JPH10215883A - Ｌ−リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コリネ型細菌のＬ−リジン生産能及び生育速
度を改善する。 【解決手段】 Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフ
ィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナ
ーゼを保持し、さらにジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼをコードするＤＮＡ配列、ジヒドロジピコリン酸シン
ターゼをコードするＤＮＡ配列、ジアミノピメリン酸デ
カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、及びアスパ
ラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
配列をコードするＤＮＡ配列が増強されたコリネ型細菌
を、好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生
産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アミノ酸などの発
酵生産に用いられているコリネ型細菌に遺伝子操作の手
法を用いて改変を加え、該微生物を培養することによる
Ｌ−リジンの製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】飼料添加物として用いられているＬ−リ
ジンは通常、コリネ型細菌のＬ−リジン生産変異株を使
って発酵法により生産されている。現在知られている種
々のＬ−リジン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変
異により作られている。

【０００３】一方、コリネ型細菌において、菌体内で自
律増殖可能でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベ
クタープラスミド（米国特許第4514502号参照）、遺伝
子の菌体への導入方法（特開平2-207791号等）が開示さ
れており、これらの技術を用いたＬ−スレオニンまたは
Ｌ−イソロイシン生産菌育成の可能性が開示されている
（米国特許第4452890号、及び米国特許第4442208号参
照）。また、Ｌ−リジン生産菌育成に関しても、ベクタ
ープラスミドにＬ−リジン生合成に関与する遺伝子を組
み込み、菌体内で増幅させる技術（特開昭56-160997号
などがある）が知られている。

【０００４】Ｌ−リジン生合成遺伝子としては、例え
ば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（特開平
7-75578）やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
遺伝子（特公平6-102028）のように、Ｌ−リジン生合成
に関与する遺伝子をクローニングした例や、ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-877
88）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（特公平
6-55149）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子（特開昭60-62994）遺伝子の増幅がＬ−リジン生産
性に影響を与える例が知られている。

【０００５】また、Ｌ−リジン生合成に関与する酵素の
うち、野生型ではフィードバック阻害を受ける酵素につ
いて、フィードバック阻害が解除された変異を有する酵
素遺伝子を導入してＬ−リジン生産性を向上させた例も
知られている。このような遺伝子として具体的には、ア
スパルトキナーゼ遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレ
ット）等が知られている。

【０００６】上記のように、Ｌ−リジン生合成遺伝子の
増幅、あるいは変異遺伝子の導入によって、一定の成果
が得られている。例えば、リジン及びスレオニンによる
協奏阻害が解除された変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
を保持するコリネ型細菌は、Ｌ−リジンを著量（約２５
ｇ／Ｌ）生産する。但し、該細菌は、変異型アスパルト
キナーゼ遺伝子を保持しない細菌と比較して生育速度が
低下する。また、変異型アスパルトキナーゼ遺伝子に加
え、さらにジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導
入することによってＬ−リジン生産性が向上するとの報
告（Applied and Environmental Microbiology 57(6),
1746-1752 (1991)）もある。但し、概細菌は、生育速度
が一層低下する。

【０００７】一方、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
遺伝子については、これを導入したコリネ型細菌のジヒ
ドロジピコリン酸レダクターゼ活性が上昇したことは示
されているが、Ｌ−リジン生産性への影響については報
告されていない（特開平7-75578）。

【０００８】また、コリネ型細菌においては、Ｌ−リジ
ン生合成遺伝子を複数個組み合わせ、Ｌ−リジン収率の
大幅な改善に成功した例は知られていないのが現状であ
る。また、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増強により生育の
改善が図られた例も報告されていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、コリ
ネ型細菌の細胞中のＬ−リジン生合成の重要な酵素であ
るアスパルトキナーゼ（以下「ＡＫ」ともいう。ＡＫタ
ンパク質をコードする遺伝子を以下「lysC」ともい
う。）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（以下「Ｄ
ＤＰＲ」ともいう。ＤＤＰＲタンパク質をコードする遺
伝子を以下「dapB」ともいう。）、ジヒドロジピコリン
酸シンターゼ（以下「ＤＤＰＳ」と略す。ＤＤＰＳタン
パク質をコードする遺伝子を以下「dapA」ともい
う。）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（以下
「ＤＤＣ」ともいう。ＤＤＣタンパク質をコードする遺
伝子を以下「lysA」ともいう。）、及びアスパラギン酸
アミノトランスフェラーゼ（以下、「ＡＡＴ」ともい
う。ＡＡＴタンパク質をコードする遺伝子を以下「asp
C」ともいう。）の各々をコードするＤＮＡ配列を遺伝
子材料に用い、コリネ型細菌のＬ−リジン生産能を改善
しようというものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、コリネ
型細菌において、リジン及びスレオニンによる協奏阻害
が解除された変異型ＡＫ（以下、単に「変異型ＡＫ」と
もいう。）をコードする変異型lysC（以下、単に「変異
型lysC」ともいう。）、dapA 、dapB、lysA、aspCを組
み合わせて増強することにより、Ｌ−リジン生産能を向
上できることにある。

【００１１】すなわち本発明は、Ｌ−リジン及びＬ−ス
レオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除され
たアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、ジヒド
ロジピコリン酸レダクターゼをコードするＤＮＡ配列、
ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするＤＮＡ配
列、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードす
るＤＮＡ配列、及びアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、コリネ型細菌細
胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡを提供する。

【００１２】また、本発明は、Ｌ−リジン及びＬ−スレ
オニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された
アスパルトキナーゼを保持し、さらにジヒドロジピコリ
ン酸レダクターゼをコードするＤＮＡ配列、ジヒドロジ
ピコリン酸シンターゼをコードするＤＮＡ配列、ジアミ
ノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配
列、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコ
ードするＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列が増強され
たコリネ型細菌を提供する。

【００１３】さらに本発明は、上記のいずれかのコリネ
型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジン
を生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取する
ことを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供するもので
ある。

【００１４】さらにまた、本発明は、配列番号３１に示
すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を提供するものである。このＤＮＡとして具体的には、
配列番号３０に示す塩基配列のうち、少なくとも塩基番
号８７９〜２１７４からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙
げられる。

【００１５】また、本発明は、エシェリヒア・コリ及び
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で
自律複製可能であり、かつ、マルチプルクローニングサ
イトとlacZ’とを保持するベクターpVK7を提供するもの
である。

【００１６】尚、本発明においてコリネ型細菌とは、バ
ージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バ
クテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative B
acteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一
群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞
子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテリウム属
細菌、及び従来ブレビバクテリウム属に分類されていた
が現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレ
ビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細
菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。

【００１７】

【発明の実施の形態】

＜１＞本発明に用いられるＬ−リジン生合成遺伝子の取
得 本発明に用いるＬ−リジン生合成遺伝子は、ＤＮＡ供与
体である細菌から染色体ＤＮＡを調製し、プラスミドベ
クター等を用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、
このライブラリーから所望の遺伝子を保持する株を選択
し、選択された株からその遺伝子が挿入された組換えＤ
ＮＡを回収することによって得られる。本発明に用いる
Ｌ−リジン生合成遺伝子のＤＮＡ供与体としては、所望
のＬ−リジン生合成遺伝子がコリネ型細菌細胞中で機能
する酵素タンパク質を発現するものであれば、特に制限
されないが、コリネ型細菌が好ましい。

【００１８】コリネ型細菌由来のlysC、dapA、dapB及び
lysAの遺伝子は、いずれも配列が知られているので、ポ
リメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymera
se chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Gene
t. 5,185(1989)参照）によって増幅することにより取得
することができる。

【００１９】以下に、本発明に用いる各Ｌ−リジン生合
成遺伝子を取得する方法を例示する。

【００２０】（１）変異型lysCの取得 変異型lysCを含むＤＮＡ断片は、ＡＫ活性に対するＬ−
リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバッ
ク阻害が実質的に解除された変異株から調製することが
できる（WO94/25605国際公開パンフレット）。このよう
な変異株は、例えば、コリネ型細菌野生株に、通常の変
異処理法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異剤処理を
施し、変異処理した細胞群の中から取得することができ
る。ＡＫ活性の測定は、Miyajima,R et al;The Journal
of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方
法を用いることができる。このような変異株として、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacte
rium lactofermentum）野生株ATCC13869株（現在の名称
は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteri
um glutamicum)に変更されている）より変異処理により
誘導されたＬ−リジン生産菌AJ3445（FERM P-1944）が
最も好ましいものとして挙げられる。

【００２１】また、変異型lysCは、野生型lysCを含むプ
ラスミドＤＮＡをインビトロ変異処理することによって
も得られる。さらに、ＡＫのＬ−リジン及びＬ−スレオ
ニンによる相乗的なフィードバック阻害を解除する変異
が具体的に知られている（WO94/25605国際公開パンフレ
ット）ので、この情報に基づいて部位特異的変異法等に
より、野生型lysCから調製することもできる。

【００２２】コリネ型細菌からlysCを単離するには、例
えば、斎藤、三浦の方法（H.Saitoand K.Miura Bioche
m.Biophys.Acta, 72,619,(1963)）等により染色体ＤＮ
Ａを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（Ｐ
ＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al
;Trends Genet. 5,185(1989)参照）により、lysCを増
幅することによって行うことができる。

【００２３】ＤＮＡプライマーとしては、例えば、コリ
ネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となってい
る配列（Molecular Microbiology(1991),5(5),1197-120
4, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にし
て、lysCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配
列表配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有する
23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの
合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380
Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron
Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成でき
る。PCR反応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラー
PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者
により 指定された方法に従って行うことができる。

【００２４】ＰＣＲ法により増幅されたlysCは、E. col
i及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、
これをE. coli細胞に導入しておくと、後の操作がしや
すくなる。E. coli細胞内において自律複製可能なベク
ターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の
細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えば pUC1
9、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF10
10等が挙げられる。

【００２５】また、これらのベクターにコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断
片を挿入すると、E. coli及びコリネ型細菌の両方で自
律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用する
ことができる。

【００２６】このようなシャトルベクターとしては、以
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に示
した。

【００２７】

【００２８】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。

【００２９】E. coliにプラスミドを導入して形質転換
するには D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymolog
y, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウ
ムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. an
d Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行う
ことができる。

【００３０】上記のようにしてＡＫ野生株からlysCを単
離すれば野生型lysCが得られ、ＡＫ変異株からlysCを単
離すれば変異型lysCが得られる。野生型lysCを含むＤＮ
Ａ断片の塩基配列の一例を、配列表配列番号３に示す。
この塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のα
サブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列
表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示
す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタ
ンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同
時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配列のみを配列番
号７に示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧ
ＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニン
と表記しているが、これは、メチオニン、バリン、また
はフォルミルメチオニンを表すものである。

【００３１】本発明に用いる変異型lysCとしては、Ｌ−
リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバッ
ク阻害が解除されたＡＫをコードするものであれば特に
制限されないが、野生型ＡＫのアミノ酸配列において、
αサブユニットではＮ末端から２７９番目のアラニン残
基に相当するアミノ酸残基がアラニン以外かつ酸性アミ
ノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニットではＮ末端
から３０番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が
アラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変
化する変異が挙げられる。ここで、野生型ＡＫのアミノ
酸配列としては、具体的にはαサブユニットでは配列表
配列番号５に示すアミノ酸配列が、βサブユニットでは
配列表配列番号７に示すアミノ酸配列が挙げられる。

【００３２】また、上記のアラニン以外かつ酸性アミノ
酸以外のアミノ酸残基として好ましいものは、スレオニ
ン残基、アルギニン残基、システイン残基、フェニルア
ラニン残基、プロリン残基、セリン残基、チロシン残基
及びバリン残基が挙げられる。尚、置換されるアミノ酸
残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードす
るものであれば種類は特に問わない。

【００３３】また、菌種や菌株の違いにより保持する野
生型ＡＫのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある
と予想される。このような酵素の活性に関与しない１又
は２以上の位置での１又は２以上のアミノ酸残基の置
換、欠失あるいは挿入等による変異を有するＡＫも本発
明に使用することができる。このような自然変異を有す
るＡＫをコードするＤＮＡは、ＡＫを保持する微生物細
胞から、例えば配列表の配列番号３に記載の塩基配列の
少なくとも一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするＤＮＡを単離することによっ
て、取得され得る。ここでいう「ストリンジェントな条
件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、
非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。こ
の条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を
示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の
相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それよ
り相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条
件、あるいは温度が完全にマッチしたハイブリッドのＴ
ｍ〜（Ｔｍ−３０）℃、好ましくはＴｍ〜（Ｔｍ−２
０）℃の範囲で、かつ１×ＳＳＣ、好ましくは０．１×
ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙
げられる。

【００３４】さらに、ＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ
−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除
に実質的に影響のない限り、他の１又は２以上のアミノ
酸の置換、欠失あるいは挿入等による人工変異を有する
ＡＫも使用できる。このような人工変異を有するＡＫを
コードするlysCは、例えば部位特異的変異法によって、
特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、あるいは挿入され
るように塩基配列を改変することによって得られる。ま
た、このような変異を有するlysCは、従来知られている
突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理と
しては、lysCを含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でイ
ンビトロ処理する方法、及びlysCを含むＤＮＡを保持す
る微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ
−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通
常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理す
る方法が挙げられる。変異処理した後、変異処理された
ＤＮＡ又は変異処理された微生物から、これらがコード
し又は産生するＡＫがＡＫ活性を保持し、かつ、ＡＫの
アミノ酸配列が変異したものを選択することによって、
変異を導入することができる位置、又は変異が生じた位
置を決定することができる。導入される変異の位置は、
ＡＫ活性及びフィードバック阻害の解除に実質的に影響
のない限り、特に制限されない。また、導入される変異
の数は、タンパク質の立体構造における変異されるアミ
ノ酸の位置や種類によっても異なり、ＡＫ活性及びフィ
ードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、特に
制限されないが、通常、１〜２０個、好ましくは１〜１
０個である。

【００３５】上記のような変異を有するＡＫのアミノ酸
配列における上記特定のアラニン残基に相当するアミノ
酸残基は、当業者であれば容易に特定できる。

【００３６】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム野生型株であるAJ12036株（FERMBP-734）に変異型lys
Cプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２
年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目
１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託され、１
９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、FERMBP-4999の受託番号で寄託されてい
る。

【００３７】（２）dapBの取得 dapBを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCR
により調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特
に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムATCC13869株が挙げられる。

【００３８】ＤＤＰＲをコードするＤＮＡ配列は、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいて既知で
あり（Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1
993)）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製する
ことができる。このようなDNAプライマーとして具体的
には、配列表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有
する各々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、P
CR反応、得られたdapBを含むプラスミドの調製等は、前
記のlysCの場合と同様にして行うことができる。

【００３９】dapBを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの
配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１０に示
す。また、アミノ酸配列のみを配列番号１１に示す。本
発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の
他、配列番号１１に示すアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列、すなわちＤＤＰＲ活性に実質的に影響が
ない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるい
は挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ断片も同様に使用できる。このような自然変異又
は人工変異を有するdapBは、前記のＡＫ活性、及びＬ−
リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバッ
ク阻害の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫを
コードするＤＮＡと同様にして取得することができる。

【００４０】E. coliJM109株に後記実施例で得られたda
pBを含むプラスミドpCRDAPBを導入して得られた形質転
換株AJ13107株は、１９９５年５月２６日より通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号F
ERM BP-5114の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国
際寄託されている。

【００４１】（３）dapAの取得 dapAを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCR
により調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特
に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムATCC13869株が挙げられる。

【００４２】ＤＤＰＳをコードするＤＮＡ配列は、コリ
ネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知であり（Nu
cleic Acids Research 18(21), 6421 (1990)、EMBL acc
ession No.X53993参照）、これを基にしてPCR用DNAプラ
イマーを調製することができる。このようなDNAプライ
マーとして具体的には、配列表の配列番号１２及び１３
に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げら
れる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたdapAを含むプ
ラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行
うことができる。

【００４３】dapAを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの
配列から予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号１４
に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号１５に示
す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
断片の他、配列番号１５に示すアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＰＳ活性に実質的に
影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠
失、挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ断片も同様に使用できる。このような自然変異
又は人工変異を有するdapAは、前記のＡＫ活性、及びＬ
−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバ
ック阻害の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫ
をコードするＤＮＡと同様にして取得することができ
る。

【００４４】E. coliJM109株に後記実施例で得られたda
pAを含むプラスミドpCRDAPAを導入して得られた形質転
換株AJ13106株は、１９９５年５月２６日より通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号F
ERM BP-5113の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国
際寄託されている。

【００４５】（４）lysAの取得 lysAを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCR
により調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特
に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムATCC13869株が挙げられる。

【００４６】コリネ型細菌においては、lysAはargS（ア
ルギニル−tRNAシンターゼ遺伝子）とともにオペロンを
形成しており、argSの下流にlysAが存在している。lysA
の発現は、argSの上流にあるプロモーターによって調節
を受ける（Journal of Bacteriology Nov., 7356-7362
(1993)参照）。これらの遺伝子の塩基配列は、コリネバ
クテリウム・グルタミカムにおいて既知であり（Molecu
lar Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecula
r and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）、
これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することがで
きる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配
列表の配列番号１６（Molecular Microbiology 4(11),
1819-1830 (1990)に記載されている塩基配列において塩
基番号１１〜３３に相当する）及び配列番号１７（Mole
cular and General Genetics 212, 112-119 (1988)に記
載の塩基配列において塩基番号１３７０〜１３９２に相
当する）に示す塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが
挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたlysAを
含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様に
して行うことができる。

【００４７】後記実施例では、lysAを増強するために、
プロモーター、argS及びlysAを含むＤＮＡ断片を用いた
が、argSは本発明に必須ではなく、lysAがプロモーター
の直下に連結されたＤＮＡ断片を用いてもよい。

【００４８】argS及びlysAを含むＤＮＡ断片の塩基配列
及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列の
一例を配列番号１８に示す。また、argSがコードするア
ミノ酸配列の一例を配列番号１９に、lysAがコードする
アミノ酸配列の一例を配列番号２０に示す。本発明に
は、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配
列番号２０に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列、すなわちＤＤＣ活性に実質的に影響がない限
り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入
等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
断片も同様に使用できる。このような自然変異又は人工
変異を有するlysAは、前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン
及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害
の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫをコード
するＤＮＡと同様にして取得することができる。

【００４９】（５）aspCの取得 aspCを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌、エシェリヒア
属細菌等の微生物の染色体から調製された遺伝子ライブ
ラリーより、ＡＡＴ欠損株の栄養要求性を相補すること
を指標として調製することができる。コリネ型細菌のＤ
ＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられ
る。また、エシェリヒア属細菌のＤＮＡ供与菌としては
特に制限されないが、E. coli JM109株が挙げられる。

【００５０】具体的には、コリネ型細菌のaspCを取得す
る方法はすでに既知であり（特公平6-102028参照）、こ
の方法に従って取得することができる。

【００５１】また、ＡＡＴをコードするＤＮＡ配列は、
E. coliにおいて既知であり（Kuramitsu,S. et al;J.Bi
ochem. 97 (4),1259-1262(1985)参照）、これを基にし
てPCR用DNAプライマーを調製することができる。このよ
うなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番
号２１及び２２に記載の塩基配列を有する各々20merの
ＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られ
たaspCを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合
と同様にして行うことができる。

【００５２】aspCを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの
配列から予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号２３
に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２４に示
す。また、aspCを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配
列から予想されるアミノ酸配列の別の例を配列番号３０
に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号３１に示
す。本発明には、これらのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ断片の他、配列番号２４または３１に示すアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＡＡＴ活
性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸
の置換、欠失、挿入等による変異を有するアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。このよう
な自然変異又は人工変異を有するaspCは、前記のＡＫ活
性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的な
フィードバック阻害の解除に実質的に影響のない変異を
有するＡＫをコードするＤＮＡと同様にして取得するこ
とができる。

【００５３】配列番号３０に示す塩基配列を有するaspC
は、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム由来の
ものであって、後記実施例９に記載の方法により、本発
明によって初めて得られたものである。従って、本発明
は、配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡとして具
体的には、配列番号３０に示す塩基配列のうち、少なく
とも塩基番号８７９〜２１７４からなる塩基配列を含む
ＤＮＡが挙げられる。

【００５４】＜２＞本発明の組換えＤＮＡ及びコリネ型
細菌 本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニ
ンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアス
パルトキナーゼ（変異型ＡＫ）を保持し、さらにジヒド
ロジピコリン酸レダクターゼをコードするＤＮＡ配列、
ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするＤＮＡ配
列、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードす
るＤＮＡ配列、及びアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼをコードするＤＮＡ配列が増強されたコリネ型細
菌である。

【００５５】ここでＤＮＡを「増強する」とは、遺伝子
のコピー数を高くする、プロモーターを強力なものを使
用する、比活性の高い酵素をコードする遺伝子を使用す
る、あるいはこれらを組み合わせるなどして、そのＤＮ
Ａによりコードされる酵素の細胞中の活性を高くするこ
とをいう。

【００５６】変異型ＡＫを保持するコリネ型細菌として
は、突然変異によって変異型アスパルトキナーゼを産生
するようになったものでもよく、また、変異型lysCを導
入することによって形質転換されたものでもよい。

【００５７】上記ＤＮＡを導入するコリネ型細菌の例と
しては、例えば次のようなＬ−リジン生産性野生株が挙
げられる。

【００５８】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14020 （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869 （コリネバクテリウム・リリウム） ATCC15990 （ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14067 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)

【００５９】また、上記菌株以外にも、これらの菌株か
ら誘導されたＬ−リジン生産能を有する変異株等も、宿
主として利用できる。この様な人工変異株としては次の
様なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイ
ン（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（N
RRL B-11470）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、
特公昭57-14157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474
号、特公昭58-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35
840号、特公昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5
-11958号、特公平7-112437号、特公平7-112438号参
照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要と
する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、A
ECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラ
ニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国
特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ
−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタ
ム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイ
ド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生
産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラー
ゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生
産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開
昭52-102498号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、
特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995
号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1
833号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジ
ン生産変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、
フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受
性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特
開昭53-86090号）、エチレングリコールに耐性を示し、
Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリ
ネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997
号）。

【００６０】上記のような宿主においてＬ−リジン生合
成遺伝子を増強するには、具体的な例としては、これら
の遺伝子をプラスミドベクター、トランスポゾン、ファ
ージベクター等を用いて宿主に導入する。その際、低コ
ピー型のベクターを用いてもある程度の増強は期待でき
るが、マルチコピー型のベクターを用いることが好まし
い。そのようなベクターとして、上記pAJ655、pAJ184
4、pAJ611、pAJ3148及びpAJ440等のプラスミドベクター
が挙げられる。また、コリネ型細菌由来のトランスポゾ
ンは、WO02/02627国際公開パンフレット、WO93/18151国
際公開パンフレット、欧州特許公開0445385号、特開平6
-46867号、Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 1
1, 739-746 (1994)、Bonamy, C., et al., Mol. Microb
iol., 14,571-581 (1994)、Vertes, A. A. et al., Mo
l. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)、Jagar, W. et
al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995)、
特開平7-107976号、特開平7-327680号等に記載されてい
る。

【００６１】尚、本発明において、変異型lysCは必ずし
も増強されている必要はなく、前記したように染色体Ｄ
ＮＡ上のlysCに変異を有するもの、あるいは変異型lysC
が染色体ＤＮＡに組み込まれたものでもよいが、プラス
ミドベクターを用いて導入されても差し支えない。一
方、dapA、dapB、lysA及びaspCは、効率よくＬ−リジン
を生産させるためには増強されていることが好ましい。

【００６２】lysC、dapA、dapB、lysA及びaspCの各遺伝
子の導入は、それぞれ別個のベクターを用いて宿主に順
次導入してもよく、単一のベクターを用いて２種類、３
種類４種類、又は５種類の遺伝子を共に導入してもよ
い。別個のベクターを用いる場合には、遺伝子の導入の
順序は問わないが、宿主での安定な分配保持機構を有
し、互いに共存可能なベクターを用いることが好まし
い。

【００６３】特に、aspCをコリネ型細菌に導入するため
のベクターとしては、ベクターpVK7を用いることが好ま
しい。ベクターpVK7は、本発明により提供されるコリネ
型細菌用クローニングベクターであって、E. coli及び
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で
自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマルチプル
クローニングサイトとlacZ’を保持している。ベクター
pVK7は、後記実施例８に記載の方法で構築できる。

【００６４】変異型ＡＫを保持し、さらにdapB、dapA、
lysA及びaspCが増強されたコリネ型細菌は、例えば、変
異型lysC、及びdapB、dapA、lysA及びaspCを含み、コリ
ネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡを宿主コ
リネ型細菌に導入することによって、得られる。

【００６５】上記のような組換えＤＮＡは、例えば、プ
ラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクター
等のベクターに、Ｌ−リジン生合成遺伝子の各々を挿入
することによって得られる。

【００６６】宿主への組換えＤＮＡの導入の方法は、プ
ラスミドの場合、電気パルス法（杉本ら、特開平2-2077
91号公報）によって行うことができる。トランスポゾン
を用いた遺伝子の増幅は、プラスミドにトランスポゾン
を搭載させて細胞内に導入し、トランスポゾンの転位を
誘導することにより行なうことができる。

【００６７】本発明のコリネ型細菌は、上記の各遺伝子
の他、Ｌ−リジン生合成に関与する他の遺伝子、例え
ば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコー
ドするＤＮＡ配列、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼをコードするＤＮＡ配列等が増強されてもよい。

【００６８】＜３＞Ｌ−リジンの製造法 上記のようにしてＬ−リジン生合成遺伝子が増強された
コリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−
リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採
取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造すること
ができる。

【００６９】使用する培地としては、炭素源、窒素源、
無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する
通常の培地が挙げられる。炭素源としては、グルコー
ス、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加
水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸
等の有機酸類を用いることができる。

【００７０】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００７１】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適
量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応
じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マ
ンガンイオン等が少量添加される。

【００７２】培養は好気的条件下で30〜90時間実施する
のがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは
５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無
機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にア
ンモニアガス等を使用することができる。培養物からの
Ｌ−リジンの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法そ
の他の公知の方法を組み合わせることにより実施でき
る。

【００７３】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【００７４】

【実施例１】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム野生型lysC及び変異型lysCの取得 ＜１＞野生型及び変異型lysCの取得、及びそれらを含有
するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
株、及びATCC13869株より変異処理により得られたＬ−
リジン生産性変異株AJ3445（FERM P-1944）を染色体Ｄ
ＮＡの供与体として用いた。AJ3445株は、変異によりly
sCがリジン及びスレオニンによる協奏阻害が実質的に解
除されている（Journal of Biochemistry68, 701-710
(1970)）。

【００７５】染色体DNAよりPCR法（polymerase chain r
eaction；White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(198
9)参照）によりlysCを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅
に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタ
ミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Micr
obiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)
224,317-324参照）を基にしてlysCをコードする約1643b
pの領域を増幅すべく、配列番号１及び配列番号２に示
す塩基配列を有する23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡを合
成した。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ
合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用
いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法
に従って合成した。

【００７６】PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマ
ルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを
用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅
を行なった。増幅された1643kbの遺伝子断片をアガロー
スゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した
該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造
（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断し
た。

【００７７】遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpH
SG399（Takeshita, S et al;Gene(1987),61,63-74参
照）を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）
製）及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅されたlysC断
片と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行
なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム染色体より増幅されたlysC断片が
接続されたプラスミドを作製した。野生株であるATCC13
869株由来のlysCを有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リ
ジン生産菌であるAJ3463由来のlysCを有するプラスミド
をp399AK9と命名した。

【００７８】p399AKYおよびp399AK9に、それぞれコリネ
バクテリウム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にす
る能力をもつＤＮＡ断片（以下「Brevi.-ori」と記す）
を導入し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能
なlysCを搭載したプラスミドを作製した。Brevi.-ori
は、これを含み、エシェリヒア・コリと、コリネバクテ
リウム属細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミ
ドベクターpHK4から調製した。pHK4は、pHC4をKpnI（宝
酒造（株）製）及びBamHI（宝酒造（株）製）で切断
し、Brevi.-ori断片を抽出し、同じくKpnI及びBamHIに
て切断したpHSG298に接続することによって構築される
（特開平5-7491号公報参照）。pHK4は、宿主にカナマイ
シン耐性を付与する。尚、pHK4を保持するエシェリヒア
・コリHB101は、エシェリヒア・コリ AJ13136と命名さ
れ、１９９５年８月１日に、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つ
くば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5186とし
て寄託されている。

【００７９】pHK4を、制限酵素KpnI及びBamHIにて切断
し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunti
ng kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて
行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー
（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分
のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される
様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生
じたBrevi.-ori ＤＮＡ断片を同じくBamHIにて切断した
p399AKY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウム属細菌
中で自律複製可能でかつlysCを含むプラスミドを作製し
た。

【００８０】p399AKY由来の野生型lysCを含むプラスミ
ドをp399AKYBと命名し、p399AK9由来の変異型lysCを含
むプラスミドをp399AK9Bと命名した。p399AK9B、p399AK
YB構築の過程を図１に示す。ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム野生株であるAJ12036株（FERM BP-73
4）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ126
91は、１９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県
つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-12918と
して寄託され、１９９５年２月１０日にブダペスト条約
に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号
で寄託されている。

【００８１】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの野生型lysC及び変異型lysCの塩基配列の決定 野生型lysCを含むプラスミドp399AKY及び変異型lysCを
含むプラ スミドp399AK9を各々の形質転換体から調製
し、野生型及び変異型lysCの塩基配列の決定を行なっ
た。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et
al :Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）に
よった。

【００８２】p399AKYにコードされている野生型lysCの
塩基配列を配列表の配列番号３に示す。一方、p399AK9
にコードされている変異型lysCの塩基配列は野生型lysC
と比べ、配列番号３において１０５１番目のＧがＡに変
化しているという１塩基の変異のみを有していた。コリ
ネバクテリウム・グルタミカムのlysCは、同一のＤＮＡ
鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディング
フレームでコードされていることが知られているが（Ka
linowski,J et al;Molecular Microbiology(1991)5(5),
1197-1204参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一
のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリー
ディングフレームでコードされていると考えられる。

【００８３】ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫ
タンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配
列と同時に配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを
配列番号５に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定され
る野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配
列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配
列のみを配列番号７に示す。尚、各サブユニットとも、
開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ
酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニ
ン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すもので
ある。

【００８４】一方、変異型lysC配列上の変異は、野生型
ＡＫタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５、７）にお
いて、αサブユニットでは２７９番目のアラニン残基が
スレオニン残基に、βサブユニットでは３０番目のアラ
ニン残基がスレオニン残基にというアミノ酸残基置換を
起こしていることを意味する。

【００８５】

【実施例２】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムdapBの取得 ＜１＞dapBの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC138
69株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRによりdapBを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅
に用いたDNAプライマーはブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムにおいて既知となっている配列（Journa
l of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)参照）を
基にしてＤＤＰＲをコードする約2.0kbの領域を増幅す
べく、配列表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有
する各々23merのＤＮＡ断片を合成した。ＤＮＡの合成
及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅さ
れた２００１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用ベクター
にはpCR-Script（Invitrogen社製）を用い、増幅したda
pB断片と接続した。この様にしてpCR-Scriptにブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅され
たdapB断片２００１ｂｐの接続されたプラスミドを作製
した。この様にして取得したATCC13869由来のdapBを有
するプラスミドをpCRDAPBと命名した。E. coliJM109株
にpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107株は、
１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つく
ば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114の受託
番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。

【００８６】更に、pCRDAPBをEcoRVとSphIで切断する事
により、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片を
抽出した。この断片を、pHSG399をHincIIおよびSphIに
て切断したものと連結したプラスミドを作成した。この
作成したプラスミドをp399DPRと命名した。

【００８７】作製したp399DPRにBrevi.-oriを導入し、
コリネ型細菌中で自律複製可能なdapBを搭載したプラス
ミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）
製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化
はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定さ
れた方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBa
mHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBre
vi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって
切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIによ
り切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくBamHIにて
切断したp399DPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖
可能でかつdapBを含むプラスミドを作製した。作製した
プラスミドをpDPRBと命名した。pDPRB構築の過程を図２
に示す。

【００８８】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムdapBの塩基配列の決定 p399DPRを保持するAJ13107株からプラスミドDNAを調製
し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なった。
決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸
配列を配列番号１０に示す。また、アミノ酸配列のみを
配列番号１１に示す。

【００８９】

【実施例３】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムdapAの取得 ＜１＞dapAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC138
69株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRによりdapAを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅
に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタ
ミカムにおいて既知となっている配列（Nucleic Acids
Research 18(21), 6421 (1990)、EMBL accession No.X5
3993参照）を基にしてＤＤＰＳをコードする約1.5kbの
領域を増幅すべく、配列表の配列番号１２及び１３に記
載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡを合成した。
ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行
った。増幅された１４１１ｂｐの遺伝子断片のクローン
化用のベクターにはpCR1000（Invitrogen社製；Bio/Tec
hnology 9, 657-663 (1991)参照）を用い、増幅したdap
A断片と接続した。DNAの接続はDNAライゲーションキッ
ト（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行な
った。この様にしてpCR1000にブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム染色体より増幅されたdapA断片１４
１１ｂｐの接続されたプラスミドを作製した。この様に
して取得したATCC13869由来のdapAを有するプラスミド
をpCRDAPAと命名した。

【００９０】E. coliJM109株にpCRDAPAを導入して得ら
れた形質転換株AJ13106株は、１９９５年５月２６日よ
り通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便
番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）
に受託番号FERM BP-5113の受託番号で、ブダペスト条約
に基づき国際寄託されている。

【００９１】作製したpCRDAPAにBrevi.-oriを導入し、
コリネ型細菌中で自律複製可能なdapAを搭載したプラス
ミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHI（宝酒
造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平
滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用
い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン
酸化済みSmaIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pH
K4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をSmaIのみによる切断
によって切り出される様改変した。このプラスミドをSm
aIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくSma
Iにて切断したpCRDAPAに接続し、コリネ型細菌中で自律
増殖可能でかつdapAを含むプラスミドを作製した。この
プラスミドをpDPSBと命名した。pDPSB（Km^r）の構築過
程を図３に示す。

【００９２】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムdapAの塩基配列の決定 pCRDAPAを保持するAJ13106株からプラスミドDNAを調製
し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なった。
決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸
配列を配列番号１４に示す。また、アミノ酸配列のみを
配列番号１５に示す。

【００９３】

【実施例４】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムlysAの取得 ＜１＞lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC138
69株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロン
のプロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用
いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グ
ルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular
Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular an
d General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）を基に
してアルギニル−tRNAシンターゼ及びＤＤＣをコードす
る約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号１６
及び１７に記載の塩基配列を有する各々23merの合成Ｄ
ＮＡを用いた。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１
と同様にして行った。増幅された３５７９ｂｐの遺伝子
断片のクローン化用のベクターにはpHSG399を用いた。p
HSG399を制限酵素SmaI（宝酒造(株)製）にて切断し、増
幅されたlysAを含むＤＮＡ断片と接続した。この様にし
て取得したATCC13869由来のlysAを有するプラスミドをp
399LYSAと命名した。

【００９４】更に、p399LYSAをKpnI（宝酒造(株)製）と
BamHI（宝酒造(株)製）で切断することにより、lysAを
含むＤＮＡ断片を抽出した。このＤＮＡ断片を、pHSG29
9をKpnIとBamHIで切断したものと連結した。得られたプ
ラスミドをp299LYSAと命名した。p299LYSA構築の過程を
図４に示す。

【００９５】得られたp299LYSAにBrevi.-oriを導入し、
コリネ型細菌中で自律複製可能なlysAを搭載したプラス
ミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHIで切断
し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunti
ng kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて
行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー
（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分
のDNA断片をKpnIのみによる切断によって切り出される
様改変した。このプラスミドをKpnIにより切断し、生じ
たBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp299LYS
Aに接続し、コリネ型細菌中で自律複製可能でかつlysA
を含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpL
YSABと命名した。pLYSAB構築の過程を図５に示す。

【００９６】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムlysAの塩基配列の決定 p299LYSAのプラスミドDNAを調製し、実施例１と同様に
して塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及び
この配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列
番号１８に示す。また、この塩基配列のうち、argSがコ
ードするアミノ酸配列及びlysAがコードするアミノ酸配
列を、各々配列番号１９及び２０に示す。

【００９７】

【実施例５】 エシェリヒア・コリaspC及びそれを含有
するプラスミドの作製 E. coli JM109株を染色体DNAの供与体として用いた。E.
coli JM109株より常法に従い、染色体DNAを調製した。
染色体DNAよりＰＣＲにより、aspCを含むＤＮＡ断片を
増幅した。増幅に用いたDNAプライマーとしては、E. co
liにおいて既知となっている配列（Kuramitsu,S. et a
l;J.Biochem. 97 (4),1259-1262(1985)参照）を基にし
て、配列表の配列番号２１及び２２に記載の塩基配列を
有する各々２０merの合成ＤＮＡを用いた。ＤＮＡの合
成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅
された１３３１ｂｐの遺伝子断片をＴＡクローニングベ
クターｐＣＲ１０００にクローン化した。構築したプラ
スミドをpCRASPCと命名した。

【００９８】増幅されたaspCを含むＤＮＡの塩基配列及
びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配
列番号２３に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号
２４に示す。

【００９９】

【比較例１】変異型lysC及びdapAを併せ持つプラスミド
の作製 dapAを有するプラスミドpCRDAPAと変異型lysC及びBrev
i.-oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lysC、
dapAおよびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミド
を作製した。p399AK9BをSalIにて完全分解した後、平滑
末端化し、EcoRIリンカーを接続する事によりSalI部位
をEcoRI部位に改変したプラスミドを作製した。得られ
たプラスミドをp399AK9BSEと命名した。p399AK9BSEをEc
oRIにて部分分解することよって変異型lysCとBrevi.−o
riを一つのフラグメントとして切り出した。このフラグ
メントをpCRDAPAをEcoRIにて切断したものと連結した。
得られたプラスミドをpCRCABと命名した。このプラスミ
ドはE. coliとコリネ型細菌中で自律増殖可能で、かつ
宿主にカナマイシン耐性を付与し、変異型lysCとdapAを
併せ保持しているプラスミドである。pCRCABの作製過程
を図６に示す。

【０１００】

【比較例２】変異型lysC及びdapBを併せ持つプラスミド
の作製 変異型lysCを有するプラスミドp399AK9とdapBを有する
プラスミドp399DPRより、変異型lysC、dapBを含むプラ
スミドを作製した。p399DPRをEcoRVとSphIで切断するこ
とにより、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片
を抽出した。この断片を、p399AK9をSalIで切断した後
平滑末端化し、更にSphIにて切断したものと結合し、変
異型lysCとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。この
プラスミドをp399AKDDPRと命名した。

【０１０１】次に、得られたp399AKDPRにBrevi.-oriを
導入した。Brevi.-oriを含むプラスミドpHK4を制限酵素
KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端
化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）
製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化
後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を
接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみ
による切断によって切り出される様改変した。このプラ
スミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片
を同じくBamHIにて切断したp399AKDDPRに接続し、コリ
ネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysCおよびdapB
を含むプラスミドを作製し、pCBと命名した。pCBの構築
の過程を図７に示す。

【０１０２】

【比較例３】dapA及びdapBを併せ持つプラスミドの作製 dapAを有するプラスミドpCRDAPAをKpnIおよびEcoRIにて
切断し、dapAを含むＤＮＡ断片を抽出し、ベクタープラ
スミドpHSG399をKpnIおよびEcoRIにて切断したものと接
続した。得られたプラスミドをp399DPSと命名した。

【０１０３】一方、dapBを有するプラスミドpCRDAPBをS
acIIおよびEcoRIにて切断し、ＤＤＰＲをコードする領
域を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片を抽出し、SacIIおよ
びEcoRIにて切断したp399DPSと接続し、dapAとdapBを併
せ持つプラスミドを作製した。得られたプラスミドをp3
99ABと命名した。

【０１０４】次に、p399ABにBrevi.-oriを導入した。Br
evi.-oriを含むpHK4を制限酵素BamHI（宝酒造（株）
製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化
はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定さ
れた方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKp
nIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrev
i.-ori部分のDNA断片をKpnIのみによる切断によって切
り出される様改変した。このプラスミドをKpnIにより切
断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断
したp399ABに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能で
かつdapAおよびdapBを含むプラスミドを作製し、pABと
命名した。pABの構築の過程を図８に示す。

【０１０５】

【実施例６】変異型lysC、dapA及びdapBを併せ持つプラ
スミドの作製 p399DPSをEcoRI、SphIにて分解し、平滑末端化した後、
dapAの断片を抽出した。この断片を、p399AK9をSalIに
て切断し平滑末端化したものとライゲーションし、変異
型lysCとdapAが共存したプラスミドp399CAを構築した。

【０１０６】dapBを有するプラスミドpCRDAPBをEcoRIに
て切断、平滑末端化した後、SacIにて切断し、dapBを含
む2.0kbのＤＮＡ断片を抽出した。dapA及び変異型lysC
を有するプラスミドp399CAをSpeIにて切断、平滑末端化
した後、SacIにて切断し、抽出したdapB断片と接続し、
変異型lysC、dapA及びdapBを含むプラスミドを得た。こ
のプラスミドをp399CABと命名した。

【０１０７】次に、p399CABにBrevi.-oriを導入した。B
revi.-oriを有するプラスミドpHK4を制限酵素BamHI（宝
酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。
平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用
い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン
酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pH
K4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpnIのみによる切断
によって切り出される様改変した。このプラスミドをKp
nIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpn
Iにて切断したp399CABに接続し、コリネ型細菌中で自律
増殖可能でかつ変異型lysC、dapAおよびdapBを併せ持つ
プラスミドを作製し、pCABと命名した。pCABの構築の過
程を図９に示す。

【０１０８】

【実施例７】変異型lysC、dapA、dapB及びlysAを併せ持
つプラスミドの作製 lysAを有するプラスミドp299LYSAをKpnI及びBamHIにて
切断し、平滑末端化した後、lysAの断片を抽出した。こ
の断片を、pCABをHpaI（宝酒造（株）製）にて切断し平
滑末端化したものとライゲーションし、コリネ型細菌中
で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapA、dapB、及びlys
Aを併せ持つプラスミドを作製し、pCABLと命名した。pC
ABL構築の過程を図１０に示す。尚、pCABL中で、lysAの
断片はdapBを含むＤＮＡ断片内のHpaI部位に挿入されて
いるが、このHpaI部位は、dapBのプロモーターよりも上
流（配列番号１０中塩基番号６１１〜６１６）に位置し
ており、dapBは分断されていない。

【０１０９】

【実施例８】aspCを持つプラスミドの作製 aspCをコリネ型細菌に導入するためのベクターには、新
規に構築したコリネ型細菌用クローニングベクターpVK7
を用いた。pVK7は、以下のようにして、E. coli用ベク
ターであるpHSG299（Km^r；Takeshita, S. et al., Gen
e, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムのクリプティックプラスミドである
pAM330を結合することによって構築した。pAM330は、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株
より調製した。pHSG299を一箇所切断酵素であるAvaII
（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒造（株）
製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端
化したpAM330と接続した。pHSG299に対するpAM330の挿
入方向により、生成した２種類のプラスミドをpVK6、pV
K7と命名し、pVK7を以下の実験に用いた。pVK7は、E. c
oli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマ
ルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。
pVK6及びpVK7の構築の過程を図１１に示す。

【０１１０】構築したシャトルベクターpVK7にaspCを接
続した。pCRASPCを制限酵素EcoRI（宝酒造（株）製）に
て切断し、同じく制限酵素EcoRIにて切断したpVK7と接
続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造（株）製）を用いて行った。pVK7にaspCの断片
が接続したもののうち、pVK7が持つlacプロモーターの
転写方向と順方向に挿入されたものをpOmと命名した。p
Omの構築の過程を図１２に示す。

【０１１１】

【実施例９】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムaspCの取得 ＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムaspC
の単離 aspC活性(ＡＡＴ活性)が消失し、アスパラギン酸要求性
となったコリネバクテリウム属に属するアスパラギン酸
要求株１０２−７株（I.Shiio and K.Ujikawa;J. Bioch
em. 84, 647(1978)）に、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム野生株ATCC13869株の染色体ＤＮＡの各
種断片を、コリネバクテリウム属細菌で機能するベクタ
ーと連結した遺伝子ライブラリー（国際公開第WO 95/23
224号）を導入して形質転換を行った。得られた形質転
換体を回収し、２度蒸留水で洗浄した後、窒素源として
アンモニア以外を含まない最少培地Medium10（I.Shiio
and K.Ujikawa; J. Biochem. 84, 647(1978)）寒天プレ
ートに数万個塗布し、アスパラギン酸要求性が回復し、
当該プレート上で良好な生育を示すものを取得した。前
記アスパラギン酸要求性回復株よりプラスミドＤＮＡを
回収し、当該プラスミドをpACと命名した。ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株をp
ACで形質転換したところ、その形質転換体はaspC活性が
向上した（表１）。活性測定は公知の方法により行った
（Sizer,I.W. and Jenkins,W.T.; Meth. Enzymol. vol.
5, 677-679(1962)参照）。

【０１１２】以上の結果、プラスミドＤＮＡ上に存在す
る約2.5kbのATCC13869株染色体ＤＮＡ断片上にブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムaspCが含まれている
ことが確認された。

【０１１３】

【表１】 表１ ────────────────────── 菌株／プラスミド aspC活性（相対値） ────────────────────── AJ13869 １．０ AJ13869/pAC ８．９ ──────────────────────

【０１１４】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムaspCの解析 2.5kbのＤＮＡ断片の塩基配列は、サンガーら（Proc. N
atl. Acad. Sci. USA,74, 5463(1977)）のジデオキシ法
に従って行った。決定した塩基配列を配列番号２５に示
す。得られた塩基配列をソフトウエア開発株式会社のＧ
ＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ Ｖｉｒｓｉｏｎ７．３プログラ
ムを用いて解析した。ＯＲＦ（Open Reading Frame）検
索の結果、図１３に示す様に互いに逆方向で重なり合う
２つのＯＲＦが認められた。配列番号２５に示す塩基配
列の８７９番目から８８１番目のＡＴＧ若しくは８９７
番目から８９９番目のＡＴＧを開始コドンとし、２１７
５番目から２１７７番目のＴＡＧを終始コドンとして順
方向にコードされる４３２アミノ酸若しくは４２６アミ
ノ酸からなるＯＲＦをＯＲＦ１と命名し、２１６３番か
ら２１６５番目のＣＡＣの相補鎖ＧＴＧを開始コドンと
し、９８４番目から９８６番目のＴＣＡの相補鎖ＴＧＡ
を終始コドンとして逆方向にコードされる３９３アミノ
酸からなるＯＲＦをＯＲＦ２と命名した。

【０１１５】＜３＞aspCをコードするＯＲＦの決定 この２つのＯＲＦのうち、どちらのＯＲＦにＡＡＴタン
パク質がコードされているか確かめるために、pACよ
り、ＰＣＲによりＯＲＦ２の全長を含ます、ＯＲＦ１の
全長をコードするＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いた
ＤＮＡプライマーとしては配列番号２５に記載の配列を
基にした、配列番号２６及び２７に記載の塩基配列を有
する各々２３ｍｅｒの合成ＤＮＡを用いた。ＤＮＡの合
成及びＰＣＲ反応は、実施例１と同様にして行った。増
幅された配列番号２５に示す塩基配列の１２６番目より
２１８７番目の２０６２ｂｐの遺伝子断片をＴＡクロー
ニングベクターpCR2.1（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に
クローン化した。構築したプラスミドをpCRORF1と命名
した。

【０１１６】同様に、ＯＲＦ２のみの全長をコードする
配列番号２５に示す塩基配列の９７５番目より２５１７
番目の１５４３ｂｐの遺伝子断片を増幅、クローン化
し、pCRORF2と命名した。増幅に用いたＤＮＡプライマ
ーとしては配列番号２８及び２９に記載の塩基配列を有
する各々２３ｍｅｒの合成ＤＮＡを用いた。

【０１１７】クローン化したＤＮＡ断片をコリネバクテ
リウム属細菌に導入するために実施例８に示すシャトル
ベクターpVK7に当該ＤＮＡ断片を接続した。pCRORF1を
制限酵素EcoRI（宝酒造（株）製）にて切断し、同じく
制限酵素EcoRIにて切断したpVK7と接続した。ＤＮＡの
接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）
を用いて行った。構築したプラスミドをpORF1と命名し
た。pORF1の構築の過程を図１４に示す。

【０１１８】同様にpCRORF2とpVK7よりpORF2を構築し
た。作製したpORF1、pORF2をブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム野生株ATCC13869株に実施例９と同様
にして導入した。ＡＴＣＣ１３８６９及び取得したプラ
スミド導入株ＡＴＣＣ１３８６９／pORF1、ＡＴＣＣ１
３８６９／pORF2のaspC活性を測定した。活性測定は実
施例１と同様にして行った。表２に示される様に、ＡＴ
ＣＣ１３８６９／pORF1においてのみaspC活性の向上が
見られたことからＯＲＦ１にaspCがコードされているこ
とが確認できた。

【０１１９】以上の実験により決定されたブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムのaspCの塩基配列及びこ
の配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列番
号３０に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号３１
に示す。ＧＥＮＥＢＡＮＫによるホモロジーリサーチの
結果、他生物のＡＡＴタンパク質を含め既知のアミノ酸
配列との相同性は認められなかった。

【０１２０】

【表２】 表２ ────────────────────── 菌株／プラスミド aspC活性（相対値） ────────────────────── AJ13869 １．０ AJ13869/pORF1 １０．１ AJ13869/pORF2 １．２ ──────────────────────

【０１２１】

【実施例１０】Ｌ−リジン生合成遺伝子を含むプラスミ
ドのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リ
ジン生産菌への導入 実施例７で作製された変異型lysC、dapA、dapB及びlysA
を有するプラスミドpCABL（Cm^r）をブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌であるＡＪ１
１０８２（ＮＲＲＬ Ｂ−１１４７０）に導入した。Ａ
Ｊ１１０８２株は、ＡＥＣ耐性の性質を有する。プラス
ミドの導入の方法は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-
207791号公報）によった。形質転換体の選択は各々のプ
ラスミドが持つ薬剤耐性マーカーによった。クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場
合は５μg/mlのクロラムフェニコールを含む完全培地に
て、また、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミド
を導入した場合には２５μg/mlのカナマイシンを含む完
全培地にて形質転換体の選択を行なった。

【０１２２】次に、上記のようにして得られた形質転換
体ＡＪ１１０８２／pCABLを、さらにエシェリヒア・コ
リのaspCを有するプラスミドpOm（Km^r）またはブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムのaspCを有するプラ
スミドpORF1（Km^r）で形質転換した。pCABLがブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム細胞中での複製起点
としてpHM1519を利用し、マーカー遺伝子としてCm耐性
遺伝子を用いているのに対し、pOmはブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム細胞中での複製起点としてpA
M330を利用し、マーカーとしてKm耐性遺伝子を用いてい
るため、両プラスミドがブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム細胞中で安定に保持される。この様にして
Ｌ−リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドとaspCを含
むプラスミドが共存した菌株ＡＪ１１０８２／pCABL／p
Om 、ＡＪ１１０８２／pCABL／pORF1を取得した。

【０１２３】同様にして、ＡＪ１１０８２株に、p399AK
9B（Cm^r）、pDPSB（Km^r）、pDPRB（Cm^r）、pLYSAB（C
m^r）、pOm、pCRCAB（Km^r）、pAB（Cm^r）、pCB（Cm^r）、
pCAB（Cm^r）を導入し、変異型lysC、dapA、dapB、lys
A、aspCが単独で、又はこれらの遺伝子が２種類又は３
種類の組み合わせで増強された形質転換体を取得した。

【０１２４】

【実施例１１】形質転換体のaspC活性の測定 ＡＪ１１０８２及び実施例１０にて取得した形質転換体
ＡＪ１１０８２／pCABL、ＡＪ１１０８２／pCABL／pOm
及びＡＪ１１０８２／pCABL／pORF1のaspC活性を測定し
た。活性測定は実施例９の＜３＞に示す方法で行った。
表３に示される様に、pOmベクター上のlacプロモーター
が、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中でも
機能し、ＡＪ１１０８２／pCABL／pOmのaspCの活性が約
３倍に上昇していることが確認された。さらに、ＡＪ１
１０８２／pCABL／pORF1においてはそれを上回る約９倍
の活性上昇が確認された。

【０１２５】

【表３】 表３ ────────────────────── 菌株／プラスミド aspC活性（相対値） ────────────────────── AJ11082 １．０ AJ11082/pOm ３．２ AJ11082/pORF1 １０．１ AJ11082/pCABL ０．９ AJ11082/pCABL/pOm ２．９ AJ11082/pCABL/pORF1 １１．５ ──────────────────────

【０１２６】

【実施例１２】Ｌ−リジンの製造 実施例１０で取得した各形質転換体をＬ−リジン生産培
地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を評価した。Ｌ−
リジン生産培地の組成は以下に示す通りである。

【０１２７】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０
に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌
した炭酸カルシウムを５０ｇ加える。

【０１２８】 グルコース 100 g （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ 55 g ＫＨ₂ＰＯ₄ 1 g ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g

【０１２９】上記組成の培地に各種形質転換体及び親株
を植菌し、31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養４０
時間、７２時間後のＬ−リジン生成量、及び７２時間後
の生育（OD₅₆₂）を表４に示す。表中、lysC^*は変異型ly
sCを表す。生育は１０１倍希釈した後、562nmにてＯＤ
を測定することにより定量した。

【０１３０】

【表４】 表４ 培養時間４０、７２時間後のＬ−リジン蓄積 ──────────────────────────────────── L-リシ゛ン生産量(g/L) 生育 菌株／プラスミド 導入遺伝子 40時間後 72時間後 (OD₅₆₂/101) ──────────────────────────────────── AJ11082 22.0 29.8 0.450 AJ11082/p399AK9B lysC^* 16.8 34.5 0.398 AJ11082/pDPSB dapA 18.7 33.8 0.410 AJ11082/pDPRB dapB 19.9 29.9 0.445 AJ11082/pLYSAB lysA 19.8 32.5 0.356 AJ11082/pOm aspC(E)注１ 21.8 30.9 0.457 AJ11082/pOm aspC(B)注２ 21.5 31.2 0.450 AJ11082/pCRCAB lysC^*,dapA 19.7 36.5 0.360 AJ11082/pAB dapA,dapB 19.0 34.8 0.390 AJ11082/pCB lysC^*,dapB 23.3 35.0 0.440 AJ11082/pCAB lysC^*,dapA,dapB 23.0 45.0 0.425 AJ11082/pCABL lysC^*,dapA,dapB,lysA 26.2 46.5 0.379 AJ11082/pCABL/ lysC^*,dapA,dapB,lysA, 26.7 47.6 0.415 pOm aspC(E) AJ11082/pCABL/ lysC^*,dapA,dapB,lysA, 27.1 48.8 0.410 pORF1 aspC(B) ──────────────────────────────────── 注１）エシェリヒア・コリのaspC 注２）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのaspC

【０１３１】以上に示すように、変異型lysC、dapA、da
pB、lysA、及びaspC単独の増強では、培養７２時間後に
はＬ−リジン生産量は親株よりも多いか同等であるが、
４０時間後では親株よりも生産量が少なく、すなわち短
期間培養におけるＬ−リジン生産速度は低下した。同様
に、変異型lysC及びdapA、又はdapA及びdapBを組み合わ
せて増強した場合には、培養７２時間後にはＬ−リジン
生産量は親株よりも多いが、４０時間後では親株よりも
生産量が少なく、L−リジン生産速度は低下した。

【０１３２】一方、変異型lysCとともにdapBを増強した
株、変異型lysC、dapA及びdapBの３者が増強された株、
及び変異型lysC、dapA、dapB及びlysAの４者が増強され
た株では、短期間培養及び長期間培養のいずれにおいて
もＬ−リジン蓄積量が向上した。

【０１３３】さらに、変異型lysC、dapA、dapB、lysA、
及びエシェリヒア・コリのaspCの５者が増強された株、
並びに、lysC、dapA、dapB、lysA、及びブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムのaspCの５者が増強された
株では、いずれの培養時間においてもＬ−リジン生産能
が一層向上した。その向上の程度は後者の方が大きかっ
た。

【０１３４】

【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジ
ン生産能を向上させることができる。

【０１３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23

【０１３６】配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21

【０１３７】配列番号：３ 配列の長さ：1643 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320 CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643

【０１３８】配列番号：４ 配列の長さ：1643 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：217..1482 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234 Met Ala Leu Val Val Gln 1 5 AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val 10 15 20 GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val 25 30 35 GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala 40 45 50 GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu 55 60 65 70 ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu 75 80 85 TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val 90 95 100 CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro 105 110 115 GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala 120 125 130 GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly 135 140 145 150 CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn 155 160 165 GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala 170 175 180 GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe 185 190 195 GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu 200 205 210 CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg 215 220 225 230 TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu 235 240 245 GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys 250 255 260 TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050 Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu 265 270 275 GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp 280 285 290 ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile 295 300 305 310 ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194 Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu 315 320 325 AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp 330 335 340 CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290 Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro 345 350 355 GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn 360 365 370 ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg 375 380 385 390 GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln 395 400 405 CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 410 415 420 AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643

【０１３９】配列番号：５ 配列の長さ：421 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420

【０１４０】配列番号：６ 配列の長さ：1643 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：964..1482 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu 1 5 10 15 GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala 20 25 30 AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val 35 40 45 CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe 50 55 60 ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys 65 70 75 CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val 80 85 90 95 GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val 100 105 110 ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu 115 120 125 TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp 130 135 140 GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly 145 150 155 GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 160 165 170 AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643

【０１４１】配列番号：７ 配列の長さ：172 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala 1 5 10 15 Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys 20 25 30 Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu 35 40 45 Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr 50 55 60 Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80 Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly 85 90 95 Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr 100 105 110 Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu 115 120 125 Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp 130 135 140 Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly 145 150 155 160 Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 165 170

【０１４２】配列番号：８ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23

【０１４３】配列番号：９ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23

【０１４４】配列番号：10 配列の長さ：2001 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：730..1473 配列 GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT 60 GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG 120 ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC 180 TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC 240 AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG 300 GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC 360 ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG TCACAACTGG 420 AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA 480 AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT 540 AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT 600 GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT 660 TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA 720 AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT 768 Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg 1 5 10 GTT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG 816 Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu 15 20 25 CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC 864 Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp 30 35 40 45 AAC GGC GCT GAA GTT GTC GTT GAC TTC ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG 912 Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met 50 55 60 GGC AAC CTG GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCT GCG GTT GTT GGA 960 Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly 65 70 75 ACC ACG GGC TTC GAT GAT GCT CGT TTG GAG CAG GTT CGC GCC TGG CTT 1008 Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu 80 85 90 GAA GGA AAA GAC AAT GTC GGT GTT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC 1056 Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile 95 100 105 TCT GCG GTG TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC TTC TTC 1104 Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe 110 115 120 125 GAA TCA GCT GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC CCC AAC AAG CTG GAT GCA 1152 Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala 130 135 140 CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA CGC 1200 Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg 145 150 155 AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT 1248 Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu 160 165 170 GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC 1296 Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val 175 180 185 CGC ATG TCC GGC ATG GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG 1344 Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln 190 195 200 205 GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT 1392 Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe 210 215 220 GCA CCA GGT GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC 1440 Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly 225 230 235 CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC 1493 Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 240 245 GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT 1553 GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT 1613 TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA 1673 GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA 1733 CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC 1793 GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT 1853 GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG 1913 TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC 1973 GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG 2001

【０１４５】配列番号：11 配列の長さ：248 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala 20 25 30 Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala 35 40 45 Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu 50 55 60 Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly 65 70 75 80 Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys 85 90 95 Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val 100 105 110 Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala 115 120 125 Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly 130 135 140 Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala 145 150 155 160 Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser 165 170 175 Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser 180 185 190 Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly 210 215 220 Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val 225 230 235 240 Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 245

【０１４６】配列番号：12 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23

【０１４７】配列番号：13 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23

【０１４８】配列番号：14 配列の長さ：1411 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：311..1213 配列 CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT 60 TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGCC CGTATGTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC 120 ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTGTA AAAGACAGCC 180 GTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT GTGGCTTGGG CGATTGTTAT 240 GCAAAAGTTG TTAGGTTTTT TGCGGGGTTG TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGGTAAC 300 CTTGAACTCT ATG AGC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG CAC 349 Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His 1 5 10 TTC GGC ACC GTT GGA GTA GCA ATG GTT ACT CCA TTC ACG GAA TCC GGA 397 Phe Gly Thr Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly 15 20 25 GAC ATC GAT ATC GCT GCT GGC CGC GAA GTC GCG GCT TAT TTG GTT GAT 445 Asp Ile Asp Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp 30 35 40 45 AAG GGC TTG GAT TCT TTG GTT CTC GCG GGC ACC ACT GGT GAA TCC CCA 493 Lys Gly Leu Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro 50 55 60 ACG ACA ACC GCC GCT GAA AAA CTA GAA CTG CTC AAG GCC GTT CGT GAG 541 Thr Thr Thr Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu 65 70 75 GAA GTT GGG GAT CGG GCG AAC GTC ATC GCC GGT GTC GGA ACC AAC AAC 589 Glu Val Gly Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn 80 85 90 ACG CGG ACA TCT GTG GAA CTT GCG GAA GCT GCT GCT TCT GCT GGC GCA 637 Thr Arg Thr Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala 95 100 105 GAC GGC CTT TTA GTT GTA ACT CCT TAT TAC TCC AAG CCG AGC CAA GAG 685 Asp Gly Leu Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu 110 115 120 125 GGA TTG CTG GCG CAC TTC GGT GCA ATT GCT GCA GCA ACA GAG GTT CCA 733 Gly Leu Leu Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro 130 135 140 ATT TGT CTC TAT GAC ATT CCT GGT CGG TCA GGT ATT CCA ATT GAG TCT 781 Ile Cys Leu Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser 145 150 155 GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG GTC AAG 829 Asp Thr Met Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys 160 165 170 GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG 877 Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr 175 180 185 GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT 925 Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu 190 195 200 205 GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC 973 Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro 210 215 220 ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC 1021 Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val 225 230 235 CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA 1069 Arg Ala Arg Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln 240 245 250 GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG 1117 Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln 255 260 265 GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA AAT GAG 1165 Gly Ile Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu 270 275 280 285 CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA 1213 Gln Glu Leu Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu 290 295 300 TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA 1273 AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA 1333 CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC 1393 TCAAGGATCC CAACATTC 1411

【０１４９】配列番号：15 配列の長さ：301 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr 1 5 10 15 Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp 20 25 30 Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu 35 40 45 Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr 50 55 60 Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr 85 90 95 Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu 100 105 110 Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu 115 120 125 Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu 130 135 140 Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met 145 150 155 160 Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys 165 170 175 Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala 180 185 190 Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu 210 215 220 Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg 225 230 235 240 Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu 245 250 255 Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn 260 265 270 Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu 275 280 285 Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu 290 295 300

【０１５０】配列番号：16 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23

【０１５１】配列番号：17 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23

【０１５２】配列番号：18 配列の長さ：3579 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：533..2182 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：2188..3522 配列 GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60 TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA 120 GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT 180 GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC 240 GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC 300 AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC 360 CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA 420 CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA 480 AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG 535 Met 1 ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT 583 Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val 5 10 15 TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT 631 Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val 20 25 30 GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT 679 Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile 35 40 45 GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727 Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala 50 55 60 65 ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775 Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala 70 75 80 GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA 823 Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala 85 90 95 CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA 871 Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly 100 105 110 AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT 919 Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser 115 120 125 GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC 967 Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala 130 135 140 145 GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG 1015 Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val 150 155 160 ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC 1063 Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe 165 170 175 GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC 1111 Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp 180 185 190 GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA 1159 Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu 195 200 205 AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT 1207 Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu 210 215 220 225 TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC 1255 Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser 230 235 240 CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC 1303 Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser 245 250 255 CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC 1351 Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp 260 265 270 AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC 1399 Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr 275 280 285 GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC 1447 Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp 290 295 300 305 GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC 1495 Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser 310 315 320 CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT 1543 Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly 325 330 335 TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA 1591 Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro 340 345 350 GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639 Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg Asp 355 360 365 GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA 1687 Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu 370 375 380 385 GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG 1735 Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu 390 395 400 ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG 1783 Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp 405 410 415 GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC 1831 Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly His 420 425 430 GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC 1879 Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr 435 440 445 GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT 1927 Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp 450 455 460 465 CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT 1975 Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala 470 475 480 GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT 2023 Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala 485 490 495 GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT 2071 Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val 500 505 510 GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA 2119 Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala 515 520 525 GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167 Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser 530 535 540 545 GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214 Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu 550 1 5 CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262 Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly 10 15 20 25 GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310 Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr 30 35 40 GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358 Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys 45 50 55 CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406 Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala 60 65 70 TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454 Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu 75 80 85 GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502 Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu 90 95 100 105 GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550 Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys 110 115 120 GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598 Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val 125 130 135 GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646 Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala 140 145 150 GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694 Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile 155 160 165 GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742 Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys 170 175 180 185 TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790 Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala 190 195 200 GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT 2838 Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val 205 210 215 GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886 Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg 220 225 230 GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934 Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu 235 240 245 CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982 Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala 250 255 260 265 GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030 Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala 270 275 280 GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT 3078 Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu 285 290 295 GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126 Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr 300 305 310 GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174 Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg 315 320 325 CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA 3222 Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala 330 335 340 345 CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270 Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu 350 355 360 GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318 Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly 365 370 375 GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366 Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly 380 385 390 GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414 Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser 395 400 405 TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462 Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala 410 415 420 425 GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510 Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu 430 435 440 TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562 Ser Leu Glu Ala 445 GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579

【０１５３】配列番号：19 配列の長さ：550 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu 1 5 10 15 Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val 20 25 30 Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn 35 40 45 Ile Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu 50 55 60 Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser 65 70 75 80 Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe 100 105 110 Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val 115 120 125 Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala 130 135 140 Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys 145 150 155 160 Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg 165 170 175 Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu 180 185 190 Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val 195 200 205 Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu 210 215 220 Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser 225 230 235 240 Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn 245 250 255 Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys 260 265 270 Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser 275 280 285 Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly 290 295 300 Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe 305 310 315 320 Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His 325 330 335 Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys 340 345 350 Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg 355 360 365 Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr 370 375 380 Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser 385 390 395 400 Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu 405 410 415 Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly 420 425 430 His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val 435 440 445 Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly 450 455 460 Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala 465 470 475 480 Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu 485 490 495 Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys 500 505 510 Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala 515 520 525 Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val 530 535 540 Ser Ala Pro Glu Lys Met 545 550

【０１５４】配列番号：20 配列の長さ：445 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro 1 5 10 15 Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val 20 25 30 Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val 35 40 45 Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe 50 55 60 Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 80 Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala 85 90 95 Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala 115 120 125 Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu 130 135 140 Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp 145 150 155 160 Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe 165 170 175 Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu 195 200 205 Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala 210 215 220 Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln 225 230 235 240 Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly 245 250 255 Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala 260 265 270 Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu 275 280 285 Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile 290 295 300 Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320 Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly 325 330 335 Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345 350 Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg 355 360 365 Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu 370 375 380 Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410 415 Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425 430 Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445

【０１５５】配列番号：21 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 AACCTCGTCA TGTTTGAGAA 20

【０１５６】配列番号：22 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 CCGGCCTACA AAATCGTGCA 20

【０１５７】配列番号：23 配列の長さ：1331 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名： エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 株名： JM109 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：10..1197 配列 AACCTCGTC ATG TTT GAG AAC ATT ACC GCC GCT CCT GCC GAC CCG ATT 48 Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile 1 5 10 CTG GGC CTG GCC GAT CTG TTT CGT GCC GAT GAA CGT CCC GGC AAA ATT 96 Leu Gly Leu Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile 15 20 25 AAC CTC GGG ATT GGT GTC TAT AAA GAT GAG ACG GGC AAA ACC CCG GTA 144 Asn Leu Gly Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val 30 35 40 45 CTG ACC AGC GTG AAA AAG GCT GAA CAG TAT CTG CTC GAA AAT GAA ACC 192 Leu Thr Ser Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr 50 55 60 ACC AAA AAT TAC CTC GGC ATT GAC GGC ATC CCT GAA TTT GGT CGC TGC 240 Thr Lys Asn Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys 65 70 75 ACT CAG GAA CTG CTG TTT GGT AAA GGT AGC GCC CTG ATC AAT GAC AAA 288 Thr Gln Glu Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys 80 85 90 CGT GCT CGC ACG GCA CAG ACT CCG GGG GGC ACT GGC GCA CTA CGC GTG 336 Arg Ala Arg Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val 95 100 105 GCT GCC GAT TTC CTG GCA AAA AAT ACC AGC GTT AAG CGT GTG TGG GTG 384 Ala Ala Asp Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val 110 115 120 125 AGC AAC CCA AGC TGG CCG AAC CAT AAG AGC GTC TTT AAC TCT GCA GGT 432 Ser Asn Pro Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly 130 135 140 CTG GAA GTT CGT GAA TAC GCT TAT TAT GAT GCG GAA AAT CAC ACT CTT 480 Leu Glu Val Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu 145 150 155 GAC TTC GAT GCA CTG ATT AAC AGC CTG AAT GAA GCT CAG GCT GGC GAC 528 Asp Phe Asp Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp 160 165 170 GTA GTG CTG TTC CAT GGC TGC TGC CAT AAC CCA ACC GGT ATC GAC CCT 576 Val Val Leu Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro 175 180 185 ACG CTG GAA CAA TGG CAA ACA CTG GCA CAA CTC TCC GTT GAG AAA GGC 624 Thr Leu Glu Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly 190 195 200 205 TGG TTA CCG CTG TTT GAC TTC GCT TAC CAG GGT TTT GCC CGT GGT CTG 672 Trp Leu Pro Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu 210 215 220 GAA GAA GAT GCT GAA GGA CTG CGC GCT TTC GCG GCT ATG CAT AAA GAG 720 Glu Glu Asp Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu 225 230 235 CTG ATT GTT GCC AGT TCC TAC TCT AAA AAC TTT GGC CTG TAC AAC GAG 768 Leu Ile Val Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu 240 245 250 CGT GTT GGC GCT TGT ACT CTG GTT GCT GCC GAC AGT GAA ACC GTT GAT 816 Arg Val Gly Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp 255 260 265 CGC GCA TTC AGC CAA ATG AAA GCG GCG ATT CGC GCT AAC TAC TCT AAC 864 Arg Ala Phe Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn 270 275 280 285 CCA CCA GCA CAC GGC GCT TCT GTT GTT GCC ACC ATC CTG AGC AAC GAT 912 Pro Pro Ala His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp 290 295 300 GCG TTA CGT GCG ATT TGG GAA CAA GAG CTG ACT GAT ATG CGC CAG CGT 960 Ala Leu Arg Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg 305 310 315 ATT CAG CGT ATG CGT CAG TTG TTC GTC AAT ACG CTG CAG GAA AAA GGC 1008 Ile Gln Arg Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly 320 325 330 GCA AAC CGC GAC TTC AGC TTT ATC ATC AAA CAG AAC GGC ATG TTC TCC 1056 Ala Asn Arg Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser 335 340 345 TTC AGT GGC CTG ACA AAA GAA CAA GTG CTG CGT CTG CGC GAA GAG TTT 1104 Phe Ser Gly Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe 350 355 360 365 GGC GTA TAT GCG GTT GCT TCT GGT CGC GTA AAT GTG GCC GGG ATG ACA 1152 Gly Val Tyr Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr 370 375 380 CCA GAT AAC ATG GCT CCG CTG TGC GAA GCG ATT GTG GCA GTG CTG 1197 Pro Asp Asn Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu 385 390 395 TAAGCATTAA AAACAATGAA CGCGCTGAAA AGCGGGCTGA GACTGATGAC AAACGCAACA 1257 TTGCCTGATG GCTACGCTTA TCAGGCCTAC GCGTCCCCTG CAATATTTTG AATTTGCACG 1317 ATTTTGTAGG CCGG 1331

【０１５８】配列番号：24 配列の長さ：396 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly 20 25 30 Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser 35 40 45 Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn 50 55 60 Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu 65 70 75 80 Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg 85 90 95 Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp 100 105 110 Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro 115 120 125 Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val 130 135 140 Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp 145 150 155 160 Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu 165 170 175 Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu 180 185 190 Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp 210 215 220 Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val 225 230 235 240 Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly 245 250 255 Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe 260 265 270 Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala 275 280 285 His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg 290 295 300 Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg 305 310 315 320 Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg 325 330 335 Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly 340 345 350 Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr 355 360 365 Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn 370 375 380 Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu 385 390 395

【０１５９】配列番号：25 配列の長さ：2517 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列 GATCAGCTTC GGGTGTTGAA GGGGCCGAAT AAGGAACTCG CGCAGTTGGG TCGTAGTTTG 60 TTTAAACGAC TTGGTGATGT GTTGGCGTAT TTCGATGTTG GTGTCTCCAA CGGTCCGGTC 120 GAAGCGATCA ACGGACGGTT GGAGCATTTG CGTGGGATTG CTCTAGGTTT CCGTAATTTG 180 AACCACTACA TTCTGCGGTG CCTTATCCAT TCAGGGCAGT TGGTCCATAA GATCAATGCA 240 CTCTAAAACA GGAAGAGCCC CTTTACAAGC GGCAAGACCA AACTGGGTGA CCGAAAATCT 300 TCAGGCCAAT CAGTTTTGGT CATATGGGAT GGTTTTTAGA CCTCGAAACC ATCCCATATG 360 ACCGAAGCCC GCGAAACTCT GTGTTCGTTG GTCGCCTGGT TCGGTCTCAA TGCCTTGCCG 420 AAACCACAAC GCCCCGAAAC CCAAAACTCC CCAATACATG AAAAAACCAG CTTCCCACCG 480 AAGTGAGAAG CTGGTTTAGT TTGCGGAGGA TAGGGGATTT GAACCCCTGA GGGATTGCTC 540 CCAACCCGCG TTCCAGGCGA GCGACATAGG CCGCTAGTCG AATCCTCCAG CTAGAACGGC 600 TGCAACGCAT GGCTGCTTTG TTCTGGGGAT TAGATTACAC AAAAGTCGTT TAGAAACTCA 660 AATCCGCTCG CAGTTGGCGT TTTCTGGGGC GGTTCAGCTA GAGTTATGCG AAGGATCCCG 720 TGCGGCGTTT ATCTTGTGAA CTCCCCCAGG GCAGGAATGC AGCAAGGGTC AGCGAGCTCT 780 GACGGGTGCG CGGGGTCCCC TAAAACGTCT AGAGTAGTGG CTTGAGGTCA CTGCTCTTTT 840 TTTGTGCCCT TTTTTTGGTC CGTCTATTTT GCCACCACAT GCGGAGGTAC GCAGTTATGA 900 GTTCAGTTTC GCTGCAGGAT TTTGATGCAG AGCGAATTGG TCTGTTCCAC GAGGACATTA 960 AACGCAAGTT TGATGAGCTC AAGTCAAAAA ATCTGAAGCT GGATCTTACT CGCGGTAAGC 1020 CTTCGTCGGA GCAGTTGGAT TTCGCTGATG AGCTGTTGGC GTTGCCTGGT AAGGGCGATT 1080 TCAAGGCTGC GGATGGTACT GATGTCCGTA ACTATGGCGG GCTGGATGGC ATTGTTGATA 1140 TTCGTCAGAT TTGGGCGGAT TTGCTGGGTG TTCCTGTGGA GCAGGTGCTG GCGGGGGATG 1200 CTTCGAGCTT GAACATCATG TTTGATGTGA TCAGCTGGTC GTACATTTTT GGTAACAATG 1260 ATTCGGTTCA GCCTTGGTCG AAGGAAGAAA CTGTTAAGTG GATTTGTCCT GTTCCGGGAT 1320 ATGATCGCCA TTTCTCCATC ACGGAGCGTT TCGGCTTTGA GATGATTTCT GTGCCAATGA 1380 ATGAAGACGG CCCTGATATG GATGCTGTTG AGGAATTGGT CAAGGATCCG CAGGTTAAGG 1440 GCATGTGGGT TGTGCCGGTA TTTTCTAACC CGACTGGTTT CACGGTGTCG GAGGACGTCG 1500 CAAAGCGTCT GAGCACGATG GAAACTGCGG CGCCGGACTT CCGCGTGGTG TGGGATAACG 1560 CTTACGCCGT TCATACTCTG ACCGATGAGT TCCCTGAGGT CATCGACATC GTTGGGCTTG 1620 GTGAGGCGGC GGGTAACCCG AACCGTTTCT GGGCGTTCAC TTCTACTTCG AAGATCACTC 1680 TCGCGGGTGC GGGCGTGTCC TTCTTCATGA CTTCTGCGGA GAACCGTAAG TGGTACTCCG 1740 GTCATGCGGG TATCCGTGGC ATTGGCCCTA ACAAGGTCAA TCAGTTGGCT CATGCGCGTT 1800 ACTTTGGCGA TGCTGAGGGA GTGCGCGCGG TGATGCGTAA GCATGCTGCG TCGTTGGCTC 1860 CGAAGTTCAA CAAGGTTCTG GAGATCCTGG ATTCTCGCCT TGCTGAGTAC GGTGTCGCGC 1920 AGTGGACTGT CCCTGCGGGC GGTTACTTCA TTTCCCTTGA TGTGGTTCCT GGTACGGCAT 1980 CTCGTGTGGC TGAGTTGGCT AAGGAAGCCG GCATTGCGTT GACGGGTGCG GGTTCTTCTT 2040 ACCCGCTGCG TCAGGATCCG GAGAACAAGA ACCTCCGTTT GGCGCCTTCT CTGCCTCCTG 2100 TTGAGGAACT TGAGGTTGCC ATGGATGGCG TGGCTACGTG TGTTTTGCTG GCAGCTGCGG 2160 AGCACTACGC TAGCTAGAGT GAATACCGCG GAAACTGCAC ATTGGATTAA CCGTTTGCTG 2220 CCGGGTCAGC CGGAGTTTCA CCAGGTTGGC GCGTTTAAAG TGGCGGGTTA CACGCTTGAT 2280 GATGAGTCAA TTGCGTGTTC TGTCAATTTC GGGCGCGTCA ACACGGGCCT GGTCACCGAG 2340 ACAGGCGCGG AAACCGTCGA TGTGCGAAGT GAGATTTTGA GCCTGGCCAG GGCCGACGTG 2400 TCCGTGCCTG GGCGCGCCGT CGGCGCTGCT GCAACAATGC TTCTCGACGC CTCCCTCTCC 2460 TTCAAATCCG CCACCGATTC CAGTGTCACT CCCATGCATG CCCAACCGGG ACAGATC 2517

【０１６０】配列番号：26 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GATCAACGGA CGGTTGGAGC ATT 23

【０１６１】配列番号：27 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 GGTATTCACT CTAGCTAGCG TAG 23

【０１６２】配列番号：28 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GAGCTCAAGT CAAAAAATCT GAA 23

【０１６３】配列番号：29 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 GATCTGTCCC GGTTGGGCAT GCA 23

【０１６４】配列番号：30 配列の長さ：2517 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：879..2174 配列 GATCAGCTTC GGGTGTTGAA GGGGCCGAAT AAGGAACTCG CGCAGTTGGG TCGTAGTTTG 60 TTTAAACGAC TTGGTGATGT GTTGGCGTAT TTCGATGTTG GTGTCTCCAA CGGTCCGGTC 120 GAAGCGATCA ACGGACGGTT GGAGCATTTG CGTGGGATTG CTCTAGGTTT CCGTAATTTG 180 AACCACTACA TTCTGCGGTG CCTTATCCAT TCAGGGCAGT TGGTCCATAA GATCAATGCA 240 CTCTAAAACA GGAAGAGCCC CTTTACAAGC GGCAAGACCA AACTGGGTGA CCGAAAATCT 300 TCAGGCCAAT CAGTTTTGGT CATATGGGAT GGTTTTTAGA CCTCGAAACC ATCCCATATG 360 ACCGAAGCCC GCGAAACTCT GTGTTCGTTG GTCGCCTGGT TCGGTCTCAA TGCCTTGCCG 420 AAACCACAAC GCCCCGAAAC CCAAAACTCC CCAATACATG AAAAAACCAG CTTCCCACCG 480 AAGTGAGAAG CTGGTTTAGT TTGCGGAGGA TAGGGGATTT GAACCCCTGA GGGATTGCTC 540 CCAACCCGCG TTCCAGGCGA GCGACATAGG CCGCTAGTCG AATCCTCCAG CTAGAACGGC 600 TGCAACGCAT GGCTGCTTTG TTCTGGGGAT TAGATTACAC AAAAGTCGTT TAGAAACTCA 660 AATCCGCTCG CAGTTGGCGT TTTCTGGGGC GGTTCAGCTA GAGTTATGCG AAGGATCCCG 720 TGCGGCGTTT ATCTTGTGAA CTCCCCCAGG GCAGGAATGC AGCAAGGGTC AGCGAGCTCT 780 GACGGGTGCG CGGGGTCCCC TAAAACGTCT AGAGTAGTGG CTTGAGGTCA CTGCTCTTTT 840 TTTGTGCCCT TTTTTTGGTC CGTCTATTTT GCCACCAC ATG CGG AGG TAC GCA 893 Met Arg Arg Tyr Ala 1 5 GTT ATG AGT TCA GTT TCG CTG CAG GAT TTT GAT GCA GAG CGA ATT GGT 941 Val Met Ser Ser Val Ser Leu Gln Asp Phe Asp Ala Glu Arg Ile Gly 10 15 20 CTG TTC CAC GAG GAC ATT AAA CGC AAG TTT GAT GAG CTC AAG TCA AAA 989 Leu Phe His Glu Asp Ile Lys Arg Lys Phe Asp Glu Leu Lys Ser Lys 25 30 35 AAT CTG AAG CTG GAT CTT ACT CGC GGT AAG CCT TCG TCG GAG CAG TTG 1037 Asn Leu Lys Leu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Pro Ser Ser Glu Gln Leu 40 45 50 GAT TTC GCT GAT GAG CTG TTG GCG TTG CCT GGT AAG GGC GAT TTC AAG 1085 Asp Phe Ala Asp Glu Leu Leu Ala Leu Pro Gly Lys Gly Asp Phe Lys 55 60 65 GCT GCG GAT GGT ACT GAT GTC CGT AAC TAT GGC GGG CTG GAT GGC ATT 1133 Ala Ala Asp Gly Thr Asp Val Arg Asn Tyr Gly Gly Leu Asp Gly Ile 70 75 80 85 GTT GAT ATT CGT CAG ATT TGG GCG GAT TTG CTG GGT GTT CCT GTG GAG 1181 Val Asp Ile Arg Gln Ile Trp Ala Asp Leu Leu Gly Val Pro Val Glu 90 95 100 CAG GTG CTG GCG GGG GAT GCT TCG AGC TTG AAC ATC ATG TTT GAT GTG 1229 Gln Val Leu Ala Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asn Ile Met Phe Asp Val 105 110 115 ATC AGC TGG TCG TAC ATT TTT GGT AAC AAT GAT TCG GTT CAG CCT TGG 1277 Ile Ser Trp Ser Tyr Ile Phe Gly Asn Asn Asp Ser Val Gln Pro Trp 120 125 130 TCG AAG GAA GAA ACT GTT AAG TGG ATT TGT CCT GTT CCG GGA TAT GAT 1325 Ser Lys Glu Glu Thr Val Lys Trp Ile Cys Pro Val Pro Gly Tyr Asp 135 140 145 CGC CAT TTC TCC ATC ACG GAG CGT TTC GGC TTT GAG ATG ATT TCT GTG 1373 Arg His Phe Ser Ile Thr Glu Arg Phe Gly Phe Glu Met Ile Ser Val 150 155 160 165 CCA ATG AAT GAA GAC GGC CCT GAT ATG GAT GCT GTT GAG GAA TTG GTC 1421 Pro Met Asn Glu Asp Gly Pro Asp Met Asp Ala Val Glu Glu Leu Val 170 175 180 AAG GAT CCG CAG GTT AAG GGC ATG TGG GTT GTG CCG GTA TTT TCT AAC 1469 Lys Asp Pro Gln Val Lys Gly Met Trp Val Val Pro Val Phe Ser Asn 185 190 195 CCG ACT GGT TTC ACG GTG TCG GAG GAC GTC GCA AAG CGT CTG AGC ACG 1517 Pro Thr Gly Phe Thr Val Ser Glu Asp Val Ala Lys Arg Leu Ser Thr 200 205 210 ATG GAA ACT GCG GCG CCG GAC TTC CGC GTG GTG TGG GAT AAC GCT TAC 1565 Met Glu Thr Ala Ala Pro Asp Phe Arg Val Val Trp Asp Asn Ala Tyr 215 220 225 GCC GTT CAT ACT CTG ACC GAT GAG TTC CCT GAG GTC ATC GAC ATC GTT 1613 Ala Val His Thr Leu Thr Asp Glu Phe Pro Glu Val Ile Asp Ile Val 230 235 240 245 GGG CTT GGT GAG GCG GCG GGT AAC CCG AAC CGT TTC TGG GCG TTC ACT 1661 Gly Leu Gly Glu Ala Ala Gly Asn Pro Asn Arg Phe Trp Ala Phe Thr 250 255 260 TCT ACT TCG AAG ATC ACT CTC GCG GGT GCG GGC GTG TCC TTC TTC ATG 1709 Ser Thr Ser Lys Ile Thr Leu Ala Gly Ala Gly Val Ser Phe Phe Met 265 270 275 ACT TCT GCG GAG AAC CGT AAG TGG TAC TCC GGT CAT GCG GGT ATC CGT 1757 Thr Ser Ala Glu Asn Arg Lys Trp Tyr Ser Gly His Ala Gly Ile Arg 280 285 290 GGC ATT GGC CCT AAC AAG GTC AAT CAG TTG GCT CAT GCG CGT TAC TTT 1805 Gly Ile Gly Pro Asn Lys Val Asn Gln Leu Ala His Ala Arg Tyr Phe 295 300 305 GGC GAT GCT GAG GGA GTG CGC GCG GTG ATG CGT AAG CAT GCT GCG TCG 1853 Gly Asp Ala Glu Gly Val Arg Ala Val Met Arg Lys His Ala Ala Ser 310 315 320 325 TTG GCT CCG AAG TTC AAC AAG GTT CTG GAG ATC CTG GAT TCT CGC CTT 1901 Leu Ala Pro Lys Phe Asn Lys Val Leu Glu Ile Leu Asp Ser Arg Leu 330 335 340 GCT GAG TAC GGT GTC GCG CAG TGG ACT GTC CCT GCG GGC GGT TAC TTC 1949 Ala Glu Tyr Gly Val Ala Gln Trp Thr Val Pro Ala Gly Gly Tyr Phe 345 350 355 ATT TCC CTT GAT GTG GTT CCT GGT ACG GCA TCT CGT GTG GCT GAG TTG 1997 Ile Ser Leu Asp Val Val Pro Gly Thr Ala Ser Arg Val Ala Glu Leu 360 365 370 GCT AAG GAA GCC GGC ATT GCG TTG ACG GGT GCG GGT TCT TCT TAC CCG 2045 Ala Lys Glu Ala Gly Ile Ala Leu Thr Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Pro 375 380 385 CTG CGT CAG GAT CCG GAG AAC AAG AAC CTC CGT TTG GCG CCT TCT CTG 2093 Leu Arg Gln Asp Pro Glu Asn Lys Asn Leu Arg Leu Ala Pro Ser Leu 390 395 400 405 CCT CCT GTT GAG GAA CTT GAG GTT GCC ATG GAT GGC GTG GCT ACG TGT 2141 Pro Pro Val Glu Glu Leu Glu Val Ala Met Asp Gly Val Ala Thr Cys 410 415 420 GTT TTG CTG GCA GCT GCG GAG CAC TAC GCT AGC TAGAGTGAAT ACCGCGGAAA 2194 Val Leu Leu Ala Ala Ala Glu His Tyr Ala Ser 425 430 CTGCACATTG GATTAACCGT TTGCTGCCGG GTCAGCCGGA GTTTCACCAG GTTGGCGCGT 2254 TTAAAGTGGC GGGTTACACG CTTGATGATG AGTCAATTGC GTGTTCTGTC AATTTCGGGC 2314 GCGTCAACAC GGGCCTGGTC ACCGAGACAG GCGCGGAAAC CGTCGATGTG CGAAGTGAGA 2374 TTTTGAGCCT GGCCAGGGCC GACGTGTCCG TGCCTGGGCG CGCCGTCGGC GCTGCTGCAA 2434 CAATGCTTCT CGACGCCTCC CTCTCCTTCA AATCCGCCAC CGATTCCAGT GTCACTCCCA 2494 TGCATGCCCA ACCGGGACAG ATC 2517

【０１６５】配列番号：31 配列の長さ：432 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Arg Arg Tyr Ala Val Met Ser Ser Val Ser Leu Gln Asp Phe Asp 1 5 10 15 Ala Glu Arg Ile Gly Leu Phe His Glu Asp Ile Lys Arg Lys Phe Asp 20 25 30 Glu Leu Lys Ser Lys Asn Leu Lys Leu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Pro 35 40 45 Ser Ser Glu Gln Leu Asp Phe Ala Asp Glu Leu Leu Ala Leu Pro Gly 50 55 60 Lys Gly Asp Phe Lys Ala Ala Asp Gly Thr Asp Val Arg Asn Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Leu Asp Gly Ile Val Asp Ile Arg Gln Ile Trp Ala Asp Leu Leu 85 90 95 Gly Val Pro Val Glu Gln Val Leu Ala Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asn 100 105 110 Ile Met Phe Asp Val Ile Ser Trp Ser Tyr Ile Phe Gly Asn Asn Asp 115 120 125 Ser Val Gln Pro Trp Ser Lys Glu Glu Thr Val Lys Trp Ile Cys Pro 130 135 140 Val Pro Gly Tyr Asp Arg His Phe Ser Ile Thr Glu Arg Phe Gly Phe 145 150 155 160 Glu Met Ile Ser Val Pro Met Asn Glu Asp Gly Pro Asp Met Asp Ala 165 170 175 Val Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Gln Val Lys Gly Met Trp Val Val 180 185 190 Pro Val Phe Ser Asn Pro Thr Gly Phe Thr Val Ser Glu Asp Val Ala 195 200 205 Lys Arg Leu Ser Thr Met Glu Thr Ala Ala Pro Asp Phe Arg Val Val 210 215 220 Trp Asp Asn Ala Tyr Ala Val His Thr Leu Thr Asp Glu Phe Pro Glu 225 230 235 240 Val Ile Asp Ile Val Gly Leu Gly Glu Ala Ala Gly Asn Pro Asn Arg 245 250 255 Phe Trp Ala Phe Thr Ser Thr Ser Lys Ile Thr Leu Ala Gly Ala Gly 260 265 270 Val Ser Phe Phe Met Thr Ser Ala Glu Asn Arg Lys Trp Tyr Ser Gly 275 280 285 His Ala Gly Ile Arg Gly Ile Gly Pro Asn Lys Val Asn Gln Leu Ala 290 295 300 His Ala Arg Tyr Phe Gly Asp Ala Glu Gly Val Arg Ala Val Met Arg 305 310 315 320 Lys His Ala Ala Ser Leu Ala Pro Lys Phe Asn Lys Val Leu Glu Ile 325 330 335 Leu Asp Ser Arg Leu Ala Glu Tyr Gly Val Ala Gln Trp Thr Val Pro 340 345 350 Ala Gly Gly Tyr Phe Ile Ser Leu Asp Val Val Pro Gly Thr Ala Ser 355 360 365 Arg Val Ala Glu Leu Ala Lys Glu Ala Gly Ile Ala Leu Thr Gly Ala 370 375 380 Gly Ser Ser Tyr Pro Leu Arg Gln Asp Pro Glu Asn Lys Asn Leu Arg 385 390 395 400 Leu Ala Pro Ser Leu Pro Pro Val Glu Glu Leu Glu Val Ala Met Asp 405 410 415 Gly Val Ala Thr Cys Val Leu Leu Ala Ala Ala Glu His Tyr Ala Ser 420 425 430

【図面の簡単な説明】

【図１】 変異型lysCを有するプラスミドp399AK9B及び
p399AKYB構築の過程を示す図。

【図２】 dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPR
Bの構築の過程を示す図。

【図３】 dapA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPS
Bの構築の過程を示す図。

【図４】 lysAを有するプラスミドp299LYSAの構築の過
程を示す図。

【図５】 lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpLYS
ABの構築の過程を示す図。

【図６】 lysC、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミ
ドpCRCABの構築の過程を示す図。

【図７】 変異型lysC及びdapBを併せ持つプラスミドpC
Bの構築の過程を示す図。

【図８】 dapA、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミ
ドpABの構築の過程を示す図。

【図９】 変異型lysC、dapA、dapB及びBrevi.-oriを有
するプラスミドpCABの構築の過程を示す図。

【図１０】 変異型lysC、dapA、dapB、lysA及びBrevi.
-oriを有するプラスミドpCABLの構築の過程を示す図。

【図１１】 新規なコリネ型細菌用クローニングベクタ
ーpVK6及びpVK7の構築の過程を示す図。

【図１２】 aspCを有するプラスミドpOmの構築の過程
を示す図。

【図１３】 ＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡ断片上の
２つのＯＲＦを示す図。

【図１４】 ｐＯＲＦ１の構築過程を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフ
   ィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナ
   ーゼをコードするＤＮＡ配列、ジヒドロジピコリン酸レ
   ダクターゼをコードするＤＮＡ配列、ジヒドロジピコリ
   ン酸シンターゼをコードするＤＮＡ配列、ジアミノピメ
   リン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、及
   びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードす
   るＤＮＡ配列を含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可
   能な組換えＤＮＡ。
2. 【請求項２】 前記Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによ
   るフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルト
   キナーゼが、コリネ型細菌由来のアスパルトキナーゼで
   あり、αサブユニットでは配列番号５に示すアミノ酸配
   列においてＮ末端から２７９番目のアラニン残基に相当
   するアミノ酸残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外
   のアミノ酸残基に、βサブユニットでは配列番号７に示
   すアミノ酸配列においてＮ末端から３０番目のアラニン
   残基に相当するアミノ酸残基がアラニン以外かつ酸性ア
   ミノ酸以外のアミノ酸残基に変化した変異型アスパルト
   キナーゼである請求項１記載の組換えＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコ
   ードするＤＮＡ配列が、配列表配列番号１５に示すアミ
   ノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコー
   ドする請求項１記載の組換えＤＮＡ。
4. 【請求項４】 ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコー
   ドするＤＮＡ配列が、配列表配列番号１１に示すアミノ
   酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコード
   する請求項１記載の組換えＤＮＡ。
5. 【請求項５】 ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
   をコードするＤＮＡ配列が、配列表配列番号１９に示す
   アミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列を
   コードする請求項１記載の組換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】 アスパラギン酸アミノトランスフェラー
   ゼをコードするＤＮＡ配列が、配列表配列番号２４もし
   くは３１に示すアミノ酸配列又はこれと実質的に同一の
   アミノ酸配列をコードする請求項１記載の組換えＤＮ
   Ａ。
7. 【請求項７】 Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフ
   ィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナ
   ーゼを保持し、さらにジヒドロジピコリン酸レダクター
   ゼをコードするＤＮＡ配列、ジヒドロジピコリン酸シン
   ターゼをコードするＤＮＡ配列、ジアミノピメリン酸デ
   カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、及びアスパ
   ラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
   配列をコードするＤＮＡ配列が増強されたコリネ型細
   菌。
8. 【請求項８】 請求項１記載の組換えＤＮＡが導入され
   たことにより形質転換された請求項７記載のコリネ型細
   菌。
9. 【請求項９】 請求項８記載のコリネ型細菌を好適な培
   地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せし
   め、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とす
   るＬ−リジンの製造法。
10. 【請求項１０】 配列番号３１に示すアミノ酸配列を有
    するタンパク質をコードするＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 配列番号３０に示す塩基配列のうち、
    少なくとも塩基番号８７９〜２１７４からなる塩基配列
    を含むＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 エシェリヒア・コリ及びブレビバクテ
    リウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能
    であり、かつ、マルチプルクローニングサイトとlacZ’
    とを保持するベクターpVK7。