JP3132497B2 - 発酵法によるl−リジンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl−リジンの製造法Info
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Description
たものであり、詳しくは、発酵法によるL−リジンの製
造法、及びこの製造法に用いる微生物に関するものであ
る。
る場合、生産性を向上させるために、自然界から分離し
た菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。L
−リジンを生産する人工変異株は数多く知られており、
その多くはS−2−アミノエチルシステイン(AEC)
耐性変異株であり、ブレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属、バチルス属、またはエシェリヒア属に属し
ている。また、組換えDNAを使用した形質転換体を用
いる(米国特許第4278765号)等、アミノ酸の生産を増
加させる種々の技術が開示されている。
昭56-18596号公報、米国特許第4346,170号およびApplie
d Microbiology and Biotechnology, 15, p227-231(198
2)においてジヒドロジピコリン酸合成酵素(以下、「D
DPS」と略すことがある)を増強した株を用いたL−
リジンの製造法が示されている。しかし、ここで用いら
れたDDPSは野生型であり、L−リジンによるフィー
ドバック阻害を受けるため、十分満足できるL−リジン
の生産性が得られていなかった。尚、上記Applied Micr
obiology and Biotechnology, 15, p227-231(1982)に記
載されているL−リジン生産量は、グルコース75g/
lからL−リジン塩酸塩3g/lであり、消費係数(糖
1gに対し生産されるL−リジンのg数、又はその百分
率)は0.04もしくは4%と計算される。
害を受けない事が知られているコリネバクテリウム属細
菌由来のDDPSを導入したエシェリヒア属細菌を用い
たL−リジンの製造法が、大韓民国特許公告92-8382号
に示されている(消費係数17%)。しかし、コリネバ
クテリウム属細菌の生育上限温度はエシェリヒア属細菌
の生育上限温度よりも10度程度低いために、コリネバ
クテリウム属細菌由来のDDPSをコードするDNAを
エシェリヒア属細菌に導入してL−リジン生産に利用す
るためには、培養温度を下げて培養する必要があると考
えられる。従って、エシェリヒア属細菌が有する、生育
温度が高く生育速度及びL−リジン生産速度も速いとい
う利点を発揮させる事が困難であると予想される。ま
た、一般に異種生物由来の遺伝子を発現させる場合に
は、発現産物がプロテアーゼに分解されたり、不溶性の
封入体を形成する事もあり、同種の遺伝子を発現させる
場合よりも困難が予想される。さらに、コリネバクテリ
ウム属細菌由来のDDPSをコードするDNAをエシェ
リヒア属細菌等に導入し、工業的にL−リジンを生産さ
せる場合には、組換えDNAガイドラインに従って、同
種遺伝子を導入した組換え体を使用するよりも厳しい規
制が課せられる。
(DDPS)は、アスパルトセミアルデヒドとピルビン
酸を脱水縮合させ、ジヒドロジピコリン酸を合成する酵
素であり、この反応はアスパラギン酸系アミノ酸の生合
成において、L−リジン生合成系への分岐の入口となっ
ている。エシェリヒア属細菌においてはアスパルトキナ
ーゼとともにL−リジン生合成の重要な調節部位を担っ
ている事が知られている。
リ:大腸菌)ではdapAという遺伝子にコードされてい
る。このdapAはすでにクローニングされており、塩基配
列も決定されている(Richaud, F. et al. J. Bacterio
l., 297 (1986))。
K」と略すことがある)は、アスパラギン酸をβ−ホス
ホアスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、
アスパラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素
となっている。E. coliのAKは3種あり(AKI, A
KII,AKIII)、うち2つはホモセリンデヒドロゲナー
ゼ(以下、「HD」と略すことがある)との複合酵素で
ある。複合酵素の内のひとつはthrA遺伝子にコードされ
るAKI−HDIであり、もう一方は metLM遺伝子にコ
ードされるAKII−HDIIである。AKIはスレオニン
とイソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンによる
阻害を受け、AKIIはメチオニンによる抑制を受ける。
であり、lysCと名付けられた遺伝子の産物であって、L
−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けるこ
とが知られている。菌体内でのこれらの活性の割合は、
AKI:AKII:AKIII=約5:1:4となっている。
菌由来のDDPSは、L−リジンによるフィードバック
阻害を受けないが、これをエシェリヒア属細菌に導入し
てL−リジン生産に利用するためには、培養温度の点で
問題がある。L−リジンによるフィードバック阻害を受
けないエシェリヒア属細菌由来のDDPSあるいはAK
IIIの変異酵素を取得することができれば、エシェリヒ
ア属細菌を用いて効率の良いL−リジンの発酵生産を行
うことができることが期待されるが、DDPSの変異酵
素を示した先行文献はなく、また、AKIIIの変異酵素
についても報告はあるものの(Boy, E. et al., J. Bac
teriol., 112, 84 (1972))、同変異酵素がL−リジン
の生産性を改善できることを示唆した例は知られていな
い。
素の増強がL−リジンの生産性の向上に有効であるかに
ついて検討した例は知られていない。
によるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリ
ヒア属細菌由来のDDPSとAKIIIを取得するととも
に、これらを用いてL−リジン生合成系の律速段階の順
位を解明し、従来よりもさらに改良された発酵法による
L−リジンの製造法を提供することを課題とする。
うな観点から、L−リジン生合成系の強化が可能にな
る。すなわち、複数反応からなる生合成系は、直列に連
結された太さの異なる複数のパイプを流れる液体にたと
えることができる。ここで、各々のパイプは個々の酵素
に相当し、そのパイプの太さは酵素反応速度に相当す
る。パイプを流れる液体の量を増やすには、最も細いパ
イプを太くするのが効果的である。太いパイプをさらに
太くしても、効果は期待できない。さらに流量を増やす
には、2番目に細いパイプを太くすればよい。
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、L−リジンに
よるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒ
ア属細菌由来のDDPSをコードするDNAを取得する
ことに成功した。尚、L−リジンによるフィードバック
阻害が十分に解除されたE. coli由来のDDPSをコー
ドするDNAを本明細書において変異型dapAあるい
はdapA*とよぶことがある。
ードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼおよび
変異型dapAを保持するエシェリヒア属細菌を創製し
た。尚、L−リジンによるフィードバック阻害が十分に
解除されたE. coli由来のアスパルトキナーゼをコード
するDNAを本明細書において変異型lysCあるいは
lysC*とよぶことがある。
した結果、lysC*、dapAあるいはdapA*を導
入した株にL−リジン生産が認められ、dapA*導入
株が最も高いL−リジン生産性を示した。この結果か
ら、dapAにコードされる酵素が触媒する反応が第一
の律速段階であることがわかった。次に、dapA*導
入株に各L−リジン生合成系遺伝子を導入したところ、
lysC*が最もL−リジン生産性向上に効果があり、
lysCにコードされる酵素が触媒する反応が第2の律
速段階であることがわかった。同様にして、dapBに
コードされる酵素(ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ)が触媒する反応が第3の律速段階であることがわか
った。この知見に基づき本発明は完成された。
ードバック阻害が解除される変異を有するエシェリヒア
属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードす
るDNAが細胞内に導入されて形質転換され、かつL−
リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパル
トキナーゼを保持することを特徴とするエシェリヒア属
細菌を提供する。L−リジンによるフィードバック阻害
が解除されたアスパルトキナーゼをエシェリヒア属細菌
に保持させる方法としては、L−リジンによるフィード
バック阻害が解除される変異を有するエシェリヒア属細
菌由来のアスパルトキナーゼIIIをコードするDNAを
細胞内に導入する方法が挙げられる。
除されるアスパルトキナーゼIIIの変異としては、配列
表の配列番号8に記載されるアスパルトキナーゼIIIの
アミノ酸配列中、N−末端から323番目のグリシン残
基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、323番目
のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ4
08番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換さ
せる変異、34番目のアルギニン残基をシステイン残基
に置換させかつ323番目のグリシン残基をアスパラギ
ン酸残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基
をフェニルアラニン残基に置換させる変異、318番目
のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変
異、318番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に
置換させかつ349番目のバリン残基をメチオニン残基
に置換させる変異、345番目のセリン残基をロイシン
残基に置換させる変異、347番目のバリン残基をメチ
オニン残基に置換させる変異、352番目のスレオニン
残基をイソロイシン残基に置換させる変異、352番目
のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ3
69番目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換さ
せる変異、164番目のグルタミン酸残基をリジン残基
に置換させる変異、417番目のメチオニン残基をイソ
ロイシン残基に置換させかつ419番目のシステイン残
基をチロシン残基に置換させる変異が挙げられる。
が解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のジ
ヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNA及びL
−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を
有するアスパルトキナーゼIIIをコードするDNAは、
各々エシェリヒア属細菌の染色体に保持されていても、
細胞内で同一または別々のプラスミド上に保持されてい
てもよい。さらに、各々のDNAの一方が染色体に保持
され、もう一方のDNAがプラスミド上に保持されてい
てもよい。
酸レダクターゼ遺伝子が増強された前記エシェリヒア属
細菌を提供する。ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺
伝子の増強は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝
子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクタ
ーに連結されてなる組換えDNAで形質転換することに
より行うことができる。
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された前記エシェ
リヒア属細菌を提供する。増強されたジアミノピメリン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のエシェリヒア属細菌への導
入は、該遺伝子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製
可能なベクターに連結されてなる組換えDNAで形質転
換することにより行うことができる。
デヒドロゲナーゼ遺伝子のかわりにテトラヒドロジピコ
リン酸スクシニラーゼ遺伝子及びスクシニルジアミノピ
メリン酸デアシラーゼ遺伝子が増強されたエシェリヒア
属細菌を提供する。これらの遺伝子の増強は、これらの
遺伝子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能な同
一又は異なるベクターに連結されてなる単一の組換えD
NA又は2つの組換えDNAで形質転換することにより
行うことができる。
のいずれかを好適な培地で培養し、該培養物中にL−リ
ジンを生産蓄積せしめ、該培養物からL−リジンを採取
することを特徴とするL−リジンの製造法を提供する。
もしくはAKIIIをコードするDNA、あるいはこれら
にプロモーターを含むDNAを、「DDPS遺伝子」又
は「AK遺伝子」もしくは「AKIII遺伝子」というこ
とがある。また、L−リジンによるフィードバック阻害
が解除された変異酵素を単に「変異型酵素」、これをコ
ードするDNAあるいはこれにプロモーターを含むDN
Aを「変異型遺伝子」ということがある。さらに、「L
−リジンによるフィードバック阻害が解除される」と
は、実質的に阻害が解除されていればよいことを意味
し、完全に解除されている必要はない。
する。 <1>本発明に用いる変異型ジヒドロジピコリン酸合成
酵素(DDPS)をコードするDNA 本発明の変異型DDPSをコードするDNAは、野生型
DDPSをコードするDNAにおいて、コードされるD
DPSのL−リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れる変異を有するものである。DDPSとしては、エシ
ェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のDDP
Sが挙げられる。また、DDPSのL−リジンによるフ
ィードバック阻害を解除する変異としては、配列表の配
列番号4に記載されるDDPSのアミノ酸配列中、DD
PSのN−末端から 81番目のアラニン残基をバリン残基に置換させる変
異、 118番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させ
る変異、 81番目のアラニン残基をバリン残基に置換させかつ11
8番目のヒスチジン残基を チロシン残基に置換させる
変異、 が挙げられる。
は、エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードするも
のであれば特に制限されないが、具体的には配列番号4
に示すアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられ、さ
らに具体的には配列番号3に示す塩基配列のうち、塩基
番号272〜1147で表される配列が挙げられる。こ
れらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こす
ような塩基配列の変異を有するものが、本発明の変異型
DDPSをコードするDNAである。尚、置換されたア
ミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコ
ードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種
や菌株の違いにより保持するDDPSの配列がわずかに
相異することが予想されるが、このような酵素の活性に
関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは
挿入を有するものも本発明の変異型DDPS遺伝子に含
まれる。
以下の通りである。まず、野生型DDPS遺伝子又は他
の変異を有するDDPS遺伝子を含有するDNAをイン
ビトロ変異処理し、変異処理後のDNAと宿主に適合す
るベクターDNAとを連結して組換えDNAを得る。組
換えDNAを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同
形質転換体のうちで変異型DDPSを発現するように至
ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子を
保持している。また、野生型DDPS遺伝子又は他の変
異を有するDDPS遺伝子を含有するDNAを、宿主に
適合するベクターDNAと連結して組換えDNAを得
て、その後組換えDNAをインビトロ変異処理し、変異
処理後の組換えDNAを宿主微生物に導入して形質転換
体を得、同形質転換体のうちで変異型DDPSを発現す
るように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異
型遺伝子を保持している。
し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異
株から変異型遺伝子を取得してもよい。もしくは、野生
型遺伝子が連結されている組換えDNAが導入されてい
る形質転換体を変異処理し、変異型酵素を生産する変異
株を創成した後、該変異株から組換えDNAを回収すれ
ば、同DNA上に変異型遺伝子が創成される。
剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒド
ロキシルアミンは、シトシンをN4−ヒドロキシシトシ
ンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起
こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処
理する場合は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)もしくは亜硝酸等の
通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を
行う。
異を有するDDPS遺伝子を含有するDNAの供与菌とし
ては、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなる
ものを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトら
の著書(Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and
Salmonella Typhimurium,American Society for Micro
biology,Washington D.C.,1208, table 1)にあげられ
るものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株や、MC
1061株などがあげられる。DDPS遺伝子を含有するDN
Aの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のDDP
S遺伝子を含むDNAが取得できる。
て述べる。まず、野生型のdapAをもつE. coli例えばMC1
061株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養する
には、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際
の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが
好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆
もしくは小麦の浸出液等の1種類以上の窒素源に、リン
酸第1カリウム、リン酸第2カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第2鉄、
硫酸第2鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上
を添加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適
宜添加した物が用いられる。なお、培地の初発pHは、
6〜8に調製するのが適当である。また培養は30〜4
2℃、好ましくは37℃前後で4〜24時間、通気攪拌
深部培養、振盪培養または静置培養等により行う。
3,000 r.p.m.で5分間遠心分離してE. coli MC1061株の
菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法
(Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963))、K. S. Kir
byの方法(Biochem.J.,64,405,(1956))等の方法により
染色体DNAを得ることができる。
S遺伝子を単離するために、染色体DNAライブラリー
を作製する。まず、染色体DNAを適当な制限酵素で部
分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を
調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵
素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度30℃以上、
好ましくは37℃、酵素濃度1〜10ユニット/mlで様
々な時間(1分〜2時間)染色体DNAに作用させてこ
れを消化する。
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDN
Aに連結し、組換えDNAを作製する。具体的には、染
色体DNAの切断に用いた制限酵素 Sau3AIと相補的な
末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHIを、
温度30℃以上、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件
下で1時間以上、好ましくは1〜3時間、ベクターDN
Aに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次い
で、上記のようにして得た染色体DNA断片混合物と切
断開裂されたベクターDNAを混合し、これにDNAリ
ガーゼ、好ましくはT4DNAリガーゼを、温度4〜1
6℃、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で1時
間以上、好ましくは6〜24時間作用させて組換えDN
Aを得る。得られた組換えDNAを用いて、エシェリヒ
ア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはJE7627
株(ponB704,dacB12,pfv+,tonA2,dapA,lysA,str,malA3
8,metB1,ilvH611,leuA371,proA3,lac-3,tsx-76)のよう
なDDPS欠損変異株を形質転換して染色体DNAライ
ブラリーを作製する。この形質転換は D.M.Morrisonの
方法(Methods in Enzymology 68, 326 (1979))あるい
は受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過
性を増す方法(Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,5
3,159(1970))等により行うことができる。なお、JE762
7株は国立遺伝学研究所(日本国静岡県三島市)より入
手可能である。
ら、DDPS活性が増大した株あるいはDDPS遺伝子
欠損に起因する栄養要求性が相補された株よりDDPS
遺伝子の組換えDNAをもつ菌株を得る。例えば、DD
PS欠損変異株はジアミノピメリン酸要求性であるの
で、DDPS欠損変異株を宿主に用いた場合は、ジアミ
ノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった菌
株を単離し、該菌株から組換えDNAを回収することに
より、DDPS遺伝子を含有するDNA断片を得ること
ができる。
もつ候補株が、実際にDDPS遺伝子がクローニングさ
れた組換えDNAを保持するかどうかを確認するには、
候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調
製してDDPS活性が増大していることを確認すること
により達成できる。DDPSの酵素活性測定法は、Yuga
riらの方法により行うことができる(Yugari,Y. and Gi
lvarg,C., J.Biol.Chem.,240,4710(1962))。
含有するDNAがベクターDNAに挿入された組換えD
NAを、例えば P. Guerryらの方法(J. Bacteriol.,11
6,1064,(1973))、D. B. Clewell の方法(J.Bacterio
l.,110,667,(1972))などにより単離することができ
る。
にDDPS遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等
により染色体DNAを調製し、ポリメラーゼチェインリ
アクション法(PCR:polymerase chain reaction;
White,T.J. et al ;Trends Genet., 5,185 (1989)参
照)により、DDPS遺伝子を増幅することによっても
行える。増幅反応に用いるDNAプライマーは、DDP
S遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するDNA二
重鎖の両3’末端に相補するものを用いる。DDPS遺
伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該DNA断片
をプライマーとして全領域を含むDNA断片を染色体D
NAライブラリーよりスクリーニングする必要がある。
DDPS遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅され
たDDPS遺伝子を含有するDNA断片を含むPCR反
応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のDN
A断片を抽出することによってDDPS遺伝子を含有す
るDNA断片を回収できる。
iにおいて既知となっている配列(Richaud, F. et al.,
J.Bacteriol.,297(1986))を基にして適宜作成すれば
よいが、具体的には、DDPS遺伝子をコードする1150
塩基からなる領域を増幅できるプライマーが好ましく、
配列番号1及び2に示した2種のプライマーが適当であ
る。プライマーDNAの合成は、ホスホアミダイト法
(Tetrahedron Letters,22,1859(1981)参照)等の常法
により、市販のDNA合成装置(例えば、AppliedBiosy
stems社製DNA合成機 model 380B等)を用いて行うこ
とができる。また、PCR反応は、市販のPCR反応装置
(宝酒造(株)製DNAサーマルサイクラー PJ2000型
等)を使用し、TaqDNAポリメラーゼ(宝酒造(株)より
供給されている)を用い、供給者により指定された方法
に従って行うことができる。
は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能な
ベクターDNAに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導
入することによって、DDPS遺伝子への変異の導入な
どの操作がしやすくなる。用いられるベクターDNAと
形質転換法、さらにDDPS遺伝子の存在の確認方法は
上述した方法と同じである。
残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法と
しては、リコンビナントPCR法(Higuchi,R.,61,in P
CR Technology (Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(198
9)))、部位特異的変異法(Kramer,W. and Frits,H.J.,
Meth. in Enzymol.,154,350 (1987)); Kunkel,T.A. et.
al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987))などがある。
これらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こ
すことができる。
れば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導
入することができる。
DPS遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法
(Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,J.Bacteriol.,159,1
039(1984))がある。また、DDPS遺伝子を保有する
エシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法またはN−メ
チル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化
学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法に
よれば、ランダムに変異を導入できる。
DPS遺伝子を含有するDNA断片とベクターDNAか
らなる組換えDNAを、直接ヒドロキシルアミン等で変
異処理し、これで例えば E. coli W3110株を形質転換す
る。次にL−リジンのアナログである、S−2−アミノ
エチルシステイン(AEC)を含む最少培地、例えばM9
に形質転換株を培養する。野生型のDDPS遺伝子を含
有する組換えDNAを保持する株は、その組換えDNA
により発現されるDDPSがAECにより阻害されるた
めに、L−リジン及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成
が出来なくなり生育が抑えられる。これに対し、L−リ
ジンによる阻害の解除されたDDPS遺伝子を含有する
組換えDNAを保持する株は、同組換えDNA中のDD
PS遺伝子にコードされる変異酵素がAECによる阻害
を受けないので、AECが添加された最少培地上での生
育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育
が、L−リジンのアナログであるAECに耐性となって
いる株、すなわち阻害の解除された変異型DDPS遺伝
子を含有する組換えDNAを保持する株を選択すること
ができる。
えDNAとして適当な宿主微生物に導入し、発現させる
ことによりフィードバック阻害が解除されたDDPSを
保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシェリ
ヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌(E. c
oli)が挙げられる。
伝子断片を取り出し、他のベクターDNAに挿入したも
のを使用してもよい。本発明において用いることのでき
ることのできるベクターDNAとしては、プラスミドベ
クターDNAが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR32
2、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pM
W119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にも
ファージDNAのベクターも利用できる。
率的に実施するために、変異型DDPSをコードするD
NA配列の上流に、lac、trp、PL等の微生物内
で働く他のプロモーターを連結してもよく、DDPS遺
伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅
して用いてもよい。
複製可能なベクターDNAに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外DNAとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン(Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983))、Muファージ(特開平2−10
9985)または相同性組換え(Experiments in Molec
ular Genetics, ColdSpring Harbor Lab.(1972))を用
いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
ナーゼIII(AKIII)をコードするDNA 本発明に用いる変異型AKIIIをコードするDNAは、
野生型AKIIIをコードするDNAにおいて、コードさ
れるAKIIIのL−リジンによるフィードバック阻害が
解除される変異を有するものである。また、AKIIIの
L−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異と
しては、配列表の配列番号8に示すAKIIIのアミノ酸
配列中、AKIIIのN−末端から(イ)323番目のグリシン
残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、(ロ)323番
目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ
408番目のグリシ ン残基をアスパラギン酸残基に置換
させる変異、(ハ)34番目のアルギニン残基をシステイン
残基に置換させかつ323番目のグリシン残基をアスパラ
ギン酸残基に置換させる変異、(ニ)325番目のロイシン残
基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、(ホ)318番
目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変
異、(ヘ)318番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に
置換させかつ349番目のバリン 残基をメチオニン残基
に置換させる変異、(ト)345番目のセリン残基をロイシン
残基に置換させる変異、(チ)347番目のバリン残基をメチ
オニン残基に置換させる変異、(リ)352番目のスレオニン
残基をイソロイシン残基に置換させる変異、(ヌ)352番目
のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ36
9番目のセリン 残基をフェニルアラニン残基に置換さ
せる変異、(ル)164番目のグルタミン酸残基をリジン残基
に置換させる変異、(ヲ)417番目のメチオニン残基をイソ
ロイシン残基に置換させかつ419番目のシステ イン残
基をチロシン残基に置換させる変異、が挙げられる。
は、特に制限されないが、エシェリヒア属細菌、例えば
E. coli由来のAKIIIをコードするDNAが挙げられ、
具体的には配列番号8に示すアミノ酸配列をコードする
DNA、さらには配列番号7に示す塩基配列のうち、塩
基番号584〜1930で表される配列が挙げられる。
尚、E. coliのAKIIIは、lysC遺伝子にコードされてい
る。
の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、
本発明の変異型AKIIIをコードするDNAである。
尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、その
アミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わ
ない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型A
KIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。
このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残
基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明の変
異型AKIII遺伝子に含まれる。例えば、後記実施例2
で得られた野生型lysC遺伝子の塩基配列(配列番号7)
は、既に発表されている E. coli K-12 JC411株のlysC
の配列(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,
J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986))と6ヶ所相違して
おり、そのうち2ヶ所でコードされるアミノ酸残基が異
なっている(JC411株のlysCは、配列番号8に示すlysC
のアミノ酸配列中、N−末端から58番目のグリシン残
基がシステイン残基に、401番目のグリシン残基がア
ラニン残基に置き換わっている)。このE. coli K-12 J
C411株のlysCと同一の配列を有するlysCであっても、上
記(イ)〜(ヲ)のいずれかの変異を導入すれば、L−リジン
によるフィードバック阻害が解除された変異を有するly
sCが得られることが予想される。
れた変異型AKIIIをコードするDNAを取得する方法
は以下の通りである。まず、野生型AKIII遺伝子又は
他の変異を有するAKIII遺伝子を含有するDNAをイ
ンビトロ変異処理し、変異処理後のDNAと宿主に適合
するベクターDNAとを連結して組換えDNAを得る。
組換えDNAを宿主微生物に導入して形質転換体を得、
同形質転換体のうちで変異型AKIIIを発現するように
至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子
を保持している。また、野生型AKIII遺伝子又は他の
変異を有するAKIII遺伝子を含有するDNAを、宿主
に適合するベクターDNAと連結して組換えDNAを得
て、その後組換えDNAをインビトロ変異処理し、変異
処理後の組換えDNAを宿主微生物に導入して形質転換
体を得、同形質転換体のうちで変異型AKIIIを発現す
るように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異
型遺伝子を保持している。
変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した
後、該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。DN
Aを直接変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシ
ルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シト
シンをN4−ヒドロキシシトシンに変えることによりシ
トシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤であ
る。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照
射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジ
ン(NTG)等の通常人工突然変異に用いられている変異
剤による処理を行う。
異を有するAKIII遺伝子を含有するDNAの供与菌として
は、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるも
のを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの
著書(Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and S
almonella Typhimurium,American Society for Microbi
ology,Washington D.C.,1208, table 1)にあげられる
ものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株や、MC10
61株などがあげられる。これらの株からAKIII遺伝子
を取得するに際し、染色体DNAの調製、染色体DNA
ライブラリーの作製等は、上記のDDPS遺伝子の取得
と同様に行えばよい。ライブラリー作製に用いる宿主と
しては、AKI、II、III全欠損株、例えばE. coli GT3
株(E. coli Genetic Stock Center(米国コネチカット
州)等から入手できる)等を用いることが好ましい。
AKIII活性が増大した株あるいは栄養要求性が相補さ
れた株としてAKIII遺伝子の組換えDNAをもつ菌株
を得る。候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵
素液を調製してAKIII活性を確認する。AKIIIの酵素
活性測定法は、スタットマンらの方法により行うことが
できる(Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,G.,and Rob
ichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236,2033(196
1))。
た場合は、L−リジン、L−スレオニン、L−メチニオ
ンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で、ま
たはホモセリンおよびジアミノピメリン酸を含有しない
培地上で生育可能となった形質転換株を単離し、該菌株
から組換えDNAを回収することにより、AKIII遺伝
子を含有するDNA断片を得ることができる。
III遺伝子を増幅する場合には、PCR反応に用いるD
NAプライマーとしては、例えばE. coliにおいて既知
となっている配列(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,a
nd Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986))を基に
して適宜作成できるが、lysC遺伝子をコードする1347塩
基からなる領域を増幅できるプライマーが適当であり、
例えば配列番号5及び6に示す配列を有する2種のプラ
イマーが適当である。
に、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実
施する方法としては、前記DDPS遺伝子の変異処理と
同様に、リコンビナントPCR法、部位特異的変異法な
どがある。
れば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導
入することができる。
DNA上のAKIII遺伝子DNAを直接ヒドロキシルア
ミンで処理する方法(Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,
J.Bacteriol.,159,1039(1984))がある。また、染色体
もしくは染色体外の組換えDNA上にAKIII遺伝子を
保持するエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法、ま
たはN−メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝
酸などの化学薬剤で処理する方法を用いてもよい。
は、まず変異処理したAKIII遺伝子を含有する組換え
DNAをAK完全欠損株、例えば E. coli GT3株に形質
転換する。次に著量のL−リジンを含む最少培地、例え
ばM9で形質転換株を培養する。野生型のAKIII遺伝子
を含有する組換えDNAを保持する株は、唯一のAKが
L−リジンにより阻害されるために、L−スレオニン、
L−イソロイシン、L−メチオニン、及びジアミノピメ
リン酸(DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。
これに対しL−リジンによる阻害の解除された変異型A
KIII遺伝子を含有する組換えDNA保持株は、著量の
L−リジンが添加された最少培地上での生育が可能にな
るはずである。この現象を利用し、生育が、L−リジン
あるいはL−リジンのアナログであるAECに耐性とな
っている株、すなわち阻害の解除された変異型AKIII
遺伝子を含有する組換えDNA保持株を選択することが
できる。
えDNAとして適当な微生物(宿主)に導入し、発現さ
せることによりフィードバック阻害が解除されたAKII
Iを保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシ
ェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌
(E. coli)が挙げられる。
子断片を取り出し、他のベクターに挿入したものを使用
してもよい。本発明において用いることのできることの
できるベクターDNAとしては、プラスミドベクターD
NAが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW
118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージ
DNAのベクターも利用できる。
率的に実施するために、変異型AKIIIをコードするD
NAの上流に、lac、trp、PL等の微生物内で働
く他のプロモーターを連結してもよく、AKIII遺伝子
に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して
用いてもよい。
複製可能なベクターDNAに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外DNAとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン(Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983))、Muファージ(特開平2−10
9985)または相同性組換え(Experiments in Molec
ular Genetics, ColdSpring Harbor Lab.(1972))を用
いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
持するエシェリヒア属細菌 L−リジンによるフィードバック阻害が解除されたAK
を保持するエシェリヒア属細菌としては、L−リジンに
よるフィードバック阻害が解除される変異を有するAK
IIIをコードするDNAが染色体DNAに組み込まれて
形質転換されたエシェリヒア属細菌、または該DNAと
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターD
NAとを連結してなる組換えDNAが細胞内に導入され
ることによって形質転換されたエシェリヒア属細菌が挙
げられる。また、L−リジンによるフィードバック阻害
が解除されたAKは、L−リジンによるフィードバック
阻害を受けない野生型AKであってもよく、このような
野生型AK遺伝子を同様にしてエシェリヒア属細菌に導
入したものでもよい。さらに、エシェリヒア属細菌細胞
を変異処理することにより、変異型AKIIIを産生する
ようになったエシェリヒア属細菌変異株であってもよ
い。
ア属細菌に導入することによって形質転換するには、変
異型DDPS遺伝子を染色体DNAに組み込んで形質転
換してもよく、変異型DDPS遺伝子とエシェリヒア属
細菌細胞内で自律複製可能なベクターDNAとを連結し
てなる組換えDNAを細胞内に導入することによって形
質転換してもよい。
遺伝子の両方をエシェリヒア属細菌に導入する場合に
は、両方の変異型遺伝子がエシェリヒア属細菌の染色体
DNA上に組み込まれて保持されていても、細胞内で単
一または別々のプラスミド上に染色体外DNAとして保
持されていてもよい。別々のプラスミドを用いる場合に
は、各々が安定して細胞内に保持されるような安定分配
機構を有するプラスミドを用いることが好ましい。さら
に、各々の変異型遺伝子の一方が染色体DNA上に組み
込まれて保持され、もう一方の変異型遺伝子が細胞内で
プラスミド上に染色体外DNAとして保持されていても
よい。変異型DDPS遺伝子及び変異型AKIII遺伝子
をエシェリヒア属細菌に導入するに際しては、両遺伝子
の導入の順序は問わない。
増強 変異型DDPS遺伝子及び変異型AK遺伝子を導入され
たエシェリヒア属細菌のジヒドロジピコリン酸レダクタ
ーゼ遺伝子を増強することにより、L−リジン生産性を
一層向上させることができる。
PS遺伝子を保持し、ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ遺伝子が増強されたエシェリヒア属細菌に、ジアミノ
ピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することによ
って、より一層L−リジン生産性を向上させることがで
きる。このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
は増強されている必要がある。ジアミノピメリン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子は通常にはコリネ型細菌に由来する
ものが挙げられ、コリネ型細菌としては、コリネバクテ
リウム属細菌またはブレビバクテリウム属細菌であっ
て、グルタミン酸生産能を有する野生株及び他のアミノ
酸生産能を有するこれらの変異株が挙げられる。より具
体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
の他に、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテ
リウム・ディバリカタム、コリネバクテリウム・グルタ
ミカム、コリネバクテリウム・リリウム等が挙げられ
る。
ゼ遺伝子を導入する代わりに、テトラヒドロジピコリン
酸スクシニラーゼ遺伝子及びスクシニルジアミノピメリ
ン酸デアシラーゼ遺伝子を増強することによっても、同
程度にL−リジン生産性を向上することができる。
発現産物である酵素の細胞当たりの活性を増強すること
をいう。具体的には、例えば、該遺伝子の細胞内コピー
数を高めること、発現効率のよいプロモーターを用いて
遺伝子当たりの発現量を高めること、酵素活性を高める
変異を該遺伝子に導入することなどが挙げられる。細胞
内の遺伝子のコピー数を高めるには、エシェリヒア属細
菌細胞内で自律複製可能なベクターに該遺伝子を挿入
し、このベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換すれ
ばよい。このベクターはマルチコピー型のプラスミドで
あることが好ましい。また、Muファージ等を用いて染
色体DNAに組み込んだDNAを増幅することによりコ
ピー数を増加させてもよい。プラスミドを用いる際に、
変異型DDPS遺伝子及び変異型AK遺伝子の導入にプ
ラスミドを用いた場合には、これらのプラスミドが共に
安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を有す
るプラスミドを用いることが好ましい。尚、各遺伝子の
導入の順序は問わない。
子を順次増強することによりL−リジン生産性を段階的
に向上させることができるメカニズムを以下に説明す
る。複数反応からなる生合成系は、直列に連結された太
さの異なる複数のパイプを流れる液体にたとえることが
できる。ここで、各々のパイプは個々の酵素に相当し、
そのパイプの太さは酵素反応速度に相当する。パイプを
流れる液体の量を増やすには、最も細いパイプを太くす
るのが効果的である。太いパイプをさらに太くしても、
効果は期待できない。さらに流量を増やすには、2番目
に細いパイプを太くすればよい。本発明者らはこのよう
な観点から、L−リジン生合成系を強化することを試み
た。そのために、後記実施例6に示すように、E. coli
に、E. coli由来のL−リジン生合成系遺伝子を段階的
に導入することによって、L−リジン生合成系の律速段
階の順位を解明した。その際、生合成系の下流に位置す
るdapC(スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナ
ーゼ遺伝子)、dapD(テトラヒドロジピコリン酸スクシ
ニラーゼ遺伝子)、dapE(スクシニルジアミノピメリン
酸デアシラーゼ遺伝子)及びdapF(ジアミノピメリン酸
エピメラーゼ遺伝子)の4遺伝子については、これらの
遺伝子産物が関与する反応を単独で触媒し得るブレビバ
クテリウム ラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum)の DDH(ジアミノピメリン酸デヒドロ
ゲナーゼ)をコードする遺伝子DDHで代替した。すなわ
ち、導入したL−リジン生合成系酵素遺伝子とそれらが
コードする酵素は次のとおりである。
クテリウム ラクトファーメンタム由来) lysA:ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
果、lysC*、dapAあるいはdapA*を導入した株にL−リジ
ン生産が認められ、dapA*導入株が最も高いL−リジン
生産性を示した。この結果から、dapAが触媒する反応が
第一の律速段階であることがわかった。次に、dapA*導
入株に各L−リジン生合成系遺伝子を導入したところ、
lysC*が最もL−リジン生産性向上に効果があり、lysC
が触媒する反応が第2の律速段階であることがわかっ
た。同様にして、dapBが触媒する反応が第3の律速段
階、DDHが触媒する反応が第4の律速段階であることが
わかった。さらに、DDHで代替されたdapC、dapD、dapE
及びdapFによる反応の間の律速段階を調べた結果、dapD
及びdapEが律速となっていることがわかった。
伝子、及びブレビバクテリウム ラクトファーメンタム
のDDH遺伝子の取得法を例示する。
ミドpS2(Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984))、
あるいはpT2から得ることができる。pS2をAatIIとAflII
で切断することにより、ppc遺伝子を有するDNA断片
が得られる。また、pT2をSmaIとScaIで切断することに
よってもppc遺伝子を有するDNA断片を得ることがで
きる。pT2を保持するE. coli F15株(AJ12873)は、工
業技術院生命工学工業技術研究所(郵便番号305日本
国茨城県つくば市東一丁目1番3号)に、FERM BP-4732
の受託番号のもとでブダペスト条約に基づいて国際寄託
されている。
ミドpLF4(Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res.,
10, 6957 (1982))から得られる。pLF4をPvuIIとStuI
で切断すると、aspC遺伝子を有するDNA断片が得られ
る。
ミドpAD20(Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379 (198
2))から得られる。pAD20をAseIとClaIで切断すると、a
sdを有するDNA断片が得られる。
オチド配列(Bouvier, J. et al.,J. Biol. Chem., 25
9, 14829 (1984))をもとに作成した2種のオリゴヌク
レオチドプライマー(例えば、配列番号9、10)を用い
たPCR法により、E. coli染色体DNAを増幅するこ
とによって得られる。
タミカム(Corynebacterium glutamicum)のDDH遺伝子
の既知のヌクレオチド配列(Ishino, S. et al., Nucle
ic Acids Res., 15, 3917 (1987))をもとに作成した2
種のオリゴヌクレオチドプライマー(例えば、配列番号
11、12)を用いたPCR法により、ブレビバクテリウム
ラクトファーメンタムの染色体DNAを増幅することに
よって得られる。
オチド配列(Stragier, P. et al.,J. Mol. Biol., 16
8, 321 (1983))をもとに作成した2種のオリゴヌクレ
オチドプライマー(例えば、配列番号13、14)を用いた
PCR法により、E. coli染色体DNAを増幅すること
によって得られる。
オチド配列(Richaud, C. et al.,J. Biol. Chem., 25
9, 14824 (1984))をもとに作成した2種のオリゴヌク
レオチドプライマー(例えば、配列番号15、16)を用い
たPCR法により、E. coliW3110株染色体DNAを増幅
することによって得られる。
オチド配列(Bouvier, J. et al.,J. Bacteriol., 174,
5265 (1992))をもとに作成した2種のオリゴヌクレオ
チドプライマー(配列番号17、18)を用いたPCR法に
より、E. coli DNAを増幅することによって得られ
る。
オチド配列(Richaud, C. et al.,Nucleic Acids Res.,
16, 10367 (1988))をもとに作成した2種のオリゴヌ
クレオチドプライマー(例えば、配列番号19、20)を用
いたPCR法により、E. coli染色体DNAを増幅する
ことによって得られる。
ヒア属細菌としては、その細胞内で変異型DDPS遺伝
子及び変異型AK遺伝子、もしくは他のL−リジン生合
成系遺伝子のプロモーター又はこれらの遺伝子を発現さ
せるための他のプロモーターが機能し、さらに変異型D
DPS遺伝子、変異型AK遺伝子、あるいは他のL−リ
ジン生合成系遺伝子をプラスミド上に染色体外DNAと
して導入する場合には、導入するのに用いるベクターD
NAの複製起点が細胞内で機能して複製可能なものであ
れば利用できる。
体的にはL−リジンアナログに耐性を有する変異株が例
示できる。このL−リジンアナログは、エシェリヒア属
細菌の増殖を阻害するようなものであるが、その抑制は
L−リジンが培地中に共存すれば、全体的または部分的
に解除されるようなものである。例えば、オキサリジ
ン、リジンハイドロキサメート、AEC、γ−メチルリ
ジン、α−クロロカプロラクタム等がある。これらのリ
ジンアナログに耐性を有する変異株は、通常の人工変異
操作をエシェリヒア属の微生物に施すことにより得られ
る。L−リジン製造に用いる菌株として、具体的には、
エシェリヒア・コリAJ11442(FERMBP−1
543及びNRRLB−12185として寄託されてい
る。特開昭56−18596号及び米国特許第4346
170号参照)が挙げられる。以上の微生物のアスパル
トキナーゼは、L−リジンによるフィードバック阻害が
解除されている。
菌が挙げられる。L−スレオニン生産菌も、一般的には
そのアスパルトキナーゼのL−リジンによる阻害が解除
されているからである。E. coliのL−スレオニン生産
菌としては、B-3996株が現在知られている内で最も高い
生産能を持っている。B-3996株は、Reserch Institute
for Genetics and Industrial Microorganism Breeding
に、登録番号RIA1867のもとに寄託されている。
することによって形質転換され、かつL−リジンによる
フィードバック阻害が解除されたAKを保持するエシェ
リヒア属細菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中に
L−リジンを生産蓄積させ、該培養物からL−リジンを
採取することにより、L−リジンを効率よく製造するこ
とができる。
使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要
に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
ス、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加
水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトー
ルなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸も
しくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アン
モニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニ
アガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
L−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を
適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に
応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が少量添加される。
施するのがよく、培養温度は25℃〜45℃に、培養中
pHは5〜8に制御する。尚、pH調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニア
ガス等を使用することができる。
ン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせ
ることにより実施できる。
に説明する
(Richaud, F. et al.,J.Bacteriol.,297(1986))、オ
ープンリーデイングフレーム(ORF)は876塩基対であり、
292アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていること
がわかっている。このdapA遺伝子がどのように調節され
ているか不明であるため、プロモーター領域を除き、S
D配列とORFのみを含む領域をPCR法を用いて増幅し、ク
ローニングすることにした。
を斎藤、三浦の方法(Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1
963))により回収し、配列番号1及び2に示す配列を有
する2種のプライマーを作製し、これらを用いて、エル
リッチらの方法(PCR Technology, Stockton press (19
89))に従ってPCR反応を行い、目的DNAの増幅を
行った。得られたDNAをそのまま市販のPCR断片用
クローニングベクターpCR1000(Invitrogen社
(米国カルホルニア州)より購入)に挿入した。pCR
1000はlacZプロモーター(Placz)を含有してお
り、lacZプロモーターの下流の部位で切断した状態で市
販されている。このpCR1000の両切断末端の間に
PCR断片を連結して得られる組換えDNAをE. coli
に導入すると、lacZプロモーター制御下でPCR断片が
転写される。PCR断片をPCR1000に連結する
際、このlacZプロモーターによる転写方向に対してdapA
の転写の向きが正方向となるように連結されたプラスミ
ドとしてpdapA1、逆方向となるように連結されたプラス
ミドとしてpdapA2の2種のプラスミドを得た(図1)。
るE. coli JE7627に導入したところ、プラスミドを導入
された株は宿主であるJE7627のジアミノピメリン酸の要
求性が相補されたので、両プラスミドに挿入されたDN
A断片は、活性のあるDDPSをコードする遺伝子dapA
を含有すると確認した。
伝学研究所(日本国静岡県三島市)から入手)に導入し
て得られる形質転換株をW3110/pdapA1、pdapA2をE. col
i W3110株に導入して得られる形質転換株をW3110/pdapA
2とそれぞれ命名した。そして以下の組成を有する最少
培地M9にリジンのアナログであるAECを加え、これら
2種の形質転換株をそれぞれ培養した。コントロールと
してプラスミドを導入していないW3110株も同培地で培
養した。2種の形質転換株もプラスミドを持たないW311
0株も、AECにより生育が抑えられたが、その生育阻
害はL−リジンの添加によって回復した。
水=5:0.1:1:0.1:95の割合で混合する。
取得 L−リジンによる阻害が解除されたDDPSをコードす
るdapA*を含有するプラスミド保持株は、著量のAEC
が添加された最少培地M9上での生育が可能になると予想
し、生育がAECに耐性となっている株を選択すること
によって、dapA *を含有するプラスミド保持株を選択す
ることにした。
で作製したpdapA1およびpdapA2上のdapAに変異処理を行
なうことにした。
株の選択条件の検討 上記で得られたW3110/pdapA1株およびW3110/pdapA2株
を、それぞれ種々の濃度のAECを含有するM9寒天平
板培地上で培養した。そしてAECによる生育阻止濃度
を調べ、dapA*を含有するプラスミド保持株の選択条件
の検討を行なった。各種濃度でAECを含むM9培地で
の形質転換体の生育を表1に示す。尚、表中の+は形質
転換株が生育することを示し、−は生育しなかったこと
を示す。
ロモーターによる転写の方向と一致している(図1)。
よってpdapA1上のdapA遺伝子はlacZプロモーターにより
発現量が増幅されているため、dapAが野生型のままでも
かなり高濃度のAECに耐性であったが、pdapA2上のda
pA遺伝子は転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向
であり、dapA自身のプロモーターも欠失しているため発
現量が少なく、より低濃度のAECで生育が阻害される
ことがわかった(W3110/pdapA1株では30mM、W3110/pdap
A2株では15mMの添加区で生育が抑えられた)。なお、こ
の生育阻害はL−リジンの同時添加により消去されるこ
とを確認した。
い、最少培地M9にAECを60mM添加したものを、dapA
*を含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、
実施例1においてこの培地を選択培地という。
2のインビトロ変異処理 pdapA2プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直
接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法
を用いた。
中(0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0)100μl、1Mヒドロキ
シルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水を
加えて計200μlとする)で、75℃で1〜4時間処理し
た。処理後のDNAをガラスパウダーで精製後、E. col
i W3110に導入し、完全培地(L-broth:1% Bacto tryp
ton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar)
に撒き、コロニーを形成させた。これらを(1-2-1)で
述べた選択培地にレプリカし、選択培地上でコロニーを
形成するものを選択した。2度の実験で合計36株の変
異プラスミドの候補が得られた。
度選択培地にスポットし、AEC耐性を確認した。
物の検討 上記36株から変異型pdapA2を回収し、これらと野生型
pdapA2のそれぞれでdapA欠損株 JE7627を形質転換し、
各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、DDPSの酵
素活性を測定した。
て調製した。形質転換株を2×TY培地(1.6% Bacto tr
ypton, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl)で培養し、6
60nmにおける濁度(OD660)が約0.8になったとこ
ろで集菌した。菌体を0℃の条件下で、0.85%NaClで洗
浄し、20mMリン酸カリウム緩衝液 pH7.5−400mM KClに
懸濁し、超音波処理(0℃,200W,10分)で菌体を破砕し
た。菌体破砕液を0℃の条件下で、33krpmで1時間遠心
し、上清をとってこれに80%飽和になるよう硫安を添加
し、0℃で一夜保存した後遠心し、ペレットを20mMリン
酸カリウム緩衝液pH7.5−400mM KClに溶解した。
法(Yugari,Y. and Gilvarg,C. J.Biol.Chem.240,4710
(1962))で行った。即ち下記組成の反応液の吸光度を、
37℃で分光光度計中で経時的に270nmの波長で測定し、
生じるジヒドロジピコリン酸を測定した。ブランクとし
ては反応系からピルビン酸ナトリウムを除いたものとし
た。
応液中に種々の濃度のL−リジンを加え、L−リジンに
よる阻害の度合を調べた。図2に示す様に、野生型DD
PSはL−リジンによる阻害を受けた。野生型に比べて
L−リジンによる阻害を受けにくくなったDDPSを有
する形質転換株由来の変異プラスミドは、候補プラスミ
ド36種中3種類であった。これらをそれぞれ、pdapAS
8、pdapAS9およびpdapAS24と命名した。後の塩基配列の
決定で pdapAS8とpdapAS9は同一変異を有することが判
明した。
*にコードされる3種の変異型DDPSのL−リジンに
よる阻害の解除の度合は様々ではあったが、3種ともL
−リジンによる阻害が解除されていた。酵素の比活性
は、菌体の生育状況や試料の調製に影響されるが、いず
れも野生型より若干の低下が見られた。しかし、育種素
材としては実質的に問題となる程ではないと判断した。
決定 DNAシークエンサー ABI Model 373A (Applied Biosyst
ems社製)を使用して、常法に従い、変異型dapA遺伝子
の塩基配列の決定を行った。その結果、配列番号3に示
す野生型dapA遺伝子の配列上で、pdapAS8及びpdapAS9
は、487番目のCがTに、pdapAS24は597番目のC
がTに変化していることが明かとなった。従って配列番
号4に示すDDPSのアミノ酸配列において、pdapAS8
及びpdapAS9のコードするDDPSは、81番目のアラ
ニン残基がバリン残基に、pdapAS24のコードするDDP
Sは、118番目のヒスチジン残基がチロシン残基に変
化していることが明かとなった。
れらの変異は阻害の解除が相加的に働くかどうかを検証
するために、2つの変異を同時に持つ変異型dapAを含有
するプラスミドを作成した。作成の手順は図3に示す通
りである。得られた二重変異プラスミドをpdapAS824と
命名した。
されており(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Pat
te,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986))、オープンリ
ーディングフレーム(ORF)は1347塩基対よりなり、449ア
ミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわか
っている。この遺伝子にはオペレーターが存在しL−リ
ジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領域を
除くために、SD配列とORFのみを含む領域を、PCR法
を用いて増幅し、クローニングすることにした。
斎藤、三浦の方法(Biochem.Biophys.Acta.,72,619(196
3))により調製し、配列番号5及び6に示す配列を有す
る2種のプライマーを作製し、これらを用いてエルリッ
チらの方法(PCR Technology, Stockton press (198
9))に従ってPCR反応を行い、lysC遺伝子の増幅を行
った。得られたDNAをBamHIとAseIで消化した後、平
滑末端にし、多コピーベクターpUC18のSmaI部位に挿入
した。このSmaI部位はベクター内に存在するlacZプロモ
ーターの下流側に位置しており、pUC18のSmaI部位にD
NA断片を挿入して得られる組換えDNAをE. coliに
導入すると、lacZプロモーター制御による読み越し(リ
ードスルー)転写により、挿入されたDNA断片が転写
される。pUC18のSmaI部位にPCR断片を挿入する際、p
UC18に含まれているlacZプロモーターによる転写方向に
対してlysCの転写の向きが逆方向となるように挿入され
たプラスミドとしてpLYSC1と、正方向となるように挿入
されたプラスミドとしてpLYSC2の2種のプラスミドを得
た(図4)。
欠損株であるE. coli GT3(thrA1016b,metLM1005,lysC1
004)を形質転換したところ、GT3のホモセリンおよびジ
アミノピメリン酸の要求性が相補されたので、両プラス
ミドに挿入されたDNA断片は、活性のあるAKIIIを
コードする遺伝子lysCを含有すると確認した。
入して得られる形質転換株をGT3/pLYSC1、pLYSC2をE. c
oli GT3に導入して得られる形質転換株をGT3/pLYSC2と
命名した。最少培地M9に著量のL−リジンを加え、GT
3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株をそれぞれ培養した。GT
3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株ともに野生型のlysCを含
有するプラスミドを保持し、同プラスミド上のlysCにコ
ードされるAKIIIが唯一のAKである。著量のL−リ
ジン存在下では唯一のAKである野生型AKIIIがL−
リジンにより阻害されるために、両株ともL−スレオニ
ン、L−イソロイシン、L−メチオニン、及びジアミノ
ピメリン酸(DAP)の合成ができなくなり生育が抑えられ
た。
得 L−リジンによる阻害の解除されたAKをコードするly
sC*を含有するプラスミド保持株は、著量のL−リジン
が添加された最少培地M9上での生育が可能になると予想
し、生育がL−リジンあるいはL−リジンのアナログで
あるAECに耐性となっている株を選択することによっ
て、lysC*を含有するプラスミド保持株を選択すること
にした。
で作製したpLYSC1およびpLYSC2上のlysCに変異処理を行
なうことにした。
株の選択条件の検討 GT3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株をそれぞれ種々の濃度
のL−リジンあるいはAECを含有するM9寒天平板培地
上で培養を行なった。そしてL−リジンあるいはAECに
よる生育阻止濃度を調べ、lysC*を含有するプラスミド
保持株の選択条件の検討を行なった。
M9培地での形質転換体の生育を表2に示す。尚、表中
の+は形質転換株が生育したことを示し、±はやや生育
したことを示し、−は生育しなかったことを示す
ーターによる転写の方向と一致している(図4)。よっ
てpLYSC2上のlysC遺伝子はlacZプロモーターで発現量が
増幅されているためlysCが野生型のままでもかなり高濃
度のL−リジン、AECに耐性であったが、pLYSC1上のlys
C遺伝子は転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向
であり、自身のプロモーターも欠失しているため発現量
が少なく、より低濃度のL−リジン、AECで生育が阻害
されることがわかった(GT3/pLYSC2株ではL−リジンに
ついては100mMの添加区まで、AECについては3mMの添加
区まで生育が抑えられなかったのに対し、GT3/pLYSC1株
ではL−リジン、AECとも0.2mMの添加区で生育が完全に
抑えられた)。なお、この生育阻害はホモセリン及びジ
アミノピメリン酸の同時添加により消去されることを確
認した。
い、最少培地M9にL−リジン10mM、もしくはAEC
0.2mMを添加したものを、lysC*を含有するプラスミド保
持株の選択に用いた。以下、実施例2においてこの培地
を選択培地という。
1のインビトロ変異処理 pLYSC1プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直
接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法
に加え、変異に多様性を与えるため、即ちヒドロキシル
アミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異を
期待して、プラスミドを保持した菌体をニトロソグアニ
ジン(NTG)で処理した後プラスミドを抽出するインビ
ボ変異処理法の2種の方法を用いた。
異処理)2μgのDNAを 0.4M ヒドロキシルアミン中
(0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0)100μl、1Mヒドロキシ
ルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水を加
えて計200μlとする)で、75℃の条件下で、1〜4時間
処理した。処理後のDNAをガラスパウダーで精製後、
AK完全欠損株E. coli GT3株に導入し、完全培地( L-
broth:1% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5
% NaCl, 1.5%寒天)に撒きコロニーを形成させた。こ
れを(2-2-1)で設定した選択培地にレプリカし、選択
培地上に生育可能な株を選択し候補株とした。形質転換
体の出現率と変異率は図5のような推移がみられた。4
時間処理では 0.5〜0.8%とかなり高率で変異株が得ら
れた。
をE. coli MC1061に導入し、菌体ごとNTG処理をおこ
なった。処理後の菌体を一夜培養して変異を固定した後
プラスミドを抽出し、E. coli GT3に導入した。すなわ
ち、形質転換株を2×TY培地(1.6% Bacto trypton, 1
% Yeastextract, 0.5% NaCl)で培養し、OD660が約
0.3になったところで集菌し、下記に示すTM緩衝液
(TM buffer)で洗浄した後、NTG液(0.2mg/mlの濃
度でNTGをTM bufferに溶解させて調製)に懸濁し、3
7℃で0〜90分処理した。菌体をTM buffer及び2×TY
培地で洗浄後、2×TY培地で一夜培養して変異を固定し
た後、菌体よりプラスミドDNAを抽出し、E. coli GT
3株に導入し、候補株のスクリーニングをインビトロ変
異と同様に行い、リジン耐性(LysR)、AEC耐性(AE
CR)の変異体を得た。
シルアミン処理48株、NTG処理132株)を再度選択培地に
スポットし、AEC及びL−リジン耐性を確認し153株を得
た。培地中のアミノ酸蓄積パターンの違いに注目して、
この153株を14群に分け各群の代表株を選んでAK活性
を測定することにした。なお、ヒドロキシルアミン処理
による変異株と、NTG処理による変異株との間ではAK
の活性に大きな差はなかったので、それぞれを区別する
ことなく以降の実験を行なった。
物の検討 上記14群の代表株として、No.24, No.43, No.48, No.6
0, No.80, No.117, No.126, No.149, No.150, No.156,
No.158, No.167, No.169, No.172を選び、おのおのから
pLYSC1に由来する変異型プラスミドを回収し、それぞれ
pLYSC1*24, pLYSC1*43, pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1
*80, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*15
0, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169,
pLYSC1*172と命名した。これらと野生型pLYSC1でAK
完全欠損株GT3を形質転換し、各形質転換株から無細胞
抽出液を調製し、AKIIIの酵素活性を測定した。
て調製した。形質転換株を2×TY培地で培養し、OD
660が約0.8になったところで集菌した。菌体を0℃の条
件下、0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.03Mβ−メルカプトエタ
ノールで洗浄し、超音波処理(0℃,100W,30秒×4)で菌
体を破砕した。菌体破砕液を0℃の条件下、33krpmで1
時間遠心し、上清をとりこれに80%飽和になるよう硫安
を添加し、遠心後ペレットを0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.0
3Mβ−メルカプトエタノールに溶解し、0℃で一夜保存
した。
らの方法にしたがった(Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBr
as,G.,and Robichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,23
6,2033(1961))。すなわち、下記組成の反応液を27℃で4
5分インキュベートし、FeCl3溶液(2.8N HCl 0.4ml + 1
2%TCA 0.4ml + 5%FeCl3・6H2O/0.1N HCl 0.7ml)を加
え発色させ、これを遠心後、上清の540nmでの吸光度を
測定した。活性は1分間に生成するヒドロキサム酸の量
で表示(1U=1μmol/min)した。モル吸光係数は600とし
た。尚、反応液からアスパラギン酸カリウムを除いたも
のをブランクとした。
M ATP(pH7.0) 5ml* 2; 8M ヒドロキシルアミン溶液を直前にKOHで中和した
もの
中に種々の濃度のL−リジンを加え、L−リジンによる
阻害の度合を調べた。結果を、図6及び表3に示した。
尚、野生型及びNo.24, 43, 48, 60, 80, 117, 126につ
いては図6Aに、No.149, 150, 156, 158, 167, 169, 1
72については図6Bに示した。
L−リジンによる阻害を非常に強く受け、L−リジン約
0.45mMで50%阻害され、5mMになるとほぼ100%阻害され
た。それに対し、今回得られた変異型AKIIIは、解除
の度合は様々ではあったが、14種ともL−リジンによる
阻害が解除されていた。特にNo.24、80、117、169、172
では、L−リジン100mMでも阻害はほとんどみられず、5
0%阻害濃度は野生型のそれと比較して200倍以上であっ
た。また総蛋白当りの比活性は、菌体の生育状況や試料
の調製に影響されるが、いずれもほとんどが野生型と同
等もしくはそれ以上のものであり、変異導入による活性
低下の問題はほとんどなかった(表3)。このことよ
り、AKIIIの活性中心とL−リジンによる調節部位が
それぞれ独立していることが予想された。尚、表3中、
阻害解除度(%)とは、反応液中L−リジン非存在下で
のAK活性に対するL−リジン 100 mM存在下でのAK
活性である。熱安定性(%)とは55℃で1.5時間処理後
の活性保持率である。
る酵素を改良し活性を上げようとする場合、創成される
酵素が細胞内で安定に保持されることが重要である。細
胞内外でのプロテアーゼの活動の違いや、酵素をインビ
トロ保存するための保存用バッファーの影響などもある
ため、インビトロの測定には問題もあるが、簡便のため
1つのパラメーターとして変異型AKIIIの熱安定性に
ついてインビトロで検討した。
た結果から、55℃、90分処理後の活性保持率を測定する
ことにした。表3に示すように、半数がむしろ野生型よ
りも優れていた。通常変異型酵素は野生型に比べ不安定
なものが多いが、今回得られた変異型AKIIIには安定
性が野生型を上回るものもあり、L−リジン生産の実用
面でかなり有力と思われるものが多かった。
塩基配列の決定 DNA シークエンサー ABI Model 373A( Applied Biosys
tems社製)を使用して、常法に従い、今回取得した野生
型lysC遺伝子の塩基配列の決定を行なった(配列番号
7)。その結果、既に発表されている E. coli K-12 JC
411株のlysCの配列(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,
and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986))と6ヶ
所(アミノ酸レベルでは2ヶ所)の相違があった。この
6ヶ所の相違は使用菌株の違いによるものであると考え
られる。
*それぞれについて塩基配列を決定し、変異点を明らか
にした。結果を表4に示す。表中、()内はヌクレオチ
ドの変異に基づくアミノ酸残基の変異を示す。14種のう
ち全く同一の変異型が2組(No.48とNo.167、及びNo.24
とNo.80)あったので、変異の種類は12種類であった。
尚、No.149,150,156,158,167,169,172はヒドロキシルア
ミン処理、No.24、43、48、60、80、117、126はNTG
処理によって得た変異型であるが、変異のパターンはい
ずれもシトシンからチミンへの変異、あるいは裏鎖のシ
トシンからチミンへの変異による表鎖のグアニンからア
デニンへの変異であった。
発酵生産 E. coliでL−リジンを生産させるためには、特開昭56-
18596号公報、及び米国特許第4,346,170公報及びApplie
d Microbiology and Biotechnology,15,p227-231(1982)
に示されるように、DDPSを増強する宿主としては、
アスパルトキナーゼがL−リジンによる阻害を受けなく
なっているように変化している事が必須であるとされて
いる。そのような株として、たとえばL−スレオニン生
産菌があげられる。E. coliスレオニン生産菌として
は、B-3996株が現在知られている内で最も高い生産能を
持っている。そこで、dapA*を評価するに当たり、B-399
6株を宿主に用いることとした。B-3996株は、染色体外
に唯一のプラスミドとしてpVIC40を保持する。詳
細は特表平3−501682号公報に記載されている。
当該微生物は、Reserch Institute for Genetics and I
ndustrial Microorganism Breedingに、登録番号RIA
1867のもとに寄託されている。
酵素の阻害解除度、比活性より判断して、pdapAS24に含
まれているdapA*(118番目のヒスチジン残基がチロ
シン残基に変異しているもの)を選択した。まず、dapA
*の発現量を増すためと、プラスミドの安定性を増すた
めに、pdapAS24上にあった変異型dapA*(以下、「dapA*
24」という)をpVIC40のテトラサイクリン耐性遺
伝子プロモーターの下流に連結し、図7に示す様にして
RSF24Pを得た。
株に導入したものは、AJ12395と命名され、19
93年10月28日に工業技術院生命工学工業技術研究
所に受託番号FERM P−13935として寄託さ
れ、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国
際寄託に移管され、FERM BP-4858の受託番号のもとで寄
託されている。pdapAS8およびpdapAS9を保持する株は寄
託しなかったが、各プラスミド上のdapA*の変異点は前
述の通りすべて明らかになっているので、上記寄託菌よ
りプラスミドをマニアティスらの方法(Sambrook,J.,Fr
itsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1.21(1989))により回収
し、サイト・ダイレクテッド・ミュータジェネシス法
(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular C
loning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,15.63
(1989))により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容
易である。B-3996株からpVIC40を常法に従い脱落
させて、プラスミドを有しない株としてB-399株を取得
した。RSF24Pプラスミドを常法にしたがいB-399
株に導入し、B-399/RSF24Pを得た。B-399/RSF24PのL−
リジン生産性について評価を行なった。
SFPを構築した。すなわち、図7に示すpVIC40
のBamHIおよびDraIによる二重消化物より大断片を選択
し、これをDNAポリメラーゼクレノー・フラグメント
によって平滑末端化処理した。平滑末端化処理した大断
片を自己連結させてプラスミドRSFPを得た。B-399
株にRSFPを常法に従い導入し、B-399/RSFPを得た。
B-399/RSFPについてもL−リジン生産性の評価を行っ
た。
間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116rpmで行った。結
果を表5に示す。
て溶解し、抗生物質(ストレフ゜トマイシン 100μg/ml,カナマイシン 5
μg/ml)を加える。
リジンの発酵生産(I)実施例3で変異型DDPSのL−
リジン生産に対する効果が示されたが、これをさらに改
良するために、実施例2で得られた変異型AKIII遺伝
子を変異型DDPS遺伝子と共存させる事とした。変異
型DDPS遺伝子と共存させる変異型AKIII遺伝子と
しては、酵素活性、熱安定性等からNo.80株由来の
もの(lysC*80)を選択した。
YSC1*80上にあったlysC*(以下、「lysC*80」という)
をpUC18に対して逆位の挿入部位を有するベクターpHSG3
99(宝酒造社製)のlacZプロモーターの下流につなぎか
えることにより作成されたプラスミドpLLC*80(図8)
から切り出したものを使用した。pLLC*80は、pLYSC1*80
上のlysC*80が、転写方向がlacZプロモーターに対して
逆方向に配置されているので、L−リジンの生産性を向
上させるために、lacZプロモーターに対して転写方向が
正方向となるようにlysC*80を配置させるために作成さ
れたプラスミドである。
4Pから、dapA*及びlysC*を有するプラスミドRSFD
80を図9の様にして作製した。RSFD80は、テト
ラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター(tetP)の下流
に、tetPに対して転写方向が正方向となるようにdapA*2
4及びlysC*80がこの順序で配置されている。
株に導入したものを、AJ12396と命名した。AJ
12396は、1993年10月28日に工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号FERM P−139
36として寄託され、1994年11月1日にブダペス
ト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受
託番号のもとで寄託されている。pLYSC1*24, LYSC1*43,
pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLY
SC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC
1*167, pLYSC1*169, pLYSC1*172を保持する株は寄託し
なかったが、各プラスミド上のlysC*の変異点は前記の
通りすべて明らかになっているので、上記寄託菌よりプ
ラスミドをマニアティスらの方法(Sambrook,J.,Fritsc
h,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory Press,1.21(1989))により回収し、
サイト・ダイレクテッド・ミュータジェネシス法(Samb
rook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Clonin
g, Cold Spring Harbor Laboratory Press,15.63(198
9))により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容易で
ある。RSFD80を常法にしたがいBー399株に導入
し、B-399/RSFD80を得た。B-399/RSFD80のL−リジン生
産性について評価を行なった。コントロールとして、B-
399/RSFPについてもL−リジン生産性の評価を行った。
培地を用い、培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌
114〜116rpmで行った。結果を表6に示す。
゛ンの発酵生産(II)エシェリヒア属細菌に変異型dapA遺
伝子と、変異型lysC遺伝子を保持させて、L−リジンの
生産性が改善できることが実施例4で確認された。この
効果が、宿主を変更した場合にも維持されるかどうかを
実験した。宿主には、E. coli W3110(tyrA)株を用い
た。W3110(tyrA)株は欧州特許公開92年488424
号公報に詳しい記載があるが、その調製方法について簡
単にふれると以下の通りである。国立遺伝学研究所(静
岡県三島市)よりE. coli W3110株を入手した。同株を
ストレプトマイシン含有のLBプレートにまき、コロニ
ーを形成する株を選択してストレプトマイシン耐性株を
取得した。選択したストレプトマイシン耐性株と、E. c
oli K-12 ME8424株を混合して、完全培地(L-Broth:1
% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaC
l)で37℃の条件下、15分間静置培養して接合を誘
導した。E. coli K-12 ME8424株は、(HfrPO45,thi, re
lA1, tyrA::Tn10, ung-1, nadB)の遺伝形質を有し、国
立遺伝学研究所より入手できる。
テトラサイクリンおよびL−チロシンを含有する完全培
地(L-Broth:1% Bacto trypton, 0.5% Yeast extrac
t, 0.5% NaCl, 1.5%寒天)にまき、コロニーを形成す
る株を選択した。この株を、E. coli W3110(tyrA)株と
命名した。
4号公報には、W3110(tyrA)株にプラスミドを導入して
形成される株が多く記載されている。例えば、プラスミ
ドpHATermを導入して得られる株は、E. coli W3110(tyr
A)/pHATerm株と命名され、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されており、登録番号FERMBP−36
53が付与されている。このE. coli W3110(tyrA)/pHAT
erm株からプラスミドpHATermを脱落させることによって
もW3110(tyrA)株を取得することができる。プラスミド
の脱落は常法によって行うことができる。
に、実施例4で得られたdapA*とlysC *をともに含有する
プラスミドRSFD80を導入し、W3110(tyrA)/RSFD80
を得た。W3110(tyrA)/RSFD80のL−リジン生産性につい
て評価を行なった。コントロールとして、W3110(tyrA)
株にRSFPを常法に従い導入し、W3110(tyrA)/RSFPを
得た。W3110(tyrA)/RSFPについてもL−リジン生産性の
評価を行った。培養は、前記L−リジン生産培地を用
い、培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116
rpmで行った。結果を表7に示す。
びL−リジン産生エシェリヒア属細菌のL−リジン生産
性の向上 E. coliのL−リジン生合成系の律速段階を解析し、そ
の段階を触媒する酵素の遺伝子を増強することによっ
て、L−リジン生産性の向上を試みた。
し、それらの遺伝子をE.coliに導入し、それぞれの遺伝
子のL−リジン生産能に対する効果を調べることによっ
て行った。導入したL−リジン生合成系酵素遺伝子とそ
れらがコードする酵素は次のとおりである。
ゼ dapA :ジヒドロジピコリン酸シンターゼ dapA*24:阻害解除型ジヒドロジピコリン酸シンターゼ dapB :ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ DDH :ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ブレビ
バクテリウム ラクトファーメンタム由来) lysA :ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
からL−リジンに至るL−リジン生合成系が網羅でき
る。尚、本来E. coliが保持するL−リジン生合成系遺
伝子のうち、dapC、dapD、dapE及びdapF遺伝子は、これ
らの遺伝子産物が関与する反応を単独で触媒し得るブレ
ビバクテリウム ラクトファーメンタム(Brevibacteri
um lactofermentum)の DDH(ジアミノピメリン酸デヒ
ドロゲナーゼ)をコードする遺伝子DDHで代替すること
にした。また、これらの遺伝子を導入する宿主として
は、E. coli K-12系の W3110(tyrA)株を用いた。
2及びpdapAS24(実施例1参照)からEcoRI及びKpnIで切
り出すことによって得た(図10)。これらの遺伝子をEc
oRI及びKpnIで消化したpMW118と連結してpdapA及びpdap
A*を得た。また、lysC及びlysC*80遺伝子は、それぞれp
LYSC1及びpLLC*80(実施例2参照)からEcoRI及びSphI
で切り出すことによって得た。これらの遺伝子をEcoRI
及びSphIで消化したpMW119と連結してplysC及びplysC*
を得た(図11)。
ミドpT2から得た。pT2をSmaIとScaIで切断し、末端を平
滑化した後、pMW118のSmaI部位に挿入し、プラスミドpp
pcを得た(図12)。pT2を保持するE. coli F15株(AJ12
873)は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所にFERM BP-4732の受託番号のもとに寄託されている。
ミドpLF4(Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res.,
10, 6957 (1982))から得た(図13)。pLF4をPvuIIとS
tuIで切断し、末端を平滑化した後、pMW119のSmaI部位
に挿入し、プラスミドpaspCを得た。
ミドpAD20(Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379 (198
2))から得た。pAD20をAseIとClaIで切断し、末端を平
滑化した後、pMW118のSmaI部位に挿入し、プラスミドpa
sdを得た(図14)。
オチド配列(Bouvier, J. et al.,J. Biol. Chem., 25
9, 14829 (1984))をもとに作成した2種のオリゴヌク
レオチドプライマー(配列番号9、10)を用いたPCR
法により、E. coli W3110株染色体DNAからdapB遺伝
子を増幅することによって得た(図15)。得られた増幅
DNA断片をAseIとDraIで切断し、末端を平滑化した
後、pMW119のSmaI部位に挿入し、プラスミドpdapBを得
た。
タミカム(Corynebacterium glutamicum)のDDH遺伝子
の既知のヌクレオチド配列(Ishino, S. et al., Nucle
ic Acids Res., 15, 3917 (1987))をもとに作成した2
種のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号11、12)
を用いたPCR法により、ブレビバクテリウム ラクト
ファーメンタム ATCC13869の染色体DNAからDDH遺伝
子を増幅することによって得た。得られた増幅DNA断
片をEcoT22IとAvaIで切断し、末端を平滑化した後、pMW
119のSmaI部位に挿入し、プラスミドpDDHを得た(図1
6)。
オチド配列(Stragier, P. et al.,J. Mol. Biol., 16
8, 321 (1983))をもとに作成した2種のオリゴヌクレ
オチドプライマー(配列番号13、14)を用いたPCR法
により、E. coli W3110株染色体DNAからlysA遺伝子
を増幅することによって得た。得られた増幅DNA断片
をSplIとBclIで切断し、末端を平滑化した後、pMW118の
SmaI部位に挿入し、プラスミドplysAを得た(図17)。
確認は、図中に示された制限酵素で切断することにより
行った。また、これらの遺伝子のクローニングに用いた
ベクターpMW118及びpMW119(ニッポンジーン製)は、後
述するリジン生産用プラスミドの作製に使用したベクタ
ーであるRSF1010とE. coli細胞中で共存でき、安定分配
機構も持つため、選択した。
したE. coliのL−リジン生産性 E. coli W3110(tyrA)を上記のL−リジン生合成系遺伝
子を含む各プラスミドで形質転換し、得られた形質転換
体を培養してL−リジン生産を行った。培養は以下の培
地を用い、培養温度37℃、撹拌114〜116rpmの条件下で3
0時間行った。結果を表8に示す。
(グルコース、MgSO4・7H2Oは別殺) 局方CaCO3 25g/l(180℃で2日間乾熱滅菌) 抗生物質(導入するプラスミドの種類に応じストレプト
マイシン20mg/l、またはアンピシリン50mg/l)
るいはpdapA*の導入でL−リジンを生産するようになっ
た。lysC産物、dapA産物ともにL−リジンによるフィー
ドバック阻害を受けることから、これらの酵素がL−リ
ジン生合成における主要な調節点であることは予想でき
ることである。dapA産物が触媒する反応は、L−スレオ
ニン、L−メチオニン及びL−イソロイシンの合成系と
L−リジン合成系との枝分かれの位置に存在し、L−リ
ジン固有の合成系の最初の段階である。野生型dapAの増
幅によってもE. coliがL−リジンを生産するようにな
ることは既に報告されており(Eur. J. Appl. Microbio
l. Biotechnol., 15, 227 (1982))、それは上記の結果
からも確認された。一方、E. coliに阻害解除型遺伝子
であるdapA*を導入すると、さらにL−リジン収率が増
すという実施例3の結果が再確認された。
0(tyrA)/pdapA*から実施例1と同様にして粗酵素液を調
製し、DDPS(ジヒドロジピコリン酸シンターゼ)活性を
測定し、さらにDDPS活性のL−リジンによる阻害の度合
いを調べた。結果を表9に示す。
比べて比活性は低いが(約1/2)、阻害解除度が高いため
に、L−リジン生産に与える効果が大きいものと思わ
れ、L−リジン生産にとってdapA産物が阻害解除される
ことの必要性が示された。
ことについては以下のように考えることができる。第1
の律速段階は、生合成系の枝分かれの点となる基質であ
るASA(アスパラギン酸-β-セミアルデヒド)を HD(ホ
モセリンデヒドロゲナーゼ:thrA又はmetLMの産物)とD
DPS(dapA産物)が取り合う段階であり、上記のようにd
apAを増強すると反応はL−リジン生合成の方向に流れ
る。一方、dapAよりさらに上流の反応に関与するlysCを
増強することによって ASAの供給量を増した場合も、HD
と DDPS が関与するいずれの反応も増進するため、L−
リジンの生産量も増加したものと考えられる。ただし、
野生型のlysCのみの増強ではこの効果はほとんど得られ
ない。その理由は、野生型AKIII(lysC産物)のL−リジ
ンによる阻害が、野生型DDPSのそれに比べて厳格である
ためであろう(L−リジン5mMの存在により、AKIIIはほ
ぼ100%、DDPSは80%阻害される)。
り高いDDPSによる反応が第1律速段階であると判断し、
さらにAKIIIによる反応が第2律速段階であると推定し
た。
各種遺伝子を増強し、第2律速段階の特定を行った。da
pA*を含むプラスミドを保持するE. coliに、他のプラス
ミドを導入したときに、これらのプラスミドが安定に保
持されるように、dapA*をpdapAからRSF1010に移し、RSF
24Pを得た(図7)。このdapA*を有するプラスミドRSF2
4PでE. coli W3110(tyrA)を形質転換した。
ン生合成系遺伝子を有するプラスミドを導入した。得ら
れた各形質転換体は、RSF24P及び他のL−リジン生合成
系遺伝子を含むプラスミドの2種類のプラスミドが共存
している。これらの株を、(6-1-2)と同様にしてL−リ
ジン生産性を調べた。結果を表10に示す。
生産性増強効果がみられた。野生型のlysCでは全く効果
がなく、その理由は先に述べたようにL−リジンによる
阻害が強いためと思われる。これによりlysC*が関与す
る反応が第2律速段階となることが確認された。
(図9)。同様に、lysCをRSF24Pに組み込み、得られた
プラスミドをRSFD1と命名した。これらのプラスミドを
E. coli W3110(tyrA)に導入し、(6-1-2)と同様に粗酵素
液を調製してAK活性及びAK活性のL−リジンによる阻害
の度合いを調べた。結果を表11に示す。
り、このプラスミドを保持する株のAKの比活性は20〜30
倍に増加した。E. coli には AK は3種類あり、lysCは
そのうちAKIIIをコードしているが、上記の実験では3
種のAKの合計の活性を測定している。野生型lysCを組み
込んだRSFD1を保持する株では、コントロール(W3110(t
yrA)/RSF24P)に比べて、AKI、AKIIに対してAKIIIが占
める割合が高いためにL−リジンによる阻害も高くな
り、結果としてL−リジン生産能増強には効果を示さな
かったと考えられる。一方、RSFD80を保持する株では、
AKIIIのほぼ100%が阻害が解除されており、これがL−
リジン生産の向上に寄与していることがわかった。
合成系プラスミドを導入し、L−リジン生産培養を行っ
た。培養結果を表12に示す。
られ、dapBが関与する反応が第3律速段階であることが
わかった。そこで、dapBをRSFD80に組み込み、pCAB1を
得た(図18)。このプラスミドをE. coli W3110(tyrA)
に導入し、粗酵素液を調製して、Tamir,H. and Gilvar
g,C., J.Biol.Chem.,249,3034 (1974)に記載の方法に
従って、DDPR(ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ)の
酵素活性を測定した。同様にして、RSFD80のみを保持す
る株とRSFD80とpdapBを共に保持する株から粗酵素液を
調製し、DDPR活性を測定した。結果を表13に示す。
持する株)に比べて、RSFD80及びpdapBを保持する株で
約3倍、RSFD80にdapBを組み込みこんだpCAB1を保持す
る株では6.5倍に増加した。L−リジンの蓄積は、W3110
(tyrA)/RSFD80+pdapB、W3110(tyrA)/pCAB1とも同等の1
0.8g/lであったことから、dapBはL−リジン生産には十
分量であり、律速段階は次の段階に移ったと判断した。
を用いて、第4の律速段階の特定を行った。E. coli W3
110(tyrA)/pCAB1に各種リジン生合成系プラスミドを導
入し、L−リジン生産培養を行った。培養結果を表14に
示す。
られ、DDHが触媒する反応が第4の律速段階となること
がわかった。また、DDH非導入株の培養ブロス中に検出
されたSDAP(N-スクシニル-L,L-α,ε-ジアミノピメリ
ン酸)が、DDH導入株の培養ブロスには検出されなかっ
た。尚、SDAPの検出はTLC展開によって行った(展開溶
媒組成 メタノール:水:10N HCl:ピリジン=80:17.5:
2.5:10)(Bouvier, J., Richaud, C., Higgins, W., Bo
gler, O. and Stragier, P. J., Bacteriol., 174,5265
(1992))。さらに、ブロスの色もDDH非導入株では茶色
であったのが、DDH導入株では黄色に変化した。そこ
で、DDHをpCAB1に組み込んだプラスミドpCABD2を作製し
(図19)、このプラスミドで形質転換したE. coli W311
0(tyrA)のDDH活性を測定した。DDH酵素活性の測定は、
文献(味園春雄 発酵と工業 45,964(1987))に従って
行った。結果を表15に示す。
コントロール(W3110(tyrA)/pCAB1)ではDDH活性は検出
されなかった。pCABD2保持株(W3110(tyrA)/pCABD2)の
DDHの比活性はpDDH保持株(W3110(tyrA)/pCAB1+pDDH)
の約2.5倍であるが、両株ともL−リジンの蓄積量は同
等(12.23g/l)であったので、pCABD2のDDH発現量は十
分量であると判断した。
段階の解析 次に、上記解析においてDDHで代替されたdapC、dapD、d
apE及びdapFの律速順位を調べるため、まずこれらの遺
伝子のクローニングを行った。dapCについては塩基配列
についての報告がないためクローン化は行わなかった
が、残り3種の遺伝子についてはPCR法にてクローニン
グを行った。
オチド配列(Richaud, C. et al.,J. Biol. Chem., 25
9, 14824 (1984))をもとに作成した2種のオリゴヌク
レオチドプライマー(配列番号15、16)を用いたPCR
法により、E. coli W3110株染色体DNAからdapD遺伝
子を増幅することによって得た。得られた増幅DNA断
片をEcoO109IとSacIで切断し、末端を平滑化した後、pM
W118のSmaI部位に挿入し、プラスミドpdapDを得た(図2
0)。
オチド配列(Bouvier, J. et al.,J. Bacteriol., 174,
5265 (1992))をもとに作成した2種のオリゴヌクレオ
チドプライマー(配列番号17、18)を用いたPCR法に
より、E. coli W3110株染色体DNAからdapE遺伝子を
増幅することによって得た。得られた増幅DNA断片を
MunIとBglIIで切断し、末端を平滑化した後、pMW118のS
maI部位に挿入し、プラスミドpdapEを得た(図21)。
オチド配列(Richaud, C. et al.,Nucleic Acids Res.,
16, 10367 (1988))をもとに作成した2種のオリゴヌ
クレオチドプライマー(配列番号19、20)を用いたPC
R法により、E. coli W3110株染色体DNAからdapF遺
伝子を増幅することによって得た。得られた増幅DNA
断片をPstIで切断し、末端を平滑化した後、pMW118のSm
aI部位に挿入し、プラスミドpdapFを得た(図22)。
を、W3110(tyrA)/pCAB1に導入し、L−リジン生産培養
を行った。先の実験で、DDHの導入前と後ではL−リジ
ン生産量の他、ブロスの色、中間体(SDAP)の蓄積の有
無についても変化がみられたため、これらも指標とし
て、律速段階の解析を行った。結果を表16に示す。
の増強によって若干増加したが、DDHには及ばなかっ
た。また、DDHの導入により観察されたブロスの色の変
化と中間体であるSDAPの蓄積は各々独立の現象であり、
ブロスの色の変化はdapD、SDAPの消失はdapEに起因する
ものであることがわかった。dapEとSDAPの関係について
はL−リジン合成経路からみても予想のつくものであ
る。dapFの増強は、L−リジン生産性向上には効果がみ
られなかった。
てdapE及びdapDを共に有するプラスミドpMWdapDE1を作
製した(図23)。さらに、pMWdapDE1からdapE及びdapD
を含む断片を切り出し、これをpCAB1に挿入してpCABDE1
を作製した(図24)。pCAB1、pCABDE1あるいはpCABD2を
保持する株、及びpCABDE1とpdapFを共に保持する株を作
製し、これらの株によりL−リジン生産培養を行った。
結果を表17に示す。
より、L−リジン生産量、ブロスの色、SDAPの蓄積の有
無ともDDHの導入と同等になることがわかった。また、
さらにdapFを増強してもL−リジン生産性向上には効果
はなく、dapFが関与する反応は律速にはなっていないこ
とがわかった。以上の結果は、以下のように解釈でき
る。
スクシニル-ε-ケト-L-α-アミノピメリン酸)とSDAPの
2段階で蓄積している。これらの中間体のうちSDAPにつ
いては菌体外のブロス中に検出された。SKAPは検出され
なかったが、おそらく菌体内に蓄積していたものと考え
られる。そう考えられる理由はブロスの色である。L−
リジンを生産しない野生株(W3110(tyrA))などではブ
ロスの色は黄色であるが、生育に負担がかかると、溶菌
などによりブロスが茶色になると考えられる。SDAPは菌
体外に排出されているため生育に対する負担は小さく、
したがって、dapDのみの増強によりSKAPが代謝されると
SDAPの蓄積量が増加するがブロスは黄色に改善したもの
と思われる。但し、dapDを増強しても、より下流のdapE
による律速が解除されないと、L−リジンの蓄積量は増
加しない。
*の導入、lysC*の導入、dapBの増強、DDH、ある
いはdapD及びdapEの増強、を行うことによって、段階的
にL−リジン生産性が向上することがわかった。また、
段階的にL−リジン生産性が向上したE. coliが得られ
た。
合成系の律速段階の解析 上記で得られた結論が、E.coli K-12系列以外の株にお
いても適用できるかを調べるために、E. coli C株(IFO1
3891)のL−リジン生合成系の律速段階の解析を上記と
同様にして行った。尚、培養条件はW3110(tyrA)と同様
にして行ったが、培地にはL-チロシンを添加しなかっ
た。
したE. coli C株(IFO13891)をL−リジン生産培地で培
養し、L−リジン塩酸塩の生産量を測定した。結果を表
18に示す。
も野生型dapA、さらに阻害解除型dapA*の導入により、
L−リジンを培地中に蓄積するようになった。lysC
*は、L−リジン生産性に効果がなかった。
さらにL−リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドを導
入し、得られた形質転換体をL−リジン生産培地で培養
し、L−リジン塩酸塩の生産量を測定した。結果を表19
に示す。
性向上に効果があるのはlysC*であり、lysC*が関与する
反応が第2律速段階であることがわかった。
を導入し、さらにL−リジン生合成系遺伝子を含むプラ
スミドを導入し、得られた形質転換体をL−リジン生産
培地で培養し、L−リジン塩酸塩の生産量を測定した。
結果を表20に示す。
産性向上に効果があり、第3律速段階であることがわか
った。
CAB1を導入し、さらにL−リジン生合成系遺伝子を含む
プラスミドを導入し、得られた形質転換体をL−リジン
生産培地で培養し、L−リジン塩酸塩の生産量を測定し
た。結果を表21に示す。
性向上に効果があり、第4律速段階であることがわかっ
た。
段階の解析 pCAB1を保持するE. coli C株に、DDHの代わりにdapD、d
apEあるいはdapF遺伝子を有するプラスミドを導入し、
L−リジン生産培養を行った。結果を表22に示す。
pEの2段階が律速となっていることがわかった。
も同様の律速順位であったことから、dapA*、lysC*の導
入、dapB、DDH(又はdapD及びdapE)の増強をこの順に
行うことによって、L−リジン生産性を段階的に向上さ
せることができるという概念は、E. coli全般に適用で
きるものと思われる。
ドバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由
来のDDPS変異遺伝子が得られた。この遺伝子を、L
−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパ
ルトキナーゼを保持するエシェリヒア属細菌に導入する
ことにより、従来よりもさらに改良されたL−リジン生
産菌を得ることができた。
H(又はdapD及びdapE)をこの順に増強することによ
り、L−リジン生産性を段階的に向上させることができ
る。
阻害を示す図である。
pAS824の製造工程を示す図である。
率と変異率を示す図である。
阻害を示す図である。
4Pの製造工程を示す図である。
である。
ラスミドRSFD80の製造工程を示す図である。
pdapA*の構造を示す図である。
びplysC*の構造を示す図である。
である。
図である。
である。
図である。
である。
図である。
由来のプラスミドpCAB1の製造工程を示す図である。
1010由来のプラスミドpCABD2の製造工程を示す図であ
る。
図である。
図である。
図である。
の製造工程を示す図である。
するプラスミドpCABDE1の製造工程を示す図である。
Claims (10)
- 【請求項1】 L−リジンによるフィードバック阻害が
解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のジヒ
ドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAが細胞内
に導入されて形質転換され、かつL−リジンによるフィ
ードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持
することを特徴とするエシェリヒア属細菌。 - 【請求項2】 L−リジンによるフィードバック阻害が
解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のアス
パルトキナーゼIIIをコードするDNAが細胞内に導入
されたことにより、L−リジンによるフィードバック阻
害が解除されたアスパルトキナーゼを保持することを特
徴とする請求項1記載のエシェリヒア属細菌。 - 【請求項3】 アスパルトキナーゼIIIのL−リジンに
よるフィードバック阻害が解除される変異が、配列表の
配列番号8に記載されるアスパルトキナーゼIIIのアミ
ノ酸配列中、N−末端から323番目のグリシン残基を
アスパラギン酸残基に置換させる変異、323番目のグ
リシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ408
番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる
変異、34番目のアルギニン残基をシステイン残基に置
換させかつ323番目のグリシン残基をアスパラギン酸
残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基をフ
ェニルアラニン残基に置換させる変異、318番目のメ
チオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、3
18番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換さ
せかつ349番目のバリン残基をメチオニン残基に置換
させる変異、345番目のセリン残基をロイシン残基に
置換させる変異、347番目のバリン残基をメチオニン
残基に置換させる変異、352番目のスレオニン残基を
イソロイシン残基に置換させる変異、352番目のスレ
オニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ369番
目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変
異、164番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換
させる変異、417番目のメチオニン残基をイソロイシ
ン残基に置換させかつ419番目のシステイン残基をチ
ロシン残基に置換させる変異、よりなる群から選ばれる
ことを特徴とする請求項2記載のエシェリヒア属細菌。 - 【請求項4】 ジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細
胞あたりの活性が上昇した請求項1〜3のいずれか一項
に記載のエシェリヒア属細菌。 - 【請求項5】 ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝
子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクタ
ーに連結されてなる組換えDNAで形質転換された請求
項4記載のエシェリヒア属細菌。 - 【請求項6】 ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの
細胞あたりの活性が上昇するようにジアミノピメリン酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された請求項4または5
記載のエシェリヒア属細菌。 - 【請求項7】 ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベク
ターに連結されてなる組換えDNAで形質転換された請
求項6記載のエシェリヒア属細菌。 - 【請求項8】 テトラヒドロジピコリン酸スクシニラー
ゼ及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの細
胞あたりの活性が上昇した請求項4または5記載のエシ
ェリヒア属細菌。 - 【請求項9】 テトラヒドロジピコリン酸スクシニラー
ゼ遺伝子及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラー
ゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能な
同一又は異なるベクターに連結されてなる単一の組換え
DNA、又は2つの組換えDNAで形質転換された請求
項8記載のエシェリヒア属細菌。 - 【請求項10】 請求項1〜9のいずれか一項に記載の
エシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物中
にL−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からL−リジ
ンを採取することを特徴とするL−リジンの製造法。
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