SK284047B6 - Baktérie rodu Serratia obsahujúce dihydrodipikolinát syntázu desenzibilizovanú na spätnú inhibíciu L-lyzínom a ich použitie na produkciu L-lyzínu - Google Patents

Abstract

Baktérie rodu Serratia, ktoré sú transformované zavedením DNA kódujúcej dihydrodipikolinát syntázu pochádzajúcu z baktérií rodu Escherichia nesúcu mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom, a DNA kódujúcej aspartokinázu pochádzajúcu z baktérií rodu Escherichia alebo Serratia s mutáciou na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom, sa kultivujú vo vhodnom médiu, L-lyzín je produkovaný a akumulovaný v produkčnom médiu odkiaľ sa izoluje.ŕ

Description

Oblasť techniky

Tento vynález spadá do oblasti mikrobiologického priemyslu a týka sa najmä spôsobu prípravy L-lyzínu fermentáciou, DNA a mikroorganizmov použitých na tento spôsob prípravy.

Doterajší stav techniky

V princípe ak je L-lyzín pripravovaný kvasným spôsobom, na zvýšenie produktivity sa použije mikrobiálny kmeň izolovaný z prirodzeného prostredia alebo umelý mutantný kmeň získaný z takého mikrobiálneho kmeňa. Je známe veľké množstvo umelých mutantných kmeňov produkujúcich L-lyzín. Väčšinou ide o mutantné kmene rezistentné proti S-2-aminoetylcysteínu (AEC) a patria k rodom Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia alebo Serratia. Okrem toho sú známe rôzne spôsoby na zvýšenie produkcie aminokyselín, napríklad s použitím transformantu a rekombinantnej DNA (US 4278765).

Napríklad baktérie rodu Serratia sa bežne používajú ako baktérie produkujúce rôzne aminokyseliny, napríklad L-prolín, L—histidín, L-arginín, L-treonín, L-valín a L-izoleucín a majú vynikajúce vlastnosti ako baktérie produkujúce aminokyseliny v rôznych aspektoch, ako je to opísané v „Oyo Bunshi Idengaku (Aplikovaná molekulová genetika)“ vydanej vydavateľstvom Kodansha Scientific, 1986, ISBN4-06-139659-5) a v „Aminosan Hakko (Fermentácia aminokyselín)“ vydanej vydavateľstvom Gakkai Shuppan Center, 1986, ISBN4-7622-9454-3). Produkcia rôznych aminokyselín pomocou baktérií rodu Serratia bola už publikovaná. Podľa jednej publikácie (Japanese Patent Publication No. 51-9393, 1976), kde sa uvádza, že rod Serratia sa stal produktívny pre L-lyzín, sa výťažok (hodnota udávaná vydelením koncentrácie produkovaného L-lyzínu ako HCI soli počiatočnou koncentráciou uhlíkového zdroja) vypočítal na 5,4 %.

Druh Serratia marcescens, ktorý je zástupcom kmeňa baktérii rodu Serratia, je svojou génovou štruktúrou a mechanizmom expresie a regulácie génov podobný baktériám rodu Escherichia, a klonovací vektor použiteľný na rekombinovanie DNA v baktériách rodu Escherichia sa môže použiť aj pre baktérie rodu Serratia (prihlášky japonských patentov číslo 2-27980 (1990) a 5-10076 (1993)).

Mimochodom, dihydrodipikolinát syntáza (DDPS) je enzým na dehydratáciu a kondenzáciu aspartosemialdehydu a kyseliny pyrohroznovej, aby sa syntetizovala kyselina dihydrodipikolinová. Táto reakcia sa nachádza na vstupe do vetvy vedúcej k systému biosyntézy L-lyzínu v biosyntéze aminokyselín zo skupiny kyseliny asparágovej. Je známe, že tento enzým riadi dôležité regulačné miesto biosyntézy L-lyzínu, ako je aspartokináza v baktériách rodu Escherichia.

DDPS je kódovaná génom dapA v E. coli (Escherichia coli). Gén dapA bol klonovaný a bola stanovená aj jeho bázová sekvencia (Richaud, F. a spol., J. Bacteriol., 297, 1986).

Na druhej strane, aspartokináza (ďalej tu niekedy skracovaná ako „AK“) je enzým na katalyzovanie reakcie, v ktorej sa kyselina asparágová prekonvertuje na kyselinu β-fosfoasparágovú, ktorá slúži ako hlavný regulačný enzým v systéme biosyntézy aminokyselín skupiny kyseliny asparágovej. AK baktérií E. coli má tri typy (AKI, AKII, AKIII), z ktorých dva sú komplexné enzýmy s homoseríndehydrogenázou (ďalej tu niekedy skracovaná ako „HD“). Jedným z týchto komplexných enzýmov je AKI-HDI kó dovaný génom thrA, a druhým je AKII-HDII kódovaný génom metLM. AKI podlieha spoločnej supresii treonínom a izoleucínom aje inhibovaný treonínom, kým AKII je suprimovaný metionínom.

Naopak, je známe, že jedine AKIII je jednoduchý funkčný enzým, ktorý je produktom génu označovaného lysC, a podlieha supresii a spätnej inhibicii L-lyzínom. Pomer ich vnútrobunkových aktivít je AKI : AKII : AKIII približne 5:1:4.

DDPS a AKIII podliehajú spätnej inhibicii L-lyzínom ako to bolo opísané, ktorá bráni efektívnej produkcii L-lyzínu. Očakáva sa, že L-lyzín možno účinne produkovať fermentáciou pomocou baktérie rodu Serratia, ak sa dá získať mutantný enzým DDPS alebo AKIII, ktorý nepodlieha spätnej inhibicii. Ale v doterajšej literatúre nie sú údaje o takomto mutantnom enzýme DDPS, a hoci existuje údaj o mutantnom enzýme AKIII (Boy, E. a spol., J. Bacteriol., 112, 84, 1972), nie je známy príklad, ktorý by naznačoval, že takýto mutantný enzým môže zvýšiť produktivitu L-lyzínu. Okrem toho nie sú známe ani príklady ohľadne génov systému biosyntézy L-lyzínu pri baktériách rodu Serratia.

Podstata vynálezu

Výsledkom usilovného a opakovaného výskumu bolo to, že súčasní vynálezcovia úspešne získali DNA kódujúcu DDPS pochádzajúcu z baktérii rodu Escherichia, v ktorej je spätná inhibícia L-lyzínom je dostatočne desenzibilizovaná. DNA kódujúca DDPS pochádzajúcu z E. coli, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom je dostatočne desenzibilizovaná, je tu niekedy nazývaná ako mutantná dapA alebo dapA *.

Vynálezcovia ďalej vytvorili baktérie rodu Serratia obsahujúce aspartokinázu, v ktorej je spätná inhibícia L-lyzínom desenzibilizovaná, a s DDPS, v ktorej je spätná inhibícia L-lyzínom dostatočne desenzibilizovaná. DNA kódujúca aspartokinázu pochádzajúcu z E. coli, v ktorej je spätná inhibícia L-lyzínom, je dostatočne desenzibilizovaná, je tu niekedy nazývaná ako mutantná lysC alebo lysC*.

Vynálezcovia ďalej vytvorili baktérie rodu Serratia obsahujúce mutantný dapA a mutantný lysC. A zistilo sa, že v kultúre sa dá produkovať a akumulovať značné množstvo L-lyzínu kultiváciou uvedených baktérií rodu Serratia vo vhodnom médiu.

Čiže súčasný vynález poskytuje baktérie rodu Serratia transformované tak, že sa do ich buniek zavedie DNA kódujúca dihydrodipikolinát syntázu s mutáciou na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom. Ako príklad dihydrodipikolinát syntázy sa uvádza dihydrodipikolinát syntáza pochádzajúca z baktérii rodu Escherichia. Vzhľadom na dihydrodipikolinát syntázu pochádzajúcu z baktérií rodu Escherichia, ako príklad mutácie na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom sa uvádza mutácia na nahradenie 81. alanínového zvyšku zvyškom valínu, mutácia na nahradenie 118. histidínového zvyšku zvyškom tyrozínu, a mutácia na nahradenie 81. alanínového zvyšku zvyškom valínu a na nahradenie 118. histidínového zvyšku zvyškom tyrozínu, počítajúc od N-konca aminokyselinovej sekvencie dihydrodipikolinát syntázy definovanej v sekv. č. 4 ako je to uvedené v zozname sekvencii. Dihydrodipikolinát syntáza môže byť syntetáza z baktérií rodu Serratia, ak obsahuje mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom.

Súčasný vynález ďalej poskytuje uvedené baktérie rodu Serratia obsahujúce aspartokinázu, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom je desenzibilizovaná. Príkladom spôsobu na umožnenie baktériám rodu Serratia obsahovať aspartokinázu, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom je desenzibilizovaná, je postup na zavedenie DNA do buniek, ktorá kóduje aspartokinázu III pochádzajúcu z baktérií rodu Escherichia s mutáciou na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom.

Ako príklad mutácie aspartokinázy III pochádzajúcej z baktérií rodu Escherichia na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom sa uvádza mutácia na nahradenie 323. glycínového zvyšku zvyškom kyseliny asparágovej, mutácia na nahradenie 323. glycínového zvyšku zvyškom kyseliny asparágovej a na nahradenie 408. glycínového zvyšku zvyškom kyseliny asparágovej, mutácia na nahradenie 34. arginínového zvyšku zvyškom cysteínu a na nahradenie 323. glycínového zvyšku zvyškom kyseliny asparágovej, mutácia na nahradenie 325. leucínového zvyšku zvyškom fenylalanínu, mutácia na nahradenie 318. metioninového zvyšku zvyškom izoleucínu, mutácia na nahradenie 318. metioninového zvyšku zvyškom izoleucínu a na nahradenie 349. valutového zvyšku zvyškom metionínu, mutácia na nahradenie 345. serínového zvyšku zvyškom leucínu, mutácia na nahradenie 347. valínového zvyšku zvyškom metionínu, mutácia na nahradenie 352. treonínového zvyšku zvyškom izoleucínu, mutácia na nahradenie 352. treonínového zvyšku zvyškom izoleucínu a na nahradenie serínového zvyšku zvyškom fenylalanínu, mutácia na nahradenie 164. zvyšku kyseliny glutámovej zvyškom lyzinu, a mutácia na nahradenie 417. metioninového zvyšku zvyškom izoleucínu a na nahradenie 419. cysteínového zvyšku zvyškom tyrozínu, počítajúc od N-konca aminokyselinovej sekvencie aspartokinázy III definovanej v sekv. č. 8 ako je to uvedené v zozname sekvencii.

Je zbytočné uvádzať, že aspartokináza, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom je desenzibilizovaná, môže byť z baktérií rodu Serratia.

DNA kódujúca dihydrodipikolinát syntázu nesúca mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom, a DNA kódujúca aspartokinázu nesúca mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom, môžu byť umiestnené v bunkách baktérií rodu Serratia na rovnakom plazmide alebo na samostatných plazmidoch.

Súčasný vynález ďalej poskytuje spôsob produkcie L-lyzínu zahŕňajúci kroky na kultiváciu ktorýchkoľvek uvedených baktérií rodu Serratia vo vhodnom médiu, produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre, a izoláciu L-lyzínu z kultúry.

V tomto opise, DNA kódujúca DDPS alebo AKIII, alebo DNA obsahujúca okrem toho aj promótor, sa niekedy nazýva aj „DDPS gén“ alebo „AKIII gén“. Ďalej, mutantný enzým, v ktorom inhibícia spätnou väzbou L-lyzinom je desenzibilizovaná, a DNA, ktorá ho kóduje, alebo DNA obsahujúca okrem toho aj promótor, sa niekedy zjednodušene nazývajú „mutantný enzým“, prípadne „mutantný gén“. Ďalej, výraz „spätná inhibícia L-lyzínom je desenzibilizovaná“ znamená, že podstatná desenzibilizácia inhibície je postačujúca, a kompletná desenzibilizácia nie je potrebná.

Predložený vynález bude v ďalšom podrobne vysvetlený.

<1> DNA kódujúca mutantnú dihydrodipikolinát syntázu (DDPS) používanú pri postupe opísanom v tomto vynáleze.

DNA kódujúca mutantnú DDPS používaná v spôsobe tohto vynálezu nesie mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom enzýmu DDPS kódovaného v DNA, ktorá kóduje štandardnú DDPS. Pre DDPS sa ako príklad uvádzajú enzýmy pochádzajúce z baktérií rodu Escherichia, osobitne DDPS pochádzajúca z E. coli. Pre mutáciu v

DDPS pochádzajúcej z baktérií rodu Escherichia na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom je uvedená ako príklad:

(1) mutácia na nahradenie 81. alanínového zvyšku zvyškom valínu;

(2) mutácia na nahradenie 118. histidínového zvyšku zvyškom tyrozínu; a (3) mutácia na nahradenie 81. alanínového zvyšku zvyškom valínu a na nahradenie 118. histidínového zvyšku zvyškom tyrozínu;

počítajúc od N-konca DDPS v aminokyselinovej sekvencii DDPS definovanej v sekv. č. 4 ako je to uvedené v zozname sekvencii.

DNA kódujúca štandardnú DDPS nie je osobitne limitovaná, za predpokladu, že kóduje DDPS pochádzajúce z baktérií rodu Escherichia. Konkrétnym príkladom DNA kódujúcej DDPS pochádzajúcej z baktérií rodu Escherichia je DNA kódujúca aminokyselinovú sekvenciu definovanú v sekv. č. 4, a ďalším konkrétnym príkladom je DNA so sekvenciou zodpovedajúcou číslam báz 272 až 1147 v bázovej sekvencii definovanej v sekv. č. 3. Z týchto sekvencii tie, ktoré majú v bázovej sekvencii mutáciu spôsobujúcu výmenu aminokyselinových zvyškov opísanú skôr, sú príkladmi DNA kódujúcej mutantnú DDPS použitú v predloženom vynáleze. Ktorýkoľvek kodón zodpovedajúci vymenenému aminokyselinovému zvyšku je dostupný, najmä bez ohľadu na svoj druh, za predpokladu, že kóduje totožný aminokyselinový zvyšok. Ďalej, predpokladá sa, že predmetná DDPS sa mierne odlišuje v sekvencii v závislosti od rozdielov medzi druhmi a kmeňmi baktérií, ale tie, v ktorých došlo k výmene, delécii alebo inzercii aminokyselinového zvyšku (zvyškov) v pozícii (pozíciách) irelevantných vo vzťahu k enzymatickej aktivite, sú tiež zahrnuté v rámci mutantného DDPS génu podľa predloženého vynálezu.

Spôsob na získanie takého mutantného génu môže byť nasledovný. Najprv sa DNA obsahujúca štandardný DDPS gén alebo DDPS gén nesúci mutáciu, ktorá nemá podstatný nepriaznivý vplyv na enzymatickú aktivitu DDPS, in vitro podrobí mutagenéze, a po tomto procese sa DNA liguje s DNA vektorom adaptovaným na hostiteľa s cieľom získať rekombinantnú DNA. Rekombinantná DNA sa zavedie do hostiteľského mikroorganizmu s cieľom získať transformanty. Ak sa transformant, ktorý exprimuje mutantnú DDPS, vyselektuje spomedzi uvedených transformantov, potom taký transformant bude obsahovať mutantný gén. Podobne, DNA obsahujúca štandardný DDPS gén alebo DDPS gén nesúci ďalšiu mutáciu, sa môže ligovať s DNA vektorom adaptovaným na hostiteľa s cieľom získať rekombinantnú DNA. Rekombinantná DNA sa potom podrobí in vitro mutagenéze, a rekombinantná DNA po mutagenéze sa zavedie do hostiteľského mikroorganizmu s cieľom získať transformanty. Ak sa transformant, ktorý exprimuje mutantnú DDPS, vyselektuje spomedzi uvedených transformantov, potom taký transformant bude obsahovať mutantný gén.

Je prijateľné aj to, že mikroorganizmus, ktorý produkuje štandardný enzým, sa podrobí mutagenéze s cieľom vytvoriť mutantný kmeň produkujúci mutantný enzým, a potom sa z tohto mutantného kmeňa získa mutantný gén. Podobne transformant, do ktorého sa zavedie rekombinantná DNA ligovaná so štandardným génom, sa môže podrobiť mutagenéze s cieľom vytvoriť mutantný kmeň produkujúci mutantný enzým. Ak sa potom z mutantného kmeňa vyizoluje rekombinantná DNA, na uvedenej DNA sa vytvorí mutantný gén.

Ako príklad činidla použitého v procese mutagenézy in vitro je uvedený hydroxylamín a podobne. Hydroxylamín je chemický mutagcn, ktorý spôsobuje mutáciu z cytozínu na tymín výmenou cytozínu na N⁴-hydroxycytozín. Podobne, ak sa mutagenéze podrobí samotný mikroorganizmus, celý postup sa uskutoční pomocou ultrafialového ožiarenia alebo mutačného činidla používaného obvykle v umelej mutagenéze, ako je napríklad N-metyl-N’-nitro-N-nitrózoguanidín (NTG) alebo kyselina dusitá.

Ako donorový mikroorganizmus poskytujúci DNA obsahujúcu štandardný DDPS gén alebo DDPS gén nesúci inú opísanú mutáciu, môže byť použitý ktorýkoľvek mikroorganizmus rodu Escherichia. Konkrétne, ako mikroorganizmy rodu Escherichia možno použiť tie, ktoré boli opísané v knihe napísanej autormi Neidhardt a spol. (Neidhardt, F. C. a spol., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Američan Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, tabuľka 1). Napríklad spomínajú sa E. coli kmeň JM109 a kmeň MC 1061. Ak sa ako donorový mikroorganizmus pre DNA obsahujúcu DDPS gén použije divý kmeň, dá sa získať DNA obsahujúca štandardný DDPS gén.

1. Príprava štandardného DDPS génu

V ďalšom uvedieme príklad prípravy DNA obsahujúcej DDPS gén. Príprava je tu opísaná vo vzťahu k E. coli, a DDPS gén môže byť pripravený podobne aj vzhľadom na iné baktérie rodu Escherichia.

Najprv sa E. coli, napríklad kmeň MC1061, so štandardným dapA génom kultivuje s cieľom získať kultúru. Keď sa uvedený mikroorganizmus kultivuje, kultivácia môže prebiehať v súlade so štandardným spôsobom kultivácie na tuhých médiách, ale kultivácia výhodne prebieha prispôsobením kultivácie na tekuté pôdy vzhľadom na účinnosť pri získavaní baktérii z kultivačného média. Môže sa použiť médium, do ktorého sa pridá jeden alebo viacero zdrojov dusíka, ako je napríklad kvasinkový extrakt, peptón, mäsový extrakt, tekutina z máčanej kukurice a exsudát zo sóje alebo pšenice spolu s jednou alebo viacerými anorganickými soľami ako je napríklad kyslý fosforečnan draselný, stredný fosforečnan draselný, síran horečnatý, chlorid sodný alebo síran manganitý, ďalej voliteľne a adekvátne cukry, vitamíny a podobne. Je vhodné, aby počiatočné pH média bolo nastavené na 6 až 8. Kultivácia môže prebiehať 4 až 24 hodín pri 30 až 42 °C, výhodne približne pri 37 °C hĺbkovou kultiváciou za prevzdušňovania a miešania, kultiváciou na trepačke alebo stacionárnou kultiváciou a podobne.

Takto získaná kultúra sa centrifuguje, napríklad pri 3000 otáčkach/minútu 5 minút, aby sa získal bunkový pelet E. coli kmeňa MC 1061. Chromozómovú DNA možno získať z bunkového peletu napríklad pomocou spôsobu autorov Saito a Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, 1963), alebo spôsobom K. S. Kirbyho (Biochem. J., 64, 405,1956).

Aby sa izoloval DDPS gén z takto získanej chromozómovej DNA, pripraví sa knižnica chromozómovej DNA. Najprv sa chromozómová DNA čiastočne poštiepi vhodným reštrikčným enzýmom, aby sa získala zmes rôznych fragmentov. Možno použiť celú škálu rôznych reštrikčných enzýmov, ak stupeň poštiepenia sa kontroluje prostredníctvom reakčného času štiepenia a podobne. Napríklad, ó'a«3AI sa nechá pôsobiť na chromozómovú DNA pri teplote aspoň 30 °C, výhodne pri 37 °C pri koncentrácii enzýmu medzi 1 až 10 jednotiek/ml, rôzne dlho, od 1 minúty do 2 hodín, aby sa DNA poštiepila.

Potom sa získané DNA fragmenty ligujú s vektorovou DNA, ktorá sa autonómne replikuje v bunkách baktérií rodu Escherichia a pripraví sa rekombinantná DNA. Kon krétne, reštrikčný enzým, ktorý generuje koncovú bázovú sekvenciu komplementárnu so sekvenciou generovanou reštrikčným enzýmom SauiŕA používaným na rozštiepenie chromozómovej DNA, napríklad BnmHÍ, sa nechá pôsobiť na vektorovú DNA za podmienok, keď teplota je aspoň 30 °C a koncentrácia enzýmu je 1 až 100 jednotiek/ml a aspoň 1 hodinu, výhodne 1 až 3 hodiny, aby sa celkom natrávila, a rozštiepila a rozkúskovala sa. Potom sa takto získaná zmes fragmentov chromozómovej DNA zmieša s poštiepenou vektorovou DNA, na ktorú sa nechá pôsobiť DNA ligáza, výhodne T4 DNA ligáza, za podmienok, keď teplota je 4 až 16 °C a koncentrácia enzýmu je 1 až 100 jednotiek/ml aspoň 1 hodinu, výhodne 6 až 24 hodín, aby sa získala rekombinantná DNA.

Získaná rekombinantná DNA sa použije na transformáciu mikroorganizmov rodu Escherichia, napríklad mutantného kmeňa deficientného v DDPS, ako je napríklad Escherichia coli kmeň K-12, výhodne kmeň JE7627 iponB704 dacB12 pvf tonA2 dapA lysA str malA38 metB12 ilvHóll leuA371 proA3 lac-3 tsx-76), na prípravu knižnice chromozómovej DNA. Transformácia môže prebiehať napríklad spôsobom D. M. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326, 1979) alebo spôsobom, v ktorom sa na recipientné bakteriálne bunky pôsobí chloridom vápenatým, aby sa zvýšila DNA permeabilita (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159,1970). Kmeň JE7627je dostupný z Národného ústavu pre genetiku (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko).

Bakteriálny kmeň s rekombinantnou DNA v DDPS géne sa získava z kmeňov so zvýšenou DDPS aktivitou alebo z kmeňov, v ktorých auxotrofia vyplývajúca z deficiencie v DDPS géne je komplementovaná získanou knižnicou chromozómovej DNA. Napríklad mutantný kmeň deficientný v DDPS vyžaduje kyselinu diaminopimelovú. Takže ak sa použije mutantný kmeň deficientný v DDPS ako hostiteľ, DNA fragment obsahujúci DDPS gén sa dá získať izoláciou bakteriálneho kmeňa, ktorý bude schopný rásť v médiu neobsahujúcom kyselinu diaminopimelovú, a získaním rekombinantnej DNA z bakteriálneho kmeňa.

Potvrdenie toho, či daný kmeň s rekombinantnou DNA obsahujúcou DDPS gén skutočne obsahuje rekombinantnú DNA, v ktorej je DDPS gén naklonovaný, možno dosiahnuť prípravou bunkového extraktu daného kmeňa a prípravou roztoku surového enzýmu z neho na potvrdenie alebo vylúčenie zvýšenej DDPS aktivity. Postup na meranie enzymatickej aktivity DDPS možno uskutočniť spôsobom Yugariho a spol. (Yugari, Y. a Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240,4710,1962).

Rekombinantnú DNA, v ktorej DNA obsahujúca DDPS gén je vložená do vektorovej DNA, možno vyizolovať z uvedeného bakteriálneho kmeňa napríklad pomocou spôsobu P. Guerryho a spol. (J. Bacteriol., 116, 1064, 1973), alebo pomocou spôsobu D. B. Clewella (J. Bacteriol., 110, 667, 1972).

Prípravu štandardného DDPS génu možno tiež uskutočniť prípravou chromozómovej DNA z kmeňa nesúceho na chromozóme DDPS gén pomocou spôsobu autorov Saito a Miura, a pod., a amplifikáciou DDPS génu pomocou spôsobu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) (pozri White, T. J. a spol.; Trends Genet., 5, 185, 1989). DNA primery, ktoré sa použijú v amplifikačnej reakcii, sú tie, ktoré sú komplementárne s oboma 3’-koncami dvoj vláknovej DNA obsahujúcej celý región alebo čiastočný región DDPS génu. Ak sa amplifikuje iba parciálny región DDPS génu, je potrebné použiť takéto DNA fragmenty ako primery na skrínovame DNA fragmentu obsahujúceho celý región z knižnice chromozómovej DNA. Ak sa amplifikuje celý región DDPS génu, reakčný roztok PCR zahŕňajúci DNA fragmenty obsahujúce amplifikovaný DDPS gén sa podrobí elektroforéze na agarovom géli, a potom sa cielene vyextrahuje konkrétny DNA fragment. Takže môže sa získať DNA fragment obsahujúci DDPS gén.

DNA prímery možno vhodne pripraviť na základe napríklad sekvencie známej pri E. coli (Richaud, F. a spol., J. Bacteriol., 297, 1986). Konkrétne, prímery, ktoré môžu amplifikovať región obsahujúci 1150 báz kódujúcich DDPS gén, sú výhodné, a vhodné sú dva druhy primerov definované v sekv. č. 1 a č. 2. Syntéza primerov sa môže uskutočniť štandardným spôsobom ako je napríklad spôsob s fosfoamiditom (pozri Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981) s použitím komerčne dostupného DNA syntetizátora (napríklad DNA Synthesizer Model 380B, výrobca Applied Biosystems). Ďalej, PCR možno uskutočniť pomocou komerčne dostupného PCR zariadenia (napr. DNA Thermal Cycler Model PJ2000, výrobca Takara Shuzo Co., Ltd.), pomocou Taq DNA polymerázy (dodanej firmou Takara Shuzo Co., Ltd.) v súlade so spôsobom navrhnutým dodávateľom.

Vzhľadom na DDPS gén amplifikovaný spôsobom PCR, kroky ako je zavedenie mutácie do DDPS génu sa stávajú ľahkými, ak gén je ligovaný z DNA vektora, ktorý sa v bakteriálnych bunkách rodu Escherichia autonómne replikuje, a je zavedený do bakteriálnych buniek rodu Escherichia. Vektorová DNA, ktorá sa použije, spôsob transformácie, a spôsob potvrdenia prítomnosti DDPS génu sú rovnaké ako boli v uvedenom postupe.

2. Zavedenie mutácie do DDPS génu

Ako príklad spôsobu na uskutočnenie mutácie, napríklad substitúcie, inzercie a delécie aminokyselinových zvyškov, je uvedený spôsob rekombinantnej PCR (Higuchi, R., 61, v PCR Technology (Erlich, H. A. Eds., Stockton Press, 1989) a spôsob miestne špecifickej mutagenézy (Kramer, W. a Frits,H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350, 1987); Kunkel T. A. a spol., Meth. In Enzymol., 154, 367, 1987). Pomocou týchto postupov možno na určitom mieste dosiahnuť cielenú mutáciu.

Ďalej, podľa chemickej syntézy cieleného génu, je možné vyvolať mutáciu alebo náhodnú mutáciu na cielenom mieste.

Ďalej, k dispozícii je postup, v ktorom je DDPS gén na chromozóme alebo plazmide priamo vystavený účinku hydroxylaminu (Hashimoto, T. a Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039, 1984). Podobne, môže sa použiť postup, v ktorom baktérie rodu Escherichia nesúce DDPS gén sa ožiaria ultrafialovým svetlom, alebo postup založený na vystavení účinkom chemickej látky, ako je napríklad N-metyl-N’-nitrózoguanidín alebo kyselina dusitá. Podľa týchto postupov mutácie možno vyvolať náhodne.

Čo sa týka spôsobu selekcie mutantného génu, rekombinantná DNA zahŕňajúca DNA fragment s DDPS génom a vektorovou DNA sa najprv vystaví mutačnému pôsobeniu pomocou hydroxylamínu (alebo inej podobnej látky), ktorý sa používa na transformáciu napríklad E. coli, kmeň W3110. Potom sa transformované kmene kultivujú v minimálnom médiu ako je napríklad M9 obsahujúce S-2-aminoetylcysteín (AEC) ako analóg L-lyzínu. Kmene s rekombinantnou DNA obsahujúcou štandardný DDPS gén nemôžu syntetizovať L-lyzín a kyselinu diaminopimelovú (DAP) a sú potlačené v raste, pretože DDPS exprimovaná z rekombinantnej DNA je inhibovaná S-2-aminoetylcysteínom (AEC). Naopak, kmeň nesúci rekombinantnú DNA obsahujúcu DDPS gén, v ktorom inhibícia L-lyzínom je desenzibilizovaná, má mutantný enzým kódovaný DDPS génom v uvedenej rekombinantnej DNA, ktorý nie je inhibovaný S-2-aminoetylcysteínom. Takže by mal byť schopný rastu na minimálnom médiu, ku ktorému sa pridáva AEC. Tento jav možno využiť na selekciu kmeňa, ktorý je rezistentný v raste proti AEC ako analógu L-lyzínu, čiže kmeň nesúci rekombinantnú DNA obsahujúcu mutantný DDPS gén, v ktorom je inhibícia desenzibilizovaná.

Mutantný gén získaný týmto spôsobom možno zaviesť ako rekombinantnú DNA do baktérií rodu Serratia a možno ho exprimovať. Takto možno získať baktérie, ktoré nesú DDPS, v ktorom je spätná inhibícia desenzibilizovaná. Podobne, mutantný fragment génu DDPS sa môže vyňať z rekombinantnej DNA a môže sa vložiť do iného vektora na použitie. Vektorová DNA, ktorá sa môže v tomto vynáleze použiť, je výhodne plazmidová vektorová DNA, napríklad pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 a pMW218. Okrem toho možno použiť aj fágové DNA vektory.

Ďalej, aby sa mutantný DDPS gén účinne exprimoval, môže sa ligovať upstream s ďalším promótorom, ktorý funguje v bunkách baktérií Serratia, ako je napríklad lac, trp a PL, z DNA sekvencie kódujúcej mutantnú DDPS, alebo promótor obsiahnutý v DDPS géne sa môže použiť buď tak ako je, alebo po amplifikácii promótora.

<2> DNA kódujúca mutantnú aspartokinázu (AK) použitá v tomto vynáleze

DNA kódujúca mutantnú AK, použitá v tomto vynáleze, nesie mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície kódovanej AK L-lyzínom v DNA kódujúcej štandardnú AK. Príkladom AK je aspartokináza pochádzajúca z baktérií rodu Escherichia, najmä AKIII z E. coli. Ďalej, akákoľvek aspartokináza baktérií rodu Serratia, za predpokladu, že nesie mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom.

Príkladom mutácie na desenzibilizáciu spätnej inhibície AKIII L-lyzínom je:

(a) mutácia, kde 323. glycínový zvyšok je nahradený zvyškom kyseliny asparágovej;

(b) mutácia, kde 323. glycínový zvyšok je nahradený zvyškom kyseliny asparágovej a 408. glycínový zvyšok je nahradený zvyškom kyseliny asparágovej;

(c) mutácia, kde 34. arginínový zvyšok je nahradený cysteínovým zvyškom a 323. glycínový zvyšok je nahradený zvyškom kyseliny asparágovej;

(d) mutácia, kde 325. leucínový zvyšok je nahradený fenylalanínovým zvyškom;

(e) mutácia, kde 318. metionínový zvyšok je nahradený izoleucínovým zvyškom;

(f) mutácia, kde 318. metionínový zvyšok je nahradený izoleucínovým zvyškom a 349. valínový zvyšok je nahradený metionínovým zvyškom;

(g) mutácia, kde 345. serínový zvyšok je nahradený leucínovým zvyškom;

(h) mutácia, kde 347. valínový zvyšok je nahradený metionínovým zvyškom;

(i) mutácia, kde 352. treonínový zvyšok je nahradený izoleucínovým zvyškom;

(j) mutácia, kde 352. treonínový zvyšok je nahradený izoleucínovým zvyškom a 369. serínový zvyšok je nahradený fenylalanínovým zvyškom;

(k) mutácia, kde 164. zvyšok kyseliny glutámovej je nahradený lyzínovým zvyškom; a (l) mutácia, kde 417. metionínový zvyšok je nahradený izoleucínovým zvyškom a 419. cysteínový zvyšok je nahradený tyrozínovým zvyškom;

pričom sa poradie počíta od N-konca AKIII v aminokyselinovej sekvencií AKIII definovanej v sekv. č. 8 v zozname sekvencií.

Ako DNA kódujúca štandardnú AKIII sa uvádza napríklad DNA kódujúca AKIII pochádzajúca z baktérií rodu Escherichia ako je napríklad E. coli. Konkrétne, ako príklady sa uvádzajú DNA kódujúce aminokyselinovú sekvenciu definovanú v sekv. č. 8, a sekvenciu zodpovedajúcu číslami báz 584 až 1930 v bázovej sekvencií, ako je definovaná v sekv. č. 7. Mimochodom, AKIII E. coli je kódovaná génom lysC.

Z týchto sekvencií sú tie, ktoré nesú mutáciu v bázovej sekvencií a majú substituované aminokyselinové zvyšky ako to je opísané, príkladmi DNA kódujúcich mutantné AKIII použitých v tomto vynáleze. Akýkoľvek kodón zodpovedajúci substituovanému aminokyselinovému zvyšku je možný, najmä bez ohľadu na jeho druh, za predpokladu, že kóduje identický aminokyselinový zvyšok. Ďalej sú tu mutácie, v ktorých sa aminokyselinové sekvencie štandardnej AKIII mierne odlišujú v závislosti od rozdielov medzi druhmi a kmeňmi baktérií. Tie, v ktorých je substitúcia, delécia alebo inzercia aminokyselinového zvyšku (zvyškov) v pozícii (pozíciách), ktoré nesúvisia s enzymatickou aktivitou, sú tiež zahrnuté v rámci mutantného AKIII génu použitého v tomto vynáleze. Napríklad bázová sekvencia štandardného génu (ysC_získaného v príklade 2 opísaného nižšie (sekv. č. 7) sa odlišuje od publikovanej sekvencie génu lysC E. coli kmeňa K-12 JC411 na 6 miestach (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., a Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986). Kódované aminokyselinové zvyšky sa odlišujú na 2 miestach (v lysC kmeni JC411 je 58. glycínový zvyšok nahradený cysteínovým zvyškom a 401 glycínový zvyšok je nahradený alanínovým zvyškom, pričom sa počíta od N-konca v aminokyselinovej sekvencií génu lysC definovaného v sekv. č. 8). Očakáva sa dokonca, žc lysC s rovnakou sekvenciou ako jc sekvencia lysC E. coli kmeňa K-12 JC411 nesúca mutáciu, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom je desenzibilizovaná, sa získa, ak sa zavedie ktorákoľvek z uvedených mutácií od (a) až po (1).

Spôsob na získanie DNA kódujúcej mutantnú AK, v ktorej je spätná inhibícia L-lyzínom desenzibilizovaná, je nasledovný. Najprv sa DNA obsahujúca štandardný AK a nesúca ďalšiu mutáciu podrobí mutačnému pôsobeniu in vitro, a DNA po mutagenéze sa liguje s vektorovou DNA adaptovanou na hostiteľa s cieľom získať rekombinantnú DNA. Rekombinantná DNA sa zavedie do hostiteľského mikroorganizmu s cieľom získať transformanty. Ak sa medzi uvedenými transformantmi vyselektuje transformant, ktorý exprimuje mutantnú AK, potom taký transformant nesie aj mutantný gén. Podobne, DNA obsahujúca štandardný AK gén alebo AK gén nesúci aj ďalšiu mutáciu, sa môže ligovať s vektorovou DNA adaptovanou na hostiteľa s cieľom získať rekombinantnú DNA. Rekombinantná DNA sa potom podrobí in vitro mutagenéze, a rekombinantná DNA po mutačnom pôsobení sa zavedie do hostiteľského mikroorganizmu s cieľom získať transformanty. Ak sa medzi uvedenými transformantmi vyselektuje transformant, ktorý exprimuje mutantnú AK, potom taký transformant nesie aj mutantný gén.

Podobne, je prijateľné aj to, že mikroorganizmus, ktorý produkuje štandardný enzým, sa podrobí mutačnému pôsobeniu s cieľom vytvoriť mutantný kmeň, ktorý produkuje mutantný enzým, a potom sa mutantný gén získa z tohto mutantného kmeňa. Činidlom na uskutočnenie priameho mutačného pôsobenia DNA je napríklad hydroxylamín a podobne. Hydroxylamín je chemický mutagén, ktorý vy voláva mutáciu z cytozinu na tymín, a to zmenou cytozínu na N⁴-hydroxycytozín. Podobne, ak sa samotný mikroorganizmus podrobí mutačnému pôsobeniu, mutagenéza sa uskutoční ožiarením ultrafialovým svetlom alebo pomocou mutagénu obvykle používaného na vyvolanie umelých mutácií, ako je napríklad N-metyl-N’-nitro-N-nitrózoguanidín (NTG).

Akýkoľvek mikroorganizmus sa používa ako donorový mikroorganizmus pre DNA obsahujúcu štandardný AK gén alebo AK gén nesúci ďalšiu mutáciu ako to je uvedené, za predpokladu, že je to mikroorganizmus rodu Escherichia alebo Serratia. Konkrétne, je možné použiť mikroorganizmy uvedené v knihe od autorov Neidhardt a spol. (Neidhardt, F. C. a spol., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Americká mikrobiologická spoločnosť, Washington D. C., 1208, tabuľka 1). Ako príklad sa uvádzajú kmene E. coli JM109 a MC 106 L Podobne, ako príklad mikroorganizmu rodu Serratia sa uvádza druh Serratia marcescens, napríklad kmeň Serratia marcescens AJ13125 (FERM BP5441).

Ak sa gén AK získa z týchto kmeňov, príprava chromozómovej DNA, príprava knižnice chromozómovej DNA, a podobne, sa môže uskutočniť takým istým spôsobom ako príprava DDPS opísaného génu. Ako hostiteľský organizmus na prípravu knižnice je výhodné použiť kmeň úplne defícientný na AKI, II a III, ako je napríklad kmeň E. coli GT3 (dostupný z E. coli Genetic Stock Center, Connecticut, Spojené štáty).

Zo získanej knižnice chromozómovej DNA sa získa bakteriálny kmeň s rekombinantnou DNA génu AK ako kmeň, v ktorom aktivita AK je zvýšená, alebo kmeň, v ktorom auxotrofia je úplná. Z vytipovaných kmeňov sa pripravia bunkové extrakty, a pripravia sa z nich roztoky surových enzýmov na potvrdenie aktivity AK. Postup merania enzymatickej aktivity AK sa môže uskutočniť podľa postupu Stadtmana a spol. (Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G., a Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033,1961).

Napríklad, ak sa ako hostiteľ použije mutantný kmeň úplne defícientný na AK, DNA fragment obsahujúci gén AK sa dá získať izolovaním transformovaného kmeňa, ktorý sa stane schopným rastu v médiu bez L-lyzínu, L-treonínu, L-metionínu a kyseliny diaminopimelovej, alebo v médiu bez homoserínu a kyseliny diaminopimelovej, a vyťažením rekombinantnej DNA z tohto bakteriálneho kmeňa.

Ak sa AK gén amplifikuje z chromozómovej DNA pomocou spôsobu PCR, DNA primery, ktoré sa majú použiť na PCR reakciu, sa dajú správne pripraviť na základe napríklad sekvencie známej pri E. coli (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., a Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986). Ale primery, ktoré môžu amplifikovať úsek obsahujúci 1347 báz, ktoré kódujú gén lysC, sú vhodné, a napríklad dva primery so sekvenciami definovanými v sekv. č. 5 a 6 sú vhodné.

Ďalej, gén AK pochádzajúci z baktérií rodu Serratia sa dá získať rovnakým spôsobom ako je uvedený spôsob, a gén sa dá izolovať z knižníc chromozómových DNA baktérií rodu Serratia hybridizáciou s použitím AK génu pochádzajúceho z E. coli alebo z jeho časti ako sondy. Podobne, gén AK pochádzajúci z baktérií rodu Serratia sa dá získať pomocou PCR postupu s použitím chromozómovej DNA baktérií rodu Serratia ako templátu a oligonukleotidov pripravených na základe bázovej sekvencie génu AK pochádzajúceho z E. coli.

Ako príklad spôsobu na vyvolanie mutácie ako je napríklad substitúcia, inzercia a delécia aminokyselinového zvyšku (zvyškov) v géne AK získaného, ako to je opísané sa uvádza spôsob rekombinantnej PCR, spôsob miestne špecifickej mutagenézy a podobne, rovnakým spôsobom ako to je opísané skôr pre proces mutagenézy génu DDPS.

Ďalej, podľa chemickej syntézy cieľového génu je možné zaviesť mutáciu alebo náhodnú mutáciu na cielené miesto.

Ďalej, je dostupný spôsob, v ktorom DNA génu AK na chromozóme alebo extrachromozómová rekombinantná DNA sa priamo vystavuje účinkom hydroxylamínu (Hashimoto, T. a Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159,1039,1984).

Podobne, je možné použiť spôsob, v ktorom sa baktérie rodu Escherichia s génom AK na chromozóme alebo extrachromozómová rekombinantná DNA ožiaria ultrafialovým svetlom, alebo spôsob na uskutočnenie mutagenézy chemickým činidlom ako je napríklad N-metyl-N’-nitrózoguanidín alebo kyselina dusitá.

Vzhľadom na spôsob selekcie mutantncho AK génu, kmeň úplne deficientný na AK, napríklad kmeň E. coli GT3, sa najprv transformuje s rekombinantnou DNA obsahujúcou gén AK, ktorý sa podrobil mutačnému pôsobeniu. Potom sa transformované kmene kultivujú v minimálnom médiu, ako je napríklad M9, obsahujúcom značné množstvo L-lyzínu. Kmene nesúce rekombinantnú DNA obsahujúcu štandardný AK gén nemôžu syntetizovať L-treonín, L-izoleucín, L-metionín a kyselinu diaminopimelovú (DAP) a majú potlačený rast, pretože L-lyzínom je inhibovaná iba jedna AK. Naopak, kmeň nesúci rekombinantnú DNA obsahujúci mutantný gén AK, v ktorom je inhibícia L-lyzínom desenzibilizovaná, by mal byť schopný rastu v minimálnom médiu, ku ktorému sa pridá značné množstvo L-lyzínu. Tento fenomén sa dá využiť na selekciu kmeňa, ktorý je rezistentný v raste proti L-lyzínu alebo AEC ako analógu L-lyzínu, t. j. kmeň nesúci rekombinantnú DNA obsahujúcu mutantný AK gén, v ktorom je inhibícia desenzibilizovaná.

Takto získaný mutantný gén sa môže zaviesť ako rekombinantná DNA do baktérií rodu Serratia, a môže sa exprimovať. Takže môžu sa získať baktérie nesúce AK, v ktorých inhibícia spätnou väzbou je desenzibilizovaná. Podobne, z rekombinantnej DNA sa môže vybrať fragment mutantného AK génu a môže sa vložiť do iného vektora. Vektorová DNA, ktorá sa môže použiť v tomto vynáleze, je výhodne plazmidová vektorová DNA, ktorej príkladom môže byť pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 a pMW218. Okrem toho sa môžu použiť aj DNA fágové vektory.

Ďalej, na účinné exprimovanie mutantncho AK génu sa môže upstream ligovať ďalší promótor, fungujúci v bakteriálnych bunkách rodu Serratia, ako je napríklad lac, trp a PL, z DNA sekvencie kódujúcej mutantnú AK, alebo promótor obsiahnutý v AK géne sa môže použiť tak ako je, alebo po amplifikácii.

<3> Produkcia L-lyzínu podľa predloženého vynálezu

L-lyzin možno účinne pripraviť vo vhodnom médiu kultiváciou baktérií rodu Serratia transformovaných zavedením mutantného DDPS génu získaného spôsobom ako to je opísané skôr, s možnosťou niesť AK, ktorej spätná inhibícia L-lyzínom je desenzibilizovaná, produkovaním a akumuláciou L-lyzínu v kultúre takýchto baktérií, a izolovaním L-lyzínu z kultúry. Špecificky, L-lyzín možno účinne produkovať tak, že sa umožní, aby baktérie rodu Serratia niesli tak mutantnú DDPS, ako aj mutantnú AK.

Príkladom baktérií rodu Serratia nesúcich AK, ktorej spätná inhibícia L-lyzinom je desenzibilizovaná, sú bakté rie rodu Serratia transformované zavedením rekombinantnej DNA do ich buniek, ktorá bola pripravená ligáciou DNA kódujúcej AK s mutáciou na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom s vektorovou DNA autonómne replikovateľnou v bunkách baktérií rodu Serratia. Ďalej AK, ktorej sparná inhibícia L-lyzínom je desenzibilizovaná, môže byť štandardná AK, ktorá nie je obmedzovaná spätnou inhibíciou L-lyzínom, alebo AK, ku ktorej sa taký štandardný AK gén do baktérii rodu Serratia zavedie rovnakým spôsobom. Ďalej je možný aj mutantný kmeň baktérií rodu Serratia, ktorý začal produkovať mutantnú AK prostredníctvom mutačného pôsobenia na bunky baktérií rodu Serratia.

Na druhej strane, ak sa má dosiahnuť transformácia zavedením mutantného DDPS génu do baktérií rodu Serratia, transformáciu možno dosiahnuť zavedením rekombinantnej DNA do bunky pripravenej ligáciou mutantného DDPS génu s vektorovou DNA autonómne replikovateľnou v bunkách baktérií rodu Serratia.

Keď sa tak mutantný DDPS gén, ako aj mutantný AK gén zavedú do baktérií rodu Serratia, oba mutantné gény môžu byť lokalizované v bunke na tom istom plazmide alebo na samostatných plazmidoch. Ak sa použijú samostatné plazmidy, je výhodné použiť plazmidy so stabilným distribučných mechanizmom, aby sa umožnilo ich stabilné zakotvenie v bunke. Ak sa mutantný DDPS gén a mutantný AK gén zavedú do baktérií rodu Serratia prostredníctvom samostatných plazmidov, je možné akékoľvek poradie zavádzania oboch génov.

Produktivitu L-lyzínu možno ďalej zlepšovať zosilnením génu dihydrodipikolinát reduktázy (dapB) baktérií rodu Serratia, do ktorých sa zaviedol mutantný DDPS gén a mutantný AK gén. Produktivitu L-lyzínu možno ďalej zvyšovať zavedením génu diaminopimelát dehydrogenázy (DDH) pochádzajúceho z baktérií typu Coryne do baktérií rodu Serratia, ktoré nesú mutantný AK gén a mutantný DDPS gén, a v ktorých gén dihydrodipikolinát reduktázy bol posilnený. Tento gén diaminopimelát dehydrogenázy by mal byť posilnený. Podobne, produktivitu L-lyzínu možno zvýšiť v podobnej miere posilnením génu sukcinyldiaminopimelát transaminázy (dapD) a génu sukcinyldiaminopimelát deacylázy (dapE), namiesto zavedenia diaminopimelát dehydrogenázy.

Posilnenie génu tu označuje posilnenie aktivity enzýmu ako expresného produktu génu na bunku. Konkrétne, ako príklad možno uviesť zvýšenie počtu kópií génu v bunke, zvýšenie množstva expresie na gén s použitím promótora s vysokou účinnosťou expresie, a zavedenie mutácie na posilnenie aktivity enzýmu do génu. Na zvýšenie počtu kópií génu v bunke sa gén vloží do vektora autonómne sa replikujúceho v baktériách rodu Serratia, a baktérie rodu Serratia sa môžu transformovať s týmto vektorom. Tento vektor je výhodne plazmid multi-kópiového typu. Podobne, počet kópií možno zvýšiť amplifikáciou DNA integrovanej do chromozómovej DNA použitím fágu Mu a podobne.

Ohľadne použitia plazmidu, ak sa na zavádzanie mutantného DDPS génu a mutantného AK génu použijú plazmidy, výhodne sa použijú plazmidy so stabilným distribučným mechanizmom, ktorým sa tieto plazmidy v bunke stabilne spolu zakotvia. Možné je akékoľvek poradie zavádzania génov.

Príklady postupu na získanie génov systému biosyntézy L-lyzínu pri E. coli a géne DDH baktérii typu Coryne budú uvedené.

Gén DDH sa získava amplifikáciou chromozómovej DNA baktérií typu Coryne, ako je napríklad Brevibacterium lactofermentum, prostredníctvom PCR s použitím dvoch druhov oligonukleotidových primerov (napríklad sekv. č. 9, sekv. č. 10) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie génu DDH baktérie Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. a spol., Nucleic Acids Res., 15,3917, 1987).

Gén dapD sa získava amplifíkáciou chromozómovej DNA E. coli kmeňa W3110 pomocou PCR s použitím dvoch druhov oligonukleotidových primerov (napríklad sekv. č. 11, sekv. č. 12) pripravených na základe nukleotidovej sekvencie známeho génu dapD (Richaud, C. a spol., J. Biol. Chem., 259,14824,1984).

Gén dapE sa získava amplifíkáciou DNA E. coli prostredníctvom PCR s použitím dvoch druhov oligonukleotidových primerov (sekv. č. 13, sekv. č. 14) pripravených na základe nukleotidovej sekvencie známeho dapE génu (Bouvier, J. a spol., J. Bacteriol., 174, 5265,1992).

V predloženom vynáleze sú ako hostiteľ použiteľné akékoľvek baktérie rodu Serratia, za predpokladu, že v bunkách funguje promótor mutantného génu DDPS génu, mutantný AK gén alebo iný gén systému biosyntézy L-lyzínu, alebo iný promótor na exprimovanie týchto génov, a počiatok replikácie vektorovej DNA, ktorá sa má použiť na zavádzanie, funguje v bunkách a jc schopný replikácie, keď sa do plazmidu ako extrachromozómovej DNA zavádza mutantný DDPS gén, mutantný AK gén alebo iný gén systému biosyntézy L-lyzínu.

Napríklad, príkladom baktérií rodu Serratia sú mikroorganizmy produkujúce L-treonín, pretože inhibícia ich aspartokinázy L-lyzínomje vo všeobecnosti desenzibilizovaná aj pri mikroorganizmoch produkujúcich L-treonín. Ako napríklad baktérie druhu S. marcescens produkujúce L-treonín, rezistentné proti AHV (kyseline a-amino-p-hydroxyvalérovej), ktorá je analógom treonínu (S. Komatsubara, M. Kisumi a I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834, 1978). Príkladom takéhoto kmeňa je Serratia marcescens kmeň AJ13125. Kmeň bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonsko) pod registračným číslom FERM P-14983 dňa 12. júna 1995 a bol prenesený do medzinárodného depozitu v súlade s Budapeštianskou dohodou dňa 4. marca 1996, a bolo mu pridelené registračné číslo FERM BP-5441.

Ďalej, príkladom baktérií rodu Serratia použiteľných v tomto vynáleze sú baktérie Serratia marcescens deficientné na lyzíndekarboxylázu (Japonská patentová prihláška č. 50-53589 (1975). Lyzíndekarboxyláza je enzým katalyzujúci reakciu produkujúcu kadaverín dekarboxyláciou L-lyzínu ako L-lyzín degradujúci enzým, a kmeň deficientný v tomto enzým je suprimovaný v degradácii L-lyzínu.

Baktérie produkujúce L-treonín a baktérie rodu Serratia deficientné v lyzin-dekarboxyláze sa dajú získať ožiarením ultrafialovým svetlom alebo pôsobením mutagénov ako je napríklad N-metyl-N’-nitro-N-nitrózoguanidín a kyselina dusitá, ktoré sa bežne používajú na získanie indukovaných mutácií.

Médium použité na kultiváciu transformantu nesúceho mutantný gén podľa tohto vynálezu je obyčajné médium obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a voliteľne aj iné organické zložky.

Ako zdroj uhlíka je možné použiť cukry ako je napríklad sacharóza, glukóza, laktóza, galaktóza, fruktóza alebo škrobový hydrolyzát; alkoholy ako je napríklad glycerol alebo sorbitol; alebo organické kyseliny ako je napríklad kyselina fumarová, citrónová alebo jantárová.

Ako zdroj dusíka je možné použiť anorganické amóniové soli ako je napríklad močovina, síran amónny, chlo rid amónny alebo fosforečnan amónny; organický dusík ako je napríklad sójový hydrolyzát; plynný alebo kvapalný amoniak.

Požadované látky, ako je napríklad vitamín B! a L-izoleucín alebo kvasinkový extrakt, je výhodné obsiahnuť vo vhodnom množstve ako organické stopové živiny. Okrem uvedených zložiek sa v prípade potreby v malých množstvách pridáva fosforečnan draselný, síran horečnatý, ióny železa, ióny mangánu a podobne.

Kultivácia výhodne prebieha za aeróbnych podmienok 16 až 96 hodín. Kultivačná teplota sa kontroluje pri 25 °C až 45 °C, a pH sa kontroluje pri 5 až 8 počas kultivácie. Na nastavenie pH možno použiť anorganické alebo organické, kyslé alebo zásadité látky, ako aj plynný amoniak a podobne.

Izolácia L-lyzínu z fermentovanej tekutiny prebieha obvykle kombináciou spôsobu ionexovej živice, precipitačného spôsobu a iných známych spôsobov.

Predložený vynález bude konkrétnejšie vysvetlený s odkazmi na príklady.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje postup prípravy pdapAl apdapA2.

Obr. 2 znázorňuje inhibíciu L-lyzínom pri štandardnej DDPS a pri mutantnej DDPS.

Obr. 3 znázorňuje postup prípravy plazmidu pdapAS824 s dvojitou mutáciou typu dapA * génu.

Obr. 4 znázorňuje postup prípravy pLYSCl a pLYSC2.

Obr. 5 znázorňuje pomer vzhľadu a mutačný pomer transformantov po pôsobení hydroxylamínu.

Obr. 6 znázorňuje inhibíciu L-lyzínom pri štandardnej AKIII a mutantnej AKIII.

Obr. 7 znázorňuje postup prípravy plazmidu RSF24P pochádzajúceho z RSF1010 nesúceho dapA*24.

Obr. 8 znázorňuje postup prípravy plazmidu pLLC*80.

Obr. 9 znázorňuje postup prípravy plazmidu RSFD80 pochádzajúceho z RSF1010 nesúceho dapA*24 a lysC*80.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 : Príprava mutantného DDPS génu <1> Klonovanie štandardného dapA génu

Bázová sekvencia génu dapA baktérie E. coli už bola publikovaná (Richaud, F., a spol., J. Bacteriol., 297, 1986), a je známe, že jej otvorený čítací rámec (ORF) má 876 bázových párov, a kóduje proteín s 292 aminokyselinovými zvyškami. Nakoľko nie je známe, ako je tento dapA gén regulovaný, oblasť obsahujúca iba SD sekvenciu a ORF, okrem oblasti promótora, sa amplifikovala pomocou PCR a klonovala sa.

Celková genómová DNA baktérií E. coli kmeňa K-12 MC 1061 bola vyextrahovaná podľa spôsobu autorov Saito a Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, 1963). Pripravili sa dva druhy primerov so sekvenciou uvedenou v sekv. č. 1 a 2, ktoré boli použité na realizáciu PCR reakcie podľa spôsobu Erlicha a spol. (PCR Technology, Stockton Press, 1989), a cieľová DNA sa amplifikovala. Získaná DNA sa vložila do komerčne dostupného klonovacieho vektora pCRIOOO pre PCR fragmenty (zakúpené od firmy Invitrogen, Ltd., Califomia, USA) tak ako bola. pCRIOOO obsahuje lacZ promótor (Placz), a predáva sa v stave rozštiepenom v mieste downstream od lacZ promótora. Ak sa rekombinantná DNA získaná ligovanim PCR fragmentu medzi oba rozštiepené konce pCRIOOO zavedie do baktérií E.

Tabuľka 1 coli, PCR fragment sa transkribuje pod kontrolou lacZ promótora. Po ligácii PCR fragmentu s pCRIOOO sa získali dva druhy plazmidov, ktorými boli pdapAl ako plazmid ligovaný v pozitívnej orientácii, a pdapA2 ako plazmid ligovaný v opačnej orientácii čo sa týka smeru transkripcie dapA vzhľadom na smer transkripcie promótorom lacZ (obrázok 1).

Ak tieto plazmidy sa zaviedli do E. coli JE7627, ktorý je kmeňom deficientným v DDPS, kmeň so zavedenými plazmidmi je komplementovaný na auxotrofiu v kyseline diaminopimelovej hostiteľa JE7627. Takto sa potvrdilo, že DNA fragmenty vložené do oboch plazmidov obsahujú gén dapA kódujúci aktívnu DDPS.

Transformovaný kmeň získaný zavedením pdapAl do štandardného kmeňa E. coli W3110 (k dispozícii z National Inštitúte of Genetics, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko) bol označený ako W3110/pdapAl, a transformovaný kmeň získaný zavedením pdapA2 do kmeňa W3110 E. coli bol označený ako W3110/pdapA2. Tieto dva transformované kmene sa kultivovali v minimálnom médiu M9 nasledovného zloženia, ku ktorému sa pridal AEC ako analóg lyzinu. Kmeň W3110 bez akéhokoľvek zavedeného plazmidu sa tiež kultivoval v rovnakom médiu ako kontrola. Tieto dva transformované kmene a kmeň W3110 bez plazmidu boli v raste suprimované pomocou AEC, ale inhibícia rastu sa odstránila pridaním L-lyzínu.

Minimálne médium M9

A: (20xM9)

	Na2HP04.12H2O	303 g/1
	KH2PO4	60 g/1
	NaCl	10 g/1
	NH4C1	20 g/1
B:	IM MgSO4
C:	50 % glukóza
D.	1 g/1 tiaminu

A, B, C a D opísané skôr sa oddelene sterilizovali a zmiešali sa v pomere A : B : C : D:voda = 5 : 0,1 : 1 : 0,1 : : 95.

<2> Príprava mutantného DDPS génu (dapA *)

Predpokladalo sa, že kmeň nesúci plazmid, ktorý obsahuje dapA* kódujúci DDPS s desenzibilizovanou inhibiciou L-lyzínom, by mohol rásť na minimálnom médiu M9, ku ktorému sa pridalo značné množstvo AEC. Kmeň nesúci plazmid, ktorý obsahuje dapA *, bol vyselektovaný na základe rastovej rezistencie proti AEC.

Aby sa účinne dosiahol dapA *, gény dapA na pdapA 1 a pdapA2 pripravené v bode <1> sa podrobili mutačnému pôsobeniu.

1.2.1 Hľadanie kmeňa nesúceho plazmid s dapA* v selektívnych podmienkach

Kmene W3110/pdapAl a W3110/pdapA2 získané spôsobom ako to je opísané skôr sa kultivovali na agarových platniach s médiom M9 obsahujúcich rôzne koncentrácie AEC. Prostredníctvom AEC sa zistili koncentrácie rastových inhibitorov a skúmali sa selekčné podmienky na kmeň nesúci plazmid obsahujúci dapA *.

Rast transformantov na médiu M9 s obsahom AEC v rôznych koncentráciách je uvedený v tabuľke 1. V tejto tabuľke „+“ označuje rast transformantu a označuje absenciu rastu.

AEC koncentrácia (mM)	W3110/pdapAl	W3110/pdapA2
250
125	-
60	-
30	-
15	+
8	+	+
4	+	+
2	+	+

Smer transkripcie dapA génu na pdapAl je v súlade so smerom transkripcie lacZ promótora (obrázok 1). Takto sa zistilo, že gén dapA na pdapAl zabezpečil rezistenciu proti AEC v značne vysokých koncentráciách dokonca aj vtedy, ak dapA zostal štandardný, pretože jeho exprimačné množstvo bolo amplifikované promótorom lacZ, kým gén dapA na pdapA2 mal menšie exprimačné množstvo a zabezpečil rast pomocou AEC pri nižších koncentráciách, pretože smer transkripcie bol opačný vzhľadom na promótor lacZ, a promótor vlastného dapA bol tiež deficientný (rast bol suprimovaný v dávkach po 30 mM v prípade kmeňa W3110/pdapAl, a po 15 mM v prípade kmeňa W3110/pdapA2). Bolo potvrdené, že inhibícia restu sa eliminovala súčasným pridaním L-lyzínu.

Preto sa použil pdapA2 ako objekt zavedenia mutácie. Médium pripravené pridaním 60 mM AEC k minimálnemu médiu M9 sa použilo na selekciu kmeňa nesúceho plazmid s dapA *. Toto médium sa v príklade 1 označuje ako „selekčné médium“.

1.2.2 In vitro mutačné pôsobenie hydroxylamínu na pdapA2

In vitro spôsob mutačného pôsobenia, v ktorom boli plazmidy priamo vystavené účinkom hydroxylamínu, bol použitý na zavedenie mutácie do plazmidu pdapA2.

pg DNA sa vystavovalo účinkom 0,4 M hydroxylamínu pri 75 °C 1 až 4 hodiny (0,1 M KH₂PO₄-1 mM EDTA, pH 6,0): 100 μΐ, 1 M hydroxylamín-1 mM EDTA (pH 6,0): 80 pl, DNA: 2 pg, celková: 200 pl doplnením vodou). DNA po ukončení postupu sa purifikovala skleným práškom, a zaviedla sa do E. coli W3110, a rozotrela sa po kompletnom médiu (L-bujón: 1 % Bacto tryptónu, 0,5 % kvasinkového extraktu, 0,5 % NaCl, 1,5 % agaru), aby sa vytvorili kolónie. Replikovali sa na selekčnom médium opísanom v bode (1.2.1), a baktérie, ktoré vytvorili kolónie na selekčnom médiu, sa vyselektovali. Po dvoch experimentoch sa získali kandidáti mutantných plazmidov v celkovom počte 36 kmeňov.

Celkovo 36 takto získaných kandidátov sa opäť naočkovalo na selekčné médium a potvrdila sa rezistencia proti AEC.

1.2.3 Izolácia génu dapA * a hľadanie dapA* produktu

Mutantné pdapA2 sa získali z 36 opísaných kmeňov. Kmeň deficientný v dapA, JE7627, sa transformoval s nimi, respektíve so štandardným pdapA2. Z každého z transformovaných kmeňov sa pripravil bezbunkový extrakt a stanovila sa enzymatická aktivita DDPS.

Bezbunkový extrakt (roztok surového enzýmu) sa pripravil nasledovným spôsobom. Transformovaný kmeň sa kultivoval v 2xTY médiu (1,6 % Bacto tryptónu, 1 % kvasinkového extraktu, 0,5 % NaCl), a izoloval sa (pri optickej hustote 660 nm (OD₆₆₀) približne 0,8. Bunkový pelet sa premyl s 0,85 % NaCl pri 0 °C a suspendoval sa v 20 mM tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (pH 7,5) s obsahom 400 mM KC1. Bunky boli rozbité sonifikovaním (0 °C, 200 W, 10 minút). Roztok rozbitých buniek sa centrifugoval pri 33000 otáčkach/minútu 1 hodinu pri 0 °C, aby sa získal supematant, ku ktorému sa pridal síran amónny s cieľom získať 80 %-nú nasýtenosť. Potom sa roztok skladoval cez noc pri 0 °C a potom sa centrifugoval. Pelet sa rozpustil v 20 mM tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (pH 7,5) - 400 mM KC1.

Enzymatická aktivita DDPS sa stanovovala v podľa spôsobu autorov Yugari a spol. (Yugari Y. a Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240,4710,1962). Absorbancia reakčnej zmesi nasledovného zloženia sa merala pri 37 °C pomocou spektrofotometra pri vlnovej dĺžke 270 nm v čase, a meral sa vzniknutý dihydrodipikolinát. Pyrohroznan sodný sa odstránil z reakčného systému, ktorý sa použil ako slepá kontrola.

Zloženie reakčného roztoku:

mM imidazol-HCl, pH 7,4 mM L-aspartosemialdehyd mM pyrohroznan sodný roztok enzýmu voda (vyvážiť) celkom: 1,0 ml

Pri meraní enzymatickej aktivity DDPS sa do roztoku enzymatickej reakcie pridávali rôzne koncentrácie L-lyzínu a stanovil sa stupeň inhibície L-lyzínom. Ako to je znázornené na obr. 2, štandardná DDPS bola inhibovaná L-lyzínom. Mutantné plazmidy pochádzajúce z transformovaných kmeňov, kde sa DDPS dala ťažko inhibovať L-lyzínom v porovnaní so štandardom, sa našli tri druhy medzi 36 druhmi kandidátnych plazmidov. Boli označené ako pdapAS8, pdapAS9 a pdapAS24. Podľa nasledovného stanovenia bázovej sekvencie sa zistilo, že pdapAS8 a pdapAS9 niesli tú istú mutáciu.

Stupeň desenzibilizácie inhibície L-lyzinom bol rôzny v týchto troch druhoch mutantnej DDPS kódovanej plazmidmi pdapAS8, pdapAS9 a pdapAS24, ale inhibícia L-lyzínom bola desenzibilizovaná vo všetkých troch druhoch. Hoci špecifická aktivita enzýmu by mohla byť ovplyvnená rastovými podmienkami buniek a prípravou vzoriek, zistilo sa, že bola v každom prípade trochu znížená v porovnaní so štandardom. Usúdilo sa však, žc by nespôsobili nijaký vážny problém, keby boli použité ako materiál na šľachtenie.

1.2.4 Stanovenie bázovej sekvencie mutantného dapA génu

Nukleotidové sekvencie mutantných dapA génov sa stanovili podľa bežného postupu s použitím prístroja na sekvenovanie DNA (ABI model 373A, Applied Biosystem Inc.). 513. C bol zamenený za T v pdapASS a pdapAS9, a 623. C bol zamenený na T v pdapAS24 v sekvencií štandardného dapA génu uvedeného v sekv. č. 3. Bolo tak zistené, že 81. alanínový zvyšok bol zamenený za valínový zvyšok v DDPS kódovanej plazmidmi pdapAS8 a pdapAS9, a 118. histidínový zvyšok bol zamenený za tyrozínový zvyšok v DDPS kódovanej plazmidom pdapAS24 v aminokyselinovej sekvencií DDPS uvedenej v sekv. č. 4.

1.2.5 Príprava dapA s dvojitou mutáciou

Získali sa dva druhy mutantných dapA génov ako to bolo opísané. Aby sa overilo, či desenzibilizácia inhibície pre tieto mutácie funguje aditívne alebo nie, pripravil sa plazmid obsahujúci mutantný dapA s oboma mutáciami. Postup prípravy je uvedený na obrázku 3. Získaný plazmid s dvojitou mutáciou bol označený ako pdapAS824.

Príklad 2: Príprava mutantného AKIII génu <1> Klono vanie štandardného lysC génu

Bázová sekvencia AKIII génu (lysC) baktérií E. coli už bola publikovaná (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., a Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986), a je známe, že jej otvorený čítací rámec (ORF) má 1347 bázových párov, a kóduje proteín so 449 aminokyselinovými zvyškami. V tomto géne je prítomný operátor a podlieha supresii L-lyzínom. Takže, aby sa odstránila operátorová oblasť, oblasť obsahujúca iba SD sekvenciu a ORF sa amplifikovala pomocou PCR postupu, a klonovala sa.

Celková genómová DNA baktérií E. coli kmeňa K-12 MC 1061 bola pripravená podľa postupu autorov Saito a Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, 1963). Pripravili sa dva druhy printerov so sekvenciami uvedenými v sekv. č. 5 a sekv. č. 6, ktoré sa použili na realizovanie PCR reakcie podľa spôsobu Erlicha a spol. (PCR Technology, Stockton Press, 1989) a lysC gén sa amplifikoval. Získaná DNA sa poštiepila enzýmami BamHI a Asel, jej konce sa potom zatupili, a vložila sa na miesto Smal multikópiového vektora pUC18. Toto miesto Smal je lokalizované downstream od lacZ promótora prítomného vo vektore, a keď sa rekombinantná DNA získaná vložením DNA fragmentu na Smal miesto vektora pUC18 zavedie do E. coli, potom sa vložený DNA fragment transkribuje prostredníctvom pokračujúcej transkripcie z lacZ promótora. Po vložení PCR fragmentu na Smal miesto vektora pUC18 sa získali dva druhy plazmidov, ktorými boli pLYSCl, ako plazmid vložený v opačnej orientácii, a pLYSC2, ako plazmid vložený v pozitívnom smere transkripcie génu lysC, vzhľadom na smer transkripcie promótora lacZ (obrázok 4).

Keď sa tieto plazmidy použili na transformáciu baktérií E. coli GT3 (thrAlOIób metLM1005 lysC1004) ako kmeňa úplne deficientného v AKI, II, III, auxotrofia GT3 pre homoserín a kyselinu diaminopimelovú bola komplementovaná. Bolo tak potvrdené, že DNA fragmenty vložené do oboch plazmidov obsahujú gén lysC kódujúci aktívnu AKIII.

Transformovaný kmeň získaný zavedením pLYSCl do kmeňa úplne deficientného v AK, kmeň E. coli GT3 sa označil ako GT3/pLYSCl, a transformovaný kmeň získaný zavedením pLYSC2 do kmeňa E. coli GT3 bol označený ako GT3/pLYSC2. Do minimálneho média M9 sa pridalo značné množstvo L-lyzínu, a oba kmene, GT3/pLYSCl a GT3/pLYSC2, sa kultivovali. Oba kmene, GT3/pLYSCl aj GT3/pLYSC2, nesú plazmidy obsahujúce štandardný gén lysC, v ktorom AKIII kódovaná génom lysC na plazmidoch je jediná AK. Štandardná AKIII, ako jediná AK, je inhibovaná L-lyzínom v prítomnosti značného množstva L-lyzínu. Takto oba kmene nemohli syntetizovať L-treonín, L-izoleucín, L-metionín a kyselinu diaminopimelovú (DAP), a boli suprimované v raste.

<2> Príprava mutantného AKIII génu (lysC*)

Predpokladalo sa, že kmeň nesúci plazmid, ktorý obsahuje lysC* kódujúci AK s desenzibilizovanou inhibiciou L-lyzínom, by mohol rásť na minimálnom médiu M9, do ktorého sa pridalo značné množstvo L-lyzínu. Kmeň nesúci plazmid, ktorý obsahuje lysC*, sa vyselektoval selekciou

SK 284047 Β6 kmeňov na rast rezistentný proti L-lyzínu alebo AEC, ako analógu L-lyzínu.

Aby sa účinne získal gén lysC*, gény lysC na plazmidoch pLYSCl a pLYSC2 pripravených v bode <1> boli podrobené mutačnému pôsobeniu.

2.2.1 Hľadanie selekčných podmienok pre kmeň nesúci plazmid, ktorý obsahuje lysC*

Kmene GT3/pLYSCl a GT3/pLYSC2 sa kultivovali na agarových platniach média M9 obsahujúcich rôzne koncentrácie L-lyzínu alebo AEC. Stanovili sa koncentrácie L-íyzínu a AEC inhibujúce rast, a stanovili sa selekčné podmienky pre kmeň nesúci plazmid, ktorý obsahuje lysC*.

Rast transformantov na médiu M9 obsahujúcom L-lyzín alebo AEC v rôznych koncentráciách je znázornený v tabuľke 2. V tejto tabuľke „+“ označuje rast transformantu, „±“ označuje slabý rast a označuje absenciu rastu.

Tabuľka 2

Rast a koncentrácia L-lyzínu (mM)

	0	02	0,4	0,8	1.5	3	6	12	25	50	100	200
GB/pLYSCl
GT3/pLYSC2	+	+	+	+	+	+	-L	4-	+	+	±	-

Rast a koncentrácia AEC (mM)

	0	0,2	0,4	0,8	1,5	3	6	12	25	50
GT3/pLYSCl	+
GT3/pLYSC2	+	±	±	±	±	±	-	-	-	-

Smer transkripcie lysC génu na plazmide pLYSC2 súhlasí so smerom transkripcie prostredníctvom lacZ promótora (obrázok 4). Tak sa zistilo, že gén lysC na plazmide pLYSC2 zabezpečil rezistenciu proti L-lyzinu a AEC v značne vysokých koncentráciách, dokonca aj keď lysC ostal štandardný, pretože jeho exprimačné množstvo bolo amplifikované lacZ promótorom, kým gén lysC na plazmide pLYSCl sa vyznačoval nižším cxprimačným množstvom a zabezpečil inhibíciu v raste L-lyzínom a AEC pri nižších koncentráciách, pretože smer transkripcie bol obrátený vzhľadom na lacZ promótor, a promótor samotný bol tiež deficientný (rast nebol suprimovaný až do pridávania dávky 100 mM L-lyzínu a pridávania dávky 3 mM AEC v prípade kmeňa GT3/pLYSC2, kým rast bol úplne suprimovaný pri pridávaní dávky 0,2 mM tak L-lyzínu, ako aj AEC v prípade kmeňa GT3/pLYSCl). Bolo potvrdené, že inhibícia rastu sa eliminovala súčasným pridávaním homoserínu a kyseliny diaminopimelovej.

Preto pLYSCl sa použil na experimenty so zavedením mutácií. Médium pripravené pridaním 10 mM L-lyzínu alcbo 0,2 mM AEC do minimálneho média M9 sa použilo na selekciu kmeňa nesúceho plazmid obsahujúci lysC*. Toto médium je v príklade 2 označované ako „selekčné médium“.

2.2.2 In vitro mutačné pôsobenie hydroxylamínu na pLYSCl

Dva druhy postupov sa použili na zavedenie mutácie do plazmidu pLYSCl, ktoré boli postupom in vitro mutačného pôsobenia, v ktorých plazmidy sa priamo vystavujú účinkom hydroxylamínu, a dodatočným postupom in vivo mutačného pôsobenia, v ktorom bunka nesúca plazmid sa vystavuje účinkom nitrózoguanidínu (NTG) a potom sa plazmid vyextrahuje, aby sa dosiahla rozmanitosť mutácie, pretože sa očakávajú mutácie iné než sú mutácie z cytozínu na tymidín po účinku hydroxylamínu.

In vitro mutačné pôsobenie hydroxylamínu pg DNA sa pri 75°C vystavili účinkom 0,4 M hydroxylamínu počas 1 až 4 hodín (0,1 M KH₂PO₄-1 mM EDTA (pH 6,0): 100 μί, 1 M hydroxylamín-1 mM EDTA (pH 6,0): 80 pl, DNA: 2 pg, celkom: 200 pl doplnením vodou). DNA po tomto postupe sa purifikovala skleným práškom, zaviedla sa do kmeňa GT3 E. coli úplne deficientného v AK, a rozotrela sa po kompletnom médiu (L-bujón: 1 % Bacto tryptónu, 0,5 % kvasinkového extraktu, 0,5 % NaCl,

1,5 % agaru), aby sa vytvorili kolónie. Zreplikovali sa na selekčnom médium opísanom v bode (2.2.1), a kmene schopné rastu na selekčnom médiu sa vyselektovali ako kandidátne kmene. Zistilo sa, že pomer vzhľadu transformantov a mutačný pomer sa zmenili (obrázok 5). Mutantné kmene sa získali účinkom mutagénu počas 4 hodín v značne vysokom pomere od 0,5 do 0,8 %.

In vitro mutačné pôsobenie nitrózoguanidínu (NTG) pLYSCl sa zaviedol do kmeňa E. coli MC1061 a celé bunky sa vystavili účinkom pôsobenia NTG. Po pôsobení sa bunky kultivovali cez noc, aby sa mutácie zafixovali, a potom sa plazmid vyextrahoval a zaviedol do kmeňa E. coli GT3. Konkrétne, transformovaný kmeň sa kultivoval v médiu 2xTY (1,6 % Bacto tryptónu, 1 % kvasinkového extraktu, 0,5 % NaCl), vyizoloval sa pri OD₆₆₀ približne 0,3, premyl sa s TM tlmivým roztokom, ktorý je opísaný, potom sa suspendoval v roztoku NTG (ktorý sa pripravil rozpustením NTG v koncentrácii 0,2 mg/ml v TM tlmivom roztoku), a nechal sa pôsobiť pri 37 °C 0 až 90 minút. Bunky sa premyli TM tlmivým roztokom a médiom 2xTY, a potom sa mutácie fixovali kultivovaním v médiu 2xTY cez noc. Potom sa plazmidová DNA z buniek vyextrabovala a zaviedla sa do kmeňa E. coli GT3. Skríning kandidátov sa uskutočnil rovnakým spôsobom to bolo v prípade in vitro mutácií, a získali sa mutanty rezistentné proti lyzinu (Lys^R) a proti AEC (AEC^R).

Zloženie TM tlmivého roztoku

Tris 50 mM

Kyselina maleínová 50 mM (NH₄)₂SO₄ 1 g/1

MgSO₄.7H₂O 0,1 g/1

Ca(NO₃)₂ 5 mg/1

FeS0₄.7H₂0 0,25 mg/1 pH bolo nastavené pomocou NaOH na 6,0.

Celkom 180 kmeňov kandidátnych kmeňov získaných spôsobom ako to je opísané skôr (pôsobenie hydroxylamínu: 48 kmeňov, pôsobenie NTG: 132 kmeňov) sa opäť nanieslo na selekčné médium, a rezistencia proti AEC a L-lyzínu sa potvrdila pri 153 kmeňoch. Majúc na zreteli rozdiely v akumulácii aminokyselín v médiu, týchto 153 kmeňov sa rozdelilo do 14 skupín, a AK aktivita sa odmerala po vyselektovaní reprezentatívnych kmeňov z každej skupiny. Medzi mutantnými kmeňmi získanými pôsobením hydroxylamínu a mutantnými kmeňmi získanými pôsobením NTG sa nezistili veľké rozdiely v aktivite AK. Nasledovné experimenty sa preto uskutočnili bez robenia rozdielov medzi nimi.

2.2.3 Izolácia génu lysC* a skúmanie produktu lysC*.

Kmene číslo 24, 43, 48, 60, 80, 117,126, 149, 150, 156, 158, 167,169 a 172 sa vyselektovali ako reprezentatívne kmene uvedených 14 skupín. Mutantné plazmidy odvodené z pLYSCl sa získali z každej z týchto skupín, a boli označené ako pLYSCl *24, pLYSCl*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl*80, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl *149, pLYSCl*150, pLYSCl *156, pLYSCl *158, pLYSCl *167, pLYSCl *169 a pLYSCl *172. Kmeň GT3 úplne deficientný v AK bol transformovaný týmito génmi, respektíve štandardným génom pLYSCl. Z každého z transformovaných kmeňov sa pripravil bezbunkový extrakt, a stanovila sa aktivita enzýmu AKIII.

Bezbunkový extrakt (surový roztok enzýmu) sa pripravil nasledovným spôsobom. Transformovaný kmeň sa kultivoval v médiu 2xTY a izoloval sa pri OD₆₆₀ približne 0,8. Bunky sa premyli s 0,02 M KH₂PO₄ (pH 6,75)-0,03 M β-merkaptoetanolu pri 0 °C, a bunky sa rozbili sonifikovaním (0 °C, 100 W, 30 minút x 4). Roztok rozbitých buniek sa centrifugoval pri 33000 otáčkach/minútu 1 hodinu pri 0 °C s cieľom získať supematant, ku ktorému sa pridal síran amónny, aby sa dosiahla 80 %-ná saturácia. Po centrifugovaní sa pelet rozpustil v 0,02 M KH₂PO₄ (pH 6,75)-0,03 M β-merkaptoetanolu, a skladoval sa cez noc pri 0 °C.

Enzymatická aktivita AKIII sa odmerala podľa spôsobu Stadtmana a spol. (Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G. a Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033, 1961). Konkrétne, reakčný roztok nasledovného zloženia sa inkuboval pri 27 °C 45 minút, a pridal sa k nemu roztok FeCl₃ (2,8 N HC1 0,4 ml + 12 % TCA 0,4 ml + 5 % FeCl₃-6H₂O/0,l N HC1 0,7 ml), aby sa získala farebná reakcia, centrifugoval sa a odmerala sa absorbancia supematantu pri 540 nm. Aktivita bola vyjadrená množstvom kyseliny hydroxamovej vzniknutej za 1 minútu (1 U = 1 pmol/min). Koeficient molámej absorpcie bol 600. Z reakčného roztoku sa odstránil asparagan draselný, a použil sa ako slepá kontrola.

Zloženie reakčnej zmesi reakčná zmes *1 0,3 ml roztok hydroxylamínu *2 0,2 ml

0,1 M asparaganu draselného (pH 7,0) 0,1 ml roztok enzýmu voda (vyvážiť) celkom 1,0 ml *1: 1 M Tris-HCl (pH 8,1) 9 ml + 0,3 M MgSO₄ 0,5 ml + + 0,2 M ATP (pH 7,0) 5 ml *2: 8 M roztok hydroxylamínu neutrálizovaný pomocou KOH tesne pred použitím

Pri meraní enzymatickej aktivity AK sa k reakčnému roztoku enzýmu pridávali rôzne koncentrácie L-lyzínu a stanovil sa stupeň inhibície L-lyzínom. Výsledky sú uvedené na obrázku 6 a v tabuľke 3. Štandard a č. 24, 43, 48, 60, 80,117 a 126 sú na obrázku 6A, č. 149, 150, 156, 158, 167, 169 a 172 sú na obrázku 6B.

Ako to vidieť z týchto výsledkov, štandardná AKIII bola silne inhibovaná L-lyzinom. Inhibícia o 50 % bola približne pri 0,45 mM L-lyzínu, a inhibícia o 100 % pri 5 mM. Naopak, hoci mutantné AKIII získané v tomto prípade mali rôzny stupeň dcscnzibilizácic, inhibícia L-lyzínom bola desenzibilizovaná vo všetkých 14 druhoch. Osobitne v prípadoch č. 24, 80, 117, 169 a 172 bola inhibícia sotva pozorovateľná dokonca aj pri 100 mM L-lyzínu, a mali 50 %-né inhibičné koncentrácie, ktoré boli aspoň 200-násobkom v porovnaní s koncentráciami zistenými pri štandarde. Špecifická aktivita založená na celkovom proteíne, ktorá mohla byť ovplyvnená rastovými podmienkami buniek a prípravou vzoriek, bola takmer vo všetkých prípadoch rovnaká alebo vyššia než sa zistilo pri štandarde, a bol malý problém poklesu aktivity v dôsledku zavedenia mutácie (tabuľka 3). Na základe tejto skutočnosti sa očakávalo, že aktívne centrum AKIII bolo vzájomne nezávislé od regulačného miesta L-lyzínu. V tabuľke 3 stupeň desenzibilizácie inhibície (%) sa vzťahuje na aktivitu AK v prítom nosti 100 mM L-lyzínu v porovnaní s aktivitou AK v neprítomnosti L-lyzínu v reakčnom roztoku. Tepelná stabilita (%) sa vzťahuje na pomer zachovania aktivity po vystavení účinku 55 °C počas 1,5-hodiny.

Tabuľka 3

	Špecifická aktivita (U/mg proteínu)	Stupeň desenzibilizácie inhibície (%)*'	Tepelná stabilita (%)‘2
Štandard	0,0247	0	18
č. 117	0,0069	120	0
č. 24	0,0218	100	30
č. 80	0,0244	99	36
č. 172	0,0189	97	0
č. 169	0,0128	96	2
č. 150	0,0062	77	25
č. 126	0,0250	61	39
č. 149	0,0256	59	9
č. 167	0,0083	43	45
č. 48	0,0228	38	42
č. 60	0,0144	35	9
č. 158	0,0224	22	42
č. 156	0,0101	18	2
č. 43	0,0212	17	0

*1: Aktivita AK (%) v prítomnosti 100 mM L-lyzínu v porovnaní s aktivitou AK v neprítomnosti L-lyzínu *2: Pomer zachovania aktivity (%) po vystavení účinku 55°C počas 1,5-hodiny

Potom sa stanovila stabilita mutantných enzýmov. Keď jc cieľom zvýšiť aktivitu enzýmu, je dôležité, aby vzniknutý enzým v bunkách zachoval svoju stabilitu. In vitro meranie je problematické kvôli rozdielu medzi vnútrobunkovými a extracelulámymi aktivitami proteáz a vplyvu tlmivých roztokov na skladovanie enzýmov in vitro. Ale kvôli výhodnosti sa tepelná stabilita mutantnej AKIII stanovovala in vitro ako jeden parameter.

Vychádzajúc z výsledkov stanovenia inaktivačnej teploty AKIII za rôznych podmienok, meral sa pomer zachovania aktivity po pôsobení pri 55 °C počas 90 minút. Ako je to uvedené v tabuľke 3, polovica enzýmov mala lepšie výsledky ako boli výsledky štandardu. Vo všeobecnosti, mutantný enzým je často nestabilný v porovnaní so štandardom. Ale niektoré z mutantných AKIII získaných v tomto prípade mali stabilitu lepšiu ako štandard, zdalo sa, že mnohé z nich budú dostatočne užitočné v praktickom využití na prípravu L-lyzínu.

2.2.4 Stanovenie bázovej sekvencie štandardného génu lysC a mutantného lysC

Bázová sekvencia štandardného génu lysC získaného v tomto prípade sa stanovovala podľa bežného postupu s použitím prístroja na sekvenovanie DNA (ABI model 373A firmy Applied Biosystem Inc.) (sekv. č. 7). Ako výsledok sa našli rozdiely na šiestich miestach (dva na úrovni aminokyselín) v porovnaní s už publikovanými sekvenciami génu lysC baktérií kmeňa E. coli K-12 JC411 (Cassan, M., Rarsot, C., Cohen, G. N. a Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986). Uvažuje sa, že rozdiel na šiestich miestach je v dôsledku rozdielu v použitom bakteriálnom kmeni.

Podobným spôsobom sa stanovili bázové sekvencie pre každý z génov lysC* prítomných na tých 14 druhoch mutantných pLYSCl, a stanovili sa mutačné body. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4. V tejto tabuľke údaje v zátvorkách ukazujú mutácie aminokyselinových zvyškov založených na mutáciách nukleotidov. Typov mutácii bolo 12, pretože dve súpravy (č. 48 a 167, a č. 24 a 80) mali medzi 14 druhmi presne ten istý typ mutácií. Čo sa týka typov mutácií, č. 149, 150, 156, 158, 167, 169 a 172 sa získali pôsobením hydroxylamínu, a č. 24, 43, 48, 60, 80, 117 a 126 sa získali pôsobením NTG. Ale čo sa týka zloženia mutácií, ktorákoľvek z nich spočívala v mutácii z cytozínu na tymín, alebo v mutácii z guanínu na adenín na kódujúcom vlákne v dôsledku mutácie z cytozínu na tymín na nekódujúcom vlákne.

Tabuľka 4. Stanovenie mutačných bodov v lysC*

Mutačný typ lysC*	Mutagén	Mutačný bod (zmena v aminokyseline)
č. 126	N	GGT->GA*T	(325Gly-»Asp)
č.43	N	GG1->GA*T	(323Gly-^Asp)
		GGC->GA‘C	(408Gly-»Asp)
i. 149	H	CGT->T*GT	(34Arg-»Cys)
		GGT->GA*T	(323Gly>Asp)
č. 48/167	N/H	CTC->T*TC	(3,sLeu->Phe)
č. 150	H	ATG—> AT A*	(’18Met-»Ile)
č. 172	H	’75C->T	(tichá)
		ATG—>ATA*	(3l8Met->Ile)
		GTG->A*TG	(!4,Val—>Met)
č. 117	N	TCA->TT*A	(34!Ser->Ľeu)
č. 158	H	GTG^A*TG	(J47Val-»Met)
č. 24/80	N/H	ACC^AT'C	(352Thr->Ile)
č. 169	H	W3C^T	(tichá)
		ACC—>AT*C	(”2Thr->Ile)
		TCT->TT*T	(369Ser->Phe)
č. 60	N	8S5g->a	(tichá)
		GAA->A*AA	(164G1u—>Lys)
č. 156	H	ATG->ATA*	(4,7Met—>Ile)
		TGT->TA*T	(4l5Cys—>Tyr)
		20l4C->T	(tichá)

*:H; pôsobenie hydroxylamínu, N; pôsobenie NTG

Príklad 3: Fermentačná produkcia L-lyzínu pomocou kmeňa, do ktorého je zavedený dapA*

Predpokladá sa, že na produkciu L-lyzínu s použitím baktérií rodu Escherichia, ako je to uvedené v japonskom Patente č. 56-18596, US Patente č. 4,346,170 a v Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227-231, 1982, je dôležité, aby hostiteľ, ktorý má mať zvýšenú DDPS, mal aspartokinázu, ktorá je zmenená tak, aby nepodliehala inhibícii L-lyzínom. Je predpoklad, že baktérie rodu Serraiia sú podobné baktériám rodu Escherichia. Príkladom takéhoto kmeňa môžu byť baktérie produkujúce L-treonín. Čo sa týka baktérií S¹, marcescens produkujúcich L-treonín, je známy kmeň rezistentný proti AHV (kyselina a-amino-β-hydroxyvalérová) ako analógu treonínu (S. Komatsubara, M. Kisumi a I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834, 1978). Špecificky ako taký kmeň je uvedený kmeň Serratia marcescens AJ13125. Kmeň bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonsko) pod registračným číslom FERM P-14983 dňa 12. júna 1995 a bol prenesený do medzinárodného depozitu podľa Budapeštianskej dohody dňa 4. marca 1996 a bolo mu pridelené registračné číslo FERMBP-5441.

Na druhej strane, dapA* obsiahnutý v pdapAS24 (v ktorom je 118. histidínový zvyšok nahradený tyrozínovým zvyškom) sa vyselektoval ako dapA *, ktorý sa má zaviesť do 5. marcescens, na základe stupňa desenzibilizácie inhibície a špecifickej aktivity enzýmu. Najprv v záujme zvýšenia exprimačného množstva dapA * a zvýšenia stability plazmidu, mutantný dapA *, ktorý bol na pdapAS24 (ďalej citovaný ako „dapA*24“) sa ligoval downstream od promótora génu rezistencie proti tetracyklínu na pVIC40, a RSF24P sa získal ako to je znázornené na obrázku 7.

Kmeň získaný zavedením plazmidu RSF24P do kmeňa E. coli JM109 bol označený ako AJ12395, ktorý bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology dňa 28. októbra 1993 pod registračným číslom FERM P—13935, a bol prenesený z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody dňa L novembra 1994, a bol uložený pod registračným číslom FERM BP-4858. Kmene nesúce pdapAS8 a pdapAS9 neboli uložené. Ale všetky mutačné body génu dapA * na každom z plazmidov sa determinovali ako to bolo opísané. Takže pre tých, ktorí sú s problematikou oboznámení, je ľahké získať plazmid z uvedených uložených baktérií pomocou postupu autorov Maniatis a spol. (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21, 1989), a získať cieľový gén s použitím postupu pre cielenú mutagenézu (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63, 1989).

Plazmid RSF24P bol zavedený do kmeňa AJ13125 s použitím bežných postupov, získal sa AJ 13125/RSF24P, a vyhodnotila sa jeho produktivita L-lyzínu.

Na druhej strane sa pripravil RSFP ako kontrolný plazmid. Konkrétne, z poštiepeného materiálu pVIC40 dvojnásobne poštiepeného enzýmom BamHl a Dral sa vyselektoval veľký fragment ako to je znázornené na obrázku 7, jeho konce sa otupili Klenowým fragmentom DNA polymerázy. Veľký fragment s otupenými koncami bol samoligovaný, čím sa získal plazmid RSFP. RSFP sa zaviedol do kmeňa AJ13125 použitím bežných postupov, a získal sa AJ13125/RSFP. Aj tu sa vyhodnotila produktivita L-lyzínu.

Kultivácia sa uskutočnila za miešania rýchlosťou 114 až 116 otáčok/minútu počas 72 hodín a pri teplote 30 °C použitím nasledovného média. Výsledky sú uvedené v tabuľke 5.

Médium na produkciu L-lyzínu

(NH4)SO4	16 g/1
kh2po4	1 g/1
MgSO4.7H2O	1 g/1
FeSO4.7H2O	0,01 gd
MnSO4.5H2O	0,01 g/1
kvasinkový extrakt (Difco)	2 g/1
L-metionín	0,5 g/1
L-treonín	0,1 g/1
L-izoleucín	0,05 g/1
pH sa nastaví na 7,0 pomocou ΚΟΗ, a autoklávuje

sa pri 115 °C 10 minút (16/20 objemu)

B: 20 % glukóza (autoklávovať pri 115 °C 10 minút) (4/20 objemu)

C: Liekopisný CaCO₃ (sterilizovaný teplom v suchom stave pri 180 °C 2 dni) (30 g/1)

A a B sa zmiešajú v pomere A : B = 4 : 1, C sa pridá k zmesi v množstve 30 g na liter a rozpustí sa, a pridá sa antibiotikum (streptomycín: 200 pg/ml).

Tabuľka 5

Kmeň baktérií	Produkované množstvo L-lyzín hydrochloridu
AJ13125/RSF24P	3,5 g/1
AJ13125/RSFP	0g/l

Príklad 4: Fermentačná produkcia L-lyzínu kmeňom, do ktorého sú zavedené dapA* a lysC*

Účinok mutantného DDPS na produkciu L-lyzínu bol ukázaný v príklade 3. Aby sa dosiahlo ďalšie zlepšenie, mutantný gén AKIII získaný v príklade 2 sa nechal koexistovať s mutantným DDPS génom. Mutantný AKIII gén koexistujúci s mutantným DDPS génom sa vyselektoval pôvodne z kmeňa č. 80 (lysC*80) na základe enzymatickej aktivity a podobne.

lysC*80 sa použil po jeho vyštiepení z plazmidu pLLC*80 (obr. 8) pripraveného ligáciou lysC* nachádzajúceho sa v pLYSCl*80 (ďalej uvádzaný ako ,,/y.sC*éO“) downstream od promótora lacZ vektora pHSG399 (vyrába ho Takara Shuzo Co., Ltd.), na ktorom je inzerčné miesto s opačným smerovaním vzhľadom na pUC18, aby sa zvýšilo exprimačné množstvo lysC*. pLLC*80 je plazmid pripravený na to, aby umožnil ZyjC*80 nasmerovať transkripciu do pozitívnej orientácie vzhľadom na lacZ promótor, aby sa zvýšila produktivita L-lyzínu, pretože lysC*80 na pLYSCl*80 má smerovanie transkripcie v opačnej orientácii vzhľadom na lacZ promótor.

Plazmid RSFD80 nesúci gény dapA * a lysC* sa pripravil z pLLC*80 a RSF24P, získaných v príklade 3, ako to je znázornené na obrázku 9. RSFD80 obsahuje dapA*24 a lysC*80 usporiadané v tomto poradí, aby sa umožnil smer transkripcie s pozitívnou orientáciou vzhľadom na promótor (tetP) génu rezistencie proti tetracyklínu na strane downstream od tetP.

Plazmid RSFD80 sa zaviedol do kmeňa E. coli JM109 označeného ako AJ12396. AJ12396 bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology dňa 28. októbra 1993 pod registračným číslom FERM P—13936, a bol prenesený z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody dňa 1. novembra 1994, a bol uložený pod registračným číslom FERM BP-4859. Kmene nesúce pLYSCl*24, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSC 1 *117, pLYSC 1 * 126, pLYSC 1*149, pLYSC 1*150, pLYSCl*156, pLYSCl*158, pLYSCl*167, pLYSCl*169 a pLYSCl*172 neboli uložené. Ale všetky mutačné body lysC* na každom z plazmidov boli určené ako to je opísané. Takže pre tých, ktorí sú s problematikou oboznámení, bude ľahké získať plazmid z uvedených uložených baktérií pomocou postupu autorov Maniatis a spol. (Sambrook, J., Fritsch, F. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21, 1989, a získať cieľový gén s použitím spôsobu cielenej mutagenézy (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63, 1989. RSFD80 bol zavedený do kmeňa AJ13125 podľa bežného postupu, získal sa AJ13125/RSFD80 a stanovila sa uňho produktivita L-lyzínu. Produktivita L-lyzínu sa vyhodnotila aj pri AJ13125/RSFP ako kontroly.

Kultivácia prebiehala počas miešania rýchlosťou 114 až 116 otáčok/minútu počas 72 hodín a pri teplote 30 °C s použitím rovnakej metódy na produkciu L-lyzínu ako to je uvedené v príklade 3. Výsledky sú uvedené v tabuľke 6.

Tabuľka 6

Kmeň baktérií	Produkované množstvo L-lyzín hydrochloridu
AJ13125/RSFD80	9,2 g/1
AJ13125/RSFP	0g/l

Priemyselná využiteľnosť

Podľa súčasného vynálezu sa získal mutantný DDPS gén pochádzajúci z baktérií rodu Escherichia, v ktorých spätná inhibícia L-lyzínom je dostatočne desenzibilizovaná. Baktérie rodu Serratia nesúce gén produkujú L-lyzín v značnom množstve. Produkcia L-lyzínu sa dá zvýšiť zavedením mutantného DDPS génu do baktérií rodu Serratia nesúcich aspartokinázu, v ktorej spätná inhibícia L-lyzínom je desenzibilizovaná.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie (1) Prihlasovateľ: AJINOMOTO Co., INC.

(ii) Názov vynálezu: Spôsob prípravy L-lyzínu (iii) Počet sekvencii: 14 (iv) Adresa pre korešpondenciu:

(A) Adresát: Ajinomoto Co., Inc.

(B) Ulica: 15-1, Kyobashi 1-chome (C) Mesto: Chuo-ku (E) Štát: Japonsko (F) ZIP: 104 (v) Počítačom čitateľná forma:

(A) Druh média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln (vi) Údaje o súčasnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(C) Zatriedenie:

(vii) Údaje o prioritnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(viii) Informácie o právnom zástupcovi:

(A) Meno:

(B) Registračné číslo:

(ix) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón:

(B) Telefax:

(2) Informácie o SEQ ID NO: 1:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná... syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:1:

CCGCAACTACTGACATGACG 20 (2) Informácie o SEQ ID NO:2:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná... syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: sekv. č.2:

AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20 (2) Informácie o SEQ ID NO:3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 1197 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: MC1061 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: prím traseript (B) Poloha: 248 (C) Identifikačná metóda: E (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 272..1150 (C) Identifikačná metóda: E (ix) Znaky:

A) Názov/kľúč: primer bind (B) Poloha: 27..46 (C) Identifikačná metóda: E (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: primer bind (B) Poloha: 1156..1175 (C) Identifikačná metóda: E (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: RBS (B) Poloha: 261..265 (C) Identifikačná metóda: S (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:3:

AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA60

TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG120

GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAÄAAAAACA180

CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA2 40

C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC292

Met Phe Thr Gly Ser íle Val

AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC340

Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser

GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC388

Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala íle

TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA436

Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu

5055

CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT484

Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg íle

6570

CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC

GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT Ala íle Val Thr Pro Met Asp 10

TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT

Leu Lys Lys Leu íle Asp Tyr

30

GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC Val Ser Val Gly Thr Thr Gly

45

CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG

His Ala Asp Val Val Met Met 60

GAA Glu

CAT His

GAG

Glu

ACG Thr (2) Informácie o SEQ ID NO:.4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 292 (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:4:

Met 1	Phe Thr	Gly Ser 5	íle	Val	Ala	íle Val Thr Pro 10	Met	Asp	Glu 15	Lys
Gly	Asn Val	Cys Arg	Ala	Ser	Leu	Lys Lys Leu íle	Asp	Tyr	His	Val
		20				25		30
Ale	Ser Gly	Thr Ser	Ala	íle	Val	ser val Gly Thr	Thr	Gly	G1U	Ser
	35				40		45
Ala	Thr Leu	Asn His	Asp	Glu	His	Ala Asp Val Val	Met	Met	Thr	Leu
	50			55		60
Asp	Leu Ala	Asp Gly	Arg	íle	Pro	Val íle Ala Gly	Thr	Gly	Ala	Asn
65			70			75				80
Ala	Thr Ala	Glu Ala	íle	Ser	Leu	Thr Gin Arg Phe	Asn	Asp	Ser	Gly
		85				90			95
íle	Val Gly	Cys Leu	Thr	Val	Thr	Pro Tyr Tyr Asn	Arg	Pro	Ser	Gin
		100				105		110
Glu	Gly Leu	Tyr Gin	His	Phe	Lys	Ala íle Ala Glu	His	Thr	Asp	Leu
	115				120		125
Pro	Gin íle	Leu Tyr	Asn	Val	Pro	Ser Arg Thr Gly	Cys	Asp	Leu	Leu
	130			13S		140
Pro	Glu Thr	Val Gly	Arg	Leu	Ala	Lys Val Lys Asn	íle	íle	Gly	íle
145			150			155				160
Lys	Glu Ala	Thr Gly	Asn	Leu	Thr	Arg Val Asn Gin	íle	Lys	Glu	Leu
		165				170			175
Val	Ser Asp	Asp Phe	Val	Leu	Leu	Ser Gly Asd Asp	Ala	Ser	Ala	Leu
		160				185		190
Asp	Phe Met	Gin Leu	Gly	Gly	His	Gly Val íle Ser	Val	Thr	Thr	Asn
	195				200		205
Val	Ala Ala	Arg Asp	Met	Ala	Gin	Met Cys Lys Leu	Ala	Ala	Glu	Glu
	210			215		220
His	Phe Ala	Glu Ala	Arg	Val	íle	Asn Gin Arg Leu	Met	Pro	Leu	His
225			230			235				240
Asn	Lys Leu	Phe Val	Glu	Pro	Asn	Pro íle Pro Val	Lys	Trp	Ala	Cys
		245				250			255
Lys	Glu Leu	Gly Leu	Val	Ala	Thr	Asp Thr Leu Arg	Leu	Pro	Met	Thr
		260				265		270
Pro	íle Thr	Asp Ser	Gly	Arg	Glu	Thr Val Arg Ala	Ala	Leu	Lys	His
	275				280		285
Ala	Gly Leu	Leu
	290

(2) Informácie o SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná..syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:5:

CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC532

Pro Val íle Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala íleSer

8085

CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA5 BO

Leu Thr Gin Arg Phe Asn Asp Ser Gly Íle Val Gly Cys Leu ThrVal

95100

ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC628

Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gin Glu Gly Leu Tyr Gin His Phe

105 110115

AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG676

Lys Ala íle Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gin íle Leu Tyr Asn Val

120 125 130135

CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG724

Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu

140 145150

GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA772

Ala Lys Val Lys Asn íle íle Gly íle Lys Glu Ala Thr Gly AsnLeu

155 160165

ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG820

Thr Arg Val Asn Gin íle Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe ValLeu

170 175180

CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT968

Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gin Leu GlyGly

185 190195

CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC916

His Gly Val íle Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp MetAla

200 205 210215

CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT964

Gin Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala ArgVal

220 225230

ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC1012 íle Asn Gin Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val GluPro

235 240245

AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TGT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG1060

Asn Pre íle Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu ValAla

250 255260

ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT1108

Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro íle Thr Asp Ser GlyArg

265 270275

GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG 1158

Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu

280 285290

GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG1197

CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG20 (2) Informácie o SEQ ID NO:6:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 18 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná..syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:6:

GAATTCCTTT GCGAGCAG 18 (2) Informácie o SEQ ID NO:7:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 2147 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi)Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: MC1061 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: -35 signál (B) Poloha: 242..249 (C) Identifikačná metóda: S (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: -10 signál (B) Poloha: 265..273 (C) Identifikačná metóda: S (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: primer bind (B) Poloha: 536..555 (C) Identifikačná metóda: E (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: primer bind (B) Poloha: 2128..2147 (C) Identifikačná metóda: E (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: RBS (B) Poloha: 575..578 (C) Identifikačná metóda: S (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 584..1933 (C) Identifikačná metóda: S (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: terminátor (B) Poloha: 1941..1968 (C) Identifikačná metóda: S (xi) Opis sekvencie: sekv. č.7:

TCGAÄGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCÄGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT60

AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA120

ÄAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA180

AGCATTTATŤ AGCTGÄACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT240

CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATÄAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC300

CCG	GCA	ACG TTG CTA CCC GCA	GTA	CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC	1411
pro	Ala	Thr Leu Leu pro Ala	Val	Arg Ser Asp íle Pro Val Phe Val
		265		270 275
GGC	TCC	AGC AAA GAC CCA CGC	GCA	GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA	1459
Gly	Ser	Ser Lys Asp Pro Arg	Ala	Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys
		280		285 290
ACT	GAA	AAT CCG CCG CTG TTC	CGC	GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG	1507
Thr	Glu	Asn Pro Pro Leu Phe	Arg	Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gin
		295	300	305
ACT	CTG	CTC ACT TTG CAC AGC	CTG	AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC	1555
Thr	Leu	Leu Thr Leu His Ser	Leu	Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe
	310	315		320
CTC	GCG	GAA GTT TTC GGC ATC	CTC	GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC	1603
Leu	Ala	Glu Val Phe Gly He	Leu	Ala Arg His Asn íle ser Val Asp
325		330		335 340
TTA	ATC	ACC ACG TCA GAA GTG	AGC	GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC	1651
Leu	íle	Thr Thr Ser Glu Val	Ser	Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr
		345		350 355
GGT	TCA	ACC TCC ACT GGC GAT	ACG	TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG	1699
Gly	Ser	Thr Ser Thr Gly Asp	Thr	Leu Leu Thr Gin Ser Leu Leu Met
		360	365	370
GAG	CTT	TCC GCA CTG TGT CGG	GTG	GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG	1747
Glu	Leu	5er Ala Leu Cys Arg	Val	Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu
		375	390	305
GTC	GCG	TTG ATT GGC AAT GAC	CTG	TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA	1795
Val	Ala	Leu íle Gly Asn Asp	Leu	Ser Lys Ala Cys Gly val Gly Lys
	390	395		400
GAG	GTA	TTC GGC GTA CTG GAA	CCG	TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT	1843
G1U	Val	Phe Gly Val Leu Glu	Pro	Phe Asn íle Arg Met íle Cys Tyr
405		410		415 420
GGC	GCA	TCC AGC CAT AAC CTG	TGC	TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC	1891
Gly	Ala	ser Ser His Asn Leu	Cys	Phe Leu val Pro Gly Glu Asp Ala
		425		430 435
GAG	CAG	GTG GTG CAA AAA CTG	CAT	AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT	1940
Glu	Gin	Val Val 31n Lys Leu	His	Ser Asn Leu Phe Glu
		440		445
ATGGCCTGGA AGCTATATTT CCGGCCGTAT	TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA	2000
ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT	TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT	2060
ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG	ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA	2120
TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC		2147

(2) Informácie o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 449 (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:8:

CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA KGTfACGGTG AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG

TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG360

CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC420

CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC480

GC7CTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC540

ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595

Met Ser Glu íle

GTT

GTC

TCC

AAA

TTT

GGC

GGT

ACC

AGC

GTA

GCT

GAT

TTT

GAC

GCC

ATG

Val

Val

Ser

Lys

Phe

Gly

Gly

Thr

Ser

Val

Ala

Asp

Phe

Asp

Ala

Met

5

10

15

20

AAC

CGC

AGC

GCT

GAT

ATT

GTG

CTT

TCT

GAT

GCC

AAC

GTG

CGT

TTA

GTT

Asn

Arg

Ser

Ala

Asp

íle

Val

Leu

Ser

Asp

Ala

Asn

Val

Arg

Leu

Val

25

30

35

GTC

CTC

TCG

GCT

TCT

GCT

GGT

ATC

ACT

AAT

CTG

CTG

GTC

GCT

TTA

GCT

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Ala

Gly

íle

Thr

Asn

Leu

Leu

Val

Ala

Leu

Ala

40

45

50

GAA

GGA

CTG

GAA

CCT

GGC

GAG

CSA

TTC

GAA

AAA

CTC

GAC

GCT

ATC

CGC

Glu

Gly

Leu

Glu

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Glu

Lys

Leu

Asp

Ala

íle

Arg

55

60

65

AAC

ATC

CAG

TTT

GCC

ATT

CTG

GAA

CGT

CTG

CGT

TAC

CCG

AAC

GTT

ATC

Asn

íle

Gin

Phe

Ala

íle

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

Tyr

Pro

Asn

Val

íle

73

75

80

CGT

GAA

GAG

ATT

GAA

CGT

CTG

CTG

GAG

AAC

ATT

ACT

GTT

CTG

GCA

GAA

Arg

Glu

G1U

íle

Glu

Arg

Leu

Leu

Glu

Asn

íle

Thr

Val

Leu

Ala

Glu

95

90

95

100

GCG

GCG

GCG

CTG

GCA

ACG

TCT

CCG

GCG

CTG

ACA

GAT

GAG

CTG

GTC

AGC

Ala

Ala

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Pro

Ala

Leu

Thr

Asp

Glu

Leu

Val

Ser

105

110

115

CAC

GGC

GAG

CTG

ATG

TCG

ACC

CTG

CTG

TTT

GTT

GAG

ATC

CTG

CGC

GAA

His

Gly

Glu

Leu

Met

Ser

Thr

Leu

Leu

Phe

Val

Glu

íle

Leu

Arg

Glu

120

125

130

643

691

739

787

835

983

931

979

CGC

GAT

GTT

CÄG

GCA

CAG

TGG

TTT

GAT

GTA

CGT

AAA

GTG

ATG

CGT

ACC

1027

Arg

Asp

Val

Gin

Ala

Gin

Trp

Phe

Asp

Val

Arg

Lys

Val

Met

Arg

Thr

135

140

145

AAC

GAC

CGA

TTT

GGT

CGT

GCA

GAG

CCA

GAT

ATA

GCC

GCG

CTG

GCG

GAA

1075

Asn

Asp

Arg

Phe

Gly

Arg

Ala

Glu

Pro

Asp

íle

Ala

Ala

Leu

Ala

Glu

150

155

160

CTG

GCC

GCG

CTG

CAG

CTG

CTC

CCA

CGT

CTC

AAT

GAA

GGC

TTA

GTG

ATC

1123

Leu

Ala

Ala

Leu

Gin

Leu

Leu

Pro

Arg

Leu

Asn

Glu

Gly

Leu

Val

íle

165

170

175

180

ACC

CAG

GGA

TTT

ATC

GGT

AGC

GAA

AAT

AAA

GGT

CGT

ACA

ACG

ACG

CTT

1171

Thr

Gin

GLy

Phe

íle

Gly

ser

Glu

Asn

Lys

Gly

Arg

Thr

Thr

Thr

Leu

185

190

195

GGC

CGT

GGA

GGC

AGC

GAT

TAT

ACG

GCA

GCC

TTG

CTG

GCG

GAG

GCT

TTA

1219

Gly

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

Tyr

Thr

Ala

Ala

Leu

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

200

205

210

CAC

GCA

TCT

CGT

GTT

GAT

ATC

TGG

ACC

GAC

GTC

CCG

GGC

ATC

TAC

ACC

1267

His

Ala

Ser

Arg

Val

Asp

íle

Trp

Thr

Asp

Val

Pro

Gly

íle

Tyr

Thr

215

220

225

ACC

GAT

CCA

CGC

GTA

GTT

TCC

GCA

GCA

AAA

CGC

ATT

GAT

GAA

ATC

GCG

1315

Thr

Asp

Pro

Arg

Val

Val

Ser

Ala

Ala

Lys

Arg

íle

Asp

Glu

íle

Ala

230

235

240

ttt

GCC

GAA

GCG

GCA

GAG

ATG

GCA

ACT

TTT

GGT

GCA

AAA

GTA

CTG

CAT

1363

Phe

Ala

Glu

Ria

Ala

Glu

Met

Ala

Thr

Phe

Gly

Ala

Lys

Val

Leu

His

245

250

255

260

Met 1

Ser Glu íle

Val 5

Val

Ser

Lys Phe

Gly 10

Gly Thr Ser

val

Ala 15

Asp

Phe

Asp

Ala

Met

Asn

Arg

ser

Ala

Asp

íle

val

Leu

Ser

Asp

Ala

Asn

20

25

30

Val

Arg

Leu

Val

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Ala

Gly

íle

Thr

Asn

Leu

Leu

35

40

45

val

Ala

Leu

Ala

Glu

Gly

Leu

Glu

Pre

Gly

Glu

Arg

Phe

Glu

Lys

Leu

30

55

60

Asp

Ala

íle

Arg

Asn

íle

Gin

Phe

Ala

íle

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

Tyr

65

70

75

80

Pro

Asn

Val

íle

Arg

Glu

Glu

íle

Glu

Arg

Leu

Leu

Glu

Asn

íle

Thr

85

90

95

Val

Leu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Pro

Ala

Leu

Thr

Asp

100

105

110

Glu

Leu

Val

Ser

His

Gly

Glu

Leu

Met

Ser

Thr

Leu

Leu

Phe

Val

Glu

115

120

125

íle

LeU

Arg

Glu

Arg

Asp

Val

Gin

Ala

Gin

Trp

Phe

Asp

val

Arg

Lys

130

135

140

Val

Met

Arg

Thr

Asn

Asp

Arg

Phe

Gly Arg

Ala

G1U

Pro

Asp

íle

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Ala

Glu

Leu

Ala

Ala

Leu

Gin

Leu

Leu

Pro

Arg

Leu

Asn

Glu

165

170

175

Gly

Leu

Val

íle

Thr

Gin

Gly

Phe

íle

Gly

ser

Glu

Asn

Lys

Gly Arg

180

185

190

Thr

Thr

Thr

Leu

Gly

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

Tyr

Thr

Ala

Ala

Leu

Leu

195

200

205

Ala

Glu

Ala

Leu

His

Ala

Ser

Arg

val

Asp

íle

Trp

Thr

Asp

Val

Pro

210

215

220

Gly

íle

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Arg

Val

vaľ

Ser

Ala

Ala

Lys

Arg

íle

225

230

235

240

Asp

GlU

íle

Ala

Phe

Ala

G1U

Ala

Ala

Glu

Met

Ala

Thr

Phe

Gly

Ala

245

250

255

Lys

Val

Leu

His

Pro

Ala

Thr

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Arg

Ser

Asp

íle

260

265

270

pro

val

Phe

Val

Gly

Ser

Ser

Lys

Asp

Pro

Arg

Ala

Gly

Gly

Thr

Leu

275

280

285

Val

Cys

Asn

Lys

Thr

Glu

Asn

Pro

Pro

Leu

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Leu

290

295

300

Arg

Arg

Asn

Gin

Thr

Leu

Leu

Thr

Leu

His

Ser

Leu

Asn

Met

Leu

His

3C5

310

315

320

Ser

Arg

Gly

Phe

Leu

Ala

Glu

Val

Phe

Gly

íle

Leu

Ala

Arg

His

Asn

325

330

335

íle

Ser

Val

Asp

Leu

íle

Thr

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Thr

340

345

350

Leu

Asp

Thr

Thr

Gly

Ser

Thr

Ser

Thr

Gly

Asp

Thr

Leu

Leu

Thr

Gin

355

360

365

Ser

Leu

Leu

Met

Glu

Leu

Ser

Ala

Leu

Cys

Arg

Val

Glu

Val

Glu

Glu

370

375

380

Gly

Leu

Ala

Leu

Val

Ala

Leu

íle

Gly

Asn

Asp

Leu

Ser

Lys

Ala

Cys

385

390

395

400

Gly

Val

Gly

Lys

Glu

Val

Phe

Gly

Val

Leu

Glu

Pro

Phe

Asn

íle

Arg

405

410

415

Met

íle

Cys

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Pro

420

425

430

Gly

Glu

Asp

Ala

Glu

Gin

Val

Val

Gin

Lys

Leu

His

Ser

Asn

Leu

Phe

435 440 445

Glu (2) Informácie o SEQ ID NO:9:

(í) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná..syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:9:

CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20 (2) Informácie o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná... syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:

TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20 (2) Informácie o SEQ ID NO: 11:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná..syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 11:

TTTATTCATA ATTGCCACCG 20 (2) Informácie o SEQ ID NO: 12:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná..syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

CACGGTAATA CATATAACCG 20 (2) Informácie o SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná..syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 13:

CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20 (2) Informácie o SEQ ID NO:14:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná. .syntetická DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:

GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20

Claims (8)

1. Baktérie rodu Serratia, ktoré sú transformované zavedením DNA kódujúcej dihydrodipikolinát syntázu s mutáciou na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom, pričom dihydrodipikolinát syntáza pochádza z baktérie rodu Escherichia.

2. Baktérie rodu Serratia podľa nároku 1, kde mutácia na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom je volená zo skupiny pozostávajúcej z mutácie na nahradenie 81. alanínového zvyšku valínovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 118. histidínového zvyšku tyrozínovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 81. alanínového zvyšku valínovým zvyškom a na nahradenie 118. histidínového zvyšku tyrozínovým zvyškom, počítajúc od N-konca v aminokyselinovej sekvencie dihydrodipikolinát syntázy definovanej v sekv. č. 4 v zozname sekvencii.

3. Baktérie rodu Serratia podľa nároku 2, ďalej nesúce aspartokinázu, v ktorej je desenzibilizovaná spätná inhibícia L-lyzínom.

4. Baktérie rodu Serratia podľa nároku 3, nesúce aspartokinázu, v ktorej je desenzibilizovaná spätná inhibícia L-lyzínom, získaná zavedením DNA kódujúcej aspartokinázu s mutáciou na desenzibilizáciu spätnej inhibície L-lyzínom, do buniek.

5. Baktérie rodu Serratia podľa nároku 4, kde aspartokináza je aspartokináza III, ktorá pochádza z baktérie rodu Escherichia.

6. Baktérie rodu Serratia podľa nároku 5, kde mutácia na desenzibilizáciu spätnej inhibície aspartokinázy III L-lyzínom sa volí zo skupiny pozostávajúcej z mutácie na nahradenie 323. glycínového zvyšku zvyškom kyseliny asparágovej, z mutácie na nahradenie 323. glycínového zvyšku zvyškom kyseliny asparágovej a na nahradenie 408. glycínového zvyšku zvyškom kyseliny asparágovej, z mutácie na nahradenie 34. arginínového zvyšku cysteínovým zvyškom a na nahradenie 323. glycínového zvyšku zvyškom kyseliny asparágovej, z mutácie na nahradenie 325. leucínového zvyšku fenylalanínovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 318. metionínového zvyšku izoleucínovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 318. metionínového zvyšku izoleucínovým zvyškom a na nahradenie 349. valínového zvyšku metioninovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 345. serínového zvyšku leucínovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 347. valínového zvyšku metionínovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 352. treonínového zvyšku izoleucínovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 352. treonínového zvyšku izoleucínovým zvyškom a na nahradenie 369. serínového zvyšku fenylalanínovým zvyškom, z mutácie na nahradenie 164. kyseliny glutámovej lyzínovým zvyškom, a z mutácie na nahradenie 417. metionínového zvyšku izoleucínovým zvyškom a na nahradenie 419. cysteinového zvyšku tyrozínovým zvyškom, počítajúc od N-konca aminokyselinovej sekvencie aspartokinázy III definovanej v sekv. č. 8 v zozname sekvencii.

7. Baktérie rodu Serratia podľa nároku 1, ktoré sú deficientné v lyzín dekarboxyláze.

8. Spôsob produkcie L-lyzínu, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa kroky kultivácie baktérií rodu Serratia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 vo vhodnom médiu, produkcie a akumulácie L-lyzínu v ich kultivačnom médiu, a izolácie L-lyzínu z kultivačného média.