KR101621243B1

KR101621243B1 - L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법

Info

Publication number: KR101621243B1
Application number: KR1020140113339A
Authority: KR
Inventors: 김효진; 이성근; 문준옥; 김형준; 김창겸; 조승현
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2016-05-16
Also published as: KR20160025884A; WO2016032158A1

Abstract

ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 (ATP-generating phosphoenolpyruvate carboxykinase) 활성이 도입 또는 증가된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물 및 이를 이용한 L-라이신의 생산 방법이 제공된다.

Description

L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법{Corynebacterium microorganism having L-lysine productivity and method for producing L-lysine using the same}

본 발명은 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물 및 이를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

생체 내에서 단백질 및 핵산 등과 같은 물질을 생합성하기 위해서는 에너지가 요구된다. 생체 내에서 사용되는 에너지의 대부분은 NADH, NADPH 및 ATP의 형태로 보존되어 이용된다. 특히, ATP는 해당과정(glycolysis)을 통해 일어나는 기질수준 인산화 반응 (substrate level phosphorylation)이나 해당과정 중에 NADH 등에 축적된 환원력을 이용하여 전자전달계를 통해 ATP를 생성하는 산화적 인산화 반응 (oxidative phosphorylation)으로 주로 생성된다. 생성된 ATP는 생합성, 운동, 신호전달 및 세포 분열과 같은 생체 내의 활동에서 소비되므로 유용한 목적 물질을 생산하는 산업용 미생물은 APT에 대한 요구도가 높은 편이다.

포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase)는 EC 4.1.1. 로 분류된다. 이 효소는 효소의 에너지의 근원에 의해, EC 4.1.1.32로 분류되는 GTP 의존성인 PCK (PCK1, PCK2)와 EC 4.1.1.49로 분류되는 ATP 의존성인 PEPCK로 구별될 수 있다. 일반적으로, 코리네박테리움의 pck는 글루코스신생합성(gluconeogenesis) 과정에 관여하여 TCA 회로의 중간 산물인 옥살로아세테이트의 포스포에놀 파이루베이트로의 전환 반응을 촉매 하는 것으로 알려졌다. 상기 pck는 guanosine 5'-triphosphate (GTP)-dependent enzyme이다. 그러나, Ryan T. Gill의 보고(Metab Eng. 2011 Jan; 13(1):76-81.)에 의하면, 악티노바실러스 유래의 pepck는 포스포에놀 파이루베이트의 옥살로아세테이트로의 전환을 촉매하면서 ATP를 생성하는 것으로 보고되어 있다 (도 1).

본 발명자들은 라이신 생산효율을 높이기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, ATP 수준을 향상시키고 이에 의해 L-라이신의 생산성을 증가시키는 방법에 대한 연구를 수행하던 중 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물을 제공하는 것이다. 구체적인 예로 본 발명에서는 ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 활성이 도입 또는 증가된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물을 들고 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태는 ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제(ATP-generating phosphoenolpyruvate carboxykinase) 활성이 도입 또는 증가된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물을 제공한다.

상기 용어 "L-라이신 생산능을 갖는"은 미생물이 배지에서 배양되는 경우, 미생물내 또는 배지 내에 L-라이신을 생산하고 분비하는 능력을 갖는 것을 의미한다. 또한 상기 미생물은 야생형 또는 모균주보다 대량으로 미생물 내에 또는 배양 배지에 L-라이신을 생산하고 축적시킬 수 있는 미생물일 수 있다. 미생물이 L-라이신 생산능을 갖기 위해서는 L-라이신 유사체에 내성을 갖는 돌연변이를 가질 수 있으며, L-라이신 유사체의 예는 옥살라이신, 라이신 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸라이신, α-클로로캄프롤락탐등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, L-라이신 생합성계 효소의 1종 또는 2종 이상의 활성을 증가시킴으로써 미생물이 L-라이신 생산능을 가질 수 있다. 이러한 효소의 예로서는 디하이드로디피콜린산 신타제(dapA), 아스파르토키나제(lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dapB), 디아미노피멜산 데카복실라제(lysA), 디아미노피멜산 데하이드로게나제(ddh), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd) 및 아스파르타제(aspA)를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 당해 미생물은 L-라이신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-라이신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있을 수 있다. 이러한 효소의 예로서는 호모세린 데하이드로게나제, 라이신 데카복실라제 또는 말산 효소를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 (ATP-generating PEP-carboxykinase) (이하 "pepck"라고도 지칭할 수 있음)"는 포스포에놀피루베이트 (Phosphoenolpyruvate, PEP)를 옥살로아세테이트 (oxaloacetate, OAA)로 전환하는 효소로서, PEP + ADP + CO₂ ↔ OAA + ATP 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 pepck 효소는 EC 4.4.4.49에 속하는 효소일 수 있다.

구체적으로, 상기 "ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제"는 악티노바실러스(Actinoabcillus), 언에어로바이오스피리륨 (Anaerobiospirillum), 또는 트리파노소마(Trypanosoma)에서 유래한 것일 수 있으나, ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제의 활성을 나타내는 것이면 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제에 포함될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 예에 한정되지 않는다. 상기 악티노바실러스는 악티노바실러스 숙시노제네스 (Actinoabcillus succinogenes)를 포함할 수 있다. 상기 언에어로바이오스피리륨은 언에어로바이오스피리륨 숙시니시프로두센 (Anaerobiospirillum succiniciproducens)을 포함할 수 있다. 상기 트리파노소마는 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi)을 포함할 수 있으며, 이는 크루스파동편모충으로 불리울 수 있다. 상기 ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제는 서열번호 1, 9 또는 13의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 구체적으로는 70% 이상, 더욱 구체적으로는 80% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 90% 이상, 가장 구체적으로는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1, 9 또는 13의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 염기서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다. 상기 아미노산 서열번호 1, 9 또는 13의 유전자 ORF는 구체적으로 서열번호 4, 12 또는 16의 염기서열일 수 있으며, 유전암호의 축퇴성에 기인하여 상기 염기서열과 약 60% 이상, 구체적으로는 70% 이상, 더욱 구체적으로는 80% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 90% 이상, 가장 구체적으로는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 또한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 염기서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

본 명세서에 있어서, 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 정렬하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 개수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 개수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 개수를 비교 범위 내의 위치의 총 개수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%를 포함하는 서열 동일성일 수 있다.

본 발명에서 용어, 단백질의 활성의 "도입"은 내재적 단백질이 없는 미생물에 당해 활성을 외부로부터 부여하는 것을 의미하며, 예컨대 외부로부터 단백질 활성을 암호화하는 유전자를 도입하여 수행될 수 있다. 또한, 단백질 활성의 "증가"는, 미생물이 보유하고 있는 단백질의 활성 상태를 향상시키는 것을 의미한다. 비제한적인 예로서, 돌연변이 등에 의해 균주 내에 존재하는 단백질 자체의 활성을 증대시켜 본래 기능 이상의 효과를 도출하고/하거나, 균주 내에 존재하는 단백질의 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자를 추가적으로 도입, 프로모터 교체 또는 변형 및 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제의 발현의 증가는 상기 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자가 도입되거나, 상기 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 도입은 상기 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 염색체 삽입용 벡터를 도입하는 것에 의해 수행될 수 있다. 상기 유전자는 외인성 유전자일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 이종성(heterogenous)일 수 있다. 보다 구체적으로는, ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 외인성 유전자는 상기 유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터의 다운스트림 위치(downstream position)에 도입될 수 있다. 또한, 상기 유전자는 숙주 세포의 게놈에 포함될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한 상기 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 도입에 의하여 상기 유전자를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가될 수 있다. 상기 미생물은 1 내지 10 카피의 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자와 같은 복수의 유전자를 포함할 수 있다. 숙주 세포가 복수의 유전자를 포함하는 경우, 각각의 유전자는 동일한 유전자의 카피이거나 둘 이상의 상이한 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다.

상기 ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열은 개체 내에서 특정 상기 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 세그먼트를 의미하며, 프로모터, 전사조절인자 결합 부위, 리보좀 결합 부위, 또는 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 증가를 초래하는 발현 조절 서열의 변형은 발현 조절 서열의 활성을 더 증진시키도록 핵산 서열의 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의해 발현 조절 서열상의 변이를 유도하거나, 더 강한 활성을 갖는 발현 조절 서열로 교체하는 것에 의해 수행될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 코리네형 (Coryneform) 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 상기 코리네형 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (C. ammoniagenes), 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스 (C. pseudotuberculosis), 코리네박테리움 에피시엔스 (C. efficiens), 코리네박테리움 슈도제니탈리움 (C. pseudogenitalium), 코리네박테리움 제니탈리움 (C. genitalium), 코리네박테리움 아코렌스 (C. accolens), 코리네박테리움 아미콜라툼 (C. amycolatum), 코리네박테리움 마트루초티 (C.matruchotii), 코리네박테리움 카세이 (C. casei), 코리네박테리움 리보필로플라봄 (C. lipophiloflavum), 코리네박테리움 투버쿨로스테아리쿰 (C.tuberculostearicum), 코리네박테리움 제이케이움 (C. jeikeium), 또는 코리네박테리움 파우로메타볼룸 (C. paurometabolum) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 양태는 상기 코리네형 미생물을 배양하는 단계, 및 수득된 미생물의 배양액으로부터 L-라이신을 분리하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식, 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시킬 수 있도록 다양한 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 미생물 배양 배지들은 예를 들어 문헌 ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.)에 기재되어 있다.

상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원을 포함할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 알코올은 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.

상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다.

상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철을 포함할 수 있다.

상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식, 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.

상기 배양 방법에 있어서, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 상기 pH의 조정은 상기 배양물에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 또는 황산을 첨가하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 기포 생성 억제를 포함할 수 있다. 상기 기포 생성 억제는 소포제의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 소포제는 지방산 폴리글리콜 에스테르를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 배양물 내로 기체의 주입을 포함할 수 있다. 상기 기체는 배양물의 호기 상태를 유지하기 위한 어떤 기체도 포함할 수 있다. 상기 기체는 산소 또는 산소 함유 기체일 수 있다. 상기 산소 함유 기체는 공기를 포함한다. 상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 L-라이신의 생성량을 획득할 때까지 지속될 수 있고 예를 들면, 10 내지 100 시간일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양은 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다. L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의하여 분리되고 분석될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 L-라이신을 생산하는 방법은 수득된 미생물의 배양액으로부터 L-라이신을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. L-라이신의 분리는 본 발명의 미생물의 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-라이신을 정제 또는 회수하는 것에 의해 이루어질 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 양태에 따른 ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 활성이 도입 또는 증가된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물에 의하면, 상기 미생물의 L-라이신 생산 능력을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따른 L-라이신의 생산 방법에 의하면, L-라이신을 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 코리네박테리움 유래의 pck와 악티노바실러스 유래의 ATP를 생성하는 pepck의 대사 기작을 나타내는 도면이다. 코리네박테리움 유래의 pck는 옥살로아세테이트(OAA)를 포스포에놀피루베이트(PEP)로 전환하면서 GTP를 사용하는 반면, 악티노바실러스 유래의 pepck는 PEP를 OAA로 전환하면서 ATP를 생성한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. ATP 생성 pepck 유전자 탐색 및 선정

라이신의 대사경로에 관련된 40종의 화학 반응식을 이용하여 코리네박테리움의 라이신 생합성 대사 모델을 구축하였고, 이를 근거로 라이신 대사 경로의 재구성을 통해 이론 수율을 증가 시킬 수 있는 방법 (BMC Syst Biol. 2009 Dec 25; 3: 120., Genome Inform. 2002; 13: 214-23.)을 탐색한 결과, 코리네박테리움의 대사 모델에 ATP를 생성하는 pepck를 도입할 경우, 수율이 이론적으로 상승할 수 있을 것으로 예측하였다.

예측에 따라 NCBI와 KEGG 데이터베이스 기반으로 악티노바실러스 숙시노제네스 (Actinoabcillus succinogenes) 유래 pepck와 유사하게 ATP를 생성하는 pepck를 암호화할 것으로 예상되는 후보 유전자들과 그것을 보유한 생물을 조사하여, 표 1에 나타낸 바와 같이 70종의 미생물을 확보하였다. 그 중 포스포에놀파이루베이트에 대한 친화도가 높은 pepck를 보유한 3종의 생물을 선정하였다.

실시예 2. 악티노바실러스 숙시노제네스 유래 pepck 과발현 벡터 제작 및 pepck 과발현 균주 개발

상기 실시예 1에서 선정한 악티노바실러스 숙시노제네스 (Actinoabcillus succinogenes) 유래의 Pepck를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)로부터 pepck 및 주변 염기서열에 대한 정보(등록번호 NC_009655)를 획득하였다. 확보된 염기서열에 근거하여 악티노바실러스 숙시노제네스 유래 pepck를 증폭시키기 위한 프라이머를 합성하였다. pepck 단편을 확보하기 위하여 악티노바실러스 숙시노제네스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 2와 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 94 ℃에서 5분 동안 변성 후, 94℃에서 30초 동안 변성, 56℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 2분 동안 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분 동안 중합반응을 수행하였다. 그 결과 서열번호 4의 pepck ORF(1,617 bp)를 포함한 서열번호 5의 유전자 단편(1,817bp)을 수득하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 pcj7 프로모터 (한국 등록특허 제10-0620092호)를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(한국 등록특허 제10-0620092호) 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 6과 7의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성 후, 94℃에서 30초 동안 변성, 56℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃ 1분 동안 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분 동안 중합반응을 수행하였다. 그 결과 서열번호 8의 프로모터 단편(318bp)을 수득하였다.

증폭된 pcj7 프로모터 부위는 SalI과 NdeI을 처리하고, pepck 부위는 NdeI과 SalI을 처리하여 대장균-코리네박테리움 셔틀벡터 pCSEC 벡터(P15A ori, pBL1 ori, Sp^r)는 SalI을 처리하여 클로닝함으로써 플라스미드를 수득하였으며, 이를 pCSEC-pcj7-pepck(AS1)로 명명하였다. 수득한 발현벡터 pCSEC-pcj7-pepck(AS1)를 라이신 생산 균주인 KCCM11016P (상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11016P로 기탁번호를 부여받았음, 한국 등록특허 제10-0159812호)에 도입하여 pepck가 발현되는 형질전환체인 KCCM11016P/ pCSEC-pcj7-pepck(AS1)를 제작하였다.

실시예 3. 언에어로바이오스피리륨 숙시니시프로두센 유래 pepck 과발현 벡터 제작 및 pepck 과발현 균주 개발

상기 실시예 1에서 선정한 언에어로바이오스피리륨 숙시니시프로두센 (Anaerobiospirillum succiniciproducens) 유래의 Pepck를 코딩하는 유전자는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)로부터 pepck 및 주변 염기서열에 대한 정보(등록번호 U95960.1)를 획득하였다. 악티노바실러스 숙시노제네스의 Pepck의 아미노산 서열(서열번호 9)을 토대로 pepck 발현량을 향상시키기 위해 코리네박테리움에 맞는 codon 최적화 Tool(ExiProgen™)을 이용하여 유전자를 합성하였다. 합성된 언에어로바이오스피리륨 숙시니시프로두센의 pepck 유전자 합성물을 주형으로 Subcloning이 용이하도록 고안된 서열번호 10과 11의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 94 ℃에서 5분 동안 변성 후, 94℃에서 30초 동안 변성, 56℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 2분 동안 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분 동안 중합반응을 수행하였다. 그 결과 서열번호 12의 유전자 ORF 단편(1,599bp)을 수득하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 pcj7 프로모터를 확보하기 위하여 실시예 2와 동일한 방법으로 SalI의 제한효소부위를 포함한 서열번호 6과 NdeI의 제한 효소부위를 포함한 서열번호 7를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 pcj7 프로모터 부위는 SalI과 NdeI을, pepck부위는 NdeI과 SalI을 처리하여 대장균-코리네박테리움 셔틀벡터 pCSEC 벡터는 SalI을 처리하여 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였으며, pCSEC-pcj7-pepck(AS2)로 명명하였다. 수득한 발현벡터 pCSEC-pcj7-pepck(AS2)를 실시예 2와 동일한 라이신 생산 균주인 KCCM11016P에 도입하여 pepck가 발현되는 형질전환체인 KCCM11016P/ pCSEC-pcj7-pepck(AS2)를 제작하였다.

실시예 4. 트리파노소마 크루지 유래 pepck 과발현 벡터 제작 및 pepck 과발현 균주 개발

상기 실시예 1에서 선정한 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) 유래의 Pepck를 코딩하는 유전자는 서열번호 13로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)로부터 pepck 및 주변 염기서열에 대한 정보(등록번호 M91163.1)를 획득하였다. 트리파노소마 크루지의 Pepck(서열번호 13)의 아미노산 서열을 토대로 pepck 발현양을 향상시키기 위해 코리네박테리움에 맞는 codon 최적화 Tool(ExiProgen™)을 이용하여 유전자를 합성하였다. 합성된 트리파노소마 크루지의 pepck 유전자 합성물을 주형으로 Subcloning이 용이하도록 고안된 서열번호 14와 15의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 94 ℃에서 5분 동안 변성 후, 94℃에서 30초 동안 변성, 56℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 2분 동안 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분 동안 중합반응을 수행하였다. 그 결과 서열번호 16의 유전자 ORF 단편(1,419bp)을 수득하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 pcj7 프로모터를 확보하기 위하여 실시예 2와 동일한 방법으로 SalI의 제한효소부위를 포함한 서열번호 6과 NdeI의 제한 효소부위를 포함한 서열번호 7를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 pcj7 프로모터 부위는 SalI과 NdeI을, pepck부위는 NdeI과 SalI을 처리하여 대장균-코리네박테리움 셔틀벡터 pCSEC 벡터는 SalI을 처리하여 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였으며, pCSEC-pcj7-pepck(TC3)로 명명하였다. 수득한 발현벡터 pCSEC-pcj7-pepck(TC3)를 실시예 2와 동일한 라이신 생산 균주인 KCCM11016P 에 도입하여 pepck가 발현되는 형질전환체인 KCCM11016P/ pCSEC-pcj7-pepck(TC3)를 제작하였다.

실시예 5. 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 pck 과발현 벡터 제작 및 pck 과발현 균주 개발

상기 실시예 1에서 선정한 pepck의 대조군으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 pck를 코딩하는 유전자는 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열을 가진다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 pck 부위를 서열번호 18과 19의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 94 ℃에서 5분 동안 변성 후, 94℃에서 30초 동안 변성, 56℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 2분 동안 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분동안 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1,833bp의 pck의 유전자 단편을 수득하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 pcj7 프로모터를 확보하기 위하여 실시예 2와 동일한 방법으로 SalI의 제한효소부위를 포함한 서열번호 6과 NdeI의 제한 효소부위를 포함한 서열번호 7을 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 pcj7 프로모터 부위는 SalI과 NdeI을, pck부위는 NdeI과 SalI을 처리하여 대장균-코리네박테리움 셔틀벡터 pCSEC 벡터는는 SalI을 처리하여 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였으며, pCSEC-pcj7-pck로 명명하였다. 수득한 발현벡터 pCSEC-pcj7-pck를 실시예 2와 동일한 라이신 생산 균주인 KCCM11016P에 도입하여 pck가 발현되는 형질전환체인 KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pck를 제작하였다.

실시예 6. 다양한 미생물 유래 pepck 이 과발현된 KCCM11016P 기반 균주들의 L-라이신 생산능 분석

상기 실시예 2 내지 5에서 제작된 4종의 균주 KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS1), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS2), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(TC3), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pck의 특성을 알아보고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 라이신 생산능을 비교하고 배양액 성분을 분석하였다.

25 ㎖의 종 배지를 함유하는 250 ㎖의 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. KCCM11016P와 발명 균주에 대한 배양물 중의 L-라이신에 대한 결과는 아래 표 2 와 같다.

종배지 ( pH 7.0)

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

생산배지 ( pH 7.0)

포도당 100g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준).

균주	L-라이신(g/L)
균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
KCCM11016P/pCSEC	43.2	43.1	42.9	43.1
KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS1)	47.2	47.5	47.1	47.3
KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS2)	45.2	45.5	45.1	45.3
KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(TC3)	44.0	44.2	43.9	44.0
KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pck	43.2	43.1	42.9	43.2

L-라이신 농도 분석 결과, 제작된 KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pck는 대조군(KCCM11016P/pCSEC) 대비 라이신 수율이 동등한 반면, 나머지 균주 3종(KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS1), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS2), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(TC3))은 대조군(KCCM11016P/ pCSEC) 대비 L-라이신 수율이 최대 10% 증가함을 확인하였다.

실시예 7. 다양한 미생물 유래 pepck 과발현 균주들의 pepck 활성 측정

상기 실시예 2 내지 5에서 제작된 4종의 균주 KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS1), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS2), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(TC3), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pck에서의 ATP를 생성하는 pepck 효소의 활성 증가 정도를 확인하기 위하여, PEP를 기질로 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 활성 측정과 동시에 ATP 생성 유무를 확인하였다.

포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 활성 측정은 공지된 Troy A. Johnson의 측정법 (Biochemistry. 49, 5176-5187, 2010)으로, ATP 생성 유무는 promega ENLITENATP® Assay system으로 측정하였다.

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 대조군 KCCM11016P/pCSEC와 KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pck 대비 KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS1), KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS2), 및 KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(TC3)의 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 효소활성이 증가하였고, ATP 생성능도 증가하였음을 확인하였다.

균주	효소 활성(Fold)
균주	포스포에놀피루브산 카르복시키나아제	ATP 생성능
KCCM11016P/pCSEC	0.0	0.0
KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS1)	5.2	5.0
KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS2)	4.0	4.0
KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(TC3)	2.2	2.0
KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pck	1.0	0.0

효소활성 및 ATP 생성능 비교를 통해 3종의 ATP를 생성하는 pepck 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 pck와는 다른 방향성과 ATP 생성능을 가진 효소의 유전자임을 확인하였다.

KCCM11016P/pCSEC-pcj7-pepck(AS1)를 2013년 11월 22일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms)에 수탁번호 KCCM11477P로 기탁하였다.

실시예 8. 악티노바실러스 숙시노제네스 유래 pepck 유전자 염색체 삽입용 재조합 벡터( pDZTn - pcj7 - pepck ( AS1 ))제작 및 pepck 도입 균주 제작

실시예 2에서 제작된 pCSEC-pcj7-pepck(AS1)를 제한효소 XhoI, SpeI을 처리하여 2,132bp의 DNA 절편 획득하였고, 염색체 형질전환용 벡터 pDZTn(한국 등록특허 제10-1126041호)은 SpeI과 XhoI을 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 이 두가지 DNA 절편을 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 연결한 후 대장균 TOP10에 형질전환 하였으며, 통상의 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 획득된 플라스미드를 pDZTn-pcj7-pepck(AS1) 명명하였다.

제작된 pDZTn-pcj7-pepck(AS1) 벡터를 라이신 생산 균주인 KCCM11016P, KCCM10770P (한국 등록특허 제10-0924065호, 라이신 생합성경로 구성 유전자들 중　6종을 염색체 상에　2 copy씩 보유한 KCCM11016P 유래의 L-라이신 생산균주), KFCC10750 (한국 등록특허 제10-073610호,), CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40, pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)) 총 4종의 균주에 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 pcj7-pepck(AS1) 유전자를 삽입한 총 4종의 균주를 얻었다. pcj7-pepck 내부 유전자의 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 20과 21을 이용한 PCR 법을 통해 pepck 유전자가 도입된 콜로니를 획득하였다.

이를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-pcj7-pepck(AS1), KCCM10770P-pcj7-pepck(AS1), KFCC10750-pcj7-pepck(AS1), CJ3P-pcj7-pepck(AS1)로 명명하였다.

실시예 9. 염색체 내 pepck 유전자 도입 균주들에서의 라이신 생산

실시예 6과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P와 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-pcj7-pepck(AS1)를 각각 접종 및 배양하였고, 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 와 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-pcj7-pepck(AS1)에 대한 배양물 중의 L-라이신에 대한 결과는 표 4에 나타내었다.

균주	라이신생산량 (g/L)
KCCM11016P	43.1
	43.2
	43.0
KCCM11016P-pcj7-pepck(AS1)	47.7
	47.5
	47.6

표 4에 나타낸 바와 같이, 라이신 생산균주 KCCM11016P에 악티노바실러스 숙시노제네스 pepck 유전자를 염색체에 도입하였을 경우, 대조군 대비, 라이신 생산이 약 10% 증가하였음을 확인하였다.

또한, 실시예 6과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P와 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P-pcj7-pepck(AS1)를 각각 접종하고 배양하였고, 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P와 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P-pcj7-pepck(AS1)에 대한 배양물 중의 L-라이신에 대한 결과는 표 5에 나타내었다.

균주	라이신생산량(g/L)
KCCM10770P	47.0
	47.3
	47.2
KCCM10770P-pcj7-pepck(AS1)	51.8
	51.7
	51.6

표 5에 나타낸 바와 같이, 라이신 생산균주 KCCM10770P에 악티노바실러스 숙시노제네스 pepck 유전자를 염색체에 도입하였을 경우, 대조군 대비, 라이신 생산이 약 9.6% 증가하였음을 확인하였다.

또한, 실시예 6과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750와 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750-pcj7-pepck(AS1)를 각각 접종하고 배양하였고, 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750 와 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750-pcj7-pepck(AS1)에 대한 배양물 중의 L-라이신에 대한 결과는 표 6에 나타내었다.

균주	라이신 생산량(g/L)
KFCC10750	38.3
	38.0
	38.2
KFCC10750-pcj7-pepck(AS1)	41.9
	41.9
	42.0

표 6에 나타낸 바와 같이, 라이신 생산균주 KFCC10750에 악티노바실러스 숙시노제네스 pepck 유전자를 염색체에 도입하였을 경우, 대조군 대비, 라이신 생산이 약 9.8% 증가하였음을 확인하였다.

또한, 실시예 6과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P와 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P-pcj7-pepck(AS1)를 각각 접종하고 배양하였고, 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P와 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P-pcj7-pepck(AS1)에 대한 배양물 중의 L-라이신에 대한 결과는 표 7에 나타내었다.

균주	라이신생산량(g/L)
CJ3P	8.0
	8.5
	8.4
CJ3P-pcj7-pepck(AS1)	9.1
	9.1
	9.2

표 7에 나타낸 바와 같이, 라이신 생산균주 CJ3P에 악티노바실러스 숙시노제네스 pepck 유전자를 염색체에 도입하였을 경우, 대조군 대비, 라이신 생산이 약 10% 증가하였음을 확인하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11477P

20131122

<110> CJ Corporation <120> Corynebacterium microorganism having L-lysine productivity and method for producing L-lysine using the same <130> PN104541 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 538 <212> PRT <213> Actinoabcillus succinogenes <400> 1 Met Thr Asp Leu Asn Lys Leu Val Lys Glu Leu Asn Asp Leu Gly Leu 1 5 10 15 Thr Asp Val Lys Glu Ile Val Tyr Asn Pro Ser Tyr Glu Gln Leu Phe 20 25 30 Glu Glu Glu Thr Lys Pro Gly Leu Glu Gly Phe Asp Lys Gly Thr Leu 35 40 45 Thr Thr Leu Gly Ala Val Ala Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Gly Arg 50 55 60 Ser Pro Lys Asp Lys Tyr Ile Val Cys Asp Glu Thr Thr Lys Asp Thr 65 70 75 80 Val Trp Trp Asn Ser Glu Ala Ala Lys Asn Asp Asn Lys Pro Met Thr 85 90 95 Gln Glu Thr Trp Lys Ser Leu Arg Glu Leu Val Ala Lys Gln Leu Ser 100 105 110 Gly Lys Arg Leu Phe Val Val Glu Gly Tyr Cys Gly Ala Ser Glu Lys 115 120 125 His Arg Ile Gly Val Arg Met Val Thr Glu Val Ala Trp Gln Ala His 130 135 140 Phe Val Lys Asn Met Phe Ile Arg Pro Thr Asp Glu Glu Leu Lys Asn 145 150 155 160 Phe Lys Ala Asp Phe Thr Val Leu Asn Gly Ala Lys Cys Thr Asn Pro 165 170 175 Asn Trp Lys Glu Gln Gly Leu Asn Ser Glu Asn Phe Val Ala Phe Asn 180 185 190 Ile Thr Glu Gly Ile Gln Leu Ile Gly Gly Thr Trp Tyr Gly Gly Glu 195 200 205 Met Lys Lys Gly Met Phe Ser Met Met Asn Tyr Phe Leu Pro Leu Lys 210 215 220 Gly Val Ala Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Lys Asp Gly Asp 225 230 235 240 Val Ala Ile Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser 245 250 255 Thr Asp Pro Lys Arg Gln Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly Trp Asp 260 265 270 Glu Ser Gly Val Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Thr Ile 275 280 285 Asn Leu Ser Gln Glu Asn Glu Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Arg Arg 290 295 300 Asp Ala Leu Leu Glu Asn Val Val Val Arg Ala Asp Gly Ser Val Asp 305 310 315 320 Phe Asp Asp Gly Ser Lys Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr Pro Ile 325 330 335 Tyr His Ile Asp Asn Ile Val Arg Pro Val Ser Lys Ala Gly His Ala 340 345 350 Thr Lys Val Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu Pro Pro 355 360 365 Val Ser Lys Leu Thr Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Gly 370 375 380 Phe Thr Ala Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Val Thr Glu Pro Thr 385 390 395 400 Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu His Pro 405 410 415 Ile Gln Tyr Ala Asp Val Leu Val Glu Arg Met Lys Ala Ser Gly Ala 420 425 430 Glu Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys Arg Ile 435 440 445 Ser Ile Lys Asp Thr Arg Gly Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asp Gly Ser 450 455 460 Ile Glu Lys Ala Glu Met Gly Glu Leu Pro Ile Phe Asn Leu Ala Ile 465 470 475 480 Pro Lys Ala Leu Pro Gly Val Asp Pro Ala Ile Leu Asp Pro Arg Asp 485 490 495 Thr Tyr Ala Asp Lys Ala Gln Trp Gln Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala 500 505 510 Asn Arg Phe Val Lys Asn Phe Val Lys Tyr Thr Ala Asn Pro Glu Ala 515 520 525 Ala Lys Leu Val Gly Ala Gly Pro Lys Ala 530 535 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 catatgactg acttaaacaa actcgt 26 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 gtcgacacta gtatgacaaa cccgttgttt at 32 <210> 4 <211> 1617 <212> DNA <213> Actinoabcillus succinogenes <400> 4 atgactgact taaacaaact cgttaaagaa cttaatgact tagggcttac cgatgttaag 60 gaaattgtgt ataacccgag ttatgaacaa cttttcgagg aagaaaccaa accgggtttg 120 gagggtttcg ataaagggac gttaaccacg cttggcgcgg ttgccgtcga tacggggatt 180 tttaccggtc gttcaccgaa agataaatat atcgtttgcg atgaaactac gaaagacacc 240 gtttggtgga acagcgaagc ggcgaaaaac gataacaaac cgatgacgca agaaacttgg 300 aaaagtttga gagaattagt ggcgaaacaa ctttccggta aacgtttatt cgtggtagaa 360 ggttactgcg gcgccagtga aaaacaccgt atcggtgtgc gtatggttac tgaagtggca 420 tggcaggcgc attttgtgaa aaacatgttt atccgaccga ccgatgaaga gttgaaaaat 480 ttcaaagcgg attttaccgt gttaaacggt gctaaatgta ctaatccgaa ctggaaagaa 540 caaggtttga acagtgaaaa ctttgtcgct ttcaatatta ccgaaggtat tcagcttatc 600 ggcggtactt ggtacggcgg tgaaatgaaa aaaggtatgt tctcaatgat gaactacttc 660 ctgccgttaa aaggtgtggc ttccatgcac tgttccgcca acgtaggtaa agacggtgac 720 gtggctattt tcttcggttt atccggtacg ggtaaaacaa cgctttcgac cgatcctaaa 780 cgccaattaa tcggtgatga cgaacacggt tgggatgaat ccggcgtatt taactttgaa 840 ggcggttgtt acgcgaaaac cattaactta tctcaagaaa acgaaccgga tatttacggc 900 gcaatccgtc gtgacgcatt attagaaaac gtcgtggttc gtgcagacgg ttccgttgac 960 tttgacgacg gttcaaaaac agaaaatacc cgtgtttcat atccgattta ccacatcgac 1020 aacatcgttc gtccggtatc gaaagccggt catgcaacca aagtgatttt cttaaccgcg 1080 gacgcattcg gcgtattgcc gccggtttca aaactgactc cggaacaaac cgaatactac 1140 ttcttatccg gctttactgc aaaattagcg ggtacggaac gcggcgtaac cgaaccgact 1200 ccgacattct cggcctgttt cggtgcggca ttcttaagcc tgcatccgat tcaatatgcg 1260 gacgtgttgg tcgaacgcat gaaagcctcc ggtgcggaag cttatttggt gaacaccggt 1320 tggaacggca cgggtaaacg tatttcaatc aaagataccc gcggtattat cgatgcgatt 1380 ttggacggtt caatcgaaaa agcggaaatg ggcgaattgc caatctttaa tttagcgatt 1440 cctaaagcat taccgggtgt tgatcctgct attttggatc cgcgcgatac ttacgcagac 1500 aaagcgcaat ggcaagttaa agcggaagat ttggcaaacc gtttcgtgaa aaactttgtg 1560 aaatatacgg cgaatccgga agcggctaaa ttagttggcg ccggtccaaa agcataa 1617 <210> 5 <211> 1817 <212> DNA <213> Actinoabcillus succinogenes <400> 5 catatgactg acttaaacaa actcgttaaa gaacttaatg acttagggct taccgatgtt 60 aaggaaattg tgtataaccc gagttatgaa caacttttcg aggaagaaac caaaccgggt 120 ttggagggtt tcgataaagg gacgttaacc acgcttggcg cggttgccgt cgatacgggg 180 atttttaccg gtcgttcacc gaaagataaa tatatcgttt gcgatgaaac tacgaaagac 240 accgtttggt ggaacagcga agcggcgaaa aacgataaca aaccgatgac gcaagaaact 300 tggaaaagtt tgagagaatt agtggcgaaa caactttccg gtaaacgttt attcgtggta 360 gaaggttact gcggcgccag tgaaaaacac cgtatcggtg tgcgtatggt tactgaagtg 420 gcatggcagg cgcattttgt gaaaaacatg tttatccgac cgaccgatga agagttgaaa 480 aatttcaaag cggattttac cgtgttaaac ggtgctaaat gtactaatcc gaactggaaa 540 gaacaaggtt tgaacagtga aaactttgtc gctttcaata ttaccgaagg tattcagctt 600 atcggcggta cttggtacgg cggtgaaatg aaaaaaggta tgttctcaat gatgaactac 660 ttcctgccgt taaaaggtgt ggcttccatg cactgttccg ccaacgtagg taaagacggt 720 gacgtggcta ttttcttcgg tttatccggt acgggtaaaa caacgctttc gaccgatcct 780 aaacgccaat taatcggtga tgacgaacac ggttgggatg aatccggcgt atttaacttt 840 gaaggcggtt gttacgcgaa aaccattaac ttatctcaag aaaacgaacc ggatatttac 900 ggcgcaatcc gtcgtgacgc attattagaa aacgtcgtgg ttcgtgcaga cggttccgtt 960 gactttgacg acggttcaaa aacagaaaat acccgtgttt catatccgat ttaccacatc 1020 gacaacatcg ttcgtccggt atcgaaagcc ggtcatgcaa ccaaagtgat tttcttaacc 1080 gcggacgcat tcggcgtatt gccgccggtt tcaaaactga ctccggaaca aaccgaatac 1140 tacttcttat ccggctttac tgcaaaatta gcgggtacgg aacgcggcgt aaccgaaccg 1200 actccgacat tctcggcctg tttcggtgcg gcattcttaa gcctgcatcc gattcaatat 1260 gcggacgtgt tggtcgaacg catgaaagcc tccggtgcgg aagcttattt ggtgaacacc 1320 ggttggaacg gcacgggtaa acgtatttca atcaaagata cccgcggtat tatcgatgcg 1380 attttggacg gttcaatcga aaaagcggaa atgggcgaat tgccaatctt taatttagcg 1440 attcctaaag cattaccggg tgttgatcct gctattttgg atccgcgcga tacttacgca 1500 gacaaagcgc aatggcaagt taaagcggaa gatttggcaa accgtttcgt gaaaaacttt 1560 gtgaaatata cggcgaatcc ggaagcggct aaattagttg gcgccggtcc aaaagcataa 1620 aactgtaaaa gcatagtatg tgcatgattc ggtaaactac cgaataaaat ctgaaaaata 1680 aaggctgagt atttccactc agccttttgt tttggaaatt agaagttgtt tagaaagata 1740 aacggcgcgg cttattcgtc cgtattattt ggggacataa aaaacccgtt gataaacaac 1800 gggtttgtca tactagt 1817 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 gtcgacctcg agagaaacat cccagcgcta ct 32 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 7 catatgtgtt tcctttcgtt gggtac 26 <210> 8 <211> 318 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 8 agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60 gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120 catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180 cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240 agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300 caacgaaagg aaacactc 318 <210> 9 <211> 532 <212> PRT <213> Anaerobiospirillum succiniciproducens <400> 9 Met Ser Leu Ser Glu Ser Leu Ala Lys Tyr Gly Ile Thr Gly Ala Thr 1 5 10 15 Asn Ile Val His Asn Pro Ser His Glu Glu Leu Phe Ala Ala Glu Thr 20 25 30 Gln Ala Ser Leu Glu Gly Phe Glu Lys Gly Thr Val Thr Glu Met Gly 35 40 45 Ala Val Asn Val Met Thr Gly Val Tyr Thr Gly Arg Ser Pro Lys Asp 50 55 60 Lys Phe Ile Val Lys Asn Glu Ala Ser Lys Glu Ile Trp Trp Thr Ser 65 70 75 80 Asp Glu Phe Lys Asn Asp Asn Lys Pro Val Thr Glu Glu Ala Trp Ala 85 90 95 Gln Leu Lys Ala Leu Ala Gly Lys Glu Leu Ser Asn Lys Pro Leu Tyr 100 105 110 Val Val Asp Leu Phe Cys Gly Ala Asn Glu Asn Thr Arg Leu Lys Ile 115 120 125 Arg Phe Val Met Glu Val Ala Trp Gln Ala His Phe Val Thr Asn Met 130 135 140 Phe Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Lys Gly Phe Glu Pro Asp Phe 145 150 155 160 Val Val Leu Asn Ala Ser Lys Ala Lys Val Glu Asn Phe Lys Glu Leu 165 170 175 Gly Leu Asn Ser Glu Thr Ala Val Val Phe Asn Leu Ala Glu Lys Met 180 185 190 Gln Ile Ile Leu Asn Thr Trp Tyr Gly Gly Glu Met Lys Lys Gly Met 195 200 205 Phe Ser Met Met Asn Phe Tyr Leu Pro Leu Gln Gly Ile Ala Ala Met 210 215 220 His Cys Ser Ala Asn Thr Asp Leu Glu Gly Lys Asn Thr Ala Ile Phe 225 230 235 240 Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp Pro Lys 245 250 255 Arg Leu Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly Trp Asp Asp Asp Gly Val 260 265 270 Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Val Ile Asn Leu Ser Lys 275 280 285 Glu Asn Glu Pro Asp Ile Trp Gly Ala Ile Lys Arg Asn Ala Leu Leu 290 295 300 Glu Asn Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Lys Val Asp Phe Ala Asp Lys 305 310 315 320 Ser Val Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr Pro Ile Phe His Ile Lys 325 330 335 Asn Ile Val Lys Pro Val Ser Lys Ala Pro Ala Ala Lys Arg Val Ile 340 345 350 Phe Leu Ser Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Ile Leu 355 360 365 Ser Lys Glu Gln Thr Lys Tyr Tyr Phe Leu Ser Gly Phe Thr Ala Lys 370 375 380 Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu Pro Thr Pro Thr Phe Ser 385 390 395 400 Ser Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Thr Leu Pro Pro Thr Lys Tyr Ala 405 410 415 Glu Val Leu Val Lys Arg Met Glu Ala Ser Gly Ala Lys Ala Tyr Leu 420 425 430 Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys Arg Ile Ser Ile Lys Asp 435 440 445 Thr Arg Gly Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asp Gly Ser Ile Asp Thr Ala 450 455 460 Asn Thr Ala Thr Ile Pro Tyr Phe Asn Phe Thr Val Pro Thr Glu Leu 465 470 475 480 Lys Gly Val Asp Thr Lys Ile Leu Asp Pro Arg Asn Thr Tyr Ala Asp 485 490 495 Ala Ser Glu Trp Glu Val Lys Ala Lys Asp Leu Ala Glu Arg Phe Gln 500 505 510 Lys Asn Phe Lys Lys Phe Glu Ser Leu Gly Gly Asp Leu Val Lys Ala 515 520 525 Gly Pro Gln Leu 530 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 10 catatgtctc tctcggagtc cctcgc 26 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 11 gtcgacacta gtttagagct gaggtcctgc ct 32 <210> 12 <211> 1599 <212> DNA <213> Anaerobiospirillum succiniciproducens <400> 12 atgtctctct cggagtccct cgcgaagtat ggtatcaccg gtgctactaa catcgtgcat 60 aacccgtccc acgaagagtt gtttgcagct gagacacagg cctctctcga gggctttgaa 120 aagggaacag tcaccgaaat gggagcggtc aacgttatga ccggtgttta caccggccgt 180 tccccaaagg ataagttcat tgtgaaaaat gaggcctcta aagaaatttg gtggacctct 240 gatgagttca agaacgacaa caaacctgtc acagaagagg cgtgggcgca gctgaaggcg 300 cttgctggta aagagctgtc caacaagcca ttgtacgtcg ttgatctttt ctgcggagca 360 aatgaaaata cccgtttgaa gatccgattt gtcatggaag ttgcatggca ggcgcacttt 420 gttactaata tgttcatccg cccgaccgaa gaagagctga aaggttttga accagatttc 480 gttgtcttga acgcgagcaa ggctaaagta gaaaacttca aagagctggg ccttaacagc 540 gaaaccgccg ttgtgttcaa tctcgcagag aagatgcaaa tcatcctcaa tacctggtac 600 ggtggagaaa tgaagaaggg catgttttcc atgatgaatt tctaccttcc ccttcaaggc 660 atcgctgcga tgcattgctc agccaacacc gacttggaag gcaagaatac cgcaatcttt 720 ttcggtctta gcggcactgg caaaaccact ctctcaactg atccaaaacg tctgctgatc 780 ggagatgatg aacacggctg ggacgatgac ggtgtattca actttgaagg cggatgctac 840 gctaaagtga ttaacttgtc caaagagaac gaacccgaca tttggggtgc gatcaagcgt 900 aatgcgcttt tggaaaacgt gaccgtcgat gcaaacggta aggtggactt cgccgacaag 960 tccgtcaccg agaatacgcg cgtgtcttat ccgatcttcc acatcaagaa tatcgtcaaa 1020 cctgtgtcca aagccccagc cgcaaagcgc gtcattttcc tgtccgcaga cgccttcggc 1080 gttctcccac ccgtgtccat tctcagcaaa gaacaaacga aatactactt tctgagcggc 1140 ttcaccgcaa agctggctgg cactgaacga ggcatcaccg agccaactcc tacgttttca 1200 tcatgtttcg gcgctgcttt tctgaccctg ccgccaacaa agtatgcaga agtcctggta 1260 aagcgaatgg aagcctcggg tgccaaagcc taccttgtga acaccggctg gaacggtacg 1320 ggaaagcgca tctcaatcaa agatacacgc ggaattatcg atgcaattct ggatggctct 1380 attgacaccg ctaacaccgc tacgattccg tacttcaact ttactgtgcc tactgagctc 1440 aagggcgttg atacgaagat tttggatccc cgcaacacct atgcagacgc gtcggagtgg 1500 gaagtgaaag ccaaggacct tgcagagcgc ttccagaaga acttcaagaa attcgagtcc 1560 ttgggcggtg atttggtgaa ggcaggacct cagctctaa 1599 <210> 13 <211> 472 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 13 Met Pro Pro Thr Ile His Arg Asn Leu Leu Ser Pro Glu Leu Val Gln 1 5 10 15 Trp Ala Leu Lys Ile Glu Lys Asp Ser Arg Leu Thr Ala Arg Gly Ala 20 25 30 Leu Ala Val Met Ser Tyr Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro Leu Asp Lys 35 40 45 Arg Ile Val Asp Thr Asp Asp Val Arg Glu Asn Val Asp Trp Gly Lys 50 55 60 Val Asn Met Lys Leu Ser Glu Glu Ser Phe Ala Arg Val Arg Lys Ile 65 70 75 80 Ala Lys Glu Phe Leu Asp Thr Arg Glu His Leu Phe Val Val Asp Cys 85 90 95 Phe Ala Gly His Asp Glu Arg Tyr Arg Leu Lys Val Arg Val Phe Thr 100 105 110 Thr Arg Pro Tyr His Ala Leu Phe Met Arg Asp Met Leu Ile Val Pro 115 120 125 Thr Pro Glu Glu Leu Ala Thr Phe Gly Glu Pro Asp Tyr Val Ile Tyr 130 135 140 Asn Ala Gly Glu Cys Lys Ala Asp Pro Ser Ile Pro Gly Leu Thr Ser 145 150 155 160 Thr Thr Cys Val Ala Leu Asn Phe Lys Thr Arg Glu Gln Val Ile Leu 165 170 175 Gly Thr Glu Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly Ile Leu Thr Val Met 180 185 190 Phe Glu Leu Met Pro Gln Met Asn His Leu Cys Met His Ala Ser Ala 195 200 205 Asn Val Gly Lys Gln Gly Asp Val Thr Val Phe Phe Gly Leu Ser Gly 210 215 220 Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asp Pro His Arg Asn Leu Ile Gly 225 230 235 240 Asp Asp Glu His Val Trp Thr Asp Arg Gly Val Phe Asn Ile Glu Gly 245 250 255 Gly Cys Tyr Ala Lys Ala Ile Gly Leu Asn Pro Lys Thr Glu Lys Asp 260 265 270 Ile Tyr Asp Ala Val Arg Phe Gly Ala Val Ala Glu Asn Cys Val Leu 275 280 285 Asp Lys Arg Thr Gly Glu Ile Asp Phe Tyr Asp Glu Ser Ile Cys Lys 290 295 300 Asn Thr Arg Val Ala Tyr Pro Leu Ser His Ile Glu Gly Ala Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Ile Ala Gly His Pro Lys Asn Val Ile Phe Leu Thr Asn Asp 325 330 335 Ala Phe Gly Val Met Pro Pro Val Ala Arg Leu Thr Ser Ala Gln Ala 340 345 350 Met Phe Trp Phe Val Met Gly Tyr Thr Ala Asn Val Pro Gly Val Glu 355 360 365 Ala Gly Gly Thr Arg Thr Ala Arg Pro Ile Phe Ser Ser Cys Phe Gly 370 375 380 Gly Pro Phe Leu Val Arg His Ala Thr Phe Tyr Gly Glu Gln Leu Ala 385 390 395 400 Glu Lys Met Gln Lys His Asn Ser Arg Val Trp Leu Leu Asn Thr Gly 405 410 415 Tyr Ala Gly Gly Arg Ala Asp Arg Gly Ala Lys Arg Met Pro Leu Arg 420 425 430 Val Thr Arg Ala Ile Ile Asp Ala Ile His Asp Gly Thr Leu Asp Arg 435 440 445 Thr Glu Tyr Glu Glu Tyr Pro Gly Trp Ala Cys Thr Ser Arg Ser Thr 450 455 460 Ser Pro Lys Cys Arg Ser Ile Cys 465 470 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 14 catatgccgc ccaccattca ccgaaa 26 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 15 gtcgacacta gtttaacaaa tggagcggca ct 32 <210> 16 <211> 1419 <212> DNA <213> Trypanosoma cruzi <400> 16 atgccgccca ccattcaccg aaacttgttg tctcctgaac tggttcaatg ggccctcaag 60 atcgaaaagg actcccgcct caccgcacgc ggtgctctcg cggtaatgtc gtacgctaaa 120 actggccgtt ccccattgga taagcgtatt gtcgataccg acgatgtccg tgagaacgtg 180 gactggggca aggtcaacat gaaactttct gaagaatcat ttgctcgtgt ccgcaagatc 240 gctaaagaat tcctggacac ccgtgagcac ttgtttgtag tggattgctt tgctggccac 300 gacgagcgat accgcctgaa ggtccgcgtg tttactacac gtccctacca tgcactcttt 360 atgcgcgata tgttgatcgt tccgacccct gaagaactgg ctacattcgg cgagccggac 420 tacgtcattt acaacgcggg agaatgcaag gccgatccat ccatccccgg tctgacctct 480 accacttgtg ttgctctcaa tttcaagact cgagaacaag tcatccttgg taccgagtac 540 gctggtgaaa tgaagaaggg tatcctcact gttatgttcg agctgatgcc acagatgaac 600 catctttgta tgcacgcgag cgcaaatgtg ggaaagcagg gcgacgtgac cgtgttcttc 660 ggccttagcg gcaccggaaa gaccacgttg tcagcagacc cacaccgtaa cttgattgga 720 gatgacgaac acgtgtggac agatcgcggc gtattcaaca tcgaaggcgg ctgctatgcc 780 aaggcaatcg gtcttaatcc caaaaccgaa aaagatatct atgatgccgt tcgtttcggc 840 gcagtggctg agaattgcgt gcttgataaa cgcacgggcg agattgactt ctacgatgaa 900 tcgatttgta agaatactcg cgttgcgtat ccactctccc atatcgaggg tgcattgtcc 960 aaggcgattg cgggccaccc taaaaacgtg atttttctga ccaacgatgc cttcggtgtg 1020 atgccgccag ttgcacgcct cacgtcggca caagcaatgt tttggttcgt catgggctat 1080 accgccaacg ttcctggtgt cgaggctggt ggtacccgca ctgcacgccc aatcttctcc 1140 agctgctttg gcggaccttt cctggtgcgc cacgccacgt tctacggtga gcagttggca 1200 gagaaaatgc agaaacacaa ttcacgtgtc tggctcctga acaccggata cgcgggtgga 1260 cgagcagacc gcggagccaa acgtatgccg cttcgagtta cccgagccat catcgacgcg 1320 atccatgatg gcacgctgga tcgcactgaa tatgaagagt acccaggctg ggcctgcacc 1380 tctcgctcca caagccccaa gtgccgctcc atttgttaa 1419 <210> 17 <211> 610 <212> PRT <213> corynebacterium glutamicum <400> 17 Met Thr Thr Ala Ala Ile Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys 1 5 10 15 Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln 20 25 30 Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg 35 40 45 Met Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu Ile Lys Leu Asn Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val 65 70 75 80 Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu 100 105 110 Met Ser Lys His Tyr Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val 115 120 125 Val Pro Phe Cys Met Gly Pro Ile Ser Asp Pro Asp Pro Lys Leu Gly 130 135 140 Val Gln Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg Ile Met 145 150 155 160 Thr Arg Met Gly Ile Glu Ala Leu Asp Lys Ile Gly Ala Asn Gly Ser 165 170 175 Phe Val Arg Cys Leu His Ser Val Gly Ala Pro Leu Glu Pro Gly Gln 180 185 190 Glu Asp Val Ala Trp Pro Cys Asn Asp Thr Lys Tyr Ile Thr Gln Phe 195 200 205 Pro Glu Thr Lys Glu Ile Trp Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn 210 215 220 Ala Ile Leu Ala Lys Lys Cys Tyr Ala Leu Arg Ile Ala Ser Val Met 225 230 235 240 Ala Arg Glu Glu Gly Trp Met Ala Glu His Met Leu Ile Leu Lys Leu 245 250 255 Ile Asn Pro Glu Gly Lys Ala Tyr His Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ser 260 265 270 Ala Cys Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Ile Thr Pro Thr Ile Pro Gly 275 280 285 Trp Thr Ala Gln Val Val Gly Asp Asp Ile Ala Trp Leu Lys Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gly Leu Tyr Ala Val Asn Pro Glu Asn Gly Phe Phe Gly Val 305 310 315 320 Ala Pro Gly Thr Asn Tyr Ala Ser Asn Pro Ile Ala Met Lys Thr Met 325 330 335 Glu Pro Gly Asn Thr Leu Phe Thr Asn Val Ala Leu Thr Asp Asp Gly 340 345 350 Asp Ile Trp Trp Glu Gly Met Asp Gly Asp Ala Pro Ala His Leu Ile 355 360 365 Asp Trp Met Gly Asn Asp Trp Thr Pro Glu Ser Asp Glu Asn Ala Ala 370 375 380 His Pro Asn Ser Arg Tyr Cys Val Ala Ile Asp Gln Ser Pro Ala Ala 385 390 395 400 Ala Pro Glu Phe Asn Asp Trp Glu Gly Val Lys Ile Asp Ala Ile Leu 405 410 415 Phe Gly Gly Arg Arg Ala Asp Thr Val Pro Leu Val Thr Gln Thr Tyr 420 425 430 Asp Trp Glu His Gly Thr Met Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Gln 435 440 445 Thr Ala Ala Ser Ala Glu Ala Lys Val Gly Thr Leu Arg His Asp Pro 450 455 460 Met Ala Met Leu Pro Phe Ile Gly Tyr Asn Ala Gly Glu Tyr Leu Gln 465 470 475 480 Asn Trp Ile Asp Met Gly Asn Lys Gly Gly Asp Lys Met Pro Ser Ile 485 490 495 Phe Leu Val Asn Trp Phe Arg Arg Gly Glu Asp Gly Arg Phe Leu Trp 500 505 510 Pro Gly Phe Gly Asp Asn Ser Arg Val Leu Lys Trp Val Ile Asp Arg 515 520 525 Ile Glu Gly His Val Gly Ala Asp Glu Thr Val Val Gly His Thr Ala 530 535 540 Lys Ala Glu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asp Thr Pro Ile Glu Asp 545 550 555 560 Val Lys Glu Ala Leu Thr Ala Pro Ala Glu Gln Trp Ala Asn Asp Val 565 570 575 Glu Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Pro Arg Val Pro Ala 580 585 590 Glu Val His Ser Gln Phe Asp Ala Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ala 595 600 605 His Ala 610 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 18 catatgacta ctgctgcaat cagggg 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 19 gtcgacttaa gcgtgagctg ctgaaa 26 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 20 accttccttc cacggaccgg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 21 caagtttctt gcgtcatcgg 20

Claims

ＡＴＰ를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제 (ATP-generating phosphoenolpyruvate carboxykinase) 활성이 도입 또는 증가된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 ATP를 생성하는 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제는 서열번호 1, 9 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 그룹에서 선택되는 하나의 아미노산 서열 또는 이와 60%이상의 서열 동일성을 갖는 것인 코리네박테리움 미생물.
청구항 1에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 코리네박테리움 미생물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 코리네박테리움 미생물을 배양하는 단계, 및
수득된 미생물의 배양액으로부터 L-라이신을 분리하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.