JP2010503395A

JP2010503395A - Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法

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Publication number: JP2010503395A
Application number: JP2009528183A
Authority: JP
Inventors: フーンパーク，ヤング; ジョリム，サン; オクムーン，ジュン; ヨンラ，ソ; ジョンリ，ヒ; ウジャン，ジャエ; ヒュンクウォン，ドゥ; ジンキム，ヒョ; サックソン，ジン; ジョーンキム，ヒュン
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2007-09-17
Publication date: 2010-02-04
Anticipated expiration: 2027-09-17
Also published as: WO2008033001A1; AU2007295159B2; JP6695308B2; KR100924065B1; EP3170889A1; BRPI0716980A2; EP2066782A4; JP2015171366A; US9109242B2; CN101573438A; JP5756259B2; EP2066782A1; CN101573438B; JP2017221202A; US20100143984A1; KR20080025355A; AU2007295159A1

Abstract

本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性より増加し、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属微生物の変異体、およびそれを用いてＬ−リジンを生産する方法が開示される。

Description

本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate dicarboxylase）の活性が内在性活性より増加し、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の変異体、並びにそれを用いてＬ−リジンを生産する方法に関する。

コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、特にコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)は、Ｌ−アミノ酸の生産に多用されているグラム陽性の微生物である。Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンは、動物飼料、医薬品および化粧品産業を含む種々の産業に適用できる。これらの産業での使用に対して、Ｌ−リジンは、典型的にはコリネバクテリウム属株を用いた発酵によって生成されている。

従来のリジン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム属株およびＬ−リジン生産方法が当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，７４６，８５５号には、ｌｙｓＥ遺伝子（リジン排出キャリア遺伝子）が強化され、ｄａｐＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子およびｄａｐＢ遺伝子を含む群から選ばれた遺伝子がさらに導入されたコリネバクテリウム属株と、この株を培養してＬ−リジンを生産する方法が開示されている。また、米国特許第６，２２１，６３６号には、Ｌ−リジンおよびＬ−トレオニンによりフィードバックの阻害に実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡを有するコリネ型細菌群が開示されている。

ところが、リジン生合成経路に関与する６種の酵素、すなわちアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp.）については、開示されたことがない。また、これらの６種酵素に加えて、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属種についても開示されたことがない。

発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、リジン生合成経路に関与する６種の酵素、すなわちアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の株を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記６種の酵素に加えて、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の株を提供することにある。

本発明の別の目的は、前記微生物を用いてＬ−リジンを生産する方法を提供することにある。

技術的解決方法
上記目的を達成するために、本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性がそれぞれの内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の株を提供する。

本発明の他の様相によれば、前記６種の酵素に加えて、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の株を提供する。

本発明の別の様相によれば、前記微生物を用いてＬ−リジンを生産する方法を提供する。

本発明のコリネバクテリウム属株において、前記７種の酵素は、それらの内在性レベルより高いレベルの活性を示す。本発明に係る前記増加した酵素の活性は、遺伝子コピー数の増加、固有のプロモーターのより強力なプロモーターへの置換および人為的な変異による酵素活性の増加を含む様々な要因に基づいている。より詳しくは、前記遺伝子コピー数は、外来対立遺伝子の導入により、および／または内在性遺伝子の増幅によって増加できる。前記遺伝子プロモーターの置換の例には、下流の構造遺伝子を発現する強力な活性を有する外来プロモーターの導入、および、内在遺伝子プロモーターでの置換によるものも含まれる。遺伝子の増幅は、当該分野で周知の方法、例えば適切な条件の下で培養するなどによって容易になされ得る。

本発明の一様相によれば、本発明のコリネ型細菌群は、その核ＤＮＡの内在性遺伝子のａｓｐＢ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子）、ｌｙｓＣ（アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子）、ａｓｄ（アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）、ｄａｐＡ（ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子）、ｄａｐＢ（ジヒドロジピコリン酸リダクターゼをコードする遺伝子）、およびｌｙｓＡ（ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子）に加えて、少なくとも１コピーのａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびｌｙｓＡ遺伝子が存在することによって特徴付けられる。この様相の変形において、外来の強力なプロモーターを、それぞれの構造遺伝子の開始コドンの上流に位置させることもできる。

本発明の他の様相によれば、本発明のコリネ型細菌群は、前記少なくとも１コピーのａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびｌｙｓＡ遺伝子と共に、その核ＤＮＡの内在性ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼ）遺伝子に加えて、少なくとも１コピーのｐｙｃ遺伝子が存在することによって特徴付けられる。この様相の変形において、前記６個それぞれの遺伝子の内在性プロモーターがそれぞれ外来の強力なプロモーターに取り替えられると同時に、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンの上流に外来の強力なプロモーターを挿入する。

コリネバクテリウム属に属しているかぎり、前記遺伝子が導入される母株（mother strain）として任意のコリネ型細菌群を使用することができる。本発明に有用なコリネバクテリウム属微生物の例には、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウムグルタミカム、コリネバクテリウムテルモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)ＦＥＲＭＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウムフラバム(Brevibacterium flavum)ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ＡＴＣＣ１３８６９、およびこれらに由来するＬ−アミノ酸生産の変異体または菌株、例えばコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１１００１が含まれる。好ましくは、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１である。

本発明のコリネバクテリウム属微生物において、ａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡおよびｐｙｃは、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０および３７のヌクレオチド配列を有し、各々が固有のプロモーターおよび終止コドンを含む。

本発明のコリネバクテリウム属微生物は、それぞれ図２〜図６の切断地図を有するベクターｐＤＺ−２ａｓｐＢ、ｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄ、ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢ、ｐＤＺ−２ｌｙｓＡおよびｐＤＺ−２ｐｙｃがコリネ型細菌群に形質転換されたものであってもよい。これらのベクターは、所定の順番で、または同時に導入することができる。上述したように、外来プロモーターが前記遺伝子の開始コドンの上流にそれぞれ挿入されたものであってもよい。前記微生物は、好ましくは、ａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡおよびｐｙｃの追加のそれぞれのコピーを少なくとも１つそのゲノムＤＮＡ内に有している。別の実施形態或いはより好適な実施形態では、各遺伝子の内在性プロモーターと開始コドンとの間に強力な外来プロモーターが挿入されている。外来遺伝子のゲノムＤＮＡ内への挿入は、当該分野で周知の方法、例えば相同組み換えによって行われ得る。

受託番号ＫＣＣＭ１０７７０ＰのコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１００８−ＣＪ５が、本発明において特に有用である。本菌株は、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１に、それぞれ図２〜図５の切断地図を有するｐＤＺ−２ａｓｐＢ、ｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄ、ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢおよびｐＤＺ−２ｌｙｓＡを導入し、選択培地でその形質転換体を培養して、外来遺伝子のａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびｌｙｓＡをそれぞれの内因性対立遺伝子と相同組み換えすることによって得ることができ、この株は、結果として２コピーのａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびｌｙｓＡをゲノムＤＮＡ内に有している。前記菌株は、母菌株より高い効率でＬ−リジンを生産することができる。また、前記菌株に、図６の切断地図を有するベクターｐＤＺ−２ｐｙｃをさらに導入し、ゲノムＤＮＡ内に２コピーのｐｙｃを有するようにすることによって、Ｌ−リジンの生産効率をより高めることができる。

本発明の別の様相によれば、本発明は、個々の遺伝子について固有プロモーターと開始コドンとの間に外来プロモーターを挿入することを含む、高収率でＬ−リジンを産生する方法を提供する。

本発明の実施形態において、リジン生合成遺伝子の各プロモーターは、それぞれ外来の強力なＣＪ７プロモーターに置換される。本発明において有用なＣＪ７プロモーターは、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）由来の配列番号４４に示されるヌクレオチド配列を有する強力なプロモーターであって、本出願人によって以前に開発されたものである（韓国特許第ＫＲ−０６２００９２号）。コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１のｌｙｓＣを発現させる場合、ＣＪ７プロモーターが内在性プロモーターを用いるときよりアスパラギン酸キナーゼの活性が約２倍増加することを確認した。本明細書においては、ＣＪ７プロモーターを用いた実施例のみが提供されているが、韓国特許第ＫＲ−０６２００９２号に開示された、コリネバクテリウムアンモニアゲネス由来のそれぞれ配列番号４５〜５０に示されるヌクレオチド配列を有するＣＪ１〜ＣＪ６プロモーターが、ＣＪ７プロモーターと同一の方式でリジン生産菌株の調製のために使用できることが理解されるべきである。よって、ＣＪ１〜ＣＪ６プロモーターは、ＣＪ７プロモーターと同様に、本発明に係る目的遺伝子の発現レベルを増加させるために有用な外来プロモーターの範囲に含まれる。

本発明の別の様相によれば、本発明は、本発明に係る微生物を培養して細胞内でＬ−リジンを発現させるか、あるいは培地中にＬ−リジンを放出する工程と、前記細胞または培地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンの生産方法を提供する。

前記培養工程は下記にさらに詳しく説明する。

本発明に係るＬ−リジン生産方法における微生物については、上述したとおりである。

前記培養工程については、当該分野で周知の種々のプロセスの１つを使用できる。前記コリネバクテリア属株は、例えば流加回分工程（fed batch process）または繰り返し流加回分工程（repeated fed batch process）など、回分工程または連続工程で培養することができる。

培養に用いられる培地は、培養される株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリア属種に対する培養培地は周知である（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981）。培養に有用な炭素源の例としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースなどの糖類および炭水化物；大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油および脂質；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸；グリセロール、エタノールなどのアルコール；および酢酸などの有機酸が含まれる。これらの物質は単独でまたは組み合わせて使用できる。本発明のバクテリアの培養培地に有用な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、コーンスティープソリッド（corn steep solid）、大豆粉、尿素、ならびに例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機化合物が含まれ得る。このような窒素源は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。培地中の窒素源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ニカリウム、またはこれらのナトリウム含有塩を使用することができる。また、培養培地は、微生物の成長に必要な成分として、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を必要とする。また、アミノ酸およびビタミンなどの他の必要成分が培養培地に含まれる。また、これらの成分それ自体の代わりに、その前駆体を使用することもできる。前述した成分は、培養過程で培養物に回分式または連続式で微生物の培養物に添加できる。

培養物のｐＨは、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩基性化合物、またはたとえばリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を用いて調整することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を添加して気泡の生成を抑制することができる。好気状態は、培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入することによって維持することができる。有機体を培養する間、培養培地は、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃の範囲で維持される。培養は、Ｌ−アミノ酸の生成量が最大に得られるまで行い続ける。この点に関し、Ｌ−リジンの最大量を得るには、１０〜１６０時間かかる。このアミノ酸は培養培地中に放出される場合もあるし、あるいは細胞中にとどまる場合もある。

回収工程は、下記のとおり実施される。細胞または培養培地からＬ−リジンを回収する方法は、当該分野で周知である。Ｌ−リジン回収方法の例としては、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣが挙げられるが、これらに限定されない。

有利な効果
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、そしてさらにピルビン酸カルボキシラーゼの内在性活性よりも高い酵素活性を有するので、Ｌ−リジン生産能を高収率で産生することができる。

よって、本発明のコリネバクテリウム属微生物の使用を特徴とする方法は、Ｌ−リジンを高効率で生産するために使用することができる。

図１はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子(nuclear-targeted gene)を挿入するためのベクターｐＤＺを示す図である。図２はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ａｓｐＢを示す図である。図３はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄを示す図である。図４はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢを示す図である。図５はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＡを示す図である。図６はコリバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ｐｙｃを示す図である。図７はｐＤＺ−ＰＣＪ７ベクターを示す図である。図８はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ａｓｐＢベクターを示す図である。図９はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｌｙｓＣベクターを示す図である。図１０はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｄａｐＡベクターを示す図である。図１１はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｄａｐＢベクターを示す図である。図１２はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｌｙｓＡベクターを示す図である。図１３はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｐｙｃベクターを示す図である。

以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

［実施例１：核標的化遺伝子を挿入するためのベクター（ｐＤＺ）の構築およびこれを用いた遺伝子の挿入］
本実施例では、大腸菌（E. coli）クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄｂｉｏｌａｂ、ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｔｉｏｎ＃Ｘ０６４０２）を基本ベクターとして使用し、コリネバクテリウム属の染色体を運ぶための組み換えベクターｐＤＺを構築した。その製作過程は次のとおりである。

ｐＡＣＹＣ１７７ベクターをＡｃｕIおよびＢａｎI制限酵素で処理した後、クレノウ酵素処理によって平滑末端化した。選別マーカーとして用いられる大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子は、大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０の核ＤＮＡからＰＣＲによって自身のプロモーターを含むように遺伝子増幅した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼ処理によって５’末端のリン酸化および平滑化を行うことにより調製した。これらの２種のＤＮＡ断片を互いにライゲーションして環状ＤＮＡ分子を得、この環状ＤＮＡ分子の制限酵素部位ＢａｍＨＩに人為的に合成した多数の制限酵素認識部位を含んでいるアダプター配列を挿入し、コリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺを構築した。図１はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺのマップを示す図である。

その後、コリネバクテリウム属の核ＤＮＡに目的の遺伝子を挿入した。このために、目的遺伝子を連続的に２コピー含有しているｐＤＺベクターをＬ−リジン生産菌株としてのコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１にエレクトロポレーションによって形質転換し（Appl. Microbiol. Biotechnol.(1999) 52:541-545による電気パルス法を用いる）、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有した選別培地で、染色体上に目的の遺伝子が挿入された形質転換体を相同性によってスクリーニングした。ベクターを用いた核ＤＮＡへの成功的な遺伝子の挿入は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含んだ固体培地で青色が出現することで示された。核に挿入された１次菌株を栄養培地で振とう培養（３０℃、８時間）した後、それぞれ１０−４から１０−１０まで連続的に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。増殖した大部分のコロニーが青色を帯びた。低い割合の白色のコロニーを選別した。交叉(crossover)によってゲノム内に挿入されたベクター配列がゲノムから除去されるで、これらの２次選別された菌株はベクター配列を有していない。これらの菌株は、最終的にカナマイシンに対する感受性について試験し、ＰＣＲによる遺伝子構造確認過程を経て最終選定された。

［実施例２：変異によるリジン産生コリネバクテリウムグルタミカム（ＫＦＣＣ−１０８８１）の調製］
リジン生合成経路に関係する複数の遺伝子が挿入された菌株は、Ｓ−（２−アミノエチル）システイン（以下「ＡＥＣ」という）に対する耐性およびホモセリン漏れ(homoserine leaky)の特徴を有するコリネバクテリウムグルタミカム（ＫＦＣＣ−１０８８１）をベースとした。

前記変異株ＫＦＣＣ−１０８８１は、コリネバクテリウムグルタミカム野生株（ＡＴＣＣ１３０３２）から調製した。突然変異誘発源であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、「ＮＴＧ」という）を細胞１０^７〜１０^８／ｍＬの濃度で母株を含む培地に対して３０℃で５００μｇ／ｍＬで３０分間処理し、ＡＥＣを５ｇ／Ｌの濃度で含有した複合プレートで成長するコロニーを選択した。前記１次変異株に対するＡＥＣ耐性度とリジン生産能を分析した後、ＮＴＧによる２次変異を誘導した。その後、形成された複数のコロニーを、ホモセリンを添加した最小培地とホモセリンが添加されていない最小培地に接種(tooth picking)することにより、ホモセリンが添加されていない最小培地で成長できないホモセリン要求性菌株（２次変異株）を分離した。このホモセリン要求性菌株からさらにホモセリン漏れ型菌株を作製するために３次変異を誘導した。この株は、ホモセリン１０ｍｇ／Ｌが含有された最小培地に接種することによって同定した。培地中で成長する菌株を、リジン生産能について試験した（表１）。最終的にＡＥＣ耐性およびホモセリン漏れ型の特徴を有するリジン生産菌株を獲得し、これを社団法人韓国種菌協会（Korean Federation of Culture Collection）に寄託し、寄託番号第ＫＦＣＣ−１０８８１号を与えられた。この実施例で使用した前記最小培地と前記生産培地は下記のとおりである。

［最小培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、コーンスティープソリッド(Corn Steep Solids) ５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）
［生産培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、コーンスティープソリッド(Corn Steep Solids) ５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）。

［実施例３：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１由来のａｓｐＢ遺伝子のクローニング、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ａｓｐＢ）の構築、およびａｓｐＢ挿入菌株の調製］
本実施例では、実施例２で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１の核ＤＮＡを鋳型として用い、リジン生合成経路に関与するａｓｐＢ遺伝子に対してＰＣＲを行った。米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨＧｅｎＢａｎｋ）のデータからａｓｐＢ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、Ｎｃｇｌ０２３７）を得て、これを使用して２組のプライマーを設計し、プロモーター領域から終止コドンにわたるａｓｐＢ遺伝子を増幅させた（表２）。

コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号１と２のオリゴヌクレオチドまたは前記配列番号３と４のオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａ^TM高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５３℃、３０秒；および伸長反応７２℃、２分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。このようにして得たＰＣＲ産物は、１，４９３ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ２種のａｓｐＢ遺伝子（ａｓｐＢ−ＡおよびａｓｐＢ−Ｂ）であった。ａｓｐＢ−Ａは配列番号１と２のセットにより、ａｓｐＢ−Ｂは配列番号３と４のセットにより産生された。このＰＣＲ産物をＴＯＰＯＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、組換えベクターｐＣＲ−ａｓｐＢ−ＡおよびｐＣＲ−ａｓｐＢ−Ｂを得た。これらのｐＣＲベクターを、ａｓｐＢ−ＡとａｓｐＢ−Ｂの反対の末端（opposite end）に特異的な制限酵素（ａｓｐＢ−Ａ：ＳａｍＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｓｐＢ−Ｂ：ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｈｅＩ）でそれぞれ処理し、前記ｐＣＲベクターからａｓｐＢ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクターのＥｃｏＲＶ−ＮｈｅＩ部位に３ピースライゲーション(3-piece ligation)によってクローニングし、ａｓｐＢの２コピーが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ−２ａｓｐＢを製作した。図２は、コリネバクテリウム属に核標的化遺伝子を挿入するためのｐＤＺ−２ａｓｐＢベクターのマップである。

組換えベクターｐＤＺ−２ａｓｐＢを、実施例２で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ上でａｓｐＢ遺伝子のすぐ隣に１コピーのａｓｐＢ遺伝子をさらに挿入して、２コピーのａｓｐＢ遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、これをコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ１と名づけた。２コピーのａｓｐＢ遺伝子が隣接して位置することは、この２コピーのａｓｐＢ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能な配列番号１７と１８（表３）のプライマーセットを用いたＰＣＲによって最終確認した。

［実施例４：リジン生産コリネバクテリウムグルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１由来のｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子の構築、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄ）の製作、およびｌｙｓＣ／ａｓｄ挿入菌株の調製］
実施例３と同様の方法で、ｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子の塩基配列の情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、Ｎｃｇｌ０２４７〜０２４８）をＮＩＨＧｅｎＢａｎｋのデータから得て、これを用いて２組のプライマーを設計し、ａｓｐＢ遺伝子をプロモーター領域から終止コドンの範囲まで増幅した（表４）。

コリネバクテリウムグルタミクムＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１と２のオリゴヌクレオチドまたは配列番号３と４のオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａ^TM高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５２℃、３０秒；および伸長反応７２℃、３分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。

こうして得たＰＣＲ産物は、２，８０５ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ２種のｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子（ｌｙｓＣ／ａｓｄ−ＡおよびｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ｂ）であった。ｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ａは配列番号５と６のセットによって、ｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ｂは配列番号７と８のセットによってそれぞれ産生された。前記ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして、組換えベタターｐＣＲ−ｌｙｓＣ／ａｓｄ−ＡとｐＣＲ−ｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ｂを得た。

これらのｐＣＲベクターを、ｌｙｓＣ／ａｓｄ−ＡおよびｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ｂの反対の末端に特異的な制限酵素（ｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳａｍＩ、ｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ｂ：ＳａｍＩ＋ＰｖｕＩ）でそれぞれ処理し、前記ｐＣＲベクターからｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクターのＢａｍＨＩ−とＰｖｕＩ部位に３ピースライゲーション(3-piece ligation)によってクローニングし、２コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄを得た。図３は、コリネバクテリウム属に核標的化遺伝子を挿入するためのｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄベクターのマップである。

組換えベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄを、実施例３で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ１に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ上でｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子をさらに挿入し、２コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子を有するリジン生産菌株を産生し、この株をコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ２と名付けた。２コピーのａｓｐＢ遺伝子が隣接して位置することは、この２コピーのａｓｐＢ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット（図５）を用いたＰＣＲによって最終確認した。

［実施例５：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１由来のｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子のクローニング、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢ）の構築、およびｄａｐＡ／ｄａｐＢ挿入菌株の調製］
ｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、Ｎｃｇｌ１８９６〜１８９８）をＮＩＨＧｅｎＢａｎｋのデータから得た。ｄａｐＡ遺伝子は、ｄａｐＢ遺伝子とオペロンを含み、それらの間には機能が解明されていないＯＲＦ（Ｎｃｇｌ１９８７）があることが確認された。この情報を用いて２組のプライマーを設計し、ｄａｐＢプロモーターから終止コドンにおよぶｄａｐＢ−ＯＲＦ（Ｎｃｇｌ１８９７）−ｄａｐＡ遺伝子全体を増幅した（表６）。

コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、配列番号９と１０のオリゴヌクレオチドまたは配列番号１１と１２のオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５２℃、３０秒；および伸長反応７２℃、３分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。

こうして得たＰＣＲ産物は、３，２１０ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ２種のｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子（ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ａ、ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ｂ）であった。ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ａは配列番号９と１０のセットによって、ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ｂは配列番号１１と１２のセットによってそれぞれ産生された。前記ＰＣＲ産物をＴＯＰＯＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして、組換えベクターｐＣＲ−ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−ＡとｐＣＲ−ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ｂを得た。

これらのｐＣＲベクターを、ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−ＡおよびｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ｂの反対の末端に特異的である対応する制限酵素（ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ａ：ＥｃｏＲＩ＋ＳａｃＩ、ｄｐａＡ／ｄａｐＢ−Ｂ：ＳａｃＩ＋ＸｈｏＩ）で処理し、前記ｐＣＲベクターからｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクターのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に３ピースライゲーション(3-piece ligation)によってクローニングし、２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢを構築した。図４は、ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢベクターのマップである。

組換えベクターｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢを、実施例４で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ２に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ上でｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子をさらに挿入して、２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ３と名付けた。２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子が隣接して位置することは、２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット（表７）を用いたＰＣＲによって最終確認した。

［実施例６：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１由来のｌｙｓＡ遺伝子のクローニング、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ｌｙｓＡ）の構築、およびｌｙｓＡ挿入菌株の調製］
ｌｙｓＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、Ｎｃｇｌ１１３２〜１１３３）をＮＩＨＧｅｎＢａｎｋのデータから得た。ｌｙｓＡ遺伝子を分析すると、ａｒｇＳ遺伝子（ａｒｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡシンテターゼ）とオペロンを含んでいた。この情報を使用して、ａｒｇＳのプロモーターから終止コドンにおよびａｒｇＳ−ｌｙｓＡ遺伝子全体を増幅するための２組のプライマーを設計した（表８）。

コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３と１４のオリゴヌクレオチドまたは配列番号１５と１６のオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５２℃、３０秒；および伸長反応７２℃、４分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。

こうして得たＰＣＲ産物は、３，３５９ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ２種のａｒｇＳ／ｌｙｓＡ遺伝子（ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−ＡおよびａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂ）であった。ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ａは配列番号１３と１４のセットによって、ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂは配列番号１５と１６のセットによって、それぞれ産生された。前記ＰＣＲ産物をＴＯＰＯＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして、組換えベクターｐＣＲ−ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−ＡとｐＣＲ−ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂを得た。

これらのｐＣＲベクターを、ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−ＡおよびａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂの反対の末端に特異的な対応する制限酵素（ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ａ：ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｏｔＩ、ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂ：ＮｏｔＩ＋ＸｂａＩ）で処理し、前記ｐＣＲベクターからａｒｇＳ／ｌｙｓＡ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に３ピースライゲーションでクローニングし、２コピーのａｒｇＳ／ｌｙｓＡ２コピーが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＡを構築した。図５は、ｐＤＺ−２ｌｙｓＡベクターのマップである。

組換えベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＡを、実施例５で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ３に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ上でｌｙｓＡ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｌｙｓＡ遺伝子をさらに挿入して、２コピーのｌｙｓＡ遺伝子を含むリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４と名付けた。２コピーのｌｙｓＡ遺伝子が隣接して位置することは、２コピーのｌｙｓＡ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット（表９）を用いたＰＣＲによって最終確認した。

インビボでリジン生合成に関連した６種の遺伝子を有するリジン生産菌株のコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４を２００６年８月２１日付けで韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１０７７０Ｐを与えられた。

［実施例７：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１由来のｐｙｃ遺伝子のクローニング、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｙｃ）の構築、およびｐｙｃ挿入菌株の調製］
実施例３と同様一の方法で、ｐｙｃ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、Ｎｃｇｌ０６５９）をＮＩＨＧｅｎＢａｎｋのデータから得て、これを用いて２組のプライマーを設計し、プロモーター領域から終止コドンにおよぶｐｙｃ遺伝子を増幅した（表１０）。

コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３１と３２のオリゴヌクレオチドまたは配列番号３３と３４のオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５２℃、３０秒；および伸長反応７２℃、４分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。こうして得たＰＣＲ産物は、３９２５ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ２種のｐｙｃ遺伝子（ｐｙｃ−Ａおよびｐｙｃ−Ｂ）であった。ｐｙｃ−Ａは配列番号３１と３２のセットによって、ｐｙｃ−Ｂは配列番号３３と３４のセットによって、それぞれ産生された。前記ＰＣＲ産物をＴＯＰＯＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして、組換えベクターｐＣＲ−ｐｙｃ−ＡおよびｐＣＲ−ｐｙｃ−Ｂを得た。

これらｐＣＲベクターを、ｐｙｃ−Ａおよびｐｙｃ−Ｂの反対の末端に特異的な対応する制限酵素（ｐｙｃ−Ａ：ＸｂａＩ＋ＥｃｏＲＶ、ｐｙｃ−Ｂ：ＥｃｏＲＶ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）で処理し、前記ｐＣＲベクターからｐｙｃ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に３ピースライゲーションでクローニングし、２コピーのｐｙｃが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ−２ｐｙｃを構築した。図６は、ｐＤＺ−２ｐｙｃベクターのマップである。

組換えベクターｐＤＺ−２ｐｙｃを、実施例６で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ上でｐｙｃ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｐｙｃ遺伝子をさらに挿入して、２コピーのｐｙｃ遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ５と名付けた。２コピーのｐｙｃ遺伝子が隣接して位置することは、２コピーのｐｙｃ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット（表１１）を用いたＰＣＲによって最終確認した。

その結果、リジン生合成に関連した７種の遺伝子を有するリジン生産菌株のコリバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ５を獲得した。

［実施例８：リジン生合成遺伝子複合挿入菌株におけるリジン生産］
それぞれ実施例６と実施例７で調製した、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリアグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４とＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ５を、Ｌ−リジンの生産のために、下記の方法で培養した。

下記の種培地２５ｍＬを含有する２４０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４およびＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ５を接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍにて振とう培養した。その後、下記の生産培地２４ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに、前記培養された１ｍＬの種培養液をそれぞれ接種し、３０℃で１２０時間２００ｒｐｍにて振とう培養した。前記種培地と前記生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりである。
［種培地（ｐＨ７．０）］
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４８ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１Ｌ基準）
［生産培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、コーンスティープソリッド５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）。

培養終了の後、ＨＰＬＣ分析を行って、これらの株によって産生されたＬ−リジンの量を測定した。コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４およびＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ５の培養物中のＬ−リジンの濃度は、以下の表１２のとおりである。

表１２に示すように、６個のリジン生合成に関与する遺伝子を有するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１に比べてリジンの生産が約７％程度増加したことを確認した。また、６個のリジン生合成遺伝子に加えてｐｙｃ遺伝子も有するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ５は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１に比べてリジンの生産が約８％程度増加したことを確認した。

［実施例９：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１由来の３コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ挿入菌株の調製］
実施例４で調製した組換えベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄを、実施例６で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ上で隣接する２コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子をさらに挿入して、３コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ６と名付けた。３コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子が連続して整列していることは、３コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子のなかの連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット（表１３）を用いたＰＣＲによって最終確認した。

リジン生産菌株のコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ６のアスパラギン酸キナーゼの活性を、ＰｅｃｈｅｒｅＪ−ＦとＣａｐｏｎｙＪ−Ｐのアスパラギン酸ヒドロキサメートを用いた測定法(Anal Biochem 22 : 536-539, 1968)によって測定した結果、ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ６がＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４より２．１倍程度高い活性を持つことを確認した。

［実施例１０：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１由来の３コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子挿入菌株の調製］
実施例５で調製した組換えベクターｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢを、実施例９で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ６に形質転換し、交差過程を経て核ＤＮＡ上で隣接する２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子をさらに挿入して、３コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ７と名付けた。３コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子が連続して整列していることは、３コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子のなかの連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット（表１５）を用いたＰＣＲによって最終確認した。

［実施例１１：リジン生合成に関係する複合遺伝子複合挿入菌株におけるリジン生産］
実施例１０で調製したＬ−リジン生産菌株としてのコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ７を、Ｌ−リジンの生産のために、下記の方法で培養した。

下記の種培地２５ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４とＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ７を接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、下記の生産培地２４ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに、各々の培養物１ｍＬを接種し、３０℃で１２０時間（２００ｒｐｍ）で振とう培養した。前記種培地および前記生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりである。
［種培地（ｐＨ７．０）］
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４８ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１Ｌ基準）
［生産培地（ｐＨ７.０）］
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、コーンスティープソリッド５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）。

培養終了の後、ＨＰＬＣ分析を行って、これらの株によって産生されたＬ−リジンの量を測定した。コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４とＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ７の培養物中のＬ−リジンの濃度は、以下の表１６のとおりである。

表１６に示すように、３個のリジン生合成に関与する遺伝子を三重で有するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ７は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４に比べてリジンの生産が約１１％程度増加したことを確認することができた。

［実施例１２：リジン生合成遺伝子についてのプロモーター置換用ベクターの構築、および外来プロモーター置換の菌株の調製］
本実施例では、ｐＤＺを基本ベクターとして使用し、リジン生合成遺伝子の固有のプロモーターを外来の強力なＣＪ７プロモーターで置換した。ＣＪ７プロモーターは、配列番号４４〜５０に示される塩基配列を有するコリネバクテリウムアンモニアゲネス由来の強力なプロモーターであって、本出願人に対して許可された韓国特許第０６２００９２号において開示されている。コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１の核ｌｙｓＣをＣＪ７プロモーターの存在下で発現させた場合、固有プロモーターを用いたときよりアスパラギン酸キナーゼの活性が約２倍程度増加することを確認した。

ＣＪ７プロモーターをリジン生産菌株の核ＤＮＡ上に導入するためのベクターは、以下のとおり調製した。

まず、ｐＤＺベクターを制限酵素ＸｂａＩとＮｄｅＩで処理した。コリネバクテリウムアンモニアゲネスの核ＤＮＡのＣＪ７プロモーターから増幅するＰＣＲ産物の５’末端および３’末端に、それぞれＸｂａＩ部位とＮｄｅＩ部位とを挿入するように設計したプライマーとして、配列番号４２および４３（表１７）を用いてＰＣＲを行った。ＣＪ７プロモーターＰＣＲ増幅産物をＸｂａＩとＮｄｅＩで処理した後、切断型（truncated）ｐＤＺベクターに連結することにより、菌株の核ＤＮＡ上にＣＪプロモーターを導入するための１次プラスミドとして機能するｐＤＺ−ＰＣＪ７を製作した（図７）。

実施例２で調製したリジン生産菌株のコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、核ＤＮＡ上に導入される遺伝子のそれぞれの固有のプロモーターをＣＪ７プロモーターで置換するために必要な２種のＤＮＡフラグメント、すなわち固有プロモーターの部分フラグメント（約３００ｂｐ）と＋２コドンから下流側へ約３００ｂｐ程度のＯＲＦの一部を得た。このＰＣＲに使用したプライマーは、固有プロモーターの部分フラグメントのＰＣＲ産物の反対の末端にＸｂａＩ部位を挿入し、そして部分ＯＲＦのＰＣＲ産物の反対の末端にＮｄｅＩ部位が挿入されるように設計した。これらのＰＣＲ産物をそれぞれの制限酵素で処理した。ｐＤＺ−ＰＣＪ７は、固有プロモーターの部分フラグメントの切断型ＰＣＲ産物にライゲーションするためにＸｂａＩで消化し、次いで、部分ＯＲＦの切断型ＰＣＲ産物にライゲーションするためにＮｄｅＩで消化して、組換えプラスミドを構築した。これらはそれぞれｐＤＺ−ＰＣＪ７−ａｓｐＢ、ｐＤＺ−ＰＣＪ７−ｌｙｓＣａｓｄ、ｐＤＺ−ＰＣＪ７−ｄａｐＡ、ｐＤＺ−ＰＣＪ７−ｄａｐＢ、ｐＤＺ−ＰＣＪ７−ａｒｇＳｌｙｓＡおよびｐＤＺ−ＰＣＪ７−ｐｙｃと命名した。これらはそれぞれ２つのＰＣＲＤＮＡフラグメントの間に位置するＣＪ７プロモーターを含んでいた（図８〜図１３）。

前記プラスミドを、以下の標的遺伝子の組み換えのために使用した。まず、組換えベクターｐＤＺ−ＰＣＪ７−ａｓｐＢをリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１に形質転換した後、交叉過程を経て、核ＤＮＡ上でａｓｐＢ遺伝子のプロモーター領域にＣＪ７プロモーターが挿入された菌株を獲得した。これと同一の方法で、ＣＪ７プロモーターがａｓｐＢ、ｌｙｓＣａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびａｒｇＳｌｙｓＡ遺伝子のプロモーター領域に位置する新規株ＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＪ７−５を作製するために、他の組み換えプラスミドを形質転換した。これらのプロモーターに加えて、ｐｙｃ遺伝子のプロモーターまでＣＪ７プロモーターで置換して、ＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−６も製作した。

［実施例１３：リジン生合成遺伝子のための外来プロモーターを有する菌株におけるリジン生産］
Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−５とＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−６を、Ｌ−リジンの生産のために、下記の方法によって培養した。

下記の種培地２５ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ−１０８８１ＰＣＪ７−５およびＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−６をそれぞれ接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、各々の培養物１ｍＬを下記の生産培地２４ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに接種し、３０℃で１２０時間（２００ｒｐｍ）で振とう培養した。前記種培地および前記生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりである。
［種培地（ｐＨ７．０）］
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４８ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１Ｌ基準）
［生産培地（ｐＨ７.０）］
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、コーンスティープソリッド５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）。

培養終了の後、ＨＰＬＣ分析を行って、これらの株によって産生されたＬ−リジンの量を測定した。コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−５およびＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−６の培養物中のＬ−リジンの濃度は、以下の表１８のとおりである。

表１８に示すように、６個のリジン生合成に関与する遺伝子がそれぞれ外来ＣＪ７プロモーターを有するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−５と、前記６個の遺伝子とプロモーターに加えて、さらにｐｙｃ遺伝子とそのＣＪ７プロモーターを有するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−６は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１に比べてリジンの生産がそれぞれ約１７．４％と１８．６％増加したことを確認することができた。

［実施例１４：リジン生合成に関係する追加遺伝子を有し、置換された外来プロモーターを有する菌株におけるリジン生合成酵素の活性］
実施例６、実施例１０および実施例１２でそれぞれ調製した、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４、ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ７およびＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−５を、リジン生合成酵素の代表として、酵素活性の測定が比較的容易なアスパラギン酸キナーゼとジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性についてアッセイした。この改変されたリジン産生菌株は、アスパラギン酸キナーゼの活性はＰｅｃｈｅｒｅＪ−ＦとＣａｐｏｎｙＪ−Ｐの測定法(Anal Biochem 22:536-539, 1968)によって測定し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性はＪ．Ｃｒｅｍｅｒなどの測定法によって測定した結果、最初の母菌株であるＫＦＣＣ１０８８１に比べて酵素活性が増加したことを確認した（表１９）。

Claims

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性がそれぞれの内在性活性と比較して増加した、コリネバクテリウム属微生物。
前記微生物は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性と比較して増加している、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コリネ型細菌群のａｓｐＢ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子およびｌｙｓＡ遺伝子の発現の増加によるものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記ピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コリネ型細菌群のｐｙｃ遺伝子の発現の増加によるものである、請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記発現の増加は、前記微生物の内在性遺伝子に対応する外来対立遺伝子の１つ以上のコピーを導入されることによるものである、請求項３または４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記微生物は、受託番号ＫＦＣＣ１０８８１のコリネ型細菌群である、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記ａｓｐＢ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｌｙｓＡ遺伝子およびｐｙｃ遺伝子は、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０および３７のヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記導入は、それぞれ図２〜図６の切断地図を有するベクターをコリネ型細菌群に形質転換することにより行われる、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記外来の対立遺伝子は、前記微生物の核ＤＮＡに挿入される、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記微生物は、受託番号ＫＣＣＭ１０７７０ＰのコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４である、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記発現の増加は、各遺伝子に対する外来プロモーターの導入によってなされる、請求項３〜１０のいずれか１項に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記外来プロモーターは、配列番号４４〜５０のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記外来プロモーターは、配列番号４４に示されるヌクレオチド配列である、請求項１２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記外来プロモーターの導入は、図８〜図１３に示されるベクターの少なくとも一つをコリネ型細菌群に導入することにより行われる、請求項１１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の微生物を培養する工程と、
前記微生物の細胞または細胞培養物からリジンを回収する工程段階とを含む、Ｌ−リジンの生産方法。