々の濃度のＬ−リジンあるいはAECを含有するＭ９寒天平板培地上で培養を行なった。そしてＬ−リジンあるいはAECによる生育阻止濃度を調べ、lysC^*を含有するプラスミド保持株の選択条件の検討を行なった。
各種濃度でＬ−リジンあるいはAECを含むＭ９培地での形質転換体の生育を表２に示す。尚、表中の＋は形質転換株が生育したことを示し、±はやや生育したことを示し、−は生育しなかったことを示す

pLYSC1上のlysC遺伝子の転写方向はlacZプロモーターによる転写の方向と一致している（図４）。よってpLYSC2上のlysC遺伝子はlacZプロモーターで発現量が増幅されているためlysCが野生型のままでもかなり高濃度のＬ−リジン、AECに耐性であったが、pLYSC1上のlysC遺伝子は転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向であり、自身のプロモーターも欠失しているため発現量が少なく、より低濃度のＬ−リジン、AECで生育が阻害されることがわかった（GT3/pLYSC2株ではＬ−リジンについては100mMの添加区まで、AECについては3mMの添加区まで生育が抑えられなかったのに対し、GT3/pLYSC1株ではＬ−リジン、AECとも0.2mMの添加区で生育が完全に抑えられた）。なお、この生育阻害はホモセリン及びジアミノピメリン酸の同時添加により消去されることを確認した。
したがって、変異導入実験にはpLYSC1を用い、最少培地Ｍ９にＬ−リジン10mM、もしくはＡＥＣ0.2mMを添加したものを、lysC^*を含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、実施例２においてこの培地を選択培地という。
（2-2-2）ヒドロキシルアミンによるpLYSC1のインビトロ変異処理
pLYSC1プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法に加え、変異に多様性を与えるため、即ちヒドロキシルアミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異を期待して、プラスミドを保持した菌体をニトロソグアニジン（NTG）で処理した後プラスミドを抽出するインビボ変異処理法の２種の方法を用いた。
（ヒドロキシルアミンによるインビトロ変異処理）
2μgのＤＮＡを0.4Mヒドロキシルアミン中（0.1M KH₂PO₄-1mM EDTA (pH6.0) 100μl、1Mヒドロキシルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水を加えて計200μlとする）で、75℃の条件下で、１〜４時間処理した。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで精製後、ＡＫ完全欠損株E. coli GT3株に導入し、完全培地（L-broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl, 1.5％ agar）に撒きコロニーを形成させた。これを（2-2-1）で設定した選択培地にレプリカし、選択培地上に生育可能な株を選択し候補株とした。形質転換体の出現率と変異率は図５のような推移がみられた。４時間処理では0.5〜0.8％とかなり高率で変異株が得られた。
（ＮＴＧによるインビボ変異処理）
pLYSC1をE. coli MC1061に導入し、菌体ごとＮＴＧ処理をおこなった。処理後の菌体を一夜培養して変異を固定した後プラスミドを抽出し、E. coli GT3に導入した。すなわち、形質転換株を２×TY培地（1.6％ Bacto trypton, 1％ Yeast extract, 0.5％ NaCl）で培養し、ＯＤ₆₆₀が約０．３になったところで集菌し、下記に示すＴＭ緩衝液（TM buffer）で洗浄した後、ＮＴＧ液（0.2mg/mlの濃度でＮＴＧをTM bufferに溶解させて調製）に懸濁し、37℃で０〜９０分処理した。菌体をTM buffer及び２×TY培地で洗浄後、2×TY培地で一夜培養して変異を固定した後、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、E. coli GT3株に導入し、候補株のスクリーニングをインビトロ変異と同様に行い、リジン耐性（Lys^r）、ＡＥＣ耐性（AEC^r）の変異体を得た。
（TM buffer）
Tris 50mM
マレイン酸 50mM
(NH₄)₂SO₄ 1g/L
MgSO₄・7H₂O 0.1g/L
Ca(NO₃)₂ 5mg/L
FeSO₄・7H₂O 0.25mg/L
NaOHを用いてpH6.0に調整
上記で得られた候補株合計180株(ヒドロキシルアミン処理48株、NTG処理132株)を再度選択培地にスポットし、AEC及びＬ−リジン耐性を確認し153株を得た。培地中のアミノ酸蓄積パターンの違いに注目して、この153株を14群に分け各群の代表株を選んでＡＫ活性を測定することにした。なお、ヒドロキシルアミン処理による変異株と、NTG処理による変異株との間ではＡＫの活性に大きな差はなかったので、それぞれを区別することなく以降の実験を行なった。
(2-2-3) lysC^*遺伝子の単離及びlysC^*産物の検討
上記14群の代表株として、No.24, No.43, No.48, No.60, No.80, No.117, No.126, No.149, No.150, No.156, No.158, No.167, No.169, No.172を選び、おのおのからpLYSC1に由来する変異型プラスミドを回収し、それぞれpLYSC1^*24, pLYSC1^*43, pLYSC1^*48, pLYSC1^*60, pLYSC1^*80, pLYSC1^*117, pLYSC1^*126, pLYSC1^*149, pLYSC1^*150, pLYSC1^*156, pLYSC1^*158, pLYSC1^*167, pLYSC1^*169, pLYSC1^*172と命名した。これらと野生型pLYSC1でＡＫ完全欠損株GT3を形質転換し、各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、ＡＫIIIの酵素活性を測定した。
無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにして調製した。形質転換株を２×TY培地で培養し、ＯＤ₆₆₀が約0.8になったところで集菌した。菌体を０℃の条件下、0.02M KH₂PO₄(pH6.75)-0.03M β−メルカプトエタノールで洗浄し、超音波処理（0℃,100W,30秒×4）で菌体を破砕した。菌体破砕液を０℃の条件下、33krpmで１時間遠心し、上清をとりこれに80％飽和になるよう硫安を添加し、遠心後ペレットを0.02M KH₂PO₄(pH6.75)-0.03M β−メルカプトエタノールに溶解し、０℃で一夜保存した。
ＡＫIII酵素活性の測定は、スタットマンらの方法にしたがった(Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,G.,and Robichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236,2033(1961))。すなわち、下記組成の反応液を27℃で45分インキュベートし、FeCl₃溶液（2.8N HCl 0.4ml + 12％TCA 0.4ml + 5％FeCl₃・6H₂O/0.1N HCl 0.7ml）を加え発色させ、これを遠心後、上清の540nmでの吸光度を測定した。活性は１分間に生成するヒドロキサム酸の量で表示（1U=1μmol/min）した。モル吸光係数は600とした。尚、反応液からアスパラギン酸カリウムを除いたものをブランクとした。
（反応液組成）

ＡＫの酵素活性を測定する際、酵素反応液中に種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる阻害の度合を調べた。結果を、図６及び表３に示した。尚、野生型及びNo.24, 43, 48, 60, 80, 117, 126については図６Ａに、No.149, 150, 156, 158, 167, 169, 172については図６Ｂに示した。
この結果が示すように、野生型ＡＫIIIはＬ−リジンによる阻害を非常に強く受け、Ｌ−リジン約0.45mMで50％阻害され、5mMになるとほぼ100％阻害された。それに対し、今回得られた変異型ＡＫIIIは、解除の度合は様々ではあったが、14種ともＬ−リジンによる阻害が解除されていた。特にNo.24、80、117、169、172では、Ｌ−リジン100mMでも阻害はほとんどみられず、50％阻害濃度は野生型のそれと比較して200倍以上であった。また総蛋白当りの比活性は、菌体の生育状況や試料の調製に影響されるが、いずれもほとんどが野生型と同等もしくはそれ以上のものであり、変異導入による活性低下の問題はほとんどなかった（表３）。このことより、ＡＫIIIの活性中心とＬ−リジンによる調節部位がそれぞれ独立していることが予想された。尚、表３中、阻害解除度（％）とは、反応液中Ｌ−リジン非存在下でのＡＫ活性に対するＬ−リジン100mM存在下でのＡＫ活性である。熱安定性（％）とは55℃で1.5時間処理後の活性保持率である。

続いて変異型酵素の熱安定性を調べた。ある酵素を改良し活性を上げようとする場合、創成される酵素が細胞内で安定に保持されることが重要である。細胞内外でのプロテアーゼの活動の違いや、酵素をインビトロ保存するための保存用バッファーの影響などもあるため、インビトロの測定には問題もあるが、簡便のため１つのパラメーターとして変異型ＡＫIIIの熱安定性についてインビトロで検討した。
ＡＫIIIの失活温度を種々の条件で検討した結果から、55℃、90分処理後の活性保持率を測定することにした。表３に示すように、半数がむしろ野生型よりも優れていた。通常変異型酵素は野生型に比べ不安定なものが多いが、今回得られた変異型ＡＫIIIには安定性が野生型を上回るものもあり、Ｌ−リジン生産の実用面でかなり有力と思われるものが多かった。
（2-2-4）野生型lysCおよび変異型lysCの塩基配列の決定
DNAシークエンサーABI Model 373A（Applied Biosystems社製）を使用して、常法に従い、今回取得した野生型lysC遺伝子の塩基配列の決定を行なった（配列番号７）。その結果、既に発表されているE. coli K-12 JC411株のlysCの配列（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）と６ヶ所（アミノ酸レベルでは２ヶ所）の相違があった。この６ヶ所の相違は使用菌株の違いによるものであると考えられる。
同様に、14種の変異型pLYSC1上にあるlysC^*それぞれについて塩基配列を決定し、変異点を明らかにした。結果を表４に示す。表中、（）内はヌクレオチドの変異に基づくアミノ酸残基の変異を示す。14種のうち全く同一の変異型が２組（No.48とNo.167、及びNo.24とNo.80）あったので、変異の種類は12種類であった。尚、No.149,150,156,158,167,169,172はヒドロキシルアミン処理、No.24、43、48、60、80、117、126はＮＴＧ処理によって得た変異型であるが、変異のパターンはいずれもシトシンからチミンへの変異、あるいは裏鎖のシトシンからチミンへの変異による表鎖のグアニンからアデニンへの変異であった。

実施例３ dapA ^* を導入した株によるＬ−リジンの発酵生産
エシェリヒア属細菌でＬ−リジンを生産させるためには、特開昭56-18596号公報、及び米国特許第4,346,170公報及びApplied Microbiology and Biotechnology,15,p227-231(1982)に示されるように、ＤＤＰＳを増強する宿主としては、アスパルトキナーゼがＬ−リジンによる阻害を受けなくなっているように変化している事が必須であるとされている。セラチア属細菌においても、エシェリヒア属細菌と同様であるものと推定される。そのような株として、たとえばＬ−スレオニン生産菌があげられる。セラチア・マルセッセンスのＬ−スレオニン生産菌としては、スレオニンアナログであるAHV（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸）に耐性な菌が知られている（S. Komatsubara, M. Kisumi and I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834 (1978)）。そのような株として具体的には、セラチア・マルセッセンスAJ13125株がある。当該菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、１９９５年６月１２日よりFERM P-14983の受託番号で寄託され、１９９６年３月４日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-5441の受託番号が付与されている。
また、セラチア・マルセッセンスに導入するdapA^*としては、酵素の阻害解除度、比活性より判断して、pdapAS24に含まれているdapA^*（１１８番目のヒスチジン残基がチロシン残基に変異しているもの）を選択した。まず、dapA^*の発現量を増すためと、プラスミドの安定性を増すために、pdapAS24上にあった変異型dapA^*（以下、「dapA^*24」という）をｐＶＩＣ４０のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモーターの下流に連結し、図７に示す様にしてＲＳＦ２４Ｐを得た。
ＲＳＦ２４ＰプラスミドをE. coli JM109株に導入したものは、ＡＪ１２３９５と命名され、１９９３年１０月２８日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭＰ−１３９３５として寄託され、１９９４年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4858の受託番号のもとで寄託されている。pdapAS8およびpdapAS9を保持する株は寄託しなかったが、各プラスミド上のdapA^*の変異点は前述の通りすべて明らかになっているので、上記寄託菌よりプラスミドをマニアティスらの方法（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)）により回収し、サイト・ダイレクテッド・ミュータジェネシス法（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63(1989)）により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容易である。
ＲＳＦ２４Ｐプラスミドを常法にしたがいAJ13125株に導入し、AJ13125/RSF24Pを得た。AJ13125/RSF24PのＬ−リジン生産性について評価を行なった。
一方、コントロールのプラスミドとしてＲＳＦＰを構築した。すなわち、図７に示すｐＶＩＣ４０のBamHIおよびDraIによる二重消化物より大断片を選択し、これをＤＮＡポリメラーゼクレノー・フラグメントによって平滑末端化処理した。平滑末端化処理した大断片を自己連結させてプラスミドＲＳＦＰを得た。AJ13125株にＲＳＦＰを常法に従い導入し、AJ13125/RSFPを得た。AJ13125/RSFPについてもＬ−リジン生産性の評価を行った。
培養は、以下の培地を用い、培養時間72時間、温度30℃の条件下、攪拌114〜116rpmで行った。結果を表５に示す。
（Ｌ−リジン生産培地）
Ａ：(NH₄)₂SO₄ 16 g/L
KH₂PO₄ 1 g/L
MgSO₄・7H₂O 1 g/L
FeSO₄・7H₂O 0.01 g/L
MnSO₄・5H₂O 0.01 g/L
Yeast Ext.(Difco) 2 g/L
Ｌ−メチオニン 0.5 g/L
Ｌ−スレオニン 0.1 g/L
Ｌ−イソロイシン 0.05 g/L
KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分
オートクレーブ (16/20容)
Ｂ：20％スクロース
(115℃で10分オートクレーブ)(4/20容)
Ｃ：局方 CaCO₃
(180℃で２日間乾熱滅菌)(30g/L)
Ａ：Ｂを４：１で混合し、１Ｌに対してＣを３０ｇ加えて溶解し、抗生物質（ストレプトマイシン200μg/ml）を加える。

実施例４ dapA ^* 及びlysC ^* を導入した株によるＬ−リジンの発酵生産
実施例３で変異型ＤＤＰＳのＬ−リジン生産に対する効果が示されたが、これをさらに改良するために、実施例２で得られた変異型ＡＫIII遺伝子を変異型ＤＤＰＳ遺伝子と共存させる事とした。変異型ＤＤＰＳ遺伝子と共存させる変異型ＡＫIII遺伝子としては、酵素活性、熱安定性等からＮｏ．８０株由来のもの（lysC^*80）を選択した。
lysC^*80は、lysC^*の発現量を増すためにpLYSC1^*80上にあったlysC^*（以下、「lysC^*80」という）をpUC18に対して逆位の挿入部位を有するベクターpHSG399（宝酒造社製）のlacZプロモーターの下流につなぎかえることにより作成されたプラスミドpLLC^*80（図８）から切り出したものを使用した。pLLC^*80は、pLYSC1^*80上のlysC^*80が、転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向に配置されているので、Ｌ−リジンの生産性を向上させるために、lacZプロモーターに対して転写方向が正方向となるようにlysC^*80を配置させるために作成されたプラスミドである。
pLLC^*80と、実施例３で得られたＲＳＦ２４Ｐから、dapA^*及びlysC^*を有するプラスミドＲＳＦＤ８０を図９の様にして作製した。ＲＳＦＤ８０は、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター（tetP）の下流に、tetPに対して転写方向が正方向となるようにdapA^*24及びlysC^*80がこの順序で配置されている。
ＲＳＦＤ８０プラスミドをE. coli JM109株に導入したものを、ＡＪ１２３９６と命名した。ＡＪ１２３９６は、１９９３年１０月２８日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭＰ−１３９３６として寄託され、１９９４年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。pLYSC1^*24, LYSC1^*43, pLYSC1^*48, pLYSC1^*60, pLYSC1^*117, pLYSC1^*126, pLYSC1^*149, pLYSC1^*150, pLYSC1^*156, pLYSC1^*158, pLYSC1^*167, pLYSC1^*169, pLYSC1^*172を保持する株は寄託しなかったが、各プラスミド上のlysC^*の変異点は前記の通りすべて明らかになっているので、上記寄託菌よりプラスミドをマニアティスらの方法（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)）により回収し、サイト・ダイレクテッド・ミュータジェネシス法（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,15.63(1989)）により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容易である。ＲＳＦＤ８０を常法にしたがいAJ13125株に導入し、AJ13125/RSFD80を得た。AJ13125/RSFD80のＬ−リジン生産性について評価を行なった。コントロールとして、AJ13125/RSFPについてもＬ−リジン生産性の評価を行った。
培養は、実施例３と同様のＬ−リジン生産培地を用い、培養時間72時間、温度30℃の条件下、攪拌114〜116rpmで行った。結果を表６に示す。

産業上の利用可能性
本発明により、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳ変異遺伝子が得られた。この遺伝子を保持するセラチア属細菌は、Ｌ−リジンを著量生産する。また、前記ＤＤＰＳ変異遺伝子を、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持するセラチア属細菌に導入することにより、さらにＬ−リジン生産量を増加させることができる。
配列表
(1)一般情報
（i）出願人：味の素株式会社
（ii）発明の名称：発酵法によるＬ−リジンの製造法
（iii）配列数：14
（iv）連絡先：
(A)宛名：味の素株式会社
(B)番地：京橋１丁目１５−１
(C)市：中央区
(D)州：東京都
(E)国：日本国
(F)ZIP ：１０４
（v）コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：IBM PC互換
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：PatentIn
（vi）現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人／事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミリ番号：
（2）配列番号１に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号１

（2）配列番号２に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号２

（2）配列番号３に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：1197
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：genomic DNA
(vi)起源
（A）生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
（B）株名：MC1061
配列の特徴：
特徴を表わす記号：prim transcript
存在位置：248
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：272..1150
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：primer bind
存在位置：27..46
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：primer bind
存在位置：1156..1175
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：RBS
存在位置：261..265
特徴を決定した方法：Ｓ
（xi）配列の説明：配列番号３
配列

（2）配列番号４に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：292
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：ペプチド
（xi）配列の説明：配列番号４

（2）配列番号５に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号５

（2）配列番号６に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：18
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号６

（2）配列番号７に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：2147
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：genomic DNA
(vi)起源
（A）生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
（B）株名：MC1061
配列の特徴：
特徴を表わす記号：-35 signal
存在位置：242..249
特徴を決定した方法：Ｓ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：-10 signal
存在位置：265..273
特徴を決定した方法：Ｓ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：primer bind
存在位置：536..555
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：primer bind
存在位置：2128..2147
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：RBS
存在位置：575..578
特徴を決定した方法：Ｓ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：584..1933
特徴を決定した方法：Ｓ
配列の特徴：
特徴を表わす記号：terminator
存在位置：1941..1968
特徴を決定した方法：Ｓ
（xi）配列の説明：配列番号７

（2）配列番号８に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：449
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：ペプチド
（xi）配列の説明：配列番号８

（2）配列番号９に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号９

（2）配列番号10に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号10

（2）配列番号11に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号11

（2）配列番号12に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号12

（2）配列番号13に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号13

（2）配列番号14に関する情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：20
（B）種類：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸合成ＤＮＡ
(xi)配列の説明：配列番号14

Claims

Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡが細胞内に導入されて形質転換されたセラチア・マルセッセンスを好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異が、エシェリヒア・コリのジヒドロジピコリン酸合成酵素のアミノ酸配列中、Ｎ−末端から８１番目のアラニン残基をバリン残基に置換させる変異、１１８番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、８１番目のアラニン残基をバリン残基に置換させかつ１１８番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載のＬ−リジンの製造法。
前記セラチア・マルセッセンスが、さらに、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持することを特徴とする請求項１または２記載のＬ−リジンの製造法。
前記セラチア・マルセッセンスが、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡが細胞内に導入されたことにより、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持することを特徴とする請求項３記載のＬ−リジンの製造法。
前記アスパルトキナーゼが、エシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIである請求項４記載のＬ−リジンの製造法。
アスパルトキナーゼIIIのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異が、エシェリヒア・コリのアスパルトキナーゼIIIのアミノ酸配列中、Ｎ−末端から３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換される変異、３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ４０８番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、３４番目のアルギニン残基をシステイン残基に置換させかつ３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、３２５番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、３１８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、３１８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３４９番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、３４５番目のセリン残基をロイシン残基に置換させる変異、３４７番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換せる変異、３５２番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３６９番目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、１６４番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、４１７番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ４１９番目のシステイン残基をチロシン残基に置換させる変異、よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項５記載のＬ−リジンの製造法。
前記セラチア・マルセッセンスが、さらに、リジンデカルボキシラーゼを欠損したことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬ−リジンの製造法。