DE69629299T2

DE69629299T2 - Prozess für die produktion von l-lysin durch fermentation

Info

Publication number: DE69629299T2
Application number: DE69629299T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Kojima; Yuri Kawasaki-shi OGAWA; Kazue Kawasaki-shi KAWAMURA; Konosuke Kawasaki-shi SANO
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-06-13
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2016-03-15
Also published as: HUP9900149A2; EP0834559A4; DE69629299D1; CN1117860C; US5989875A; EP0834559B1; MX9710044A; HUP9900149A3; SK170597A3; WO1996041871A1; EP0834559A1; CN1203629A; JP4004065B2; HU224158B1; SK284047B6

Description

Technisches Gebiet
Eie vorliegende Erfindung betrifft die mikrobielle Industrie, insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation sowie DNAs und Mikroorganismen zur Verwendung für dieses Herstellungsverfahren.
Stand der Technik
Im Stand der Technik wird zur Herstellung von L-Lysin mittels Methoden der Fermentation ein aus der natürlichen Umgebung isolierter Mikrobenstamm oder ein künstlicher mutanter Stamm, der aus einem solchen Mikrobenstamm hervorgegangen ist, verwendet, um die Produktivität zu verbessern. Eine große Anzahl L-Lysin produzierender künstlicher mutanter Stämme ist bekannt. Die meisten von diesen sind S-2-Aminoethylcystein (AEC) resistente mutante Stämme und gehören zu den Gattungen Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia oder Serratia. Darüber hinaus sind verschiedene Techniken zur Steigerung der Aminosäureproduktion bekannt, zum Beispiel der Einsatz einer Transformanten unter Verwendung rekombinanter DNA (US-Patent 4,278,765).
Zum Beispiel finden zur Gattung Serratia gehörende Bakterien weite Anwendung als Bakterien zur Herstellung verschiedener Aminosäuren wie L-Prolin, L-Histidin, L-Arginin, L-Threonin, L-Valin und L-Isoleucin und besitzen in verschiedener Hinsicht hervorragende Eigenschaften als Aminosäure-produzierende Bakterien, wie beschrieben in „Oyo Bunshi Idengaku (Applied Molecular Genetics)", veröffentlicht durch Kodansha Scientific, 1986, ISBN4-06-139659-5) und „Aminosan Hakko (Amino Acid Fermentation)", veröffentlicht durch Gakkai Shuppan Center, 1986, ISBN4-7622-9454-3). Es gibt Berichte über die Herstellung verschiedener Aminosäuren unter Verwendung von zur Gattung Serratia gehörenden Bakterien. In einem dieser Dokumente (Japanische Patentschrift 51-9393 (1976)), das über eine erworbene L-Lysin-Produktivität bei Serratia berichtet, wird die Produktionsausbeute (ermittelt durch Division der Konzentration des produzierten L-Lysin-HCl-Salzes durch die Anfangskonzentration der Kohlenstoffquelle) mit 5,4% berechnet.
Serratia marcescens, eine repräsentative Bakterienart der zur Gattung Serratia gehörenden Bakterien, ist im Hinblick auf ihre Genstruktur sowie ihre Mechanismen der Genexpression und -Regulation den zur Gattung Escherichia gehörenden Bakterien ähnlich, so dass ein Klonierungsvektor zur DNA-Rekombination in Bakterien der Gattung Escherichia auch in Bakterien der Gattung Serratia verwendet werden kann (Japanische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummern 2-27980 (1990) und 5-10076 (1993)).
Es ist anzumerken, dass die Dihydrodipicolinatsynthase (DDPS) ein Enzym zur Wasserabspaltung und Kondensation von Aspartosemialdehyd und Brenztraubensäure zur Synthese von Dihydrodipicolinsäure darstellt. Diese Reaktion ist im Eingang einer Stoffwechselverzweigung lokalisiert und führt weiter zu einem L-Lysin-Biosynthesesystem für die Biosynthese von Aminosäuren der Asparaginsäurefamilie. Dieses Enzym ist bekannter Maßen für eine wichtige regulatorische Stelle der L-Lysin Biosynthese verantwortlich, ebenso wie die Aspartokinase in Bakterien der Gattung Escherichia.
DDPS wird in E. coli (Escherichia coli) durch ein als dapA bezeichnetes Gen codiert. Das dapA Gen wurde kloniert und seine Basensequenz bestimmt (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)).
Auf der anderen Seite ist Aspartokinase (hier im folgenden gelegentlich als „AK" abgekürzt) ein Enzym zur Katalyse einer Reaktion zur Umwandlung von Asparaginsäure in β-Phospho-Asparaginsäure und dient als ein wesentliches regulatorisches Enzym in einem Biosynthesesystem von Aminosäuren der Asparaginsäurefamilie. AK aus E. coli umfasst drei Typen (AKI, AKII, AKIII), von denen zwei Typen komplexe Enzyme in Verbindung mit Homoserin-Dehydrogenase (hier im folgenden gelegentlich als „HD" abgekürzt) darstellen. Eines der komplexen Enzyme ist AKI-HDI, codiert durch ein thrA Gen, und das andere ist AKII-HDII, codiert durch ein metLM Gen. AKI ist einer konzertierten Suppression durch Threonin und Isoleucin unterworfen und wird durch Threonin inhibiert, während AKII durch Methionin supprimiert wird.
Im Gegensatz dazu ist nur AKIII als Enzym einfacher Funktion bekannt. AKIII ist ein Produkt eines als lysC bezeichneten Gens und ist einer Suppression und Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterworfen. Das Verhältnis ihrer intrazellulären Aktivitäten beträgt für AKI : AKII : AKIII = etwa 5 : 1 : 4.
DDPS und AKIII sind – wie oben beschrieben – einer Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterworfen, wodurch die effektive Produktion von L-Lysin gehemmt wird. Es ist zu erwarten, dass L-Lysin effizient durch Fermentation unter Verwendung eines zur Gattung Serratia gehörenden Bakteriums produziert werden kann, wenn ein mutantes Enzym der DDPS oder AKIII gewonnen werden kann, welches keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterworfen ist. Es existiert jedoch keine vorhergehende Literatur, die ein solches mutantes Enzym der DDPS beschreibt und – trotz eines Berichtes über eine mutante Form der AKIII (Boy, E., et al., J. Bacteriol., 112, 84 (1972)) – ist kein Beispiel bekannt, welches suggeriert, das ein derartiges mutantes Enzym die Produktionsrate von L-Lysin verbessern könnte. Hinzu kommt, dass derartige Beispiele nicht im Hinblick auf Gene eines L-Lysin-Biosynthesesystems von Bakterien der Gattung Serratia bekannt sind.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde unter Berücksichtigung der zuvor genannten Gesichtspunkte verwirklicht und hat die Zielsetzung, eine DDPS und AK – insbesondere eine aus Bakterien der Gattung Serratia stammende DDPS und AKIII – zu gewinnen, bei denen die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin hinreichend unempfindlich gemacht (desensibilisiert) ist, und ein Verfahren zur Produktion von L-Lysin bereitzustellen, in dem ein im Vergleich zu den Bakterien im Stand der Technik effizienteres Bakterium der Gattung Serratia verwendet wird.
Als Ergebnis sorgfältiger und wiederholter Untersuchung zum Erreichen der oben beschriebenen Zielsetzung ist es den vorliegenden Erfindern gelungen, für DDPS codierende DNA von einem Bakterium der Gattung Escherichia zu erhalten, bei dem die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausreichend unempfindlich gemacht ist. Die für DDPS codierende DNA, welche aus dem E. coli-Bakterium stammt, bei dem die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausreichend unempfindlich gemacht ist, wird hier gelegentlich als mutantes dapA oder dapA* bezeichnet.
Die Erfinder haben ferner ein Bakterium der Gattung Serratia geschaffen, das eine Aspartokinase beinhaltet, bei der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin desensibilisiert ist, sowie eine DDPS, bei der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausreichend desensibilisiert ist. Die für Aspartokinase aus E. coli codierende DNA, bei der die Rückkopplungshemmung des Enzyms durch L-Lysin ausreichend unempfindlich gemacht ist, wird hier gelegentlich als mutantes lysC oder lysC* bezeichnet.
Die Erfinder haben darüber hinaus ein Bakterium der Gattung Serratia geschaffen, welches mutantes dapA und mutantes lysC enthält. Es wurde festgestellt, dass eine erhebliche Menge an L-Lysin in einer Kultur produziert und angereichert werden kann, wenn das vorgenannte Bakterium der Gattung Serratia in einem geeigneten Medium kultiviert wird.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Bakterium aus der Gattung Serratia bereit, welches durch Einführung einer DNA transformiert wurde, die für eine Dihydrodipicolinatsynthase mit einer im Hinblick auf die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin desensibilisierend wirkenden Mutation codiert. Die Dihydrodipicolinatsynthase ist beispielhaft durch das aus einem Bakterium der Gattung Escherichia stammende Enzym dargestellt.
Im Hinblick auf die Dihydrodipicolinatsynthase aus dem Bakterium der Gattung Escherichia ist die Mutation zur Desensibilisierung der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin beispielhaft dargestellt durch eine Mutation zum Austausch des Alaninrestes in Position 81 durch einen Valinrest; den Austausch des Histidinrestes in Position 118 durch einen Tyrosinrest; sowie die Mutationen zum Austausch des Alaninrestes in Position 81 durch einen Valinrest und den Austausch des Histidinrestes in Position 118 durch einen Tyrosinrest; hierbei werden die Reste jeweils vom N-Terminus der Aminosäuresequenz der Dihydrodipicolinatsynthase gemäss Definition in SEQ ID NO: 4 der Sequenzliste gezählt. Die Dihydrodipicolinatsynthase kann ein nativ in einem Bakterium der Gattung Serratia vorliegendes Enzym sein, vorausgesetzt, dass dieses eine Mutation aufweist, um die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich zu machen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner das vorstehend erwähnte Bakterium der Gattung Serratia bereit, welches eine Aspartokinase aufweist, in der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist. Ein Verfahren, um ein zur Gattung Serratia gehörendes Bakterium mit einer Aspartokinase mit desensibilisierter Rückkopplungshemmung durch L-Lysin auszustatten, wird exemplarisch anhand eines Verfahrens dargestellt, bei der eine für Aspartokinase III codierende DNA in die Bakterienzellen von Serratia eingeführt wird. Diese Aspartokinase III stammt aus einem Bakterium der Gattung Escherichia und ist so mutiert, dass die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist.
Für die aus einem Bakterium der Gattung Escherichia stammende Aspartokinase III ist die eine Desensibilisierung der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin bewirkende Mutation beispielhaft durch folgende Mutation, bzw. Mutationen dargestellt: Austausch des Glycinrestes in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest; Austausch des Glycinrestes in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest und Austausch des Glycinrestes in Position 408 durch einen Asparaginsäurerest; Austausch des Argininrestes in Position 34 durch einen Cysteinrest und Austausch des Glycinrestes in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest; Austausch des Leucinrestes in Position 325 durch einen Phenylalaninrest; Austausch des Methioninrestes in Position 318 durch einen Isoleucinrest; Austausch des Methioninrestes in Position 318 durch einen Isoleucinrest und Austausch des Valinrestes in Position 349 durch einen Methioninrest; Austausch des Serinrestes in Position 345 durch einen Leucinrest; Austausch des Valinrestes in Position 347 durch einen Methioninrest; Austausch des Threoninrestes in Position 352 durch einen Isoleucinrest, Austausch des Threoninrestes in Position 352 durch einen Isoleucinrest und Austausch des Serinrestes in Position 369 durch einen Phenylalaninrest; Austausch des Glutaminsäurerestes in Position 164 durch einen Lysinrest; sowie schließlich durch den Austausch des Methioninrestes in Position 417 durch einen Isoleucinrest und den Austausch des Cysteinrestes in Position 419 durch einen Tyrosinrest, wobei die Reste jeweils vom N-Terminus der Aminosäuresequenz von Aspartokinase III gemäß Definition in SEQ ID NO: 8 der Sequenzliste gezählt werden.
Selbstverständlich kann die Aspartokinase mit der desensibilisierten Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ein natives Enzym aus einem zur Gattung Serratia gehörenden Bakterium sein.
Die für die mutante Dihydrodipicolinatsynthase und die mutante Aspartokinase mit jeweils desensibilisierter Rückkopplungshemmung durch L-Lysin codierenden DNAs können beide in Zellen eines Bakteriums der Gattung Serratia befindlich sein und dort auf einem identischen Plasmid oder auf separaten Plasmiden vorliegen.
Das als Träger für die DNA, codierend für eine mutante Dihydrodipicolinatsynthase mit desensibilisierter Rückkopplungshemmung durch L-Lysin, vorgesehene Bakterium der Gattung Serratia wird beispielhaft dargestellt durch ein Bakterium mit einer Defizienz für Lysindecarboxylase.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereit, umfassend die Schritte der Kultivierung eines jedweden der oben genannten Bakterien der Gattung Serratia in einem geeigneten Medium, die Produktion und Anreicherung von L-Lysin in einer Kultur desselben und die Abtrennung von L-Lysin aus der Kultur.
In dieser Beschreibung wird die für DDPS oder AKIII codierende DNA oder eine DNA, die zusätzlich hierzu einen Promotor enthält, gelegentlich als „DDPS-Gen" oder „AKIII-Gen" bezeichnet. Darüber hinaus wird das mutante Enzym, in dem die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist und die dafür codierende DNA oder DNA, die zusätzlich dazu einen Promotor enthält, gelegentlich einfach als „mutantes Enzym" bzw. „mutantes Gen" bezeichnet. Weiterhin bedeutet die Formulierung „gegenüber Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht (desensibilisiert)", dass eine wesentliche Herabsetzung der Inhibition ausreichend ist, eine vollständige Desensibilisierung aber nicht zwingend erforderlich ist.
Die Vorliegende Erfindung wird im folgenden detailliert beschrieben.
(1) DNA, für eine mutante Dihydrodipicolinatsynthase (DDPS) codierend, zur Verwendung im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete, für die mutante DDPS codierende DNA hat Mutationen) zur Desensibilisierung der durch L-Lysin bewirkten Rückkopplungshemmung der von wildtypischer DNA codierten DDPS.
DDPS ist beispielhaft durch solche Enzyme dargestellt, die von Bakterien der Gattung Escherichia stammen, insbesondere durch DDPS stammend aus E. coli. Darüber hinaus kann jedwede DDPS von Bakterien der Gattung Serratia ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie eine Mutation aufweist, um die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin zu desensibilisieren. Die Mutation der DDPS, stammend aus einem Bakterium der Gattung Escherichia, zur Desensibilisierung der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ist beispielhaft dargestellt durch:

(1) Austausch des Alaninrestes in Position 81 durch einen Valinrest;
(2) Austausch des Histidinrestes in Position 118 durch einen Tyrosinrest; und
(3) Austausch des Alaninrestes in Position 81 durch einen Valinrest und Austausch des Histidinrestes in Position 118 durch einen Tyrosinrest;

Die für die wildtypische DDPS codierende DNA ist nicht exakt festgelegt, vorausgesetzt, dass sie für eine DDPS aus einem Bakterium der Gattungen Escherichia oder Serratia codiert. Die für DDPS codierende, aus einem Bakterium der Gattung Escherichia stammende DNA ist konkret und beispielhaft durch eine, für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 codierende DNA dargestellt; weiterhin ist sie beispielhaft dargestellt durch eine durch die Basennummern 272– 1147 der Basensequenz gemäß SEQ ID NO: 3 spezifizierte DNA. Bei diesen Sequenzen sind diejenigen Beispiele für DNA, die für die mutante DDPS zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung codiert, die solche Mutationen in der Basensequenz aufweisen, um die oben beschriebenen Aminosäure-Austausche zu bewirken. Jedes Codon, das in Übereinstimmung mit einem ersetzten Aminosäurerest steht, ist unabhängig von seiner Art verwendbar, vorausgesetzt es codiert für den identischen Aminosäurerest. Weiterhin wird postuliert, dass die verfügbare DDPS in Abhängigkeit von Unterschieden der Bakterienarten und des Bakterienstammes geringfügig in der Sequenz variieren kann, dass jedoch diejenigen Sequenzen mit einem Austausch, einer Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Aminosäurereste an für die Enzymaktivität irrelevanter/irrelevanten Positionen) ebenfalls vom mutanten DDPS-Gen der vorliegenden Erfindung umfasst sind.
Ein Verfahren zur Gewinnung eines solchen mutanten Gens kann wie folgt aussehen. Zuerst wird eine DNA, die ein wildtypisches DDPS-Gen oder ein DDPS-Gen mit einer Mutationen, welche praktisch keinen nachteiligen Effekt auf die Enzymaktivität von DDPS hat, einer Behandlung der in vitro-Mutagenese unterzogen und die DNA nach der Mutagenesebehandlung mit einer an einen Wirt angepassten Vektor-DNA ligiert, um eine rekombinante DNA zu erhalten. Die rekombinante DNA wird dann in einen Wirtsorganismus eingeführt, um Transformanten zu gewinnen. Wenn eine Transformante, die eine mutante DDPS exprimiert, aus den zuvor genannten Transformanten selektiert wird, so beinhaltet eine solche Transformante ein mutantes Gen. Alternativ können eine, ein wildtypisches DDPS-Gen enthaltende DNA oder ein DDPS-Gen mit einer anderen Mutation mit der an einen Wirt angepassten Vektor-DNA ligiert werden, um eine rekombinante DNA zu gewinnen. Die rekombinante DNA wird danach einer Behandlung der in vitro-Mutagenese unterzogen, und die rekombinante DNA wird nach der Mutagenesebehandlung in einen Wirtsmikroorganismus eingeführt, um Transformanten zu erhalten. Wenn eine, eine mutante DDPS exprimierende Transformante aus den zuvor genannten Transformanten selektiert wird, beinhaltet eine solche Transformante ebenfalls ein mutantes Gen.
Es ist ebenfalls akzeptabel, dass ein Mikroorganismus, der das wildtypische Enzym produziert, einer Mutagenesebehandlung unterzogen wird, um einen mutanten Stamm herzustellen, der das mutante Enzym produziert, und dann das mutante Gen aus dem mutanten Stamm zu gewinnen. Eine alternative Möglichkeit zur Erzeugung eines mutanten Stammes, der ein mutantes Enzym produziert, besteht darin, eine Transformante, in welche eine rekombinante, mit dem wildtypischen Gen ligierte DNA eingeführt wurde, einer Mutagenesebehandlung zu unterwerfen. Wenn danach eine rekombinante DNA aus dem mutanten Stamm gewonnen wird, wird auf Basis der vorgenannten DNA ein mutantes Gen erzeugt.
Als Agens zur Durchführung der in vitro-Mutagenesebehandlung der DNA wird beispielhaft auf Hydroxylamin und dergleichen verwiesen. Hydroxylamin ist ein chemisches Mutagen, das eine Mutation von Cytosin zu Thymin verursacht, indem es Cytosin in N⁴-Hydroxycytosin umwandelt. Alternativ, wenn ein Mikroorganismus selbst einer Mutagenesebehandlung unterzogen wird, wird die Behandlung unter Verwendung ultravioletter Licht-Bestrahlung durchgeführt, oder unter Verwendung eines üblicherweise für künstliche Mutation verwendeten Mutagens wie etwa N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetriger Säure. Als Donor-Mikroorganismus für DNA, die das wildtypische DDPS-Gen oder ein DDPS-Gen mit einer anderen oben beschriebenen Mutation enthält, kann jeder Mikroorganismus einschließlich eines zu den Gattungen Escherichia oder Serratia gehörenden Mikroorganismus verwendet werden. Konkret gesagt, ist es möglich, für einen zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus diejenigen Mikroorganismen zu verwenden, die in einem Buch von Neidhardt et al. (Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabelle 1) beschrieben sind. Es werden z. B. ein E. coli JM109 Stamm und ein MC1061 Stamm erwähnt. Wenn ein wilder Stamm als Donor-Mikroorganismus für eine das DDPS-Gen enthaltende DNA verwendet wird, kann eine DNA, die das wildtypische DDPS-Gen enthält, gewonnen werden.
Auf der anderen Seite sind die zur Gattung Serratia gehörenden Mikroorganismen durch Serratia marcescens, z. B. den Serratia marcescens Stamm AJ13125 (FERM BP-5441) beispielhaft vertreten.
(1) Präparation des wildtypischen DDPS-Gens
Ein Beispiel für die Präparation einer das DDPS-Gen enthaltenden DNA wird im folgenden beschrieben. Die Präparation ist hier im Hinblick auf E. coli beschrieben, und das DDPS-Gen kann in ähnlicher Weise bei einem anderen zur Gattung Escherichia sowie einem zur Gattung Serratia gehörenden Bakterium präpariert werden.
Zunächst wird E. coli mit wildtypischem dapA, z. B. der MC1061 Stamm, zur Herstellung einer Kultur kultiviert. Bei der Kultivierung des oben beschriebenen Mikroorganismus kann die Durchführung in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren der Kultur auf Festmedium erfolgen, bevorzugt wird jedoch eine Kultivierung unter Verwendung eines Verfahrens für Flüssigmedien durchgeführt, wenn die Effizienz bei der Gewinnung des Bakteriums in Betracht gezogen wird. Es kann ein Medium verwendet werden, bei dem eine oder mehrere Stickstoffquellen wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, das Einweichwasser von Getreide, bzw. Mais oder das Exsudat von Sojabohnen oder Weizen zu einem oder mehreren anorganischen Salzen wie Kalium-Dihydrogenphosphat, Di-Kalium-Hydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Eisen(III)-Chlorid, Eisen(III)-Sulfat oder Mangansulfat und weiteren optionalen und passenden Bestandteilen wie Zuckermaterialien, Vitaminen oder dergleichen hinzugegeben wird. Es ist angemessen, wenn der anfängliche pH des Mediums auf 6 bis 8 eingestellt wird. Die Kultur kann für 4 bis 24 Stunden bei 30 bis 42°C durchgeführt werden, bevorzugt bei etwa 37°C mittels einer Intensivkultur unter Belüftung und Schütteln, einer Schüttelkultur oder einer stationären Kultur oder dergleichen.
Die derart gewonnene Kultur wird zentrifugiert, z. B. bei 3.000 rpm für 5 Minuten, um ein Zellpellet des E. coli MC1061 Stammes zu erhalten. Die chromosomale DNA kann z. B. mittels eines Verfahrens von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) oder mittels eines Verfahrens von K. S. Kirby (Biochem. J., 64, 405 (1956)) aus dem Zellpellet gewonnen werden.
Um das DDPS-Gen aus der derart gewonnenen chromosomalen DNA zu isolieren, wird eine chromosomale DNA-Bibliothek angelegt. Zuerst wird die chromosomale DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym partiell verdaut, um ein Gemisch verschiedener Fragmente zu erhalten. Eine große Vielzahl an Restriktionsenzymen kann verwendet werden, wenn das Ausmaß des Verdaus durch die Dauer des Verdaus und dergleichen kontrolliert wird. Zum Beispiel lässt man Sau3AI bei Temperaturen nicht unter 30°C, bevorzugt bei 37°C und bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 10 U/ml für verschiedene Zeitspannen (1 Minute bis 2 Stunden) mit der chromosomalen DNA reagieren, um diese zu verdauen.
Im nächsten Schritt werden die erhaltenen DNA-Fragmente mit einer autonom in Bakterienzellen der Gattung Escherichia replizierbaren Vektor-DNA ligiert, um rekombinante DNA zu erzeugen. Konkret lässt man ein Restriktionsenzym, z. B. BamHI, das eine endständige Basensequenz generiert, die komplementär zur derjenigen ist, die durch das Restriktionsenzym Sau3AI beim Schneiden der chromosomalen DNA erzeugten wurde, auf die Vektor-DNA einwirken. Die dabei verwendeten Reaktionsbedingungen beinhalten eine Temperatur nicht unter 30°C und eine Enzymkonzentration von 1 bis 100 U/ml für nicht weniger als 1 Stunde, bevorzugt für 1 bis 3 Stunden, um die Vektor-DNA vollständig zu verdauen, zu schneiden und zu spalten. Im nächsten Schritt wird die erhaltene Mischung chromosomaler DNA-Fragmente gemäß obiger Beschreibung mit der geschnittenen und gespaltenen Vektor-DNA gemischt, wobei man DNA-Ligase, bevorzugt T4-DNA-Ligase unter Temperaturbedingungen von 4°C bis 16°C bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 U/ml für nicht weniger als 1 Stunde, bevorzugt für 6 bis 24 Stunden reagieren lässt, um rekombinante DNA zu erhalten.
Die erhaltene rekombinante DNA wird verwendet, um einen zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus zu transformieren, um eine chromosomale DNA-Bibliothek zu erzeugen. Hierzu kann z. B. ein für DDPS defizienter mutanter Stamm wie etwa ein Escherichia coli K-12 Stamm, bevorzugt ein JE7627 Stamm (ponB704 dacB12 pfv⁺ tonA2 dapA lysA str malA38 metB1 ilvH611 leuA371 proA3 lac-3 tsx-76) verwendet werden. Die Transformation kann z. B. durch eine Methode von D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) durchgeführt werden, oder ebenso durch eine Methode, bei der die aufnehmenden Bakterienzellen (rezipiente Zellen) mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Durchlässigkeit für die DNA zu steigern (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol Biol., 53, 159 (1970)). Der JE7627-Stamm ist beim nationalen Institut für Genetik (National Institut of Genetics) erhältlich (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japan).
Ein Bakterienstamm, der die aus der erzeugten chromosomalen DNA-Bibliothek stammende rekombinante DNA des DDPS-Gens aufweist, wird aus Stämmen gewonnen, die eine verstärkte DDPS-Aktivität aufweisen, oder aus Stämmen, bei denen eine aus der Defizienz des DDPS-Gens resultierende Auxotrophie komplementiert wird. Zum Beispiel benötigt ein DDPS defizienter mutanter Stamm Diaminopimelinsäure. Somit kann ein das DDPS-Gen enthaltendes DNA-Fragment bei Verwendung eines DDPS defizienten, mutanten Stammes als Wirt gewonnen werden, indem ein Bakterienstamm isoliert wird, der die Fähigkeit erlangt, auf einem Medium ohne Diaminopimelinsäure zu wachsen, und indem die rekombinante DNA aus diesem Bakterienstamm isoliert wird.
Die Bestätigung, ob ein rekombinante DNA enthaltender Kandidatenstamm tatsächlich rekombinante DNA mit dem klonierten DDPS-Gen enthält, kann erbracht werden, indem ein zellulärer Extrakt aus dem Kandidatenstamm hergestellt wird, und indem daraus eine Rohenzym-Lösung hergestellt wird, um zu bestätigen, ob die DDPS-Aktivität zugenommen hat oder nicht. Die Messung der Enzymaktivität von DDPS kann mittels eines Verfahrens von Yugari et al. (Yugari, Y. und Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240, 4710 (1962)) durchgeführt werden.
Aus dem oben beschriebenen Bakterienstamm kann eine rekombinante DNA, bei der DNA mit dem DDPS-Gen in die Vektor-DNA inseriert ist, z. B. über ein Verfahren von P. Guerry et al. (J. Bacteriol., 116, 1064 (1973)) oder über ein Verfahren von D. B. Clewell (J. Bacteriol., 110, 667 (1972)) isoliert werden.
Die Präparation des wildtypischen DDPS-Gens kann auch durchgeführt werden, indem chromosomale DNA aus einem Stamm, der ein DDPS-Gen auf dem Chromosom trägt, mittels eines Verfahrens von Saito und Miura oder dergleichen präpariert und das DDPS-Gen mittels eines Verfahrens der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (siehe White, T. J. et al.; Trends Genet., 5, 185 (1989)) amplifiziert wird. Für die Amplifikationsreaktion zu verwendende DNA-Primer sind solche, die zu beiden 3'-Enden einer doppelsträngigen DNA, welche die gesamte Region oder eine Teilregion des DDPS-Gens enthält, komplementär sind. Wenn nur eine Teilregion des DDPS-Gens amplifiziert wird, ist es nötig, entsprechende DNA-Fragmente als Primer zu verwenden, um auf ein DNA-Fragment zu screenen, das die gesamte Region aus einer chromosomalen DNA-Bibliothek enthält. Wenn die gesamte Region des DDPS-Gens amplifiziert wird, wird die PCR-Reaktionslösung, die DNA-Fragmente mit dem amplifizierten DDPS-Gen enthält, einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und das gewünschte DNA-Fragment dann extrahiert. Auf diese Weise kann ein das DDPS-Gen enthaltendes DNA-Fragment gewonnen werden.
Die DNA-Primer können in adäquater Weise auf Basis z. B. einer in E. coli bekannten Sequenz (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)) präpariert werden. Konkret sind Primer bevorzugt, die eine Region, umfassend 1150 Basen, welche für das DDPS-Gen codieren, amplifizieren können, wofür zwei Arten von Primern, definiert in den SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, geeignet sind. Die Synthese der Primer kann durch ein gewöhnliches Verfahren, wie etwa ein Phosphoamidit-Verfahren (siehe Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)), durchgeführt werden, indem ein kommerziell erhältliches Gerät zur DNA-Synthese (z. B. das DNA Synthesizer Model 380B, hergestellt von Applied Biosystems) verwendet wird. Weiterhin kann die PCR mittels eines kommerziell erhältlichen PCR-Gerätes (z. B. dem DNA Thermal Cycler Model PJ2000, hergestellt von der Takara Shuzo Co., Ltd.) und unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase (vertrieben von der Takara Shuzo Co., Ltd.) in Übereinstimmung mit einem vom Anbieter benannten Verfahren durchgeführt werden.
Im Hinblick auf das durch das PCR-Verfahren amplifizierte DDPS-Gen werden Operationen wie die Einführung von Mutationen in das DDPS-Gen einfach, wenn dieses mit einer in Bakterienzellen der Gattung Escherichia autonom replizierbaren Vektor-DNA ligiert und in die Bakterienzellen der Gattung Escherichia eingeführt wird. Die zu verwendende Vektor-DNA, das Transformations-Verfahren und die Nachweismethode auf Anwesenheit des DDPS-Gens sind die gleichen wie die im vorgenannten Verfahren.
Ein aus einem Bakterium der Gattung Serratia stammendes DDPS-Gen kann in der gleichen Weise wie der obigen erhalten werden, und das Gen kann aus chromosomalen DNA-Bibliotheken von Bakterien der Gattung Serratia mittels Hybridisierung isoliert werden, indem ein aus E. coli stammendes DDPS-Gen oder ein Teil davon als Sonde verwendet wird. Ebenso kann das aus einem Bakterium der Gattung Serratia stammende DDPS-Gen durch ein PCR-Verfahren gewonnen werden, indem eine chromosomale DNA eines Bakteriums der Gattung Serratia als Matrize verwendet wird. Als Primer können präparierte Oligonukleotide verwendet werden, die auf Basensequenzen des aus E. coli stammenden DDPS-Gens basieren, z. B. die Oligonukleotide mit zwei Arten von Sequenzen wie in den SEQ ID No. 1 und 2 gezeigt.
Die zu der Gattung Serratia gehörenden Bakterien sind mit den zu der Gattung Escherichia gehörenden Bakterien eng verwandt, und es ist bekannt, dass die Homologie der Aminosäuresequenzen der Proteine und der Basensequenzen der Gene in den Zellen zwischen diesen beiden Bakteriengruppen hoch ist. Als derartig homologe Gene sind z. B. thrA, thrB und thrC bekannt, deren Homologie 83%, 73%, bzw. 84% beträgt (K. Omori et al., J. Bacteriol., 175, 785–794 (1993)). Weiterhin ist das Gen dnaA als Beispiel für die Isolierung eines Gens von Bakterien der Gattung Serratia unter Verwendung einer aus Bakterien der Gattung Escherichia stammenden Gensequenz bekannt (O. Skovgaard und F. G. Hansen, J. Bacteriol., 169, 3976–3981 (1987)). Es ist daher mit Sicherheit anzunehmen, dass das DDPS-Gen von Bakterien der Gattung Serratia durch Hybridisierung oder PCR-Verfahren basierend auf einer Basensequenz eines DDPS-Gens von Bakterien der Gattung Escherichia isoliert werden kann.
(2) Einführung von Mutationen in das DDPS-Gen
Das Verfahren zur Durchführung von Mutationen wie dem Austausch, der Insertion oder Deletion von Aminosäureresten ist beispielhaft dargestellt durch ein rekombinantes PCR-Verfahren von Higuchi, R., 61, in PCR Technology (Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)) und ein Verfahren zur positionsspezifischen Mutagenese (site-specific mutagenesis) (Kramer, W. und Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)). Gewünschte Mutationen können unter Verwendung dieser Verfahren an einer gewünschten Stelle ausgelöst werden.
Weiterhin ist es gemäß der chemischen Synthese eines gewünschten Gens möglich, eine Mutation oder zufällige Mutation an einer gewünschten Stelle einzuführen.
Weiterhin ist ein Verfahren verfügbar, bei dem das DDPS-Gen auf dem Chromosom oder einem Plasmid direkt mit Hydroxylamin behandelt wird (Hashimoto, T. und Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039 (1984)). Alternativ kann ein Verfahren benutzt werden, bei dem ein zur Gattung Escherichia gehörendes Bakterium, das das DDPS-Gen aufweist, mit ultraviolettem Licht bestrahlt wird oder mit einem Verfahren behandelt wird, welches auf der Behandlung mit einem chemischen Agens wie N-methyl-N'-nitrosoguanidin oder salpetriger Säure basiert. Gemäß diesen Verfahren können Mutationen willkürlich eingeführt werden.
Im Hinblick auf ein Selektionsverfahren für das mutante Gen wird zunächst rekombinante DNA, enthaltend ein DNA-Fragment mit dem DDPS-Gen und Vektor-DNA, einer direkten Mutagenesebehandlung mit Hydroxylamin oder dergleichen unterzogen, wobei die rekombinante DNA dann verwendet wird, um z. B. einen E. coli W3110 Stamm zu transformieren. Im nächsten Schritt werden die transformierten Stämme auf einem Minimalmedium wie M9, das S-2-Aminoethylcystein (AEC) als Analogon von L-Lysin enthält, kultiviert. Stämme, die rekombinante DNA mit dem wildtypischen DDPS-Gen enthalten, können kein L-Lysin und keine Diaminopimelinsäure (DAP) synthetisieren und werden im Wachstum gehemmt, da die von der rekombinanten DNA exprimierte DDPS durch AEC inhibiert wird. Im Gegensatz dazu besitzt ein Stamm, der eine rekombinante DNA mit dem DDPS-Gen enthält, bei dem die Inhibition durch L-Lysin desensibilisiert wurde, ein mutantes, vom DDPS-Gen der vorgenannten rekombinanten DNA codiertes Enzym, welches durch AEC nicht inhibiert wird. Somit sollte ein derartiger Stamm dazu befähigt sein auf Minimalmedium zu wachsen, dem AEC zugesetzt wurde. Dieses Phänomen kann verwendet werden, um einen Stamm zu selektieren, der in seinem Wachstum gegenüber AEC als Analogon von L-Lysin resistent ist, d. h. einen Stamm, der eine rekombinante DNA mit einem mutanten DDPS-Gen enthält, bei dem die Inhibition unempfindlich gemacht ist.
Das derart gewonnene mutante Gen kann als rekombinante DNA in ein zur Gattung Serratia gehörendes Bakterium eingeführt und dort exprimiert werden. Somit kann ein Bakterium erhalten werden, das eine DDPS enthält, bei der die Rückkopplungshemmung desensibilisiert ist. Alternativ kann ein Fragment des mutanten DDPS-Gens aus der rekombinanten DNA entnommen und in einen anderen Vektor eingesetzt werden, um zur Anwendung zu kommen. Die Vektor-DNA, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist bevorzugt Plasmid- Vektor-DNA, beispielhaft pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 und pMW218. Daneben können auch Vektoren aus Phagen-DNA verwendet werden.
Weiterhin kann ein anderer Promotor, der in Bakterienzellen der Gattung Serratia funktioniert, wie etwa lac, trp und PL stromaufwärts einer für das mutante DDPS codierenden DNA-Sequenz anligiert werden, um das mutante DDPS-Gen effizient zu exprimieren. Ebenso kann zu diesem Zweck ein im DDPS-Gen enthaltener Promotor in seiner originären Form oder nach Vervielfältigung des Promotors verwendet werden.
<2> DNA, codierend für mutante Aspartokinase (AK) zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
Die für die mutante AK zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung codierende DNA besitzt Mutation(en), um die Rückkopplungshemmung der wildtypisch codierten AK durch L-Lysin unempfindlich zu machen. Die AK wird beispielhaft repräsentiert durch die Enzyme, die aus Bakterien der Gattung Escherichia stammen, insbesondere AKIII, welches aus E. coli stammt und weiterhin durch jede Aspartokinase von zur Gattung Serratia gehörenden Bakterien, vorausgesetzt, dass sie eine Mutation, bzw. Mutationen aufweist, um die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin zu desensibilisieren.
Die Mutation zur Desensibilisierung der Rückkopplungshemmung von AKIII durch L-Lysin wird beispielhaft vertreten durch:

(a) eine Mutation zum Austausch des Glycinrestes in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest;
(b) Mutationen zum Austausch des Glycinrestes in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest und zum Austausch des Glycinrestes in Position 408 durch einen Asparaginsäurerest;
(c) Mutationen zum Austausch des Argininrestes in Position 34 durch einen Cysteinrest und zum Austausch des Glycinrestes in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest;
(d) eine Mutation zum Austausch des Leucinrestes in Position 325 durch einen Phenylalaninrest;
(e) eine Mutation zum Austausch des Methioninrestes in Position 318 durch einen Isoleucinrest;
(f) Mutationen zum Austausch des Methioninrestes in Position 318 durch einen Isoleucinrest und zum Austausch des Valinrestes in Position 349 durch einen Methioninrest;
(g) eine Mutation zum Austausch des Serinrestes in Position 345 durch einen Leucinrest;
(h) eine Mutation zum Austausch des Valinrestes in Position 347 durch einen Methioninrest;
(i) eine Mutation zum Austausch des Threoninrestes in Position 352 durch einen Isoleucinrest;
(j) Mutationen zum Austausch des Threoninrestes in Position 352 durch einen Isoleucinrest und zum Austausch des Serinrestes in Position 369 durch einen Phenylalaninrest;
(k) eine Mutation zum Austausch des Glutaminsäurerestes in Position 164 durch einen Lysinrest; und
(l) Mutationen zum Austausch des Methioninrestes in Position 417 durch einen Isoleucinrest und zum Austausch des Cysteinrestes in Position 419 durch einen Tyrosinrest;

Als für eine wildtypische AKIII codierende DNA sei z. B. die DNA genannt, die für die AKIII aus einem Bakterium der Gattung Escherichia, wie z. B. E. coli codiert. Konkret als Beispiel genannt ist DNA, die für eine in SEQ ID NO: 8 definierte Aminosäuresequenz codiert, sowie eine Sequenz, die durch die Basen-Nummern 584–1930 der in SEQ ID NO: 7 definierten Basensequenz repräsentiert ist. Nebenbei gesagt ist AKIII von E. coli durch das lysC-Gen codiert.
Bei diesen Sequenzen sind solche Sequenzen Beispiele für eine DNA, die für eine mutante AKIII zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung codieren, diejenigen, die eine Mutation, bzw. Mutationen der Basensequenz aufweisen, um den oben beschriebenen Austausch von Aminosäureresten zu verursachen. Jedes dem ersetzten Aminosäurerest entsprechende Codon ist gänzlich unabhängig von seiner Art verwendbar, vorausgesetzt, dass es für den identischen Aminosäurerest codiert. Weiterhin gibt es jene Sequenzen, bei denen Aminosäuresequenzen der Wildtyp-eigenen AKIII in Abhängigkeit von Unterschieden der Bakterienarten und der Bakterienstämme geringfügig verschieden sind. Diejenigen, die Austausche, Deletionen oder Insertionen von Aminosäurerest(en) an Position(en) aufweisen, die in solcher Form für die Enzymaktivität unerheblich sind, sind ebenfalls durch den Begriff des „mutanten AKIII-Gens", das für die vorliegende Erfindung verwendet wird, eingeschlossen. So unterscheidet sich z. B. eine Basensequenz des wildtypischen lysC-Gens (SEQ ID NO: 7) (erhalten in Beispiel 2, siehe Beschreibung unten) von einer bereits veröffentlichten Sequenz von lysC eines E. coli K-12 JC411 Stammes an 6 Positionen (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., und Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261 1052 (1986)). Die codierten Aminosäurereste sind an zwei Positionen von ihnen unterschiedlich (in lysC des JC411 Stammes sind ein Glycinrest in Position 58 durch einen Cysteinrest und ein Glycinrest in Position 401 durch einen Alaninrest ersetzt; gezählt vom N-Terminus der Aminosäuresequenz von lysC gemäß Definition in SEQ ID NO: 8). Es wird sogar für eine lysC mit der gleichen Sequenz wie der von lysC des E. coli K-12 JC411 Stammes erwartet, dass eine lysC mit die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin desensibilisierenden Mutationen erhalten wird, wenn eine beliebige der vorgenannten Mutationen von (a) bis (l) eingeführt wird.
Ein Verfahren zur Gewinnung einer DNA, die für eine mutante AK codiert, bei der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist, kann wie folgt aussehen. Zuerst wird eine DNA, die ein wildtypisches AK-Gen oder ein AK-Gen mit einer anderen Mutation enthält, einer Behandlung der in vitro-Mutagenese unterzogen und die DNA nach der Mutagenesebehandlung mit einer an einen Wirt angepassten Vektor-DNA ligiert, um eine rekombinante DNA zu erhalten. Die rekombinante DNA wird dann in einen Wirtsmikroorganismus eingeführt, um Transformanten zu gewinnen. Wenn eine Transformante, die eine mutante AK exprimiert, aus den zuvor genannten Transformanten selektiert wird, so beinhaltet eine solche Transformante ein mutantes Gen. Alternativ kann eine, ein wildtypisches AK-Gen enthaltende DNA oder ein AK-Gen mit einer anderen Mutation mit einer an einen Wirt angepassten Vektor-DNA ligiert werden, um eine rekombinante DNA zu erhalten. Die rekombinante DNA wird danach einer Behandlung der in vitro-Mutagenese unterzogen, und die rekombinante DNA wird nach der Mutagenesebehandlung in einen Wirtsmikroorganismus eingeführt, um Transformanten zu erhalten. Wenn eine, eine mutante AK exprimierende Transformante aus den zuvor genannten Transformanten selektiert wird, beinhaltet eine solche Transformante ebenfalls ein mutantes Gen.
Alternativ ist es weiterhin akzeptabel, dass ein Mikroorganismus, der ein wildtypisches Enzym produziert, einer Mutagenesebehandlung unterzogen wird, um einen mutanten Stamm herzustellen, der das mutante Enzym produziert, um dann das mutante Gen aus dem mutanten Stamm zu gewinnen. Als Agens zur Durchführung einer direkten Mutagenesebehandlung der DNA wird beispielhaft auf Hydroxylamin und dergleichen verwiesen. Hydroxylamin ist ein chemisches Mutagen, das eine Mutation von Cytosin zu Thymin verursacht, indem es Cytosin in N⁴-Hydroxycytosin umwandelt. Alternativ, wenn ein Mikroorganismus selbst einer Mutagenesebehandlung unterzogen wird, wird die Behandlung unter Verwendung ultravioletter Licht-Bestrahlung durchgeführt, oder unter Verwendung eines üblicherweise für künstliche Mutation verwendeten Mutagens wie etwa N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG).
Als Donor-Mikroorganismus für DNA, die das wildtypische AK-Gen oder ein AK-Gen mit einer anderen oben beschriebenen Mutation enthält, kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, vorausgesetzt, dass dieser ein Mikroorganismus ist, der zu der Gattung Escherichia oder der Gattung Serratia gehört. Konkret gesagt, ist es möglich, diejenigen Mikroorganismen zu verwenden, die einem Buch von Neidhardt et al. (Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabelle 1) beschrieben sind. Beispielhaft werden ein E. coli JM109 Stamm und ein MC1061 Stamm erwähnt. Ebenso sind die zur Gattung Serratia gehörenden Mikroorganismen durch Serratia marcescens, z. B. den Serratia marcescens Stamm AJ13125 (FERM BP-5441) beispielhaft vertreten.
Wenn das AK-Gen aus diesen Stämmen gewonnen wird, können die Präparation chromosomaler DNA, die Herstellung einer chromosomalen DNA-Bibliothek und dergleichen in der selben Weise wie oben für die Gewinnung des DDPS-Gens beschrieben, durchgeführt werden. Es ist bevorzugt, als Wirt für die Herstellung der Bibliothek einen Stamm zu verwenden, der für AKI, II und III vollständig defizient ist, wie etwa einen E. coli GT3 Stamm (erhältlich bei dem E. coli Genetic Stock Center, Connecticut, United States).
Aus der erhaltenen chromosomalen DNA-Bibliothek wird ein Bakterienstamm mit einer rekombinanten DNA des AK-Gens als ein Stamm gewonnen, bei dem die AK-Aktivität gesteigert ist oder als ein Stamm, bei dem Auxotrophie komplementiert ist. Zelluläre Extrakte werden aus Kandidatenstämmen gewonnen, und Rohenzym-Lösungen werden aus diesen gewonnen, um die AK-Aktivität zu bestätigen. Das Messverfahren für die AK-Enzymaktivität kann in Übereinstimmung mit einem Verfahren von Stadtman et al. (Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G., und Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033 (1961)) durchgeführt werden.
Wenn z. B. ein für AK vollständig defizienter Stamm als Wirt verwendet wird, kann ein, ein AK-Gen enthaltendes Fragment gewonnen werden, indem ein transformierter Stamm isoliert wird, der die Fähigkeit erlangt, auf Medium ohne L-Lysin, L-Threonin, L-Methionin und Diaminopimelinsäure, oder auf einem Medium ohne Homoserin und Diaminopimelinsäure zu wachsen, wobei rekombinante DNA aus diesem Bakterienstamm gewonnen werden kann.
Wenn das AK-Gen mittels des PCR-Verfahrens aus chromosomaler DNA amplifiziert wird, können die für die PCR-Reaktion zu verwendenden DNA-Primer in geeigneter Weise z. B. auf Basis einer in E. coli bekannten Sequenz (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., und Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)) hergestellt werden. Jedoch sind auch Primer verwendbar, die eine Region amplifizieren können, die 1347 für das lysC-Gen codierende Basen umfasst, wobei z. B. die zwei Primer mit den in SEQ ID NO: 5 und NO: 6 definierten Sequenzen geeignet sind.
Weiterhin kann ein aus einem Bakterium der Gattung Serratia stammendes AK-Gen in der selben wie der oben genannten Weise gewonnen werden, und das Gen kann aus chromosomalen DNA-Bibliotheken von Bakterien der Gattung Serratia isoliert werden, indem eine Hybridisierung durchgeführt wird, bei der das aus E. coli stammende AK-Gen oder ein Teil davon als Sonde verwendet wird. Ebenso kann das AK-Gen aus einem Bakterium der Gattung Serratia durch ein PCR-Verfahren gewonnen werden, bei dem eine chromosomale DNA eines Bakteriums der Gattung Serratia als Matrize und auf der Basensequenz eines AK-Gens von E. coli basierende, präparierte Oligonukleotide verwendet werden.
Das Verfahren zur Ausführung von Mutationen wie Austauschen, Insertionen und Deletionen eines oder mehrerer Aminosäurereste in dem wie oben beschrieben gewonnenen AK-Gen wird beispielhaft repräsentiert durch das rekombinante PCR-Verfahren, das Verfahren der positions-spezifischen Mutagenese und dergleichen, und zwar in der selben Weise wie für die oben beschriebene Mutagenesebehandlung des DDPS-Gens.
Ebenso ist es gemäß der chemischen Synthese eines gewünschten Gens möglich, eine Mutation oder eine willkürliche Mutation an einer gewünschten Stelle einzuführen.
Weiterhin ist ein Verfahren verfügbar, bei dem die DNA des AK-Gens auf dem Chromosom oder einer extrachromosomalen rekombinanten DNA direkt mit Hydroxylamin behandelt wird (Hashimoto, T. und Sekiguchi, M. J. Bacteriol., 159, 1039 (1984)). Alternativ ist es möglich, ein Verfahren zu verwenden, bei dem ein Bakterium der Gattung Escherichia, das ein AK-Gen auf dem Chromosom oder auf extrachromosomaler rekombinanten DNA aufweist, mit ultraviolettem Licht bestrahlt wird, ebenso wie ein Verfahren, bei dem eine Behandlung mit einem chemischen Agens wie N-methyl-N'-nitrosoguanidin oder salpetriger Säure durchgeführt wird.
Im Hinblick auf ein Selektionsverfahren für das mutante AK-Gen wird ein vollständig für AK defizienter Stamm, z. B. ein E. coli GT3 Stamm zunächst mit einer rekombinanten DNA transformiert, die ein AK-Gen enthält, das der Mutagenesebehandlung unterzogen wurde. Im nächsten Schritt werden die transformierten Stämme auf einem Minimalmedium wie etwa M9 kultiviert, das eine erhebliche Menge an L-Lysin enthält. Stämme, die eine rekombinante DNA mit einem wildtypischen AK-Gen enthalten, können kein L-Threonin, L-Isoleucin, L-Methionin und keine Diaminopimelinsäure (DAP) synthetisieren und sind in ihrem Wachstum gehemmt, da die einzige AK durch L-Lysin inhibiert wird. Im Gegensatz dazu sollten die Stämme, die eine rekombinante DNA mit dem mutanten AK-Gen enthalten, bei dem die Inhibition durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist, dazu in der Lage sein, auf einem Minimalmedium zu wachsen, dem eine erhebliche Menge L-Lysin zugegeben wurde. Dieses Phänomen kann ausgenutzt werden, um einen Stamm zu selektieren, der in seinem Wachstum gegenüber L-Lysin oder AEC als einem Analogon des L-Lysins resistent ist, d. h. einen Stamm, der eine rekombinante DNA aufweist, welche ein mutantes AK-Gen beinhaltet, bei der die Inhibition desensibilisiert wurde.
Das derart gewonnene mutante Gen kann als rekombinante DNA in ein Bakterium der Gattung Serratia eingeführt und exprimiert werden. Auf diese Weise kann das Bakterium gewonnen werden, das eine AK enthält, bei der die Rückkopplungshemmung desensibilisiert ist. Alternativ kann ein mutantes Fragment des AK-Gens aus der rekombinanten DNA herausgenommen und in einen anderen Vektor eingesetzt werden, um zum Einsatz zu gelangen. Die Vektor-DNA, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, ist bevorzugt Plasmidvektor-DNA, z. B. pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 und pMW218. Daneben können auch Vektoren aus Phagen-DNA verwendet werden.
Weiterhin kann ein anderer Promotor, der in Bakterienzellen der Gattung Serratia funktioniert, wie etwa lac, trp und PL, stromaufwärts einer für die mutante AK codierenden DNA-Sequenz anligiert werden, um das mutante AK-Gen effizient zu exprimieren. Ebenso kann ein in dem AK-Gen enthaltener Promotor in seiner originären Form oder nach seiner Amplifikation verwendet werden.
<3> Herstellung von L-Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung.
L-Lysin kann effizient hergestellt werden, indem man das Bakterium der Gattung Serratia, das durch Einführung des wie oben beschrieben gewonnenen, mutanten DDPS-Gens transformiert wurde, in einem geeigneten Medium wachsen lässt, wobei das Bakterium ferner mit einer AK ausgestattet wird, bei der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist. L-Lysin wird dann in einer Kultur dieses Bakteriums produziert und angereichert und aus der Kultur abgetrennt. Genauer gesagt, kann L-Lysin effizient produziert werden, indem man es dem Bakterium der Gattung Serratia ermöglicht, sowohl das mutante DDPS-Gen als auch das mutante AK-Gen zu beinhalten.
Das Bakterium der Gattung Serratia, das eine AK enthält, bei der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin desensibilisiert ist, ist beispielhaft durch bestimmte transformierte Bakterien der Gattung Serratia repräsentiert. Diese werden dadurch transformiert, dass in die Zellen eine rekombinante DNA eingeführt wird, die derart konstruiert wurde, dass eine DNA, welche für eine AK mit Mutationen) zur Desensibilisierung der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin codiert, mit einer in Bakterienzellen der Gattung Serratia autonom replizierbaren Vektor-DNA ligiert ist. Ebenso kann die AK, in der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin desensibilisiert ist, eine wildtypische AK sein, die nicht der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, oder eine Ausführung, bei der ein solches wildtypisches AK-Gen in ein Bakterium der Gattung Serratia in entsprechender Weise eingeführt wurde. Ebenfalls akzeptabel ist ein mutanter Stamm eines Bakteriums der Gattung Serratia, das mittels einer Mutagenesebehandlung von Bakterienzellen der Gattung Serratia dazu gebracht wurde, eine mutante AK zu produzieren.
Auf der anderen Seite kann, um eine Transformation durch Einführung des mutanten DDPS-Gens in ein Bakterium der Gattung Serratia zu erreichen, die Transformation durchgeführt werden, indem in die Zellen eine rekombinante DNA eingeführt wird, die dadurch konstruiert wurde, dass das mutante DDPS-Gen mit einer in Bakterienzellen der Gattung Serratia autonom replizierbaren Vektor-DNA ligiert wurde.
Wenn sowohl das mutante DDPS-Gen als auch das mutante AK-Gen in ein Bakterium der Gattung Serratia eingeführt werden, können beide mutanten Gene in den Zellen auf einem identischen Plasmid oder auf separaten Plasmiden vorliegen. Wenn separate Plasmide verwendet werden, ist es bevorzugt, Plasmide zu verwenden, die einen stabilen Mechanismus der Verteilung besitzen, um es jedem von ihnen zu ermöglichen, stabil in den Zellen beinhaltet zu sein. Wenn das mutante DDPS-Gen und das mutante AK-Gen unter Verwendung separater Plasmide in ein Bakterium der Gattung Serratia eingeführt werden, ist jede Reihenfolge der Einführung der beiden Gene akzeptabel.
Die Produktivität für L-Lysin kann weiter verbessert werden, wenn ein Dihydrodipicolinatreduktase-Gen (dapB) des Bakteriums der Gattung Serratia, in das das mutante DDPS-Gen und das mutante AK-Gen eingeführt worden sind, in seiner Wirkung verstärkt wird. Die Produktivität für L-Lysin kann dadurch noch weiter verbessert werden, indem ein Diaminopimelinat-Dehydrogenase-Gen (DDH) aus einem Bakterium des Coryne-Typs in ein Bakterium der Gattung Serratia eingeführt wird, das das mutante AK-Gen und das mutante DDPS-Gen enthält, und bei dem das Dihydrodipicolinatreduktase-Gen verstärkt wurde. Dieses Diaminopimelinat-Dehydrogenase-Gen sollte verstärkt werden. Alternativ kann die Produktivität für L-Lysin ebenso und in einem ähnlichen Ausmaß verbessert werden, indem anstelle der Einführung der Diaminopimelinat-Dehydrogenase ein Succinyldiaminopimelinat-Transaminase-Gen (dapD) und ein Succinyldiaminopimelinat-Deacylase-Gen (dapE) verstärkt werden.
Die „Verstärkung eines Gens" bezieht sich hier auf eine Steigerung der Aktivität eines Enzyms als einem Expressionsprodukt des Gens pro Zelle. Konkret ausgedrückt, kann z. B. eine Steigerung der Kopienzahl des Gens in einer Zelle, eine Steigerung der Expressionsmenge pro Gen durch Verwendung eines Promotors mit starker Expressionswirkung sowie die Einführung von Mutationen) in das Gen zur Steigerung der Enzymaktivität vorliegen. Um die Kopienzahl eines Gens in einer Zelle zu erhöhen, wird das Gen in einen in Bakterien der Gattung Serratia autonom replizierbaren Vektor inseriert, und ein Bakterium der Gattung Serratia kann dann mit diesem Vektor transformiert werden. Dieser Vektor ist vorzugsweise ein Plasmid, das in mehreren Kopien in der Zelle vorliegt (multi-copy type plasmid). Alternativ kann die Kopienzahl erhöht werden, indem in die chromosomale DNA integrierte DNA unter Verwendung des Phagen Mu oder dergleichen amplifiziert wird.
Im Hinblick auf die Verwendung des Plasmids ist zu sagen, dass in dem Fall, in dem Plasmide zur Einführung des mutanten DDPS-Gens und des mutanten AK-Gens benutzt werden, solche Plasmide bevorzugt benutzt werden, die einen stabilen Mechanismus der Weitergabe aufweisen, so dass die Plasmide stabil und gemeinsam in einer Zelle gehalten werden. Jede Reihenfolge der Einführung der Gene ist akzeptabel.
Ein Verfahren zur Gewinnung der Gene des L-Lysin-Biosynthesesystems von E. coli und des DDH-Gens des Bakteriums des Coryne-Typs wird unten beispielhaft dargestellt.
Das DDH-Gen wird erhalten, indem chromosomale DNA eines Bakteriums des Coryne-Typs wie etwa Brevibacterium lactofermentum mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert wird, das zwei Arten von Oligonukleotid-Primern verwendet, die auf Basis einer bekannten Nukleotidsequenz eines DDH-Gens von Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) hergestellt wurden (z. B. die Primer gemäß SEQ ID NO: 9, NO: 10).
Das dapD-Gen wird erhalten, indem chromosomale DNA eines E. coli W3110 Stammes mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert wird, das zwei Arten von Oligonukleotid-Primern verwendet, die auf Basis einer Nukleotidsequenz eines bekannten dapD-Gens (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)) hergestellt wurden (z. B. die Primer gemäß SEQ ID NO: 11, NO: 12).
Das dapE-Gen wird erhalten, indem DNA aus E. coli mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert wird, das zwei Arten von Oligonukleotid-Primern verwendet, die auf Basis einer Nukleotidsequenz eines bekannten dapE-Gens (Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)) hergestellt wurden (z. B. die Primer gemäß SEQ ID NO: 13, NO: 14).
Bei der vorliegenden Erfindung kann jedes Bakterium der Gattung Serratia als Wirt verwendet werden, vorausgesetzt, dass ein Promotor des mutanten DDPS-Gens, des mutanten AK-Gens oder eines anderen Gens des L-Lysin Biosynthese-Systems oder ein anderer Promotor zur Expression dieser Gene in seinen Zellen funktionell ist, und vorausgesetzt, dass ein Replikationsursprung einer zur Einführung vorgesehenen Vektor-DNA in seinen Zellen funktionell ist, um zur Replikation befähigt zu sein, wenn das mutante DDPS-Gen, das mutante AK-Gen oder ein anderes Gen des L-Lysin Biosynthese-Systems als extrachromosomale DNA in das Plasmid eingeführt wird.
Zum Beispiel wird ein Bakterium der Gattung Serratia beispielhaft durch L-Threonin-produzierende Mikroorganismen repräsentiert, da ihre Inhibition der Aspartokinase durch L-Lysin im allgemeinen auch bei den L-Threonin-produzierenden Mikroorganismen desensibilisiert ist. Als L-Threonin-produzierendes Bakterium der Art S. marcescens ist dieses resistent gegenüber AHV (α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure), einem Analogon des Threonins (S. Komatsubara, M. Kisumi und I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834 (1978)). Ein derartiger Stamm ist Serratia marcescens AJ13125. Dieser Stamm wurde bei dem „National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology" (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) unter der Zugangsnummer FERM P-14983 am 12. Juni 1995 hinterlegt und unter dem Budapester Abkommen am 4. März 1996 in eine internationale Hinterlegung überführt, wobei die Zugangsnummer FERM BP-5441 zugeteilt wurde.
Stellvertretend für ein in der vorliegenden Erfindung verwendbares Bakterium der Gattung Serratia steht ferner Serratia marcescens mit einer Defizienz der Lysindecarboxylase (Japanische Offenlegungsschrift No. 50-53589 (1975)). Lysindecarboxylase ist ein Enzym des L-Lysin-Abbaus, das eine Reaktion katalysiert, bei der Cadaverin durch Decarboxylierung von L-Lysin gebildet wird, und ein dafür defizienter Stamm ist hinsichtlich des Abbaus von L-Lysin supprimiert.
L-Threonin-produzierende Bakterien und Bakterien der Gattung Serratia, die defizient für Lysindecarboxylase sind, können gewonnen werden, indem eine Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder eine Behandlung mit Mutagenen wie den üblicherweise für künstliche Mutation angewandten Mutagenen N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und salpetriger Säure erfolgt.
Das für die Kultur der Transformanten mit dem erfindungsgemäßen mutanten Gen zu verwendende Medium ist ein gewöhnliches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und – optional – andere organische Komponenten enthält.
Es ist möglich, als Kohlenstoffquelle Zucker wie Sucrose, Glukose, Laktose, Galaktose, Fruktose oder Stärkehydrolysat; Alkohole wie Glycerin oder Sorbit; oder organische Säuren wie Fumarsäure, Zitronensäure oder Bernsteinsäure zu verwenden.
Es ist möglich, als Stickstoffquelle anorganische Ammoniumsalze wie Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumphosphat; organisch gebundenen Stickstoff wie Sojahydrolysat; sowie Ammoniumgas oder wässrige Ammoniaklösung zu verwenden.
Es ist bevorzugt, dass benötigte Substanzen wie Vitamin B₁ und L-Isoleucin oder Hefeextrakt in angemessenen Mengen als organische Spurennährstoffe enthalten sind. Anders als die obigen Bestandteile werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen – wenn nötig – in kleinen Mengen zugegeben.
Die Kultur erfolgt bevorzugt unter aeroben Bedingungen für 16 bis 96 Stunden. Die Kultivierungstemperatur wird kontrolliert auf 25°C bis 45°C eingestellt, und der pH wird während der Kultur kontrolliert auf 5 bis 8 eingestellt. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen ebenso wie Ammoniumgas oder dergleichen können zur pH-Einstellung verwendet werden. Die Gewinnung von L-Lysin aus einer fermentierten Flüssigkeit wird gewöhnlich durchgeführt, indem ein Verfahren mit Ionenaustauscher-Harz, ein Fällungsverfahren und andere bekannte Verfahren kombiniert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Präparationsschritte für pdapA1 und pdapA2.
2 zeigt die Inhibition der wildtypischen und mutanten DDP's durch L-Lysin.
3 zeigt Präparationsschritte für ein Plasmid pdapAS824 mit einem dapA*-Gen des doppelt mutanten Typs.
4 zeigt Präparationsschritte für pLYSC1 und pLYSC2.
5 zeigt eine Rate des Auftretens sowie eine Mutationsrate von Transformanten nach einer Hydroxylamin-Behandlung.
6 zeigt die Inhibition durch L-Lysin bei den wildtypischen und den mutanten AKIII's.
7 zeigt Präparationsschritte für ein aus RSF1010 abgeleitetes Plasmid RSF24P mit dapA*24.
8 zeigt Präparationsschritte für ein Plasmid pLLC*80.
9 zeigt Präparationsschritte für ein aus RSF1010 abgeleitetes Plasmid RSFD80 mit dapA*24 und lysC*80.
Optimale Vorgehensweise bei der Ausführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung soll durch die Referenz auf die Beispiele im folgenden näher erläutert werden.
Beispiel 1 Präparation eines mutanten DDPS-Gens
<1> Klonierung des wildtypischen dapA-Gens
Über eine Basensequenz eines dapA-Gens von E. coli wurde bereits berichtet (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)), und es ist bekannt, dass sein offenes Leseraster (open reading frame, ORF) 876 Basenpaare aufweist und für ein Protein mit 292 Aminosäureresten codiert. Da es unbekannt ist, wie dieses dapA-Gen reguliert wird, wurde eine Region, die nur eine SD-Sequenz und das ORF, abgesehen von einer Promotorregion, enthielt, unter Verwendung des PCR-Verfahrens amplifiziert und kloniert.
In Übereinstimmung mit einem Verfahren von Saito und Miura Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) wurde die genomische Gesamt-DNA eines E. coli K-12 MC1061 Stammes extrahiert. Es wurden zwei Arten von Primern mit den in SEQ ID NO: 1 und NO: 2 gezeigten Sequenzen präpariert und diese dazu verwendet, die PCR-Reaktion gemäß eines Verfahrens von Erlich et al. (PCR Technology, Stockton press (1989)) durchzuführen und die Ziel-DNA zu amplifizieren. Die erhaltene DNA wurde so wie sie war in einen kommerziell erhältlichen Klonierungsvektor, den Vektor pCR1000 für PCR-Fragmente (Invitrogen, Ltd., California, United States) inseriert. PCR1000 enthält einen lacZ-Promotor (Placz) und wird in einem Zustand verkauft, bei dem er an einer stromabwärts des lacZ-Promotors gelegenen Position geschnitten ist. Wenn eine rekombinante DNA, dadurch erhalten, dass ein PCR-Fragment zwischen die beiden geschnittenen Enden von pCR1000 ligiert wurde, in E. coli eingeführt wird, so wird das PCR-Fragment unter der Kontrolle des lacZ-Promotors transkribiert. Bei der Ligation des PCR-Fragments mit pCR1000 wurden zwei Arten von Plasmiden erhalten; diese waren pdapA1 als ein Plasmid, das in einer positiven Orientierung ligiert ist, und pdapA2 als ein in umgekehrter Orientierung ligiertes Plasmid, jeweils bezogen auf die Transkriptionsrichtung von dapA im Hinblick auf die Transkriptionsrichtung durch den lacZ-Promotor (1).
Wenn diese Plasmide in E. coli JE7627, einem für DDPS defizienten Stamm, eingeführt werden, werden Stämme mit dem eingeführten Plasmid hinsichtlich der beim Wirt JE7627 vorliegenden Auxotrophie für Diaminopimelinsäure komplementiert. Es wurde somit bestätigt, dass die in die beiden Plasmide eingesetzten DNA-Fragmente das Gen dapA, welches für aktive DDPS codiert, enthalten.
Ein transformierter Stamm, der dadurch erhalten wurde, dass pdapA1 in einen wildtypischen E. coli W3110 Stamm (erhältlich beim National Institute of Genetics (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japan)) eingeführt wurde, wurde W3110/pdapA1 genannt. Ebenso wurde ein transformierter Stamm, der dadurch erhalten wurde, dass pdapA2 in den E. coli W3110 Stamm eingeführt wurde, als W3110/pdapA2 benannt. Diese zwei transformierten Stämme wurden jeweils in einem Minimalmedium M9 der folgenden Zusammensetzung, dem AEC als Analogon von Lysin zugegeben wurde, kultiviert. Der Stamm W3110 ohne eingeführtes Plasmid wurde außerdem als Kontrolle in dem gleichen Medium kultiviert. Diese zwei transformierten Stämme und der W3110-Stamm ohne Plasmid wurden im Wachstum durch AEC supprimiert, jedoch wurde ihre Wachstumshemmung durch Zugabe von L-Lysin geheilt.
Minimalmedium M9
A, B, C und D entsprechend obiger Beschreibung wurden separat sterilisiert und in einem Verhältnis von A : B : C : D : Wasser = 5 : 0,1 : 1 : 0,1 : 95 gemischt.
<2> Präparation des mutanten DDPS-Gens dapA*
Es wurde angenommen, dass ein Stamm, der ein Plasmid mit dapA* enthält, das für eine DDPS mit desensibilisierter Inhibition durch L-Lysin codiert, auf einem Minimalmedium M9 wachsen könnte, dem eine erhebliche Menge an AEC zugegeben wurde. Ein Stamm, der ein Plasmid mit dapA* enthielt, wurde anhand seiner Wachstumsresistenz gegenüber AEC selektiert.
Um dapA* in effizienter Weise zu gewinnen, wurden die dapA's auf den in <1 > präparierten pdapA1 und pdapA2 einer Mutagenesebehandlung unterzogen.
(1-2-1) Untersuchung auf Selektionsbedingungen für Stämme, die ein Plasmid mit dapA* enthalten.
Der Stamm W3110/pdapA1 und der Stamm W3110/pdapA2, die wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden auf M9 Agarplatten-Medien mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen an AEC kultiviert. Wachstums-inhibierende Konzentrationen von AEC wurden überprüft, und es wurde eine Untersuchung im Hinblick auf eine Selektionsbedingung für einen Stamm durchgeführt, der ein Plasmid mit dapA* enthält.
Das Wachstum der Transformanten auf den M9-Medien mit verschiedenen AEC-Konzentrationen ist in Tabelle 1 dargestellt. In dieser Tabelle zeigt ein „+" ein Wachstums der Transformante an, ein „=" hingegen zeigt fehlendes Wachstum an.
Tabelle 1
Die Transkriptionsrichtung des dapA-Gens auf pdapA1 stimmt mit der Transkriptionsrichtung durch den lacZ-Promotor überein (1). Es wurde folglich herausgefunden, dass das dapA-Gen auf pdapA1 eine Resistenz gegen AEC bei ziemlich hohen Konzentrationen verleiht, selbst wenn dapA in der wildtypischen Form verbleibt, da das Ausmaß seiner Genexpression durch den lacZ-Promotor vervielfacht wird. Demgegenüber hatte das dapA-Gen auf pdapA2 eine kleinere Expressionsrate und führte bei niedrigeren Konzentrationen zur Wachstumshemmung durch AEC, da die Transkriptionsrichtung im Hinblick auf den lacZ-Promotor in der umgedrehten Orientierung vorlag und ein funktioneller Promotor des dapA-Gens selbst ebenso fehlte (das Wachstum wurde bei zugegebenen Anteilen von 30 mM im Fall des W3110/pdapA1-Stammes und von 15 mM im Fall des W3110/pdapA2-Stammes unterdrückt). Es wurde bestätigt, dass die Wachstumshemmung durch gleichzeitige Gabe von L-Lysin eliminiert wurde.
Daher wurde pdapA2 als Objekt zur Einführung von Mutationen) verwendet. Zur Selektion eines Stammes, der ein Plasmid mit dapA* enthält, wurde ein Medium hergestellt, bei dem 60 mM an AEC zu dem Minimalmedium M9 gegeben wurden. Dieses Medium wird in Beispiel 1 unten als „Selektionsmedium" bezeichnet.
(1-2-2) In vitro-Mutagenesebehandlung von pdapA2 mit Hydroxylamin
Zur Einführung von Mutationen in das pdapA2-Plasmid wurde ein Verfahren zur in vitro-Mutagenesebehandlung benutzt, bei dem die Plasmide direkt mit Hydroxylamin behandelt wurden.
2 μg DNA wurden bei 75°C für 1 bis 4 Stunden in 0,4 M Hydroxylamin behandelt (0,1 M KH₂PO₄ – 1 mM EDTA (pH 6,0): 100 μl, 1 M Hydroxylamin – 1 mM EDTA (pH 6,0): 80 μl, DNA: 2 μg; Gesamtvolumen, mit Wasser aufgefüllt: 200 μl). Nach der Behandlung wurde die DNA mit Glaspulver gereinigt und in E. coli W3110 eingeführt, das dann auf einem Vollmedium („L-broth": 1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 1,5% Agar) verteilt wurde, um Kolonien zu bilden. Diese wurden dann durch Replika-Plattierung auf das in (1-2-1) beschriebene Selektionsmedium aufgebracht („repliziert") und diejenigen Stämme, die auf dem Selektionsmedium Kolonien ausbildeten, wurden selektiert. Kandidaten für mutante Plasmide wurden nach zweifachen Experimenten bei einer Gesamtheit von 36 Stämmen erhalten.
Die Kandidatenstämme von insgesamt 36 derart erhaltenen Stämmen wurden wiederum auf das Selektionsmedium getupft und die AEC-Resistenz bestätigt.
(1-2-3) Isolierung des dapA*-Gens und Untersuchung des dapA*-Genprodukts
Mutante Formen von pdapA2 wurden aus den 36 oben beschriebenen Stämmen gewonnen. Ein dapA-defizienter Stamm, JE7627, wurde mit diesen Formen, bzw. mit dem wildtypischen pdapA2 transformiert. Es wurde ein zellfreier Extrakt aus jedem der transformierten Stämme hergestellt und die Enzymaktivität von DDPS gemessen.
Der zellfreie Extrakt (Rohenzym-Lösung) wurde wie folgt hergestellt. Ein transformierter Stamm wurde in einem 2 × TY-Medium (1,6% Bacto Trypton, 1 Hefeextrakt, 0,5% NaCl) kultiviert und bei einer optischen Dichte von etwa 0,8, gemessen bei 660 nm (OD₆₆₀) gesammelt. Ein entsprechendes Zellpellet wurde mit 0,85% NaCl bei 0°C gewaschen und in 20 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,5), enthaltend 400 mM KCl, suspendiert. Die Zellen wurden mittels Ultraschall aufgebrochen (0°C, 200 W, 10 Minuten). Eine Lösung aufgebrochener Zellen wurde bei 33 krpm für 1 Stunde bei 0°C zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Zu diesem Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zum Erreichen einer 80%igen Sättigung zugegeben, gefolgt von einer Lagerung bei 0°C über Nacht und anschließender Zentrifugation. Das Pellet wurde jeweils in 20 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,5) – 400 mM KCl gelöst.
Die Enzymaktivität von DDPS wurde entsprechend eines Verfahrens von Yugari et al. (Yugari, Y. und Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240, 4710 (1962)) gemessen. Genauer gesagt, wurde die Absorption einer Reaktionslösung mit der folgenden Zusammensetzung bei 37°C mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 270 nm über einen Zeitverlauf bestimmt und das gebildete Dihydrodipicolinat gemessen. Natriumpyruvat wurde zur Nullmessung aus dem Reaktionssystem entnommen.
Zusammensetzung der Reaktionslösung:

50 mM Imidazol-HCl pH 7,4

20 mM L-Aspartat-Semialdehyd

20 mM Natriumpyruvat

Enzymlösung

Wasser (zum Auffüllen)

Gesamt: 1,0 ml
Bei der Messung der Enzymaktivität der DDPS wurden verschiedene Konzentrationen an L-Lysin zu der Enzymreaktionslösung zugegeben und das Ausmaß der Inhibition durch L-Lysin überprüft. Wie in 2 gezeigt, unterlag das wildtypische DDPS einer Inhibition durch L-Lysin. Unter den 36 Arten von Kandidaten-Plasmiden waren drei Arten von mutanten Plasmiden, die aus transformierten Stämmen stammten, die eine DDPS aufwiesen, die im Vergleich zum Wildtyp kaum einer Inhibition durch L-Lysin unterlag. Sie wurden als pdapAS8, pdapAS9, bzw. pdapAS24 bezeichnet. Anhand der folgenden Bestimmung der Basensequenzen wurde festgestellt, dass pdapAS8 und pdapAS9 die gleiche Mutation aufwiesen.
Das Ausmaß der Desensibilisierung der Inhibition durch L-Lysin war verschieden in den drei Arten von mutantem DDPS, die durch pdapAS8, pdapAS9 und pdapAS24 codiert wurden, jedoch war die Inhibition durch L-Lysin bei allen drei Arten unempfindlich gemacht. Obwohl die spezifische Aktivität des Enzyms durch die Wachstumssituation der Zellen und die Präparationen der Proben beeinflusst sein kann, wurde diese in allen Fällen im Vergleich zum Wildtyp als geringfügig verändert beobachtet. Der Einschätzung zufolge würde es jedoch kein wesentliches Problem geben, wenn diese als Material zur Zucht verwendet werden.
(1-2-4) Bestimmung der Basensequenz des mutanten dapA-Gens
Die Basensequenz der mutanten dapA-Gene wurde gemäß eines üblichen Verfahrens unter Verwendung eines DNA-Sequenziergeräts (DNA sequencer ABI Model 373A, hergestellt durch die Applied Biosystem Inc.) bestimmt. Im Ergebnis wurde gezeigt, dass – im Bezug auf eine Sequenz des wildtypischen dapA-Gens gemäß SEQ ID NO: 3 – in pdapAS8 und pdapAS9 das C in Position 487 zu T geändert worden war, während in pdapAS24 das C in Position 597 zu T geändert worden war. Es wurde somit festgestellt, dass in dem von pdapAS8 und pdapAS9 codierten DDPS ein Alaninrest in Position 81 in einen Valinrest geändert worden war, während in dem von pdapAS24 codierten DDPS ein Histidinrest in Position 118 in einen Tyrosinrest geändert worden war, wobei diese Änderungen jeweils in der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Aminosäuresequenz von DDPS erfolgten.
(1-2-5) Herstellung von dapA mit doppeltes Mutation
Es wurden gemäß obiger Beschreibung zwei Arten des mutanten dapA-Gens gewonnen. Um zu verifizieren, ob sich die Desensibilisierung der Inhibition bei diesen Mutationen additiv verhält oder nicht, wurde ein Plasmid hergestellt, das mutantes dapA mit beiden dieser zwei Mutationen enthielt. Ein Verfahren der Herstellung ist in 3 gezeigt. Das erhaltene Plasmid mit doppelter Mutation wurde pdapAS824 genannt.
Beispiel 2: Herstellung eines mutanten AKIII-Gens
<1> Klonierung des wildtypischen lysC-Gens
Über eine Basensequenz eines AKIII-Gens (lysC) von E. coli ist bereits berichtet worden (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., und Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), und es ist bekannt, dass sein offenes Leseraster (ORF) 1347 Basenpaare umfasst und für ein Protein mit 449 Aminosäureresten codiert. In diesem Gen ist ein Operator vorhanden, der einer Suppression durch L-Lysin unterliegt. Folglich wurde eine Region, die nur eine SD-Sequenz und das ORF enthielt, unter Verwendung des PCR-Verfahrens amplifiziert und kloniert, um die Operator-Region zu entfernen.
Genomische Gesamt-DNA eines E. coli K-12 MC1061-Stammes wurde gemäß eines Verfahrens von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) präpariert. Es wurden zwei Arten von Primern mit den in SEQ ID NO: 5 und NO: 6 gezeigten Sequenzen hergestellt, die verwendet wurden, um die PCR-Reaktion gemäß eines Verfahrens von Erlich et al. (PCR Technology, Stockton press (1989)) durchzuführen, und das lysC-Gen wurde amplifiziert. Die erhaltene DNA wurde mit BamHI und AseI verdaut, danach mit stumpfen Enden versehen, und in eine Smal-Restriktionsstelle eines Multi-Kopien-Vektors, pUC18, inseriert. Diese Smal-Restriktionsstelle ist an einer Position stromabwärts des im Vektor vorliegenden lacZ-Promotors lokalisiert, so dass das inserierte DNA-Fragment mittels durchgehender Transkription (read-through transcription) unter der Kontrolle des lacZ-Promotors transkribiert wird, wenn eine durch Inserieren eines DNA-Fragments in die Smal-Restriktionsstelle von pUC18 gewonnene rekombinante DNA in E. coli eingeführt wird. Bei Insertion des PCR-Fragments in die Smal-Restriktionsstelle von pUC18 wurden zwei Arten von Plasmiden erhalten. Diese waren pLYSC1 als ein in umgekehrter Orientierung inseriertes plasmid und pLYSC2 als ein für die Transkriptionsrichtung von lysC im Bezug zu der Transkriptionsrichtung durch den lacZ-Promotor in positiver Orientierung inseriertes Plasmid (4).
Wenn diese Plasmide verwendet wurden, um E. coli GT3 (thrA1016b metLM1005 lysC1004) als einen für AKI, II und III vollständig defizienten Stamm zu transformieren, wurde die Auxotrophie von GT3 für Homoserin und Diaminopimelinsäure komplementiert. Es wurde somit bestätigt, dass die in die beiden Plasmide inserierten DNA-Fragmente das lysC-Gen enthalten, das für aktive AKIII codiert.
Ein transformierter Stamm, der erhalten wurde, indem pLYSC1 in den vollständig für AK defizienten Stamm E. coli GT3 eingeführt wurde, wurde als GT3/pLYSC1 bezeichnet; ebenso wurde ein transformierter Stamm, der erhalten wurde, indem pLYSC2 in E. coli GT3 eingeführt wurde, als GT3/pLYSC2 bezeichnet. Dem Minimalmedium M9 wurde eine beträchtliche Menge an L-Lysin zugegeben, und die Stämme GT3/pLYSC1 und GT3/pLYSC2 wurden jeweils darauf kultiviert. Sowohl der Stamm GT3/pLYSC1 als auch der Stamm GT3/pLYSC2 enthalten Plasmide mit dem wildtypischen lysC, bei denen die von lysC auf dem Plasmid codierte AKIII die einzige AK darstellt. Die wildtypische AKIII als die alleinige AK wird in Gegenwart einer hohen Menge an L-Lysin durch L-Lysin inhibiert. Somit waren beide Stämme nicht in der Lage, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Methionin und Diaminopimelinsäure (DAP) zu synthetisieren und waren in ihrem Wachstum gehemmt.
<2> Präparation eines mutanten AKIII-Gens (lysC*)
Es wurde angenommen, dass ein Stamm, der ein Plasmid mit lysC*, codierend für eine AK mit desensibilisierter Inhibition durch L-Lysin, enthält, auf einem Minimalmedium M9 wachsen könnte, dem eine erhebliche Menge an L-Lysin zugegeben wurde. Es wurde ein Stamm selektiert, der ein Plasmid mit lysC* enthält, indem Stämme selektiert wurden, die in ihrem Wachstum gegenüber L-Lysin oder AEC als einem Analogon von L-Lysin resistent waren.
Um lysC* effizient zu gewinnen, wurden die lysC's auf den in <1> hergestellten pLYSC1 und pLYSC2 einer Mutagenesebehandlung unterzogen.
(2-2-1) Untersuchungen hinsichtlich einer Selektionsbedingung für einen Stamm, der ein Plasmid mit lysC* enthält
Die Stämme GT3/pLYSC1 und GT3/pLYSC2 wurden jeweils auf M9 Agarplattenmedien mit unterschiedlichen Konzentrationen an L-Lysin oder AEC kultiviert. Wachstumsinhibierende Konzentrationen von L-Lysin und AEC wurden getestet und eine Selektionsbedingung für einen Stamm untersucht, der ein Plasmid mit lysC* enthält.
Das Wachstum der Transformanten auf den M9 Medien, die L-Lysin oder AEC in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, ist in Tabelle 2 dargestellt. In dieser Tabelle zeigt ein „+" das Wachstum der Transformante an, „±" zeigt ein geringes Wachstum an und „–^" zeigt fehlendes Wachstum an.
Tabelle 2 Wachstum und Konzentration an L-Lysin (in mM)
Wachstum und Konzentration an AEC (in mM)
Die Transkriptionsrichtung des lysC-Gens auf pLYSC2 stimmt mit der Transkriptionsrichtung durch den lacZ-Promotor überein (4). Es wurde folglich herausgefunden, dass das lysC-Gen auf pLYSC2 eine Resistenz gegen L-Lysin und AEC bei recht hohen Konzentrationen verlieh, selbst wenn das lysC in einer wildtypischen Form verbleibt, da seine Expressionsrate durch den lacZ-Promotor amplifiziert wird. Demgegenüber hatte das lysC-Gen auf pLYSC1 eine kleinere Expressionsrate und hatte bereits bei niedrigeren Konzentrationen eine Wachstumsinhibition durch L-Lysin und AEC zur Folge, da die Transkriptionsrichtung im Hinblick auf den lacZ-Promotor in umgekehrter Orientierung vorlag und ein eigener funktioneller Promotor ebenfalls fehlte (im Fall des Stammes GT3/pLYSC2 wurde das Wachstum bis zu einem zugegebenen Anteil von 100 mM für L-Lysin und einem zugegebenen Anteil von 3 mM für AEC nicht supprimiert; dagegen wurde das Wachstum im Fall des Stammes GT3/pLYSC1 bei einem zugegebenen Anteil von 0,2 mM sowohl durch L-Lysin als auch durch AEC vollständig supprimiert). Es wurde bestätigt, dass die Wachstumsinhibition durch gleichzeitige Zugabe von Homoserin und Diaminopimelinsäure eliminiert wurde.
Daher wurde pLYSC1 für Experimente zur Einführung von Mutationen) verwendet. Zur Selektion eines Stammes, der ein Plasmid mit lysC* enthält, wurde ein Medium verwendet, das durch Zugabe von 10 mM an L-Lysin oder 0,2 mM an AEC zu dem Minimalmedium M9 hergestellt wurde. Dieses Medium wird in Beispiel 2 unten als „Selektionsmedium" bezeichnet.
(2-2-2) In vitro-Mutagenesebehandlung von pLYSC1 mit Hydroxylamin
Es wurden zwei Arten von Verfahren verwendet, um Mutationen) in das pLYSC1-Plasmid einzuführen. Dies waren eine in vitro-Mutagenesebehandlung, bei der Plasmide direkt mit Hydroxylamin behandelt werden, und eine zusätzliche in vivo-Mutagenesebehandlung, bei der eine, ein Plasmid enthaltende Zelle mit Nitrosoguanidin (NTG) behandelt wird, gefolgt von der Extraktion des Plasmids zur Bereitstellung einer Vielzahl von Mutationen. Dabei werden Mutationen erwartet, die sich von dem Wechsel von Cytosin nach Thymin bei Hydroxylamin unterscheiden.
In vitro-Mutagenesebehandlung mit Hydroxylamin:
2 μg DNA wurden bei 75°C für 1 bis 4 Stunden in 0,4 M Hydroxylamin (0,1 M KH₂PO₄-1 mM EDTA (pH 6,0): 100 μl, 1 M Hydroxylamin-1 mM EDTA (pH 6,0): 80 μl, DNA: 2 μg, Gesamtvolumen: 200 μl durch Auffüllen mit Wasser) behandelt. Die DNA wurde nach der Behandlung mit Glaspulver gereinigt, in einen für AK vollständig defizienten Stamm, einen E. coli GT3 Stamm eingeführt, und dieser dann auf einem Vollmedium (L-broth: 1% Bacto Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 1,5% Agar) verteilt, um Kolonien zu bilden. Diese wurden durch Replika-Plattierung auf das in (2-2-1) beschriebene Selektionsmedium übertragen (repliziert) und zum Wachstum auf dem Selektionsmedium befähigte Stämme als Kandidatenstämme selektiert. Die Rate des Erscheinens von Transformanten und die Mutationsrate wurden, wie in 5 gezeigt, als veränderlich ermittelt. Mutante Stämme wurden bei 4-stündiger Behandlung in einer relativ hohen Rate von 0,5 bis 0,8 % erhalten.
In vivo-Mutagenesebehandlung mit NTG:
PLYSC1 wurde in E. coli MC1061 eingeführt und die unversehrten Zellen einer Behandlung mit NTG unterzogen. Nach der Behandlung wurden die Zellen über Nacht kultiviert, um die Mutationen zu stabilisieren, dann wurde ein Plasmid extrahiert und in E. coli GT3 eingeführt. Genauer gesagt, wurde der transformierte Stamm in einem 2 × TY-Medium (1,6% Bacto Trypton, 1% Hefeextrakt, 0,5% NaCl) kultiviert, bei einer OD₆₆₀ von etwa 0,3 gesammelt, mit einem unten beschriebenen TM-Puffer gewaschen, dann in einer NTG-Lösung (hergestellt durch Auflösen von NTG in einer Konzentration von 0,2 mg/ml in TM-Puffer) suspendiert und bei 37°C für 0 bis 90 Minuten behandelt. Die Zellen wurden mit TM-Puffer und 2 × TY-Medium gewaschen und die Mutationen durch Übernachtkultur in 2 × TY-Medium fixiert. Danach wurde Plasmid-DNA aus den Zellen extrahiert und in einen E. coli GT3 Stamm eingeführt. Das Screenen der Kandidatenstämme wurde in der selben Weise wie bei der in vitro-Mutagenese durchgeführt und Mutanten mit Lysinresistenz (Lys^®) und AEC-Resistenz (AEC^®) wurden gewonnen.
TM-Puffer:

Tris 50 mM

Maleinsäure 50 mM

(NH₄)₂SO₄ 1 g/l

MgSO₄ × 7H₂O 0,1 g/l

Ca(NO₃)₂ 5 mg/l

FeSO₄ × 7H₂O 0,25 mg/l
Der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt.
Es wurden ins gesamt 180 Stämme der wie oben beschrieben erhaltenen Kandidatenstämme (Hydroxylaminbehandlung: 48 Stämme, NTG-Behandlung: 132 Stämme) wiederum auf das Selektionsmedium getupft. Dabei wurde bestätigt, dass die AEC- und L-Lysin-Resistenzen 153 Stämme umfassten. Unter Betrachtung der Unterschiede in den Mustern der Akkumulation von Aminosäuren im Medium wurden diese 153 Stämme in 14 Gruppen aufgeteilt und die AK-Aktivität wurde gemessen, nachdem repräsentative Stämme aus jeder dieser Gruppen ausgewählt worden waren. Zwischen den mutanten Stämmen, die durch die Hydroxylamin-Behandlung erhalten wurden, und den mutanten Stämmen, die durch die NTG-Behandlung erhalten wurden, bestanden keine großen Unterschiede hinsichtlich der AK-Aktivität.
Daher wurden die folgenden Experimente durchgeführt, ohne diese Gruppen zu unterscheiden.
(2-2-3) Isolation des lysC*-Gens und Untersuchung des lysC*-Genprodukts
Nr. 24, Nr. 43, Nr. 48, Nr. 60, Nr. 80, Nr. 117, Nr. 126, Nr. 149, Nr. 150, Nr. 156, Nr. 158, Nr. 167, Nr. 169 und Nr. 172 wurden als repräsentative Stämme der zuvor genannten 14 Gruppen ausgewählt. Mutante, von pLYSC1 abgeleitete Plasmide, wurden von jedem dieser Stämme gewonnen und als pLYSC1*24, pLYSC1*43, pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*80, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169, bzw. pLYSC1*172, bezeichnet. Ein vollständig für AK defizienter Stamm GT3 wurde mit diesen Plasmiden und dem Wildtyp pLYSC1 transformiert. Es wurde von jedem dieser transformierten Stämme ein zellfreier Extrakt hergestellt, und die Enzymaktivität von AKIII wurde gemessen.
Der zellfreie Extrakt (Rohenzym-Lösung) wurde wie folgt hergestellt. Ein transformierter Stamm wurde in einem 2 × TY-Medium kultiviert und bei einer OD₆₆₀ von etwa 0,8 gesammelt. Die Zellen wurden mit 0,02 M KH₂PO₄ (pH 6,75)-0,03 M β-Mercaptoethanol bei 0°C gewaschen und die Zellen dann durch Ultraschall aufgebrochen (0°C, 100 W, 30 Minuten × 4). Eine aufgebrochene Zelllösung wurde bei 33 krpm für 1 Stunde bei 0°C zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, zu dem Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 80% zugegeben wurde. Nach Zentrifugation wurde das Pellet in 0,02 M KH₂PO₄ (pH 6,75)-0,03 M β-Mercaptoethanol gelöst und bei 0°C über Nacht gelagert.
Die Enzymaktivität von AKIII wurde gemäß eines Verfahrens von Stadtman et al. (Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G. und Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033 (1961)) gemessen. Genauer gesagt, wurde eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung für 45 Minuten bei 27°C inkubiert und eine FeCl₃-Lösung (2,8 N HCl 0,4 ml + 12% TCA 0,4 ml + 5% FeCl₃ × 6 H₂O/0,1 N HCl 0,7 ml) wurde dieser hinzu gegeben, um eine Farbe zu entwickeln, wobei der Ansatz zentrifugiert und im folgenden die Absorption des Überstandes bei 540 nm gemessen wurde. Die Aktivität wurde durch die Menge der pro Minute gebildeten Hydroxamsäure angezeigt (1 U = 1 μmol/min). Der molare Absorptionskoeffizient betrug 600. Aus der Reaktionslösung wurde Kaliumaspartat zur Messung des Nullwertes herangezogen.
Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Reaktions-Mischung 0,3 ml

Hydroxylamin-Lösung 0,2 ml

0,1 M Kaliumaspartat (pH 7,0) 0,1 ml

Enzymlösung

Wasser (zum Auffüllen)

Gesamt: 1,0 ml
Bei der Messung der Enzymaktivität von AK wurden der Enzymreaktionslösung unterschiedliche Konzentrationen an L-Lysin zugesetzt und das Ausmaß der Inhibition durch L-Lysin untersucht. Die Ergebnisse sind in 6 und Tabelle 3 dargestellt. Der Wildtyp und die Nummern 24, 43, 48, 60, 80, 117 und 126 sind in 6A dargestellt. Die Nummern 149, 150, 156, 158, 167, 169 und 172 sind in 6B dargestellt.
Wie in diesen Ergebnissen gezeigt, unterliegt die wildtypische AKIII einer starken Inhibition durch L-Lysin, wobei sie bei etwa 0,45 mM an L-Lysin um 50%, und bei 5 mM um etwa 100% inhibiert wurde. Dagegen war die Inhibition durch L-Lysin in allen 14 Arten von Mutanten desensibilisiert, jedoch wiesen die bei diesem Mal erhaltenen mutanten AKIII's unterschiedliche Grade der Desensibilisierung auf. Insbesondere im Fall der Nummern 24, 80, 117, 169 und 172 war eine Inhibition selbst bei 100 mM an L-Lysin kaum zu beobachten, und sie wiesen eine Konzentration der 50%igen Inhibition auf, die nicht weniger als das 200fache des Wildtyps betrug. Die auf dem Gesamtprotein basierende spezifische Aktivität, die durch Wachstumsbedingungen der Zellen und die Präparation der Proben beeinflusst werden kann, war in fast allen Fällen derjenigen des Wildtyps gleichwertig oder höher als diese, und es gab kaum Probleme einer Aktivitätsabnahme aufgrund der Einführung der Mutationen) (Tabelle 3). Im Hinblick auf diese Tatsache wurde erwartet, dass ein aktives Zentrum von AKIII und eine regulatorische Stelle für L-Lysin jeweils unabhängig voneinander sind. In Tabelle 3 bezieht sich der Grad der Desensibilisierung der Inhibition (%) auf eine AK-Aktivität in Gegenwart von 100 mM an L-Lysin im Vergleich zu einer AK-Aktivität in der Abwesenheit von L-Lysin in der Reaktionslösung. Die Hitzestabilität (%) bezieht sich auf die Rate der verbleibenden Aktivität nach einer Behandlung bei 55°C für 1,5 Stunden.
Tabelle 3
Im folgenden wurde die Hitzestabilität der mutanten Enzyme überprüft. Wenn es beabsichtigt ist, ein Enzym zu verbessern, um die Aktivität zu steigern, ist es wichtig, dass ein derart geschaffenes Enzym stabil in den Zellen aufrecht erhalten wird. Eine in vitro-Messung ist aufgrund des Unterschieds zwischen intrazellulärer und extrazellulärer Proteaseaktivitäten und des Einflusses von Puffern bei der in vitro-Lagerung von Enzymen mit einigen Problemen verbunden. Jedoch wurde der Praktikabilität halber die Hitzestabilität der mutanten AKIII's in vitro als ein Parameter untersucht.
Ausgehend von Ergebnissen der Untersuchung der Inaktivierungstemperatur von AKIII unter verschiedenen Bedingungen wurde die Rate der verbleibenden Aktivität nach einer 90-minütigen Behandlung bei 55°C gemessen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, war die Hälfte der Enzyme dem Wildtyp recht deutlich überlegen. Im allgemeinen ist ein mutantes Enzym oft instabiler als ein wildtypisches Enzym. Jedoch waren einige der bei diesem Ansatz gewonnenen mutanten AKIII's dem Wildtyp hinsichtlich der Stabilität überlegen, und einige von ihnen erscheinen als recht zweckdienlich in der praktischen Anwendung zur Herstellung von L-Lysin.
(2-2-4) Bestimmung der Basensequenz von wildtypischem lysC und mutantem lysC
Eine bei dieser Gelegenheit erhaltene Basensequenz des wildtypischen lysC-Gens wurde gemäß eines gewöhnlichen Verfahrens unter Verwendung eines DNA-Sequenziergerätes (DNA sequencer ABI Model 373A, hergestellt von der Applied Biosystem Inc.) bestimmt (siehe SEQ ID NO: 7). Im Ergebnis wurden im Vergleich zu einer bereits veröffentlichten Sequenz des lysC eines E. coli K-12 JC411 Stammes (Cassan, M., Rarsot, C., Cohen, G. N. und Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)) Unterschiede an sechs Positionen ermittelt, davon zwei auf dem Aminosäure-Niveau. Es wird spekuliert, dass der Unterschied an diesen sechs Positionen auf die unterschiedlichen verwendeten Bakterienstämme zurückgeht.
In der selben Weise wurden die Basensequenzen für sämtliche lysC*'s, die in den 14 Arten mutanter pLYSC1-Formen vorliegen, bestimmt, und die Punktmutationen ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Bei dieser Tabelle zeigen die Angaben in Klammern Mutationen von Aminosäureresten in Folge von Mutationen der Nukleotide. Die Mutationstypen entsprachen 12 Arten, da zwei Gruppen unter den 14 Arten (Nr. 48 und Nr. 167, Nr. 24 und Nr. 80) exakt die gleichen Mutationstypen aufwiesen. Im Hinblick auf die Mutationstypen wurden die Nummern 149, 150, 156, 158, 167, 169 und 172 durch die Behandlung mit Hydroxylamin gewonnen, die Nummern 24, 43, 48, 60, 80, 117 und 126 dagegen durch die Behandlung mit NTG. Hinsichtlich der Charakteristik der Mutationen ist jedoch zu sagen, dass sämtliche von ihnen aus Mutationen von Cytosin zu Thymin oder – als Ergebnis der Mutation von. Cytosin zu Thymin auf einem nicht-codierenden Strang – aus Mutation von Guanin zu Adenin auf einem codierenden Strang bestanden.
Tabelle 4: Bestimmung der Mutationspunkte von lysC*
Beispiel 3: Produktion von L-Lysin durch Fermentation mittels eines Stammes, in den dapA* eingeführt wurde
Um L-Lysin unter Verwendung eines Bakteriums der Gattung Escherichia herzustellen, wie dies in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 56-18596, dem US-Patent Nr. 4,346,170 und in Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227–231 (1982) beschrieben ist, wird es als essentiell eingeschätzt, dass ein in der DDPS zu verstärkender Wirt eine Aspartokinase aufweist, die derart verändert ist, dass sie keiner Inhibition durch L-Lysin unterliegt. Ein Bakterium der Gattung Serratia wird als ähnlich zu dem Bakterium der Gattung Escherichia vorausgesagt. L-Threonin-produzierende Bakterien können beispielhaft als ein derartiger Stamm benannt werden. Im Hinblick auf L-Threonin-produzierende S. marcescens ist ein gegenüber AHV (α-Amino-β-hydroxy-valeriansäure) als einem Threonin-Analogon resistenter Stamm bekannt (S. Komatsubara, M. Kisumi und I. Chiba, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834 (1978)). Konkret ist Serratia marcescens AJ13125 als ein derartiger Stamm genannt. Dieser Stamm wurde im National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) unter der Zugangsnummer FERM P-14983 am 12. Juni 1995 hinterlegt und entsprechend dem Budapester Abkommen am 4. März 1996 in eine internationale Hinterlegung übertragen, wobei die Zugangsnummer FERM BP-5441 vergeben wurde.
Auf der anderen Seite wurde das in pdapAS24 enthaltene dapA* (in dem der Histidinrest in Position 118 durch einen Tyrosinrest ersetzt wurde) als das in S. marcesecens einzuführende dapA* ausgewählt, wobei nach dem Ausmaß der Desensibilisierung der Inhibition und der spezifischen Aktivität des Enzyms geurteilt wurde. Um die Expressionsrate von dapA* zu steigern und die Stabilität des Plasmids zu erhöhen, wurde zunächst das bislang auf pdapAS24 liegende mutante dapA* (hier im folgenden als „dapA*24" bezeichnet) stromabwärts eines Promotors eines Tetracyclin-Resistenzgens von pVIC40 ligiert und RSF24P wurde erhalten, wie in 7 gezeigt.
Ein Stamm, der dadurch erhalten wurde, dass das Plasmid RSF24P in einen E. coli-Stamm JM109 eingeführt wurde, wurde als AJ12395 bezeichnet, welcher am 28. Oktober 1993 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer FERM P-13935 hinterlegt wurde, wobei diese ursprüngliche Hinterlegung am 1. November 1994 gemäß des Budapester Abkommens in eine internationale Hinterlegung überführt und mit der Zugangsnummer FERM BP-4858 belegt wurde. Stämme, die pdapAS8 und pdapAS9 enthalten, wurden nicht hinterlegt. Jedoch wurden alle Mutationspunkte von dapA* bei jedem der Plasmide wie oben beschrieben bestimmt. Es ist daher für Fachleute einfach, das Plasmid aus dem vorgenannten hinterlegten Bakterium unter Verwendung eines Verfahrens von Maniatis et al. (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)) zu isolieren und ein Zielgen durch Anwendung eines Verfahrens der positionsspezifischen Mutagenese (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63 (1989)) zu gewinnen.
Das Plasmid RSF24P wurde gemäß eines gewöhnlichen Verfahrens in den AJ13125-Stamm eingeführt, wobei AJ13125/RSF24P erhalten wurde. Die Produktivität von AJ13125/RSF24P für L-Lysin wurde beurteilt.
Auf der anderen Seite wurde RSFP als ein Kontrollplasmid konstruiert. Genauer gesagt, wurde ein großes Fragment aus dem Doppelverdau von pVIC40 mit BamHI und DraI, wie in 7 gezeigt, ausgewählt, und dieses mittels DNA-Polymerase Klenow-Fragment in eine stumpfendige Form überführt. Das große Fragment mit stumpfen Enden wurde mit sich selbst ligiert, um das Plasmid RSFP zu erhalten. RSFP wurde mittels eines gängigen Verfahrens in den AJ13125-Stamm eingeführt und AJ13125/RSFP gewonnen. Die L-Lysin-Produktivität wurde auch für AJ13125/RSFP evaluiert.
Die Kultur wurde bei einem Schütteln von 114 bis 116 rpm bei Bedingungen einer Kulturphase von 72 Stunden und einer Temperatur von 30°C unter Verwendung des folgenden Mediums durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Medium zur L-Lysin-Produktion:
Der pH wird mit KOH auf 7,0 eingestellt; es wird für 10 Minuten bei 115°C autoklaviert.
A und B werden in einem Verhältnis von A : B = 4 : 1 gemischt, danach wird C in einer Menge von 30 g pro Liter der Mischung zugegeben und aufgelöst. Des weiteren wird ein Antibiotikum (Streptomycin: 200 μg/ml) zugegeben.
Tabelle 5

Bakterienstamm Produzierte Menge an L-Lysin-Hydrochlorid

AJ13125/RSF24P 3,5 g/l

AJ13125/RSFP 0 g/l
Beispiel 4: Produktion von L-Lysin durch Fermentation mittels eines Stammes, in den dapA* und lysC* eingeführt wurden
Die Auswirkung des mutanten DDPS auf die L-Lysin-Produktion ist in Beispiel 3 gezeigt worden. Um eine weitere Verbesserung zu erreichen, wurde das in Beispiel 2 gewonnene mutante AKIII-Gen in Co-Existenz mit dem mutanten DDPS-Gen gebracht. Unter Berücksichtigung von Enzymaktivität, Hitzestabilität und dergleichen wurde ein aus dem Stamm Nr. 80 stammendes Gen (lysC*80) als das für die Co-Existenz mit dem mutanten DDPS-Gen vorgesehene mutante AKIII-Gen ausgewählt.
lysC*80 wurde verwendet, nachdem es aus einem pLLC*80-Plasmid (8) herausgeschnitten worden war, das präpariert worden war, indem das vormals in pLYSC1*80 vorliegende lysC* (hier im folgenden als „lysC*80" bezeichnet) stromabwärts eines lacZ-Promotors des Vektors pHSG399 (hergestellt durch die Takara Shuzo Co., Ltd) ligiert wurde. Der Vektor pHSG399 hat eine im Bezug zu pUC18 umgekehrt ausgerichtete Insertionsstelle, um die exprimierte Menge von lysC* zu steigern. pLLC*80 ist ein Plasmid, das hergestellt wurde, um lysC*80 derart zu arrangieren, dass die Transkriptionsrichtung im Hinblick auf den lacZ-Promotor eine positive Orientierung erhält, um die Produktivität von L-Lysin zu verbessern, da das auf pLYSC1*80 liegende lysC*80 eine Transkriptionsrichtung aufwies, die gegenüber dem lacZ-Promotor umgekehrt orientiert angeordnet war.
Ein Plasmid, RSFD80, das dapA* und lysC* beinhaltet, wurde aus pLLC*80 und RSF24P, das in Beispiel 3 gewonnen wurde, hergestellt (siehe 9). RSFD80 enthält dapA*24 und lysC*80, welche in einer derartigen Positionierung angeordnet sind, dass sie im Hinblick auf einen Promotor eines Tetracyclin-Resistenzgens (tetP) stromabwärts von tetP in positiv orientierter Transkriptionsrichtung vorliegen.
Das RSFD80-Plasmid wurde in einen E. coli JM109 Stamm eingeführt, der danach als AJ12396 bezeichnet wurde. AJ12396 ist am 28. Oktober 1993 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Zugangsnummer FERM P-13936 hinterlegt worden und wurde dann, am 1. November 1994, gemäß des Budapester Abkommens aus der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung überführt und mit der Zugangsnummer FERM BP-4859 belegt. Stämme, die pLYSC1*24, pLYSC1*43, pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169 und pLYSC1*172 enthalten, wurden nicht hinterlegt. Jedoch wurden alle Mutationspunkte von lysC* auf jedem dieser Plasmide wie oben beschrieben bestimmt. Es ist somit für Fachleute einfach, das Plasmid aus dem vorgenannten hinterlegten Bakterium unter Verwendung eines Verfahrens von Maniatis et al. (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)) zu isolieren und ein Zielgen durch Anwendung eines Verfahrens der positionsspezifischen Mutagenese (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63 (1989)) zu gewinnen.
RSFD80 wurde gemäß eines gewöhnlichen Verfahrens in den AJ13125-Stamm eingeführt, wobei AJ13125/RSFD80 erhalten wurde. Die Produktivität von AJ13125/RSFD80 für L-Lysin wurde beurteilt. Als Kontrolle wurde die L-Lysin-Produktivität auch für AJ13125/RSFP evaluiert.
Die Kultivierung erfolgte unter Schütteln bei 114 bis 116 rpm über eine Zeitspanne von 72 Stunden und unter Temperaturbedingungen von 30°C unter Verwendung des gleichen Mediums zur L-Lysin-Produktion wie in Beispiel 3. Die Resultate sind in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6

Bakterienstamm Produzierte Menge an L-Lysin-Hydrochlorid

AJ13125/RSFD80 9,2 g/l

AJ13125/RSFP 0 g/l
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein mutantes DDPS-Gen aus einem Bakterium der Gattung Escherichia erhalten worden, bei dem die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausreichend unempfindlich gemacht ist. Ein dieses Gen enthaltendes Bakterium der Gattung Serratia produziert L-Lysin in einer erheblichen Menge. Die Produktion von L-Lysin kann gesteigert werden, indem das mutante DDPS-Gen in ein Bakterium der Gattung Serratia eingeführt wird, das eine Aspartokinase enthält, bei der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Bakterium der Gattung Serratia, das durch Einbringen einer DNA in Zellen des Bakteriums transformiert ist, die für eine Dihydrodipicolinatsynthase kodiert, welche eine Mutation aufweist, um das Enzym gegenüber Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich zu machen, worin die Dihydrodipicolinatsynthase aus einem Bakterium der Gattung Escherichia stammt.
Bakterium der Gattung Serratia nach Anspruch 1, worin die Mutation, durch die das Enzym gegenüber Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht wird, aus der Gruppe ausgewählt ist, die, ausgehend vom N-terminalen Ende der in SEQ ID NO: 4 der Sequenzliste definierten Aminosäuresequenz der Dihydrodipicolinatsynthase, aus einem Austausch des Alaninrests in Position 81 durch einen Valinrest, einem Austausch des Histidinrests in Position 118 durch einen Tyrosinrest und einem Austausch des Alaninrests in Position 81 durch einen Valinrest und des Histidinrests in Position 118 durch einen Tyrosinrest besteht.
Bakterium der Gattung Serratia nach Anspruch 1, das weiterhin eine Aspartokinase enthält, die gegenüber der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist.
Bakterium der Gattung Serratia nach Anspruch 3, das die Aspartokinase enthält, die gegenüber der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich gemacht ist, erhalten durch Einbringen einer DNA in Zellen des Bakteriums, die für eine Aspartokinase kodiert, die eine Mutation aufweist, um das Enzym gegenüber der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich zu machen.
Bakterium der Gattung Serratia nach Anspruch 4, worin die Aspartokinase eine Aspartokinase III ist, die aus einem natürlichen Bakterium der Gattung Escherichia stammt.
Bakterium der Gattung Serratia nach Anspruch 5, worin die Mutation, die die Aspartokinase III gegenüber der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unempfindlich macht, aus der Gruppe ausgewählt ist, die, ausgehend vom N-terminalen Ende der in der Sequenz ID NO: 8 der Sequenzliste definierten Aminosäuresequenz der Aspartokinase III, aus einem Austausch des Glycinrests in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest, einem Austausch des Glycinrests in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest und des Glycinrests in Position 408 durch einen Asparaginsäurerest, einem Austausch des Argininrests in Position 34 durch einen Cysteinrest und des Glycinrests in Position 323 durch einen Asparaginsäurerest, einem Austausch des Leucinrests in Position 325 durch einen Phenylalaninrest, einem Austausch des Methioninrests in Position 318 durch einen Isoleucinrest, einem Austausch des Methioninrests in Position 318 durch einen Isoleucinrest und des Valinrests in Position 347 durch einen Methioninrest, einem Austausch des Serinrests in Position 345 durch einen Leucinrest, einem Austausch des Valinrests in Position 347 durch einen Methioninrest, einem Austausch des Threoninrests in Position 352 durch eine Isoleucinrest, einem Austausch des Threoninrests in Position 352 durch einen Isoleucinrest und des Serinrests in Position 369 durch einen Phenylalaninrest, einem Austausch des Glutaminsäurerests in Position 164 durch einen Lysinrest und einem Austausch des Methioninrests in Position 417 durch einen Isoleucinrest und des Cysteinrests in Position 419 durch einen Tyrosinrest besteht.
Bakterium der Gattung Serratia nach Anspruch 1, dem die Lysindecarboxylase fehlt.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, welches folgende Stufen umfasst: Kultivieren des Bakteriums der Gattung Serratia nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem geeigneten Medium, Produzieren und Anhäufen von L-Lysin in der Kultur und Gewinnen von L-Lysin aus der Kultur.