DE69727260T3 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Produzieren von L-Lysin durch das Kultivieren eines Mikroorganismus, der durch das Modifizieren eines coryneformen Bakteriums erhalten wurde, das für die fermentative Produktion von Aminosäuren oder ähnlichem verwendet wird, mit Hilfe einer Technik, die auf der Gentechnik beruht.
  • L-Lysin, welches als Futtermittel-Zusatzstoff verwendet wird, wird für gewöhnlich mit einem fermentativen Verfahren hergestellt, bei dem ein L-Lysin produzierender Mutantenstamm verwendet wird, der zu den coryneformen Bakterien gehört. Zahlreiche L-Lysin produzierende Bakterien, die gegenwärtig bekannt sind, sind solche, die durch künstliche Mutationen, ausgehend von Wildtypstämmen, die zu den coryneformen Bakterien gehören, erzeugt wurden.
  • Für coryneforme Bakterien sind ein Vektorplasmid, das autonom in bakteriellen Zellen replizierbar ist, und ein Medikamenten-Resistenz-Markergen hat, offenbart (siehe US-Patent Nr. 4,514,502 ), und ein Verfahren zum Einschleusen eines Gens in bakterielle Zellen (z. B. japanische Patentanmeldungs-Offenlegung Nr. 2-207791 ). Ebenfalls offenbart ist eine Möglichkeit zum Züchten eines L-Threonin oder L-Isoleucin produzierenden Bakteriums unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken (siehe US-Patent Nrn. 4,452,890 und 4,442,208 ). Für das Züchten von einem L-Lysin produzierenden Bakterium ist eine Technik bekannt, bei der ein Gen, das an der L-Lysin-Biosynthese teilnimmt, in ein Vektorplasmid eingeschleust ist, um das Gen in bakteriellen Zellen zu amplifizieren (z. B. japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 56-160997 ).
  • Bereits bekannte Gene für die L-Lysin-Biosynthese schließen z. B. ein Dihydrodipicolinat-Reduktasegen ( japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 7-75578 ) und ein Diaminopimelatdehydrogenasegen (S. Ishino et al., Nucleic Acids. Res., 15, 3917 (1987)) ein, welche klonierte Gene sind, die an der L-Lysin-Biosynthese teilhaben, sowie ein Phosphoenolpyruvatcarboxylasegen ( japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 60-87788 ), ein Dihydrodipicolinatsynthasegen ( japanische Patentanmeldung Nr. 6-55149 ) und ein Diaminopimelatdecarboxylasegen ( japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 60-62994 ), deren Amplifizierung die L-Lysin-Produktionsfähigkeit beeinflusst.
  • Wie oben beschrieben wurde, sind einige erfolgreiche Ergebnisse, um die L-Lysin-Produktivität zu verbessern, mit Hilfe der Amplifizierung von Genen der L-Lysin-Biosynthese erhalten worden. Die Amplifizierung einiger Gene senkt jedoch die Wachstumsgeschwindigkeit der Bakterien, obwohl die Amplifizierung die L-Lysin-Produktivität verbessert, was zu einer Senkung der L-Lysin-Produktionsrate führt.
  • Es ist von keinem Fall berichtet worden, bei dem beabsichtigt wurde, das Wachstum durch das gleichzeitige Verstärken eines Gens für die L-Lysin-Biosynthese zu verbessern. Unter den gegenwärtigen Umständen ist für die coryneformen Bakterien kein Fall bekannt, bei dem es irgendjemandem gelungen ist, die L-Lysin-Ausbeute, ohne das Wachstum zu begrenzen, durch das Kombinieren einer Vielzahl an Genen für die L-Lysin-Biosynthese bemerkenswert zu verbessern.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Verbessern der L-Lysin-Produktionsfähigkeit, ohne die Wachstumsgeschwindigkeit eines coryneformen Bakteriums zu senken, indem eine Vielzahl an Genen die für L-Lysin-Biosynthese in Kombination in den coryneformen Bakterien verstärkt wird.
  • Wenn eine Zielsubstanz fermentativ unter Verwendung eines Mikroorganismus produziert wird, sind die Produktionsgeschwindigkeit wie auch die Ausbeute der Zielsubstanz, bezogen auf ein hinzugefügtes Material, extrem wichtige Faktoren. Eine Zielsubstanz kann beträchtlich günstiger durch das Verstärken der Produktionsgeschwindigkeit pro Unit der Fermentierausrüstung hergestellt werden. Demgemäß ist es industriell extrem wichtig, dass die fermentative Ausbeute und die Produktionsgeschwindigkeit miteinander kompatibel sind. Die vorliegende Erfindung schlägt eine Lösung für das Problem vor, das oben beschrieben wurde, um fermentativ L-Lysin unter Verwendung eines coryneformen Bakteriums herzustellen.
  • Das Prinzip der vorliegenden Erfindung berücksichtigt die Tatsache, dass das Wachstum eines coryneformen Bakteriums verbessert werden kann, und dass dessen L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit durch das Verstärken sowohl einer DNA-Sequenz, die für eine Diaminopimelatdecarboxylase (die Diaminopimelatdecarboxylase wird nachfolgend als ”DDC” bezeichnet, und das Gen, das für das DDC-Protein kodiert, wird nachfolgend als ”lysA”, falls notwendig, bezeichnet) und eine DNA-Sequenz, die für eine Diaminopimelatdehydrogenasegen (die Diaminopimelatdehydrogenasege wird nachfolgend als ”DDH”, und das Gen, das für ein DDH-Protein kodiert, nachfolgend als ”ddh”, falls notwendig, bezeichnet), verglichen mit einem Fall, bei dem diese DNA-Sequenzen jeweils einzeln verstärkt sind, zu verbessern.
  • Das bedeutet, dass die vorliegende Erfindung in einem coryneformen Bakterium liegt, das eine DNA-Sequenz hat, die für eine Aspartokinase kodiert, die hinsichtlich einer Rückkopplungshemmung durch L-Lysin und L-Threonin desensibilisiert ist, und worin die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten von Dihydrodipicolinatreduktase, Dihydrodipicolinatsynthase, Diaminopimelatdecarboxylase und Diaminopimelatdehydrogenase erhöht werden durch Steigern einer Kopienzahl der DNA-Sequenzen, die für diese Enzyme kodieren.
  • In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von L-Lysin zur Verfügung, das die Schritte des Kultivierens des coryneformen Bakteriums umfasst, das oben beschrieben wurde, in einem Medium, um zu ermöglichen, dass L-Lysin produziert wird, und in der Kultur akkumuliert, und das Einsammeln des L-Lysins aus der Kultur.
  • Die in der vorliegenden Erfindung betroffenen coryneformen Bakterien sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, B. Ausgabe, Seite 599 (1974) definiert sind, welche aerobe Gram-positive non-acid-fast-Stäbchen sind, die keine Sporenbildungsfähigkeit besitzen. Die coryneformen Bakterien schließen Bakterien ein, die zum Genus Corynebacterum gehören, Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören, die bis dato in den Genus Brevibacterium klassifiziert worden sind, aber als Bakterien, die zum Genus Corynebacterum gegenwärtig gehören, zusammengefasst sind, und Bakterien, die zum Genus Brevibacterum gehören, die den Bakterien, die zum Genus Corynebacterum gehören, nahe verwandt sind.
  • Erfindungsgemäß kann die L-Lysin-Produktionsfähigkeit der coryneformen Bakterien verbessert werden, und die Wachstumsgeschwindigkeit kann ebenfalls verbessert werden. Die vorliegende Erfindung kann auf gewöhnliche L-Lysin-produzierende Bakterien wie auch auf Stämme mit hoher L-Lysin-Produktionsfähigkeit angewendet werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids p299LYSA dar, welches lysA trägt.
  • 2 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pLYSAB dar, das lysA und Brevi.-ori trägt.
  • 3 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pPK4D dar, das ddh und Brevi.-ori trägt.
  • 4 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids p399DL dar, das ddh und lysA trägt.
  • 5 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pDL dar, das ddh, lysA und Brevi.-ori trägt.
  • 6 stellt ein Verfahren zur Herstellung der Plasmide p399AKYB und p399AK9B dar, die jeweils mutiertes lysC tragen.
  • 7 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pDPRB dar, das dapB und Brevi.-ori trägt.
  • 8 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pDPSB dar, das dapA und Brevi.-ori trägt.
  • 9 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pCRCAB dar, das lysC, dapB und Brevi.-ori trägt.
  • 10 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pCB dar, das lysC, dapB und Brevi.-ori trägt.
  • 11 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pAB dar, das dapA, dapB und Brevi.-ori trägt.
  • 12 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pCAB dar, das lysC, dapA, dapB und Brevi.-ori trägt.
  • 13 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pCABL dar, das lysC, dapA, dapB, lysA und Brevi.-ori trägt.
  • 14 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pCABDL dar, das lysC, dapA, dapB, ddh, lysA und Brevi.-ori trägt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird im Detail unten beschrieben.
  • <1> Herstellung von Genen für die L-Lysin-Biosynthese, die für die vorliegende Erfindung verwendet wurden
  • Die Gene für die L-Lysin-Biosynthese, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, können jeweils durch das Herstellen chromosomaler DNA eines Bakteriums als DNA-Donor, das Konstruieren einer chromosomalen DNA-Bibliothek unter Verwendung eines Plasmidvektors oder ähnlichem, das Selektionieren eines Stammes, der ein gewünschtes Gen beinhaltet, aus der Bibliothek, und das Gewinnen der rekombinanten DNA, in die das Gen insertiert wurde aus dem ausgewählten Stamm. Der DNA-Donor für das Gen der L-Lysin-Biosynthese, das erfindungsgemäß verwendet wird, ist nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, dass das gewünschte Gen für die Lysin-Biosynthese ein Enzymprotein exprimiert, welches in Zellen der coryneformen Bakterien funktioniert. Der DNA-Donor ist jedoch bevorzugt ein coryneformes Bakterium.
  • Sowohl die Gene für lysA und ddh, die aus coryneformen Bakterien stammen, haben bekannte Sequenzen. Demgemäß können sie durch das Durchführen einer Amplifizierung mit dem Polymerase-Kettenreaktionsverfahren PCR; siehe T. J. White et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) erhalten werden.
  • Jedes der Gene der L-Lysin-Biosynthese, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in Übereinstimmung mit bestimmten Verfahren erhältlich, die unten beispielhaft dargestellt werden.
  • (1) Herstellung der Mutante lysA
  • lysA kann vom Chromosom eines coryneformen Bakteriums durch das Herstellen chromosomaler DNA beispielsweise in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Saito und Miura (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)), und durch das Amplifizieren von lysA in Übereinstimmung mit dem Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR; siehe T. J. White et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) isoliert werden. Der DNA-Donor ist nicht spezifisch begrenzt, er wird jedoch durch Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Stamm beispielhaft dargestellt.
  • In dem coryneformen Bakterium bildet lysA zusammen mit argS (Arginyl-tRNA-Synthasegen) ein Operon, und lysA liegt stromabwärts des argS vor. Die Expression von lysA wird durch einen Promotor reguliert, der stromaufwärts des argS liegt (siehe Journal of Bacteriology, Nov., 7356–7362 (1993)). DNA-Sequenzen dieser Gene sind aus Corynebacterum glutamicum (siehe Molecular Microbiology, 4(11), 1819–1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112–119 (1988)) bekannt, auf deren Grundlage DNA-Primer für eine PCR hergestellt werden können. Solche DNA-Primer werden spezifisch durch 23-mer DNA's dargestellt, mit Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 1 in der Sequenzliste gezeigt sind (entsprechend den Nukleotidnummern 11 bis 33 in der Nukleotidsequenz, die in Molecular Microbiology, 4(11), 1819–1830 (1990)) beschrieben ist, und SEQ ID NO: 2 (entsprechend den Nukleotidnummern 1370 bis 1392 in der Nukleotidsequenz, die in Molecular and General Genetics, 212, 112–119 (1988) beschrieben ist.
  • Im später beschriebenen Beispiel wurde ein DNA-Fragment, das einen Promotor, argS und lysA enthält, verwendet, um lysA zu verbessern. argS ist jedoch nicht essentiell für die vorliegende Erfindung. Es ist auch erlaubt, ein DNA-Fragment zu verwenden, in dem lysA direkt stromabwärts des Promotors ligiert ist.
  • Die Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments, das argS und lysA enthält, und eine Aminosäuresequenz, von der abgeleitet wird, dass sie durch die Nukleotidsequenz kodiert wird, werden beispielhaft in der SEQ ID NO: 3 angegeben. Ein Beispiel der Aminosäuresequenz, die durch argS kodiert wird, ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt, und ein Beispiel einer Aminosäuresequenz, die durch lysA kodiert wird, ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten, die für diese Aminosäuresequenzen kodieren, kann die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Fragmente verwenden, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die im wesentlichen die gleichen sind wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist, das bedeutet, Aminosäuresequenzen mit einer Mutation, die beispielsweise auf einer Substituierung, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren beruht, vorausgesetzt, dass es keinen wesentlichen Einfluß auf die DDC-Aktivität gibt.
  • DNA kann in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren unter Verwendung eines DNA-Synthese-Modells 380B synthetisiert werden, welches von Applied Biosystems hergestellt wird, und unter Verwendung der Phosphoamiditmethode (siehe Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). Eine PCR kann unter Verwendung eines DNA-Thermo-Cycler-Modells PJ2000 durchgeführt werden, welcher von Takara Shuzo hergestellt wird, und durch das Verwenden der Taq-DNA-Polymerase in Übereinstimmung mit einem Verfahren, das durch den Lieferanten angegeben wird.
  • Es wird bevorzugt, dass durch PCR-amplifiziertes lysA mit einer Vektor-DNA ligiert wird, die in Zellen von E. coli und/oder coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, um rekombinante DNA herzustellen, und die rekombinante DNA wird zuvor in E. coli-Zellen eingeschleust. Eine solche Voraussetzung macht die folgenden Arbeitsschritte leicht. Der in E. coli-Zellen autonom replizierbare Vektor ist bevorzugterweise ein Plasmidvektor, welcher bevorzugt autonom replizierbar ist in Zellen des Wirts, einschließlich beispielsweise pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 und RSF1010.
  • Wenn ein DNA-Fragment mit der Fähigkeit, einem Plasmid zu erlauben, in coryneformen Bakterien autonom repliziert zu werden, in diese Vektoren inseriert wird, können sie als sogenannte Shuttle-Vektoren verwendet werden, die autonom sowohl in E. coli und coryneformen Bakterien replizierbar sind.
  • Ein solcher Shuttle-Vektor schließt die folgenden ein. Mikroorganismen, die jeden der Vektoren beinhalten und die Zugangsnummern bei internationalen Hinterlegungsstellen werden in Klammern gezeigt.
    pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532)
    pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136)
    Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)
    pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137)
    Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)
    pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
    pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)
    pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140).
  • Diese Vektoren sind aus den hinterlegten Mikroorganismen wie folgt erhältlich. Zellen, die in einer logarithmischen Wachstumsphase eingesammelt wurden, wurden unter Verwendung von Lysozym und SDS lysiert, gefolgt von der Trennung vom Lysat mit Hilfe einer Zentrifugation bei 30.000 × g, um einen Überstand zu gewinnen. Zu dem Überstand wird Polyethylglycol hinzugegeben, gefolgt von einer Fraktionierung und Reinigung mit Hilfe der Cesiumchlorid-Ethidiumbromid-Äquilibrierungs-Dichtegradienten-Zentrifugierung.
  • E. coli können durch das Einschleusen eines Plasmids in Übereinstimmung mit beispielsweise dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) oder dem Verfahren, bei dem die Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität für DNA zu erhöhen (M. Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) transformiert werden.
  • (2) Herstellung von ddh
  • Ein DNA-Fragment, das ddh enthält, kann von dem Chromosom eines coryneformen Bakteriums mit Hilfe der PCR hergestellt werden. Der DNA-Donor ist nicht spezifisch begrenzt, er wird jedoch durch den Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm beispielhaft dargestellt.
  • Das DDH-Gen ist für Corynebacterium glutamicum (S. Ishino et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) bekannt, und auf dieser Grundlage werden Primer für eine PCR hergestellt. Solche DNA-Primer werden spezifisch durch 20-mer DNA's mit Nukleotidsequenzen beispielhaft dargestellt, die in den SEQ ID Nrn. 6 und 7 in der Sequenzliste gezeigt sind. Die Synthese der DNA, die PCR und die Herstellung eines Plasmids, das das erhaltene ddh trägt, kann auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie das für lysA oben beschriebene.
  • Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das ddh enthält, und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wird, sind in der SEQ ID NO: 8 dargestellt.
  • Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten, die für diese Aminosäuresequenz kodieren, kann die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Fragmente verwenden, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die im wesentlichen die gleichen sind wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt wird, das bedeutet, Aminosäuresequenzen mit einer Mutation, die beispielsweise auf einer Substituierung, Detektion oder Insertion von einer oder mehrerer Aminosäuren beruht, vorausgesetzt, dass sie keinen wesentlichen Einfluß auf die DDH-Aktivität ausübt.
  • <2> Rekombinante DNA und coryneforme Bakterien der vorliegenden Erfindung
  • Das coryneforme Bakterium der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine DNA-Sequenz, die für eine Diaminopimelatdecarboxylase (lysA) und eine DNA-Sequenz, die für eine Diaminopimelatdehydrogenase (ddh) kodiert, welche verstärkt sind.
  • Der Begriff ”eine DNA-Sequenz ist verstärkt” bezeichnet hier die Tatsache, dass die intrazelluläre Aktivität eines Enzyms, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, beispielsweise erhöht wird, indem die Kopienanzahl eines Gens erhöht wird, durch einen starken Promotor oder durch das Kombinieren dieser Mittel.
  • Das coryneforme Bakterium, in das die DNA-Sequenzen, die oben beschrieben wurden, eingeschleust wurden, ist ein L-Lysin-produzierendes coryneformes Bakterium, wobei Beispiele hierfür L-Lysin-produzierende Wildtypstämme und künstliche Mutantenstämme und coryneforme Bakterien einschließen, die hinsichtlich ihrer L-Lysin-Produktionsfähigkeit durch Gentechnik verbessert wurden. Selbst wenn das Bakterium eine niedrige L-Lysin-Produktionsfähigkeit aufweist, kann die L-Lysin-Produktionsfähigkeit durch das Verstärken von lysA und ddh verbessert werden. Wenn das Bakterium eine hohe L-Lysin-Produktionsfähigkeit besitzt, kann die L-Lysin-Produktionseffizienz durch das Verstärken von lysA und ddh noch mehr erhöht werden.
  • (1) L-Lysin-produzierende Stämme, die zu den coryneformen Bakterien gehören
  • Beispiele für das coryneforme Bakterium, das verwendet wird, um lysA und ddh einzuschleusen, schließen beispielsweise die folgenden Lysin-produzierenden Stämme ein:
    Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;
    Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
    Corynebacterium callunae ATCC 15991;
    Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;
    (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;
    (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;
    (Corynebacterium lilium) ATCC 15990;
    (Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
    Corynebacterium melassecola ATCC 17965;
    Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;
    Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;
    Brevibacterium roseum ATCC 13825;
    Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;
    Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
    Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
  • Neben den oben beschriebenen bakteriellen Stämmen sind solche als Wirt verwendbar, in denen lysA und ddh verstärkt wurden, und schließen beispielsweise Mutantenstämme mit L-Lysin-Produktionsfähigkeit ein, die von den zuvor erwähnten Stämmen abstammen. Solche artifiziellen Mutantenstämme schließen die folgenden ein: S-(2-Aminoethyl)-cystein (nachfolgend als ”AEC” abgekürzt), resistente Mutantenstämme ((Brevibacterium lacofermentum AJ11082 (NRRL B-11470); japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 56-1914 , 56-1915 , 57-14157 , 57-14158 , 57-30474 , 58-10075 , 59-4993 , 61-35840 , 62-24074 , 62-36673 , 5-11958 , 7-112437 und 7-112438 ); Mutantenstämme, die eine Aminosäure für ihr Wachstum benötigen, wie beispielsweise L-Homoserin ( japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 48-28078 und 56-6499 ); Mutantenstämme, die eine Resistenz gegenüber AEC aufweisen und Aminosäuren benötigen wie beispielsweise L-Leucin, L-Homoserin, L-Prolin, L-Serin, L-Arginin, L-Alinin, und L-Valin ( US-Patente Nrn. 3,708,395 und 3,825,472 ); L-Lysin-produzierende Mutantenstämme, die eine Resistenz gegenüber DL-α-Amino-ε-caprolactam aufweisen, α-Aminolauryllactam, Aspartatanaloga, Sulfamedikamenten, Chinoid und N-Lauroylleucin; L-Lysin-produzierende Mutantenstämme, die eine Resistenz gegenüber Inhibitoren der Oxyaloacetatdecarbosylase oder Enzymen des Atemsystems aufweisen ( japanische Patentanmeldung-Offenlegungsschriften Nrn. 50-53588 , 50-31093 , 52-102498 , 53-9394 , 53-86089 , 55-9783 , 55-9759 , 56-32995 und 56-39778 und japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 53-43591 und 53-'1833 ); L-Lysin produzierende Mutantenstämme, die Inositol oder Essigsäure benötigen ( japanische Patentanmeldungs-Veröffentlichungen Nrn'. 55-9784 und 56-8692 ); L-Lysin produzierende Mutantenstämme, die eine Empfindlichkeit gegenüber Fluorpyruvatsäure oder einer Temperatur von nicht weniger als 34°C aufweisen ( japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 55-9783 und 53-86090 ); und Produktions-Mutantenstämme, die zum Genus Brevibacterium oder Corynebacterium gehören, welche eine Resistenz gegenüber Ethylenglycol aufweisen und L-Lysin herstellen ( US-Patent NO: 4,411,997 ).
  • (2) L-Lysin-produzierende coryneforme Bakterien mit L-Lysin-Produktionsfähigkeit, welche durch Genrekombination gesteigert ist
  • Die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit kann durch das Verstärken von lysA und ddh weiter verbessert werden, falls das coryneforme Bakterium hinsichtlich der L-Lysin-Produktionsfähigkeit durch Gentechnik gesteigert worden ist, z. B. durch das Einschleusen eines Gens, das für ein Enzym mit einer Mutation kodiert, die eine Desensibilisierung der Feedback-Inhibition wobei der Wildtyp dieses Enzyms einer Feedback-Inhibierung der an der L-Lysin-Biosynthese teilnehmenden Enzyme unterworfen wird, oder durch das Verbessern eines Genes der L-Lysin-Biosynthese, das nicht lysA und ddh ist.
  • Das coryneforme Bakterium, das hinsichtlich der L-Lysin-Produktionsfähigkeit verstärkt wurde, schließt ein coryneformes Bakterium ein, das eine DNA-Sequenz beinhaltet, die für eine Aspartokinase kodiert, welche in ihrer Feedback-Inhibierung durch L-Lysin und L-Threonin desensibilisiert ist (die Aspartokinase wird nachfolgend als ”AK” bezeichnet, eingehen, das für ein AK-Protein kodiert, wird nachfolgend als ”lysC” bezeichnet, und ein Gen, das für ein AK-Protein kodiert, welches in der Feedback-Inhibierung durch L-Lysin und L-Threonin desensibilisiert wird, falls notwendig), und eine verstärkte DNA-Sequenz, die für eine Dihydrodipicolinatreduktase kodiert (die Dihydrodipicolinatreduktase wird nachfolgend als ”DDPR” bezeichnet, und das Gen, das für das DDPR-Protein kodiert, wird, falls notwendig, nachfolgend als ”dapB” bezeichnet), und ein coryneformes Bakterium, das des Weiteren eine verstärkte DNA-Sequenz beherbergt, die für eine Dihydrodipicolinatsynthase kodiert (die Dihydrodipicolinatsynthase wird nachfolgend als ”DDPS” bezeichnet, und das Gen, das für das DDPS-Protein kodiert, wird nachfolgend, falls notwendig, als ”dapA” bezeichnet). Jedes der Gene der L-Lysin-Biosynthese, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist gemäß bestimmten Verfahren, die unten beispielhaft dargestellt werden, erhältlich.
  • (i) Herstellung des mutierten lysC
  • Ein DNA-Fragment, das mutiertes lysC enthält, kann aus einem mutierten Stamm in dem eine synergistische Feedback-Inhibierung der AK-Aktivität durch L-Lysin oder L-Threonin wesentlich desensibilisiert ist, hergestellt werden (internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/25605 ). Ein solcher Mutantenstamm kann. beispielsweise von einer Gruppe an Zellen erhalten werden, die von einem Wildtypstamm des coryneformen Bakteriums stammen, der einer Mutationsbehandlung unterworfen wurde, durch das Anwenden einer gewöhnlichen Mutationsbehandlung wie beispielsweise ultravioletter Bestrahlung und einer Behandlung mit einem Mutationsmittel wie beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Die AK-Aktivität kann durch das Verfahren gemessen werden, das von R. Miyajima et al., The Journal of Biochemistry (1968), 63(2), 139–148 beschrieben ist. Der als Mutantenstamm am meisten bevorzugte ist durch das L-Lysin-produzierende Bakterium AJ3445 (FERM P-1944) repräsentiert, der aus einer Mutationsbehandlung eines Wildtypstammes von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 abstammt (mit dem geänderten gegenwärtigen Namen Corynebacterium glutamicum).
  • Alternativ ist mutiertes lysC auch durch eine in vitro Mutationsbehandlung von Plasmid-DNA erhältlich, die Wildtyp lysC enthält. In einem weiteren Aspekt ist eine spezifische Information über eine Mutation bekannt, um die synergistische Feedback-Inhibierung von AK durch L-Lysin und L-Threonin (internationale Veröffentlichungsnummer WO 94/25605 ). Demgemäß kann mutiertes lysC auch aus Wildtyp lysC hergestellt werden, auf der Grundlage der Information in Übereinstimmung beispielsweise mit der ortspezifischen Mutagenesemethode.
  • Das DNA-Fragment, das lysC enthält, kann aus dem Chromosom eines coryneformen Bakterium mit Hilfe einer PCR hergestellt werden. DNA-Primer werden durch Einzelstrang-DNA's als 23-mer und 21-mer mit Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID Nrn. 10 und 11 der Sequenzliste beispielhaft dargestellt sind, um beispielsweise auf der Grundlage einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum lysC kodiert eine Region von ungefähr 1.643 bp zu erhalten (siehe Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197–1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317–324). Die Synthese der DNA, die PCR und die Herstellung eines Plasmids, das das erhaltene lysC trägt, kann auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie die für lysA oben beschriebenen.
  • Wildtyp lysC wird erhalten, wenn lysC von einem AK-Wildtypstamm isoliert wird, während mutiertes lysC erhalten wird, wenn lysC aus einem AK-Mutantenstamm in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Verfahren isoliert wird.
  • Ein Beispiel für eine Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments, das Wildtyp lysC enthält, wird in SEQ ID NO: 12 in der Sequenzliste gezeigt. Eine Aminosäuresequenz der α-Untereinheit des Wildtyp AK-Proteins wird von der Nukleotidsequenz abgeleitet, und wird in der SEQ ID NO: 13 in der Sequenzliste zusammen mit der DNA-Sequenz gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 14 gezeigt. Eine Aminosäuresequenz einer β-Untereinheit des Wildtyp AK-Proteins wird aus der Nukleotidsequenz von DNA abgeleitet und ist in SEQ ID NO: 15 in der Sequenzliste zusammen mit der DNA-Sequenz gezeigt. Allein die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 16 gezeigt. In jeder der Untereinheiten wird GTP als Initiationscodon verwendet, und die entsprechende Aminosäure wird durch Methionin dargestellt. Diese Darstellung betrifft jedoch Methionin, Valin oder Formylmethionin.
  • Das mutierte lysC, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht spezifisch begrenzt, vorausgesetzt, dass es für ein AK kodiert, bei dem die synergistische Feedback-Inhibierung durch L-Lysin und L-Threonin desensibilisiert ist. Das mutierte lysC wird jedoch durch eines beispielhaft dargestellt, das eine Mutation einschließt, wobei der 279te Alaninrest, vom N-Terminus aus gezählt, in einen Aminosäurerest verändert ist, der nicht Alanin ist, und anders ist, als die saure Aminosäure in der α-Untereinheit, und der 30te Alaninrest ist in einen Aminosäurerest verändert, der anders als Alanin ist, und anders als der saure Aminosäurerest in der β-Untereinheit in der Aminosäuresequenz des Wildtyp AK. Die Aminosäuresequenz des Wildtyp AK schließt spezifisch die Aminosäuresequenz ein, die in der SEQ ID NO: 14 in der Sequenzliste als α-Untereinheit gezeigt ist, und die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NO: 14 in der Sequenzliste als β-Untereinheit gezeigt ist.
  • Die, die als Aminosäurerest, der nicht Alanin ist und ein anderer als der saure Aminosäurerest ist, schließen Threonin-, Arginin-, Cystein-, Phenylalanin-, Prolin-, Serin-, Tyrosin- und Valinreste ein.
  • Der Codon, der einem Aminosäurerest entspricht, welcher substituiert werden soll, ist nicht spezifisch in seiner Art beschränkt, vorausgesetzt, dass er für einen Aminosäurerest kodiert. Es wird vermutet, dass die Aminosäuresequenz des erhaltenen Wildtyp AK in Abhängigkeit vom Unterschied der bakteriellen Spezies und des Bakterienstammes leicht verschieden sein kann. AK's, die eine Mutation haben, die z. B. auf einer Substituierung, Deletion oder Insertion von einer oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehrerer Positionen beruht, die für die Enzymaktivität irrelevant ist, wie oben beschrieben wurde, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Andere AK's, die eine Mutation haben, die z. B. einer Substituierung, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Aminosäurereste beruht, können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie keinen wesentlichen Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung der synergistischen Feedback-Inhibierung durch L-Lysin und L-Threonin ausüben.
  • Der Stamm AJ12691, der durch das Einschleusen des lysC-Plasmids p399AK9B in den AJ12036-Stamm (FERM BP-734) als Wildtypstamm des Brevibacterium lactofermentum erhalten wurde, wurde am 10. April 1992 unter der Zugangsnummer FERM P-12918 beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt, und in eine internationale Hinterlegung auf Grundlage des Budapester Vertrages vom 10. Februar 1995 übertragen, und unter der Zugangsnummer FERM BP-4999 hinterlegt.
  • (ii) Herstellung von dapB
  • Das DNA-Fragment, das dapB enthält, kann aus dem Chromosom eines coryneformen Bakteriums mit Hilfe der PCR hergestellt werden. Der DNA-Donor ist nicht spezifisch begrenzt, jedoch wird er beispielhaft durch Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Stamm angegeben.
  • Eine DNA-Sequenz, die für DDPR kodiert, ist aus Brevibacterium lactofermentum (Journal of Bacteriology, 175(9), 2743–2749 (1993)) bekannt, und auf dieser Grundlage wurden DNA-Primer für die PCR hergestellt. Solche DNA-Primer sind spezifisch durch die DNA's der 23-mere, die jeweils in den Nukleotidsequenzen in SEQ ID Nrn. 21 und 22 in der Sequenzliste beispielhaft wiedergegeben sind. Die Synthese der DNA, die PCR und die Herstellung eines Plasmids, das das erhaltene dapB trägt, kann auf gleiche Weise wie für lysC, wie oben beschrieben wurde, erreicht werden.
  • Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das dapB enthält, und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wird, ist in SEQ ID NO: 23 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NO: 24 gezeigt. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten, die für diese Aminosäuresequenz kodieren, kann die vorliegende Erfindung ebenfalls Fragmente verwenden, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die im wesentlichen der in der SEQ ID NO: 24 gezeigten Aminosäuresequenz gleich sind, das bedeutet, Aminosäuresequenzen mit einer Mutation, die z. B. auf einer Substituierung, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren beruhen, vorausgesetzt, dass es keinen wesentlichen Einfluss auf die DDPR-Aktivität gibt.
  • Ein Transformantenstamm AJ13107, der durch das Einschleusen eines Plasmids pCRDAPB in den E. coli JM109-Stamm erhalten wird, welches das dapB trägt, welches im später beschriebenen Beispiel erhalten wurde, ist international seit dem 26. Mai 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5114 beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japan) auf der Grundlage des Budapester Vertrages hinterlegt.
  • (iii) Herstellung von dapA
  • Ein DNA-Fragment, das dapA enthält, kann aus dem Chromosom eines coryneformen Bakteriums mit Hilfe von PCR hergestellt werden. Der DNA-Donor ist nicht spezifisch begrenzt, wird jedoch durch Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm beispielhaft angegeben.
  • Die DNA-Sequenz, die für die DPS kodiert, ist aus Corynebacterium glutamicum bekannt (siehe Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL accession Nr. X53993) und auf dieser Grundlage können DNA-Primer für die PCR hergestellt werden. Solche DNA-Primer sind spezifisch durch die DNA's der 23-mere beispielhaft angegeben, die die SEQ ID Nrn. 17 und 18 in der Sequenzliste haben. Die Synthese der DNA, die PCR und die Herstellung eines Plasmids, das das erhaltene dapA trägt, kann auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie oben für lysC beschrieben wurde.
  • Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das dapA enthält, und eine Aminosäuresequenz, die von dieser Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind beispielhaft in der SEQ ID NO: 19 angegeben. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 20 angegeben. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten, die für diese Aminosäuresequenz kodieren, kann die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Fragmente verwenden, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die im wesentlichen die gleichen sind wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 20 gezeigt ist, das bedeutet, Aminosäuresequenzen mit einer Mutation, die beispielsweise auf einer Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren beruht, vorausgesetzt, dass es keinen wesentlichen Einfluß auf die DDPS-Aktivität ausübt.
  • Der Transformantenstamm AJ13106, der durch das Einschleusen eines Plasmids pCRDAPA erhalten wird, welches das dapA trägt, welches im Beispiel erst später beschrieben wird, erhalten wird, in E. coli JM109-Stamm ist international seit dem 26. Mai 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5113 beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukubashi-Ibaraki-ken, Japan) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.
  • In einer besonderen Ausführungsform werden die Gene in einen Wirt unter Verwendung eines Plasmidvektors, Transposons oder Phagenvektors oder ähnlicher eingeschleust, um lysA und ddh in dem L-Lysin-produzierenden coryneformen Bakterium, wie oben beschrieben wurde, zu verstärken. Nach der Einschleusung wird erwartet, dass es in einem gewissen Ausmaß selbst bei Verwendung eines Vektors vom low copy-Typ eine Steigerung gibt. Es ist jedoch bevorzugt, einen Vektor vom multiple copy-Typ zu verwenden. Ein solcher Vektor schließt z. B. Plasmidvektoren, pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 und pAJ440, die oben beschrieben wurden, ein. Daneben können Transposons, die aus coryneformen Bakterien stammen, und in den Internationalen Veröffentlichungsnummern WO 92/02627 und WO 93/18151 ; europäische Patentveröffentlichung Nr. 445385 ; japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 6-46867 ; A. A. Vertes et al., Mol. Microbiol., 11, 739–746 (1994); C. Bonamy et al., Mol. Microbiol., 14, 571–581 (1994); A. A. Vertes et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397–405 (1994); W. Jagar et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1–6 (1995); japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nrn. 7-107976 und 7-327680 und ähnliche beschrieben sind, verwendet werden.
  • Ein hinsichtlich des lysA und ddh gemäß der vorliegenden Erfindung verstärktes coryneformen Bakterium kann z. B. durch das Einschleusen in einen Wirt coryneformen Bakterium einer rekombinanten DNA erhalten werden, welche lysA und ddh enthält, und autonom in coryneformen Bakterienzellen replizierbar ist. Die rekombinante DNA kann z. B. durch das Inserieren von lysA und ddh in einen Vektor erhalten werden, wie beispielsweise in einem Plasmidvektor, ein Transposon oder einem Phagenvektor, wie oben beschrieben wurde.
  • Jedes der Gene lysA und ddh kann nacheinander in der Wirt eingeschleust werden, indem jeweils verschiedene Vektoren verwendet werden. Alternativ dazu können zwei Arten von Genen zusammen unter Verwendung eines einzelnen Vektors eingeschleust werden. Wenn verschiedene Vektoren verwendet werden, können die Gene in jeder Reihenfolge eingeschleust werden, es wird jedoch bevorzugt, Vektoren zu verwenden, die einen stabilen Teilungs- und Beinhaltungsmechanismus in dem Wirt haben, und die in der Lage sind, miteinander gleichzeitig zu existieren.
  • In einem Fall, in dem ein Plasmid als Vektor verwendet wird, kann die rekombinante DNA in den Wirt gemäß einem elektrischen Pulsverfahren (Sugimoto et al., japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 2-207791 ). Die Amplifizierung des Gens, unter Verwendung eines Transposons, kann durch das Einschleusen eines Plasmids in eine Wirtszelle durchgeführt werden, welches ein Transposon trägt, und das Induzieren der Tranposition des Transposons.
  • Auch wenn mutiertes lysC, dapA und dapB in das coryneforme Bakterium eingeschleust werden, kann jedes der Gene nacheinander in den Wirt eingeschleust werden, indem jeweils verschiedene Vektoren verwendet werden, oder alternativ dazu können zwei oder mehr Arten der Gene gemeinsam zusammen unter Verwendung eines einzelnen Vektors eingeschleust werden.
  • <3> Verfahren zum Herstellen von L-Lysin
  • L-Lysin kann effizient durch das Kultivieren des coryneformen Bakteriums, das verstärkte Gene für die L-Lysin-Biosynthese enthält, die oben beschrieben wurden, in einem geeigneten Medium, um zu ermöglichen, dass L-Lysin produziert wird und in der Kultur angehäuft wird, und durch das Einsammeln des L-Lysins aus der Kultur erzeugt werden.
  • Ein Medium, das verwendet werden kann, wird beispielhaft durch ein gewöhnliches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls weitere organische Bestandteile enthält
  • Als Kohlenstoffquelle ist es möglich, Zucker, wie beispielsweise Glucose, Fructose, Sucrose, Molassen und Stärkehydrolysate; und organische Säuren wie beispielsweise Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure zu verwenden.
  • Als Stickstoffquelle ist es möglich, anorganische Ammoniumsalze wie beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischen Stickstoff wie beispielsweise Sojabohnenhydrolysat, Ammoniumgas und wässrigen Harnstoff zu verwenden.
  • Als Quellen für organische Spurenelemente ist es möglich, dass die benötigten Substanzen wie beispielsweise Vitamin B1 und L-Homoserin oder Hefeextrakt oder ähnliches in geeigneten Mengen enthalten sind. Neben den obengenannten werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Magnesiumionen usw., falls notwendig, in geringen Mengen hinzugegeben.
  • Die Kultivierung wird bevorzugt unter aeroben Bedingungen für ungefähr 30 bis 90 Stunden durchgeführt. Die Kulturtemperatur wird bevorzugt auf 25°C bis 37°C kontrolliert, und der pH-Wert ist während der Kultivierung bevorzugt auf 5 bis 8 eingestellt. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen, oder Harnstoffgas oder ähnliche können zur pH-Einstellung verwendet werden. L-Lysin kann aus der Kultur durch das Kombinieren eines gewöhnlichen Ionenaustauschharzverfahrens, ein Präzipitationsverfahren und andere bekannte Verfahren eingesammelt werden.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele spezifischer erklärt.
  • Beispiel 1: Herstellung von lysA aus Brevibacterium lactofermentum
  • <1> Herstellung von lysA und die Konstruktion des Plasmids, welches lysA trägt
  • Der Wildtypstamm ATCC 13869 des Brevibacterium lactofermentum wurde als Donor für chromosomale DNA verwendet. Die chromosomale DNA wurde aus den ATCC 13869 Stamm gemäß einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Das DNA-Fragment, das argS, lysA und einen Promotor des Operons enthält, welches diese enthält, wurde von der chromosomalen DNA in Übereinstimmung mit einer PCR amplifiziert. Als DNA-Primer, die für diese Amplifizierung verwendet wurden, wurden synthetische DNA's von 23-meren mit Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID NO: 1 und 2 in der Sequenzlichste gezeigt sind, verwendet, um auf der Grundlage einer Sequenz, die aus Corynebacterium glutamicum bekannt ist (siehe Molecular Microbiology, 4(11), 1819–1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112–119 (1988)) eine Region von ungefähr 3,6 kb zu amplifizieren, welche für Arginyl-tRNA-Synthase und DDC kodiert.
  • DNA wurde gemäß einem gewöhnlichen Verfahren unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätmodells 380B, welches von Applied Biosystems hergestellt wird, synthetisiert, und indem die Phosphoamiditmethode verwendet wurde (siehe Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).
  • Das Gen wurde mittels PCR unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler Modell PJ2000 amplifiziert, welches von Takara Shuzo hergestellt wird, und in dem die Taq-Polymerase in Übereinstimmung mit einem vom Lieferanten angegebenen Verfahren verwendet wurde. pHSG399 wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 3.579 Bp verwendet. pHSG399 wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und wurde mit dem DNA-Fragment ligiert, welches amplifiziertes lysA enthält. Ein Plasmid, das wie oben beschrieben, erhalten wurde, welches lysA, das aus ATCC 13869 stammt, wurde als p399LYSA bezeichnet.
  • Das DNA-Fragment, das lysA enthält, wurde durch das Verdauen des p399LYSA mit KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) extrahiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit pHSG299 ligiert, welches mit KpnI und BamHI verdaut wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als p299LYSA bezeichnet. Das Konstruktionsverfahren von p299LYSA ist in 1 gezeigt.
  • Das DNA-Fragment (nachfolgend als ”Brevi.-ori” bezeichnet) mit der Fähigkeit, ein Plasmid in Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, autonom replizierbar zu machen, wurde in p299LYSA eingeschleust, um Plasmide herzustellen, die lysA tragen, welches autonom in Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, replizierbar ist, Brevi.-ori wurde aus einem Plasmidvektor pHK4 hergestellt, welcher Brevi.-ori enthält und sowohl in Escherichia coli und Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, autonom replizierbar ist. pHK4 wurde durch das Verdauen von pHC4 mit KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) durch das Extrahieren des Brevi.-ori-Fragments, und das Ligieren desselben mit pHSG298, welches ebenfalls mit KpnI und BamHI verdaut worden ist (siehe japanisches Patent, Anmeldungs-Veröffentlichungsnummer 5-7491 ) hergestellt. pHK4 verleiht dem Wirt eine Kanamycinresistenz. Escherichia coli HB101, welche pHK4 beinhalten, wurden als Escherichia coli AJ13136 bezeichnet, und am 01. August 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5186 beim National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt.
  • pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI verdaut und die durchtrennten Enden wurden geglättet (blunted). Die Blunt-end-Bildung wurde unter Verwendung des DNA-Blunting-Kit (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein phosphorylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifikation zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 nur durch einen Verdau mit KpnI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit KpnI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori DNA-Fragment wurde mit p299LYSA ligiert, welches ebenfalls mit KpnI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, welches lysA trägt, und das autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pLYSAB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pLYSAB wird in 2 gezeigt.
  • <2> Bestimmung der Nukleotidsequenz von lysA aus Brevibacterium lactofermentum
  • Es wurde Plasmid-DNA aus p299LYSA hergestellt, und die Nukleotidsequenzbestimmung wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Sanger et al. (z. B. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)) durchgeführt. Die bestimmte Nukleotidsequenz und eine davon abgeleitete Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz kodiert wird, werden in der SEQ ID NO: 3 gezeigt. Hinsichtlich der Nukleotidsequenz werden eine Aminosäuresequenz, die durch argS und eine Aminosäuresequenz, die durch lysA kodiert werden, in SEQ ID NO: 4 bzw. 5 gezeigt.
  • Beispiel 2: Herstellung von ddh aus Brevibacterium lactofermentum
  • Das ddh-Gen wurde durch das Amplifizieren des ddh-Gens aus chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum, ATCC 13869 in Übereinstimmung mit dem PCR-Verfahren durch das Verwenden von zwei Oligonukleotidprimern (SEQ ID Nrn. 6, 7) erhalten, welche auf der Grundlage einer bekannten Nukleotidsequenz des ddh-Gens aus Corynabacterium glutamicum (S. Ishino et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) hergestellt worden sind. Das erhaltene amplifizierte DNA-Fragment wurde mit EcoT22I und AvaI verdaut, und die geschnittenen Enden wurden glatt gemacht. Danach wurde das Fragment in die SmaI-Stelle von pMW119 inseriert, um das Plasmid pDDH zu erhalten.
  • Als nächstes wurde pDDH mit SalI und EcoRI verdaut, gefolgt von der Blunt end Bildung. Danach wurde das erhaltene Fragment mit pUC18 ligiert, welches mit SmaI verdaut worden ist. Das so erhaltene Plasmid wurde als pUC18DDH bezeichnet.
  • Der Brev.-ori wurde in pUC18DDH eingeschleust, um ein Plasmid herzustellen, welches ein in coryneformen Bakterien autonom replizierbares ddh trägt. pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Blunt end Bildung wurde mit dem DNA-Blunting-Kit (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blut-end-Bildung wurde ein phosphorylierter PstI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, so dass es in die PstI-Stelle von pHSG299 inseriert wurde. Das wie oben beschrieben konstruierte Plasmid wurde als pPK4 bezeichnet. Als nächstes wurde pUC18DDH mit XbaI und KpnI verdaut, und das erzeugte Fragment wurde mit pPK4 ligiert, welches mit KpnI und XbaI verdaut worden ist. So wurde ein Plasmid, welches ddh trägt, das in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, konstruiert. Dieses Plasmid wurde als pPK4D bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pPK4D ist in 3 gezeigt.
  • Beispiel 3: Konstruktion des Plasmids, das sowohl ddh als auch lysA trägt
  • Das Plasmid pUC18DDH, das ddh trägt, wurde mit EcoRI verdaut und dann geglättet und weiter mit Xba verdaut, um ein DNA-Fragment zu extrahieren, welches ddh enthält. Dieses ddh-Fragment wurde mit dem Plasmid p399LYSA ligiert, welches lysA trägt, und welches mit BamHI verdaut wurde, und dann geglättet wurde und außerdem mit Xba verdaut worden ist. Das erhaltene Plasmid wurde als p399DL bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von p399DL ist in 4 gezeigt.
  • Als nächstes wurde der Brevi.-ori in p399DL eingeschleust. pHK4 wurde mit XbaI und BamHI verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein phosphorylierter XbaI-Linker ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch den Verdau nur mit XbaI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit XbaI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399DL ligiert, welches ebenfalls mit XbaI verdaut worden ist, um ein Plasmid zu konstruieren, das ddh und lysA trägt, und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. Das konstruierte Plasmid wurde als pDL bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pDL ist in 5 gezeigt.
  • Beispiel 4: Herstellung von mutiertem lysC, dapA und dapB aus Brevibacterium lactofermentum
  • <1> Herstellung von Wildtyp lysC-Gen und mutiertem lysC-Gen aus Brevibacterium lactofermentum
  • (1) Herstellung der Wildtyp und mutierten lysC's und die Herstellung von Plasmiden, die diese tragen
  • Der Stamm Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und ein L-Lysin-produzierender Mutantenstamm AJ3445 (FERM P-1944), welcher aus dem ATCC 13869-Stamm durch eine Mutationsbehandlung erhalten wurde, wurde als chromosomale DNA-Donoren verwendet. Der AJ3445-Stamm ist einer Mutierung unterworfen worden, so dass lysC verändert wurde, um eine wesentliche Desensibilisierung der gemeinsamen Inhibierung durch Lysin und Threonin (Journal of Biochemistry, 68, 701–710 (1970)) zu beinhalten.
  • Das DNA-Fragment, das lysC enthält, wurde aus chromosomaler DNA in Übereinstimmung mit dem PCR-Verfahren (Polymerase-Kettenreaktion, siehe T. J. White et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) amplifiziert. Hinsichtlich der DNA-Primer, die für die Amplifizierung verwendet wurden, wurden einzelsträngige DNA's aus 23-meren und 21-meren mit den Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID Nrn. 10 und 11 gezeigt sind, synthetisiert, um eine Region von ungefähr 1.643 Bp zu amplifizieren, die für lysC kodieren, auf der Grundlage einer bekannten Sequenz aus Corynebacterium glutamicum (siehe Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197–1204; und Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317–324).
  • Das amplifizierte Genfragment von 1.643 kb wurde durch Agarosegelelektrophorese bestätigt. Danach wurde das Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren gereinigt, und es wurde mit den Restriktionsenzymen NruI (produziert von Takara Shuzo) und EcoRI (produziert von Takara Shuzo) verdaut.
  • pHSG399 (siehe S. Takeshita et al., Gene (1987), 61, 63–74) wurde als Klonierungsvektor für das Genfragment verwendet. pHSG399 wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI (hergestellt von Takara Shuzo) und EcoRI verdaut, und es wurde mit dem amplifizierten lysC-Fragment ligiert. Die DNA wurde unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren ligiert. Auf diese Weise wurden Plasmide hergestellt, in denen die lysC-Fragmente, die aus den Chromosomen von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert wurden, jeweils mit pHSG399 ligiert waren. Das Plasmid, das lysC aus ATCC 13869 (Wildtypstamm) trägt, wurde als p399AKV bezeichnet, und das Plasmid, das lysC aus AJ3463 (L-Lysin-produzierendes Bakterium) trägt, wurde als p399AK9 bezeichnet.
  • Der Brevi.-ori wurde in die hergestellten p399AKY und p399AK9 jeweils eingeschleust, um die Plasmide zu konstruieren, die lysC tragen, welches in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist.
  • pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Blunt-end-Bildung wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt end Bildung wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, aus dem pHK4 durch einen Verdau nur mit BamHI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399AKY und p399AK9 ligiert, welche ebenfalls mit BamHI verdaut worden sind, um Plasmide herzustellen, die lysC tragen, und die in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist.
  • Das Plasmid, das das Wildtyp lysC-Gen trägt, welches aus p399AKY stammt, wurde als p399AKYB, und das Plasmid, das das mutierte lysC-Gen trägt, welches aus p399AK9 stammt, wurde als p399AK9B bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von p399AK9B und p399AKYB ist in 6 gezeigt. Der Stamm AJ12691, der durch das Einschleusen des mutierten lysC-Plasmids p399AK9B in einen Wildtypstamm des Brevibacterium lactofermentum (AJ12036-Stamm, FERM BP-734) erhalten wurde, wurde am 10. April 1992 unter der Zugangsnummer FERM P-12918 beim National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Sience and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt, in eine internationale Hinterlegung, basierend auf dem Budapester Vertrag am 10. Februar 1995 übertragen und unter der Zugangsnummer FERM BP-4999 hinterlegt.
  • (2) Bestimmung der Nukleotidsequenz des Wildtyp lysC und des mutierten lysC aus Brevibacterium lactofermentum
  • Das Plasmid p399AKY, welches die Wildtyp lysC und das Plasmid p399AK9 trägt, welches das mutierte lysC enthält, wurden aus den entsprechenden Transformanten hergestellt, um die Nukleotidsequenz des Wildtyps und des mutierten lysC zu bestimmen. Die Nukleotidsequenzbestimmung wurde in Übereinstimmung mit einem Verfahren von Sanger et al. (z. B. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)) durchgeführt.
  • Die Nukleotidsequenz des Wildtyp lysC, welche durch p399AKY kodiert wird, ist in der SEQ ID NO: 12 in der Sequenzliste gezeigt. Andererseits hatte die Nukleotidsequenz des mutierten lysC, welches durch p399AK9 kodiert wird, nur eine Mutationvon einem Nukleotid, wobei das 1051ste G in ein A in der SEQ ID NO: 12 verändert wurde, verglichen mit dem Wildtyp lysC. Es ist bekannt, dass lysC des Corynebacterium glutamicum zwei Untereinheiten (α, β) hat, welche in einem gleichen Leseraster auf dem gleichen DNA-Strang kodiert werden (siehe J. Kalinowski et al., Molecular Microbiology (1991) 5(5), 1197–1204). Von der Homologie aus beurteilt wird erwartet, dass das hier sequenzierte Gen ebenfalls zwei Untereinheiten (α, β) hat, welche in einem identischen Leseraster auf einen identischen DNA-Strang kodiert werden.
  • Die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit des Wildtyp AK-Proteins, welche von der Nukleotidsequenz der DNA abgeleitet wird, ist in SEQ ID NO: 13 gezeigt, zusammen mit der DNA-Sequenz. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 14 gezeigt. Die Aminosäuresequenz der β-Untereinheit des Wildtyp AK-Proteins, welches von der Nukleotidsequenz der DNA abgeleitet wurde, ist in SEQ ID NO: 15 zusammen mit der DNA gezeigt.
  • In SEQ ID NO: 16 ist nur die Aminosäuresequenz gezeigt. Bei jeder der Untereinheiten wird GTG als Initiationscodon verwendet, und die entsprechende Aminosäuresequenz ist durch Methionin repräsentiert. Diese Repräsentierung betrifft jedoch Methionin, Valin oder Formylmethionin.
  • Andererseits bedeutet die Mutation der Sequenz des mutierten lysC das auftreten einer Aminosäurerest-Substitution, so dass der 279ste Alaninrest der α-Untereinheit in einen Threoninrest geändert ist, und ein 30ter Alaninrest der β-Einheit in einen Threoninrest in der Aminosäuresequenz des Wildtyp AK-Proteins (SEQ ID Nrn. 14 und 16) geändert ist.
  • <2> Herstellung von dapB aus Brevibacterium lactofermentum
  • (1) Herstellung von dapB und Herstellung des Plasmids, das dapB trägt
  • Der Wildtypstamm ATCC 13869 von Brevibacterium lactofermentum wurde als chromosomaler DNA-Donor verwendet. Die chromosomale DNA des ATCC 13869-Stammes wurde in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Das DNA-Fragment, das dapB enthält, wurde aus der chromosomalen DNA in Übereinstimmung mit der PCR amplifiziert. Hinsichtlich der DNA-Primer, die für die Amplifizierung verwendet wurden, wurden DNA's von 23-meren mit Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID Nrn. 21 und 22 der Sequenzliste jeweils gezeigt sind, synthetisiert, um eine Region von ungefähr 2,0 kb zu amplifizieren, welche für DDPR kodiert, auf der Grundlage der Sequenz, die für Brevibacterium lactofermentum (siehe Journal of Bacteriology, 157(9), 2743–2749 (1993)) bekannt ist. Die Synthese der DNA und der PCR wurden auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pCR-Script (hergestellt von Invitrogen) wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 2.001 Bp verwendet, und wurde mit dem amplifizierten dapB-Fragment ligiert. So wurde ein Plasmid konstruiert, bei dem das dapB-Fragment von 2.001 bp, welches aus dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert wurde, mit dem pCR-Script ligiert. Das wie oben beschrieben erhaltene Plasmid, welches dapB, welches aus ATCC 13869 stammt, beinhaltete, wurde als pCRDAPB bezeichnet. Ein Transformantenstamm AJ13107, der durch das Einschleusen von pCRDAPB im E. coli JM109-Stamm erhalten wurde, wurde international seit dem 26. Mai 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5114 beim National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie hinterlegt (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) auf der Grundlage des Budapester Vertrages.
  • Ein DNA-Fragment von 1.101 bp, welches ein Strukturgen des DDPR enthält, wurde durch den Verdau mit pCRDAPB mit EcoRV und SphI extrahiert. Dieses Fragment wurde mit pHSG399, welches mit HincII und SphI verdaut worden ist, ligiert, um ein Plasmid herzustellen. Das hergestellte Plasmid wurde als p399DPR bezeichnet.
  • Der Brevi.-ori wurde in das hergestellte p399DPR eingeschleust, um ein Plasmid zu konstruieren, das das dapB trägt, welches in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. pHK4 wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Blunt-end-Bildung wurde unter Verwendung eines DNA-Bluntingkits (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit dem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, von pHK4 durch den Verdau nur mit BamHI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut, und das so erzeugte Brevi.-ori DNA-Fragment wurde mit p399DPR ligiert, welches ebenfalls mit BamHI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das dapB enthält, welches autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pDPRB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pDPRB ist in 7 gezeigt.
  • (2) Bestimmung der Nukleotidsequenz von dapB aus Brevibacterium lactofermentum
  • Plasmid-DNA wurde aus dem AJ13107-Stamm, der p399DPR beinhaltet, hergestellt, und seine Nukleotidsequenz wurde auf gleiche Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die bestimmte Nukleotidsequenz, und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wurde, sind in SEQ ID NO: 23 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 24 gezeigt.
  • <3> Herstellung von dapA aus Brevibacterium lactofermentum
  • (1) Herstellung von dapA und Konstruktion des Plasmids, das dapA trägt
  • Der Wildtypstamm Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als chromosomaler DNA-Donor verwendet. Die chromosomale DNA wurde aus dem ATCC 13869-Stamm in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Das DNA-Fragment, das dapA enthält, wurde von der chromosomalen DNA in Übereinstimmung mit der pCR amplifiziert. Als DNA-Primer, die für die Amplifizierung verwendet wurden, wurden 23-mer DNA's mit den Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID Nrn. 17 und 18 in der Sequenzliste jeweils gezeigt sind, synthetisiert, um eine Region von ungefähr 1,5 kb zu amplifizieren, die für DDPS auf der Grundlage einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum (siehe Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL accession Nr. X53993) kodiert. Die Synthese der DNA und die PCR wurden auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pCR1000 (hergestellt von Invitrogen, siehe Bio/Technology, 9, 657–663 (1991)) wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 1.411 bp verwendet, und wurde mit dem amplifizierten dapA-Fragment ligiert. Die Ligierung der DNA wurde durch die Verwendung eines DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren hergestellt. So wurde ein Plasmid konstruiert, in dem das dapA-Fragment von 1.411 bp, welches aus dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert wurde, mit dem pCR1000 ligiert war. Das wie oben beschrieben erhaltene Plasmid, welches dapA beinhaltet, welches aus ATCC 13869 stammt, wurde als pCRDAPA bezeichnet.
  • Der Transformantenstamm AJ13106, der durch das Einschleusen von pCRDAPA in E. coli JM109-Stamm erhalten wurde, wurde international am 26. Mai 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5113 beim National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) auf der Grundlage des Budapester Vertrages hinterlegt.
  • Brevi.-ori wurde in das hergestellte pCRDAPA eingeschleust, um ein Plasmid zu konstruieren, das dapA trägt, welches autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut (hergestellt von Takara Shuzo), und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Blunt-end-Bildung wurde durch die Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein phosphorylierter SmaI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, welches dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, aus pHK4 durch den Verdau nur mit SmaI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit SmaI verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit pCRDAPA ligiert, welches ebenfalls mit SmaI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das dapA trägt, welches autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Dieses Plasmid wurde als pDPSB bezeichnet. Das Konstruktionsverfahren von pDPSB(Kmr) ist in 8 gezeigt.
  • (2) Bestimmung der Nukleotidsequenz von dapA aus Brevibacterium lactofermentum
  • Plasmid-DNA wurde aus dem AJ13106-Stamm, der pCRDAPA beinhaltet, hergestellt, und dessen Nukleotidsequenz wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die ermittelte Nukleotidsequenz und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wird, ist in SEQ ID NO: 19 gezeigt. Die SEQ ID Aminosäuresequenz allein ist in SEQ ID NO: 20 gezeigt.
  • <4> Konstruktion eines Plasmids, das sowohl mutiertes LysC und dapA trägt
  • Ein Plasmid, das mutiertes lysC, dapA und den Replikationsursprung der coryneformen Bakterien trägt, wurde von dem Plasmid pCRDAPA konstruiert, welche ein dapA trägt, und von dem Plasmid p399AK9B, welcher mutiertes lysC und den Brevi.-ori trägt. p399AK9B wurde vollständig mit SalI verdaut, und dann wurde es geglättet. Ein EcoRI-Linker wurde hiermit ligiert, um ein Plasmid zu konstruieren, bei dem die SalI-Stelle in eine EcoRI-Stelle modifiziert wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als p399AK9BSE bezeichnet. Das mutierte lysC und der Brevi.-ori wurden als ein Fragment durch das Teilverdauen von p399AK9BSE mit EcoRI ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde mit pCRDAPA ligiert, welches mit EcoRI verdaut worden ist. Das erhaltene Plasmid wurde als pCRCAB bezeichnet. Dieses Plasmid ist in E. coli und coryneformen Bakterien autonom replizierbar und verleiht dem Wirt eine Kanamycin-Resistenz, und das Plasmid trägt sowohl mutiertes lysC und dapA. Das Konstruktionsverfahren von pCRCAB ist in 9 gezeigt.
  • <5> Konstruktion des Plasmids, das sowohl mutiertes lysC und dapB trägt
  • Ein Plasmid, das mutiertes lysC und dapB trägt, wurde aus dem Plasmid p399AK9 konstruiert, welches mutiertes lysC trägt, und dem Plasmid p399DPR, welches dapB trägt. Ein Fragment von 1.101 bp, welches das Strukturgen für DDPR trägt, wurde durch das Verdauen von p399DPR mit EcoRV und SphI extrahiert, konstruiert. Dieses Fragment wurde mit p399AK9 ligiert, welches mit SalI verdaut worden ist und dann geglättet wurde, und das weiter mit SphI verdaut worden ist, um ein Plasmid zu konstruieren, das sowohl mutiertes lysC und dapB trägt. Dieses Plasmid wurde als p399AKDDPR bezeichnet.
  • Als nächstes wurde der Brevi.-ori in das erhaltene p399AKDDPR eingeschleust. Das Plasmid pHK4, das den Brevi.-ori enthält, wurde mit einem Restriktionsenzym KpnI verdaut (hergestellt von Takara Shuzo), und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Blunt end Bildung wurde unter Verwendung des DNA-Bluntingkits (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem vorgegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt end-Bildung wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, aus pHK4 durch die Verdauung allein mit BamHI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399AKDDPR ligiert, welches ebenfalls mit BamHI verdaut worden ist, um ein Plasmid zu konstruieren, das mutiertes lysC und dapB trägt, welche in coryneformen Bakterien autonom replizierbar sind. Das konstruierte Plasmid wurde als pCB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pCB ist in 10 gezeigt.
  • <6> Konstruktion des Plasmids, das sowohl dapA und dapB trägt
  • Das Plasmid pCRDAPA, das dapA trägt, wurde mit KpnI und EcoRI verdaut, um ein DNA-Fragment zu extrahieren, das dapA enthält, und das Fragment wurde mit dem Vektorplasmid pHSG399 ligiert, welches mit KpnI und EcoRI verdaut worden ist. Das erhaltene Plasmid wurde als p399DPS bezeichnet.
  • Andererseits wurde das Plasmid pCRDAPB, das dapB trägt, mit SacII und EcoRI verdaut, um ein DNA-Fragment zu extrahieren von 2,0 kb, welches eine Region enthält, die für DDPR kodiert, und das Fragment wurde mit p399DPS ligiert, welches mit SacII und EcoRI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das sowohl dapA und dapB trägt. Das erhaltene Plasmid wurde als p399AB bezeichnet.
  • Als nächstes wurde der Brevi.-ori in p399AB eingeschleust. pHK4, der den Brevi.-ori trägt, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut (hergestellt von Takara Shuzo), und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Blunt-end-Bildung wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein phosporylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, nur mit dem Verdau von pHK4 mit KpnI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit KpnI verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399AB ligiert, welches ebenfalls mit KpnI verdaut worden ist, um ein Plasmid zu konstruieren, das dapA und dapB trägt, die in coryneformen Bakterien autonom replizierbar sind. Das konstruierte Plasmid wurde als pAB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pAB ist in 11 gezeigt.
  • <7> Konstruktion des Plasmids, das mutiertes lysC, dapA und dapB zusammen trägt
  • p399DPS wurde mit EcoRI und SphI verdaut, gefolgt von der Blunt-end-Bildung, um ein dapA-Genfragment zu extrahieren. Dieses Fragment wurde mit dem p399AK9 ligiert, welches mit SalI verdaut worden ist und geglättet wurde, um ein Plasmid p399CA zu konstruieren, bei dem mutiertes lysC und dapA gemeinsam vorhanden sind.
  • Das Plasmid pCRDAPB, das dapB trägt, wurde mit EcoRI verdaut, und geglättet, gefolgt von dem Verdau mit SacI, um ein DNA-Fragment von 2,0 kb zu extrahieren, welches dapB umfasst. Das Plasmid p399CA, das dapA und mutiertes lysC trägt, wurde mit SpeI verdaut und geglättet, und danach wurde es mit SacI verdaut und mit dem extrahierten dapB-Fragment ligiert, um ein Plasmid zu erhalten, das mutiertes lysC, dapA und dapB trägt. Dieses Plasmid wurde als p399CAB bezeichnet.
  • Als nächstes wurde der Brevi.-ori in p399CAB eingeschleust. Das Plasmid pHK4, welches den Brevi.-ori trägt, wurde mit einem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Blunt-end-Bildung wurde durch das Verwenden von einem DNA-Blunting-Kit (hergestellt von Takara Shuz0) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein phosphorylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, durch den Verdau nur mit KpnI aus pHK4 ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit KpnI verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399CAB ligiert, welches ebenfalls mit KpnI verdaut worden ist, um ein Plasmid zu konstruieren, das mutiertes lysC, dapA und dapB zusammen trägt, welches autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das konstruierte Plasmid wurde als pCAB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pCAB ist in 12 gezeigt.
  • <8> Konstruktion des Plasmids, das mutiertes lysC trägt, dapA, dapB und lysA zusammen trägt
  • Das Plasmid p299LYSA, das lysA trägt, wurde mit KpnI und BamHI geschnitten und geglättet, und dann wurde das lysA-Genfragment extrahiert. Dieses Fragment wurde mit pCAB ligiert, welches mit HpaI verdaut worden ist (hergestellt von Takara Shuzo), und geglättet wurde, um ein Plasmid zu konstruieren, das mutiertes lysC, dapA, dapB und lysA zusammenträgt, welches in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. Das konstruierte Plasmid wurde als pCABL bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pCABL ist in 13 gezeigt. Es ist anzumerken, dass das lysA-Genfragment in die HpaI-Stelle in einem DNA-Fragment inseriert wurde, welches das dapB-Gen in pCABL trägt, jedoch ist die HpaI-Stelle stromaufwärts des Promotors des dapB-Gens (Nukleotidnummern 611 bis 616 in der SEQ ID NO: 23) lokalisiert, und das dapB-Gen ist nicht geteilt.
  • <9> Konstruktion eines Plasmids, das mutiertes lysC, dapA, dapB, ddh und lysA zusammen trägt
  • pHSG299 wurde mit XbaI und KpnI verdaut, und wurde mit p399DL ligiert, das ddh und lysA trägt, welche mit XbaI und KpnI verdaut wurden. Das konstruierte Plasmid wurde als p299DL bezeichnet. p299DL wurde mit XbaI und KpnI verdaut und geglättet. Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein DNA-Fragment, das ddh und lysA trägt, extrahiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem Plasmid pCAB ligiert, welches mutiertes lysC, dapA und dapB zusammen trägt, welche mit HpaI verdaut worden sind und blunt-ended wurden, um ein Plasmid zu konstruieren, das mutiertes lysC, dapA, dapB, lysA und ddh zusammen trägt, welches in coryneformen Bakterien autonom replizierbar sind. Das konstruierte Plasmid wurde als pCABDL bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pCABDL ist in 14 gezeigt.
  • Beispiel 5: Einschleusen des Plasmids, das Gene für die L-Lysin-Biosynthese trägt, in L-Lysin produzierende Bakterien von Brevibacterium lactofermentum
  • Die Plasmide, die die Gene für die L-Lysin-Biosynthese tragen, die wie oben beschrieben konstruiert wurden, d. h. pLYSAB(Cmr), pPK4D(Cmr), p399AK9B(Cmr), pDPSB(Kmr), pDPRB(Cmr), pCRCAB(Kmr), pAB(Cmr), pDL(Cmr), pCB(Cmr), pCAB(Cmr), pCABL(Cmr) und pCABDL(Cmr) wurden in das L-Lysin produzierende Bakterium AJ11082 (NRRL B-1470) des Brevibacterium lactofermentum jeweils eingeschleust. Der AJ11082-Stamm hat die Eigenschaft der AEC-Resistenz. Die Plasmide wurden in Übereinstimmung mit einem elektrischen Pulverfahren (Sugimoto et al., japanisches Patent, Anmeldungs-Veröffentlichungsnummer 2-207791 ) eingeschleust. Transformanten wurden auf der Grundlage einer von Medikamenten-Resistenzmarkern selektioniert, die von den jeweiligen Plasmiden besessen werden. Die Transformanten wurden auf komplettem Medium, enthaltend 5,5 μg/ml Chloramphenicol selektioniert, wenn ein Plasmid, das ein Chloramphenicol-Resistenzgen trägt, eingeschleust wurde, oder die Transformanten wurden auf komplettem Medium selektioniert, das 25 μg/ml Kanamycin enthält, wenn ein Plasmid, das ein Kanamycin-Resistenzgen trägt, eingeschleust wurde.
  • Beispiel 6: Produktion von L-Lysin
  • Jeder der Transformanten, die im Beispiel 5 erhalten wurden, wurde in einem L-Lysin-Produktionsmedium kultiviert, um die L-Lysin-Produktionsfähigkeit zu evaluieren. Das L-Lysin-Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung.
  • [L-Lysin-Produktionsmedium]
  • Die folgenden Bestandteile neben Calciumcarbonat (je l) wurden gelöst, um eine Einstellung auf pH 8,0 mit KOH zu ergeben. Das Medium wurde bei 115°C für 15 min sterilisiert und Calciumcarbonat (50 g), welches separat in trockenem Zustand in heißer Lust sterilisiert worden ist, wurde zu dem sterilisierten Medium hinzugegeben.
    Glucose 100 g
    (NH4)2SO4 55 g
    KH2PO4 1 g
    MgSO4·7H2O 1 g
    Biotin 500 μg
    Thiamin 2000 μg
    FeSO4·7H2O 0,01 g
    MnSO4·7H2O 0,01 g
    Nicotinamid 5 mg
    Proteinhydrolysat (Mamenou) 30 ml
    Calciumcarbonat 50 g
  • Jede der verschiedenen Arten der Transformanten und der Parentalstamm wurden in das Medium inokuliert, welches die oben beschriebene Zusammensetzung hat, um eine Kultivierung bei 31,5°C mit reciprokem Schütteln durchzuführen. Die Menge an hergestelltem L-Lysin nach 40 oder 72 Stunden Kultivierung und das Wachstum nach 72 Stunden (OD562) sind in der Tabelle 1 gezeigt. In der Tabelle stellt lysC* mutiertes lysC dar.
  • Das Wachstum wurde quantitativ durch das Messen der OD bei 560 nm nach 101facher Verdünnung bestimmt. Tabelle 1 Anhäufung von L-Lysin nach der Kultivierung für 40 oder 72 Stunden
    Bakterienstamm/Plasmid Eingeschleustes Gen Menge hergestellten L-Lysin (g/l) Wachstum (OD562/101)
    nach 40 h nach 72 h
    AJ11082 22,0 29,8 0,450
    AJ11082/pLYSAB lysA 19,8 32,5 0,356
    AJ11082/pKD4D ddh 19,0 33,4 0,330
    AJ11082/p399AK9B lysC* 16,8 34,5 0,398
    AJ11082/pDPSB dapA 18,7 33,8 0,410
    AJ11082/pDPRB dapB 19,9 29,9 0,445
    AJ11082/pCRCAB lysC*, dapA 19,7 36,5 0,360
    AJ11082/pAB dapA, dapB 19,0 34,8 0,390
    AJ11082/pDL lysA, ddh 23,3 31,6 0,440
    AJ11082/pCB lysC*, dapB 23,3 35,0 0,440
    AJ11082/pCAB lysC*, dapA, dapB 23,0 45,0 0,425
    AJ11082/pCABL lysC*, dapA, dapB, lysA 26,2 46,5 0,379
    AJ11082/pCABDL lysC*, dapA, dapB, lysA, ddh 26,5 47,0 0,409
  • Wie oben gezeigt wird, war die Menge an hergestelltem L-Lysin nach 72 Stunden Kultivierung größer als oder gleich dem durch den Parentalstamm hergestellten, wenn lysA, ddh, mutiertes lysC, dapA oder dapB einzeln verstärkt wurden, jedoch war die Menge an hergestelltem L-Lysin nach 40 Stunden Kultivierung geringer als die durch den Parentalstamm hergestellt. Das heißt, dass die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit bei einer Kultivierung für eine geringere Dauer abgesenkt war. Gleichermaßen war die Menge an produziertem L-Lysin nach 72 Stunden Kultivierung größer als die, durch den Parentalstamm hergestellte, wenn mutiertes lysC und dapA, oder dapA und dapB in Kombination verstärkt wurden, jedoch war die Menge an produziertem L-Lysin nach 40 Stunden Kultivierung geringer als die, die vom Parentalstamm hergestellt wurde. Das bedeutet, dass die L-Lysinproduktionsgeschwindigkeit gesenkt war.
  • Wenn andererseits nur lysA und ddh in Kombination verstärkt wurden, war das Wachstum verbessert, die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit wurde bei der kurzen Kultivierungsdauer erfolgreich wieder hergestellt, und die angehäufte L-Lysinmenge war bei der Kultivierung über einen langen Zeitraum ebenfalls verbessert.
  • Auch in dem Fall, dass ein Stamm, bei dem dapB zusammen mit mutiertem lysC verstärkt wurde, und im Fall, dass der Stamm in dem dapA wie auch diese Gene gleichzeitig verstärkt waren, war das Wachstum und die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit verbessert bzw. verstärkt, verglichen mit dem Parentalstamm. Im Fall eines Stammes, bei dem diese drei Gene gleichzeitig verstärkt wurden, wurden sowohl die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit und die Menge akumulierten L-Lysins durch das weitere Verstärken von lysA und ddh weiter verbessert.
  • SEQUENZLISTE
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Claims (7)

  1. Coryneformes Bakterium, das eine DNA-Sequenz hat, die eine Aspartatkinase kodiert, in der die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin und L-Threonin desensibilisiert ist, und in dem die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten von Dihydrodipicolinatreduktase, Dihydrodipicolinatsynthase, Diaminopimelatdecarboxylase und Diaminopimelatdehydrogenase durch Erhöhen der Kopienanzahl der DNA-Sequenzen, die die Enzyme kodieren, gesteigert sind.
  2. Coryneformes Bakterium gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Dihydrodipicolinatreduktase kodiert, die Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO: 24 der Sequenzliste gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die in SEQ ID NO: 24 gezeigte Aminosäuresequenz.
  3. Coryneformes Bakterium gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Dihydrodipicolinatsynthase kodiert, die Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO: 20 der Sequenzliste gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die in SEQ ID NO: 20 gezeigte Aminosäuresequenz.
  4. Coryneformes Bakterium gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Aspartatkinase kodiert, als eine Mutante bereitgestellt wird, in der ein 279ster Alanin-Rest in SEQ ID NO: 14 in einen Aminosäurerest außer ein Alanin und außer eine saure Aminosäure geändert ist, und ein 30ster Alanin-Rest in SEQ ID NO: 16 in einen Aminosäurerest außer ein Alanin und außer eine saure Aminosäure geändert ist.
  5. Coryneformes Bakterium gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Diaminopimelatdecarboxylase kodiert, die Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO: 5 der Sequenzliste gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Aminosäuresequenz.
  6. Coryneformes Bakterium gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Diaminopimelatdehydrogenase kodiert, die Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO: 9 der Sequenzliste gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die in SEQ ID NO: 9 gezeigte Aminosäuresequenz.
  7. Verfahren zum Herstellen von L-Lysin, umfassend die Schritte des Kultivierens des coryneformen Bakteriums, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 definiert ist, in einem Medium, um zu ermöglichen, dass L-Lysin in einer Kultur hergestellt und akkumuliert wird, und des Gewinnens von L-Lysin aus der Kultur.
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