KR20080025355A - Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를이용한 ｌ－라이신 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아스파테이트 아미노트란스퍼라제, 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로피콜리네이트 리덕타제 및 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있고 이에 추가로 파이루베이트 카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있는 코리네박테리아 속 미생물 및 그를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
L-라이신, 코리네박테리움, 아스파테이트 키나제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 디아미노피멜레이트 디카르복실라제

Description

Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 Ｌ－라이신 생산 방법{A corynebacteria having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same}
본 발명은 아스파테이트 아미노트란스퍼라제, 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로피콜리네이트 리덕타제 및 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있고 이에 추가로 파이루베이트 카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있는 코리네박테리아 속 미생물 및 그를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 (Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 균주를 이용한 발효에 의해 생성되고 있다.
종래 라이신 생합성 관련 유전자가 강화된 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제6,746,855호에는 lysE 유전자 (라이신 배출 캐리어 유전자)가 강화되고, dapA 유전자, lysC 유전자, pyc 유전자 및 dapB 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된 유전자가 추가적으로 도입된 코리네박테리아를 배양하여 L-라이신을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 미국특허 제6,221,636호에는 L-라이신 및 L-쓰레오닌에 의하여 피드백 저해에 실질적으로 탈감작화된 (insensitive) 아스파토키나제를 코딩하는 DNA 서열 및 디아미노피멜레이트 디카르복실라제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA로 형질전환된 코리네박테리아가 개시되어 있다.
그러나, 라이신 생합성 경로의 6종 효소 즉, 아스파테이트 아미노트란스퍼라제, 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로피콜리네이트 리덕타제 및 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있는 코리네박테리아 속 미생물에 대하여는 개시된 바 없다. 또한 이들에 추가로 파이루베이트 카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있는 코리네박테리아 속 미생물에 대하여도 개시된 바 없다.
본 발명의 목적은, 라이신 생합성 경로의 6종 효소 즉, 아스파테이트 아미노트란스퍼라제, 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로피콜리네이트 리덕타제 및 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있고 이에 추가로 파이루베이트 카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있는 코리네박테리아 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 아스파테이트 아미노트란스퍼라제, 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로피콜리네이트 리덕타제 및 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있고 이에 추가로 파이루베이트 카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있는 코리네박테리아 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 코리네박테리아 속 미생물에서, 상기 7종의 효소는 내재적 상기 효소에 비하여 증가된 활성을 갖는다. 상기 증가된 효소 활성은 유전자 카피 수의 증가, 고유 프로모터보다 강력한 프로모터로의 교체 및 돌연변이에 의한 효소활성 의 증가에 의한 것이 포함된다. 상기 유전자 카피 수의 증가는, 외래 유전자의 도입에 의한 카피 수의 증가뿐만 아니라, 내재적 유전자의 증폭에 의한 것도 포함된다. 상기 유전자 프로모터의 교체는 하류에 연결된 유전자를 증가발현시키는 특성을 가진 외래 프로모터의 도입은 물론 내재 프로모터로의 교체에 의한 것도 포함된다. 이러한 내재적 유전자의 증폭은 당업계에 알려진 방법, 예를 들면 적당한 선택 압력하에서 배양하는 등에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다.
본 발명의 코리네박테리아 속 미생물에 있어서, 상기 미생물은 코리네형 박테리아의 내재적 aspB (아스파테이트 아미노트란스퍼라제를 코딩하는 유전자), lysC (아스파테이트 키나제를 코딩하는 유전자), asd (아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 유전자), dapA (디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자), dapB (디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 유전자) 및 lysA (디아미노디피멜레이트 디카르복실라제를 코딩하는 유전자)에 더하여 1 카피 이상의 aspB, lysC, asd, dapA, dapB 및 lysA 유전자가 상기 코리네형 박테리아에 도입되어 있는 것일 수 있다. 또한 외래의 강력한 프로모터가 상기 유전자들의 개시코돈 상류에 각각 삽입되어 있는 것일 수 있다. 게다가 상기 유전자들이 각각 1 copy 이상 추가도입된 미생물에 추가로 pyc(파이루베이트 카르복실라제) 유전자가 1 copy 이상 추가도입되어 있는 것이거나 상기 유전자들의 프로모터가 각각 외래의 강력한 프로모터로 교체된 미생물에 추가로 pyc 유전자 개시코돈 상류에 외래의 강력한 프로모터를 삽입한 것일 수 있다.
본 발명의 코리네박테리아 속 미생물에 있어서, 상기 유전자들이 도입되는 코리네형 박테리아는 코리네박테리움 속 미생물이면 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 코리네박테리아 속 미생물에는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum) ATCC 13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001이 포함되며, 바람직하게는, 수탁번호 KFCC10881인 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
본 발명의 코리네박테리아 속 미생물에 있어서, 상기 aspB, lysC, asd, dapA, dapB, lysA 및 pyc 유전자는 각각 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 37의 각 유전자 고유의 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 코리네박테리아 속 미생물에 있어서, 상기 미생물은 각각 도 2, 3, 4, 5 및 6의 개열지도를 갖는 벡터 pDZ-2aspB, pDZ-2lysC/asd, pDZ-2dapA/dapB, pDZ-2lysA 및 pDZ-2pyc가 코리네형 박테리아에 도입된 것일 수 있다. 이들 벡터는 순서대로 또는 동시에 상기 박테리아에 도입될 수 있다. 또한 외래 프로모터가 상기 유전자들의 개시코돈 상류에 각각 삽입된 것일 수 있다. 상기 미생물은 바람직하게는, 상기 aspB, lysC, asd, dapA, dapB, lysA 및 pyc 유전자가 염색체 내에 1 copy 이상 추가 삽입되어 있는 것이거나 각 유전자들의 고유 프로모터와 개시코돈 사이에 외래 프로모터가 삽입되어 있는 것이다. 상기 유전자의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 코리네박테리아 속 미생물에서, 상기 미생물은 바람직하게는, 수탁번호가 수탁번호 KCCM10770P인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-1008-CJ5이다. 본 균주는 수탁번호가 KFCC-10881인 코리네박테리움 글루타미쿰에 각각 도 2, 3, 4 및 5의 개열지도를 갖는 벡터 pDZ-2aspB, pDZ-2lysC/asd, pDZ-2dapA/dapB 및 pDZ-2lysA가 도입되고, 선택배지에 배양하여 각각 2개 카피의 aspB, lysC, asd, dapA, dapB 및 lysA 유전자가 내재적 유전자를 상동 재조합에 의하여 치환하여, 결과적으로 2개 카피의 aspB, lysC, asd, dapA, dapB 및 lysA 유전자가 염색체 내에 삽입되어 있는 균주이다. 상기 균주는 L-라이신 생산 효율이 높다. 또한 상기 균주에 추가로 도 6의 개열지도를 갖는 pDZ-2pyc를 도입하여 상기 유전자 재조합과 동일한 방법으로 2개 카피의 pyc 유전자가 염색체 내에 삽입되도록 함으로서 L-라이신 생산 효율을 보다 높일 수 있다. 이와 더불어 본 발명에서는 수탁번호가 KFCC-10881인 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 상에서 상기 유전자들의 고유 프로모터와 개시코돈 사이에 각각 외래 프로모터를 삽입함으로서 L-라이신 생산 효율을 더욱 높일 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 라이신 생합성 유전자들의 각 프로모터들이 외래의 강력한 CJ7 프로모터로 교체된 균주를 제작하였다. CJ7 프로모터는 서열번호 44로 표시되는 염기서열을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강 력한 프로모터로서 당사에서 개발하여 보유하고 있는 것으로(특허 등록번호 KR-0620092), 이를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881의 lysC를 염색체 상에서 발현시킬 경우 고유 프로모터를 이용할 때 보다 아스파테이트 키나제 활성이 약 2배 가량 증가됨을 확인하였다. 본 발명의 실시예에서는 외래 프로모터로서 상기한 CJ7 프로모터를 이용한 것만 구체적으로 기술하였으나, 상기 등록특허 KR-0620092 호에서는 CJ7 프로모터와 유사한 활성을 갖는 서열번호 45 내지 50 으로 표시되는 염기서열을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스로부터 유래한 CJ1 내지 CJ6 프로모터들 또한 개시하고 있으며, 이들 CJ1 내지 CJ6 프로모터 또한 상기 본 발명에 따른 각 유전자 발현양 증가의 목적을 위해 CJ7 프로모터와 동일한 방식으로 본 발명에 따른 라이신 고 생산 균주의 제조를 위해 사용될 수 있음을 당해 분야의 기술자들은 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에서 라이신 고 생산 균주의 제조를 위한 특정 유전자의 발현양 증가를 위한 외래 프로모터로서 CJ7 프로모터 뿐만 아니라 CJ1 내지 CJ6 프로모터도 포함된다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 미생물을 배양하여 세포 또는 배양물 중에 라이신을 생산하는 단계; 및
상기 세포 또는 배양물로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 L-라이신을 생산하는 방법은, 본 발명에 따른 미생물을 배양하여 세포 또는 배양물 중에 라이신을 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 상기 미생물에 관하여는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 코리네박테리아를 이용하여 L-라이신을 배양하는 당업계에 널리 알려져 있는 방법이 사용될 수 있다. 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 L-라이신을 생산하는 방법은, 세포 또는 배양 배지로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 L-라이신 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 코리네박테리아 속 미생물은, 아스파테이트 아미노트란스퍼라제, 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로피콜리네이트 리덕타제, 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 및 파이루베이트 카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있어, L-라이신 생산능이 향상되어 있다.
본 발명의 L-라이신 생산방법에 의하면, L-라이신을 높은 효율로 생산할 수 있다.
실시예 1: 염색체 삽입용 벡터 ( pDZ )의 제작 및 이를 이용한 유전자의 삽입방법
본 실시예에서는 대장균 클로닝용 벡터 pACYC177(New England Biolab, GenBank accetion # X06402)을 기본 벡터로 사용하여, 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 제작하였으며, 제작 과정은 다음과 같다.
pACYC177 벡터를 AcuI 및 BanI 제한 효소로 처리한 후, 클레나우 효소처리를 통하여 평활말단화하였다. 선별 마커로 사용될 대장균 유래의 lacZ 유전자는 대장균 K12 W3110의 게놈 DNA로부터 PCR을 통하여 자체 프로모터를 포함하도록 증폭한 후, T4 DNA 폴리머라제 및 폴리뉴클레오티드 키나제 처리를 통하여 5' 말단 인산화 및 평활화함으로써 준비하였다. 이상과 같이 준비한 2종의 DNA 단편을 접합하였으며, 접합된 환상 DNA 분자의 제한효소 BamHI 부위로 인위적으로 합성한 다수의 제한효소 인식 부위를 포함하고 있는 아답터 (adaptor) 서열을 삽입하여, 코리네박테 리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 완성하였다. 도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 나타내는 도면이다.
이하의 실시예에서는 코리네박테리움의 염색체로 여분의 유전자를 삽입하기 위하여, 대상이 되는 유전자를 연속적으로 2 카피 포함하고 있는 pDZ 벡터를 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 전기펄스법으로 형질전환한 후 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신 (kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부를 확인함으로써 가능하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10-4으로부터 10-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 띄는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다. 이상과 같이 선별된 균주는 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부의 확인 및 PCR을 통하여 유전자 구조 확인 과정을 거쳐 최종 선정되었다.
실시예 2: 인공변이법에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰 라이신 생산균주 (KFCC-10881) 제조
라이신 생합성 경로의 복수 개의 유전자를 삽입할 균주는 인공변이법에 의하 여 제작된 S- (2-아미노에틸) 시스테인 (S-(2-aminoethyl) cysteine, 이하 AEC)에 대한 내성 및 호모세린 유출 (homoserine leaky)의 특징을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 (KFCC-10881)을 이용하였다.
상기의 변이주 KFCC-10881은 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주 (ATCC13032)를 모균주로 하여 돌연변이 유발원인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: 이하 NTG)을 세포 107 내지 108/ml에 대하여 30 ℃에서 최종농도 500 ㎍/ml로 30 분간 처리하고, AEC를 5 g/l의 농도로 함유한 복합평판 배지에서 성장하는 균주를 분리함으로써 얻을 수 있었다. 상기의 1차 변이주에 대한 AEC 내성도와 라이신 생산능을 확인한 후, NTG에 의한 2차 인공변이를 유도한 후 획득한 다수의 콜로니를 호모세린 (100 mg/L)을 함유한 최소 배지와 호모세린이 첨가되지 않은 최소배지에 접종(tooth picking)하여 호모세린이 첨가되지 않은 최소배지에서 성장하지 못하는 호모세린 요구성 균주 (2차 변이주)를 분리하였다. 이로부터 다시 호모세린 유출형 균주를 분리하고자 3차 인공변이를 유도한 후, 호모세린 10 mg/L가 함유된 최소배지에서 성장하는 균주를 분리하여 라이신 생산능을 확인하였다(표 1). 최종적으로 AEC 내성 및 호모세린 유출형 특징을 갖는 라이신 생산주를 획득하여 이를 사단법인 한국종균협회에 기탁하고, 기탁번호 제 KFCC-10881호를 부여받았다. 상기 최소배지와 생산배지의 조성 및 표1은 각각 하기와 같다.
균주 라이신 (g/l)
배치1 배치2 배치3
야생주 (ATCC13032) 0 0 0
KFCC-10881 45 43 42.5
최소배지 ( pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 (Soy Protein) 2.5 g, 옥수수 침지고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
생산배지 ( pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 (Soy Protein) 2.5 g, 옥수수 침지고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
실시예 3: 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC -10881 유래 aspB 유전자 클로닝 및 재조합벡터 ( pDZ -2 aspB ) 제작, aspB 삽입균주 개발
본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 라이신 생합성 경로의 aspB 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 aspB 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 NC_003450, Ncgl0237)를 확보하고, 이에 근거하여 aspB 유전자 프로모터 부위에서부터 터미네이터 부위까지 증폭시킬 수 있는 두 쌍의 프라이머 (표 2)를 합성하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
F-aspB-Sma I_P1 ccc ggg　 gcg gtt cag cta gag tta tgc 1
R-aspB-Hind III_P2 aag ctt　 tta gtt agc gta atg ctc cgc 2
F-aspB-Hind III_P3 aag ctt　 gcg gtt cag cta gag tta tgc 3
R-aspB-Nhe I_P4 gct agc　 tta gtt agc gta atg ctc cgc 4
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1과 2 및 3과 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, 1,493bp의 프로모터 부위를 포함한 aspB 유전자 두 쌍 (aspB-A, aspB-B)을 얻었다. aspB-A는 서열번호 1과 2를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, aspB-B는 서열번호 3과 4를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-aspB-A와 pCR-aspB-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 aspB-A와 aspB-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (aspB-A: SmaI+HindIII, aspB-B: HindIII+NheI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 aspB 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 EcoRV와 NheI가 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합 (3-piece ligation)을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 aspB 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2aspB 재조합 벡터를 제작하였다. 도 2는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2aspB를 나타내는 도면이다.
제작된 pDZ-2aspB 벡터를 실시예 2에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 aspB 유전자의 바로 옆에 1 카피의 aspB 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 라이신 생산주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ1을 얻었다. 연속적으로 삽입된 aspB 유전자는 2 카피의 aspB 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 17과 18 (표3)의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
F-M-aspB gca gtg gac tgt ccc tgc 17
R-M-aspB cct gca gcg aaa ctg aac tc 18
실시예 4: 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC -10881 유래 lysC/asd 유전자 클로닝 및 재조합벡터 ( pDZ -2 lysC / asd ) 제작, lysC / asd 삽입균주 개발
실시예 3과 동일한 방법으로 lysC/asd 유전자를 확보하기 위하여 NIH GenBank를 근거로 하여 lysC/asd 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 NC_003450, Ncgl0247~0248)를 확보하고, 이에 근거하여 lysC 유전자 프로모터 부위에서부터 asd 유전자 터미네이터 부위까지 증폭시킬 수 있는 두 쌍의 프라이머 (표 4)를 합성하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
lysC-F1 (BamHI) ttg cac gga tcc cag ggt agt tga cta aag 5
asd-R1 (SmaI) atg gat ccc ggg tat caa cgc gtc ggt aga 6
lysC-F2 (SmaI) ttg cac ccc ggg cag ggt agt tga cta aag 7
asd-R2 (PvuI) atg gat cga tcg tat caa cgc gtc ggt aga 8
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 5와 6 및 7과 8의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 52℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 3분을 30회 반복하였다.
그 결과, 2,805bp의 프로모터 부위를 포함한 lysC/asd 유전자 두 쌍 (lysC/asd-A, lysC/asd-B)을 얻었다. lysC/asd-A는 서열번호 5와 6을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, lysC/asd-B는 서열번호 7과 8을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-lysC/asd-A와 pCR-lysC/asd-B 벡터를 얻었다.
상기 pCR 벡터에 lysC/asd-A와 lysC/asd-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (lysC/asd-A: BamHI+SmaI, lysC/asd-B: SmaI+PvuI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 lysC/asd 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 BamHI과 PvuI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합 (3-piece ligation)을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 lysC/asd 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2lysC/asd 재조합 벡터를 얻었다. 도 3은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2lysC/asd를 나타내는 도면이다.
제작된 pDZ-2lysC/asd 벡터를 실시예 3에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ1에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 lysC/asd 유전자의 바로 옆에 1 카피의 lysC/asd 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ2를 얻었다. 연속적으로 삽입된 lysC/asd 유전자는 2 카피의 lysC/asd 연결부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (표 5)를 이용한 PCR로 최종 확인하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
lysC-2 cat ggc gag gat ccc gtt aga aat acg ctc 19
asd-1 ttc acg ccg aat tcg aca agg caa tca ccg 20
실시예 5: 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC -10881 유래 dapA/dapB 클로닝 및 염색체 삽입용 재조합벡터 ( pDZ -2 dapA / dapB ) 제작, dapA / dapB 삽입균주 개발
실시예 3과 동일한 방법으로 dapA/dapB 유전자를 확보하기 위하여 NIH GenBank를 근거로 하여 dapA/dapB 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 NC_003450, Ncgl1896~1898)를 확보하였다. 그 결과, dapA 유전자는 dapB 유전자와 오페론을 구성하고 있으며, 그 사이에 기능이 밝혀지지 않은 ORF (Ncgl1987)가 존재하고 있었으므로 dapB 유전자의 프로모터 부위를 포함한 dapB-ORF (Ncgl1897)-dapA 유전자 전체를 증폭하기 위하여 두 쌍의 프라이머 (표 6)를 합성하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
Dap-EcoRI-F gac gaa ttc tca ttg gcg ttt ccg gat cc 9
Dap-Sac I-R tca gag ctc aca agc gcc aag gaa cta cc 10
Dap-SacI-F tga gag ctc tca ttg gcg ttt ccg gat cc 11
Dap-XhoI-R tgt ctc gag aca agc gcc aag gaa cta cc 12
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 9와 10 및 11과 12의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 52℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 3분을 30회 반복하였다.
그 결과, 3,210bp의 프로모터 부위를 포함한 dapA/dapB 유전자 두 쌍 (dapA/dapB-A, dapA/dapB-B)을 얻었다. dapA/dapB-A는 서열번호 9와 10을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, dapA/dapB-B는 서열번호 11과 12를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-dapA/dapB-A와 pCR-dapA/dapB-B 벡터를 얻었다.
상기 pCR 벡터에 dapA/dapB-A와 dapA/dapB-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (dapA/dapB-A: EcoRI+SacI, dapA/dapB-B: SacI+XhoI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 dapA/dapB 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 EcoRI과 XhoI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합 (3-piece ligation)을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 dapA/dapB 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2dapA/dapB 재조합 벡터를 얻었다. 도 4는 pDZ-2dapA/dapB 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 pDZ-2dapA/dapB 벡터를 실시예 4에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ2에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 dapA/dapB 유전자의 바로 옆에 1 카피의 dapA/dapB 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 라이신 생산주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ3을 얻었다. 연속적으로 삽입된 dapA/dapB 유전자는 2 카피의 dapA/dapB 연결부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (표 7)를 이용한 PCR로 최종 확인하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
Dap-seq-3 agg cat ttc att ggc a 21
Dap-seq-5 ttt gcg tgc cgc agc a 22
실시예 6: 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC -10881 유래 lysA 유전자 클로닝 및 염색체 삽입용 재조합벡터 ( pDZ -2 lysA ) 제작, lysA 삽입균 주 개발
실시예 3과 동일한 방법으로 lysA 유전자를 확보하기 위하여 NIH GenBank를 근거로 하여 lysA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 NC_003450, Ncgl1132~1133)를 확보하였다. 그 결과, lysA 유전자는 argS 유전자 (arginyl-tRNA synthetase)와 오페론을 구성하고 있었으므로 argS의 프로모터 부위를 포함한 argS-lysA 유전자 전체를 증폭하기 위하여 두 쌍의 프라이머 (표 8)를 합성하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
FargHN1 ATT AAG CTT TGC ATG GGC ACG TCG ATG 13
RargHN1 ATT GCG GCC GCT CCA CGG CGA AGG TGA AG 14
FargNX2 ATT GCG GCC GCT GCA TGG GCA CGT CGA TG 15
RargNX2 ATT CTA GAT CCA CGG CGA AGG TGA AG 16
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 13과 14 및 15와 16의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 52℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 4분을 30회 반복하였다.
그 결과, 3,359bp의 프로모터 부위를 포함한 argS/lysA 유전자 두 쌍 (argS/lysA-A, argS/lysA-B)을 얻었다. argS/lysA-A는 서열번호 13와 14를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, argS/lysA-B는 서열번호 15와 16을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-argS/lysA-A와 pCR-argS/lysA-B 벡터를 얻었다.
상기 pCR 벡터에 argS/lysA-A와 argS/lysA-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (argS/lysA-A: HindIII+NotI, argS/lysA-B: NotI+XbaI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 argS/lysA 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 HindIII와 XbaI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합 (3-piece ligation)을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 argS/lysA 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2lysA 재조합 벡터를 얻었다. 도 5는 pDZ-2lysA 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 pDZ-2lysA 벡터를 실시예 5에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ3에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 lysA 유전자의 바로 옆에 1 카피의 lysA 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ4를 얻었다. 연속적으로 삽입된 lysA 유전자는 2 카피의 lysA 연결부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (표 9)를 이용한 PCR로 최종 확인하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
2lysAR GAG　 ATC AGC TGG TGT CAT GG 23
2lysAF5 ATC CAC AGC GAA CTG GGC G 24
그 결과, 라이신 생합성관련 6종 유전자가 삽입된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ4를 2006년 8월 21일자로 한국미생물보존센터에 기탁하고, 수탁번호 KCCM10770P를 부여받았다.
실시예 7: 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC -10881 유래 pyc 유전자 클로닝 및 염색체 삽입용 재조합벡터 ( pDZ -2 pyc ) 제작, pyc 삽입균주 개발
실시예 3과 동일한 방법으로 pyc 유전자를 확보하기 위하여 NIH GenBank를 근거로 하여 pyc 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 NC_003450, Ncgl0659)를 확보하였다. 그 결과, pyc의 프로모터 부위를 포함한 pyc 유전자 전체를 증폭하기 위하여 두 쌍의 프라이머 (표 10)를 합성하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
pyc-XbaI-F ggc tct aga agg att gct ttg tgc act cct g 31
pyc-EcoRV-R gaa gat atc gag cct tgg tct cca tct tc 32
pyc-EcoRV-F gaa gat atc agg att gct ttg tgc act cct g 33
pyc-HindIII-R gac aag ctt gag cct tgg tct cca tct tc 34
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 31과 32 및 33과 34의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 52℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 4분을 30회 반복하였다. 그 결과, 각각 프로모터 부위를 포함한 3925bp의 pyc 유전자 두 쌍 (pyc -A, pyc -B)을 얻었다. pyc-A는 서열번호 31과 32를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, pyc-B는 서열번호 33과 34를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-pyc-A와 pCR-pyc-B 벡터를 얻었다.
상기 pCR 벡터에 pyc-A와 pyc-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (pyc-A: XbaI 및 EcoRV, pyc-B: EcoRV 및 HindIII)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 pyc 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 XbaI과 HindIII가 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합 (3-pieces ligation)을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 pyc 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2pyc 재조합 벡터를 얻었다. 도 5는 pDZ- 2pyc 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 pDZ-2pyc 벡터를 실시예 6에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ4에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 pyc 유전자의 바로 옆에 1 카피의 pyc 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ5를 얻었다. 연속적으로 삽입된 pyc 유전자는 2 카피의 pyc 연결부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (표 11)를 이용한 PCR로 최종 확인하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
2pyc-F ctg agg aag agc agg cgc acc tcg 35
2pyc-R ttc cgc aca ctc gcg ggc aag ctg 36
그 결과, 라이신 생합성관련 7종 유전자가 삽입된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ5를 획득하였다.
실시예 8: 라이신 생합성 유전자 복합 삽입균주에서의 라이신 생산
각각 실시예 6과 7에서 제작된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리아 글루타미쿰 KFCC-10881-CJ4와 KFCC-10881-CJ5를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC-10881과 KFCC-10881-CJ4 및 KFCC-10881-CJ5를 각각 접종하고 30 ℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 상기 배양된 1 ml의 종 배양액을 각각 접종하고 30 ℃에서 120 시간 동안 (200 rpm)으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
종배지 ( pH 7.0)
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
생산배지 ( pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881과 KFCC10881-CJ4 및 KFCC10881-CJ5에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래와 (표 12) 같았다.
균주 라이신 (g/l)
배치1 배치2 배치3
KFCC-10881 44 43 42.8
KFCC-10881-CJ4 47 46.2 45.6
KFCC-10881-CJ5 47.5 46.9 46.1
상기 표 12에서 나타낸 바와 같이, 6개의 라이신 생합성 유전자가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-CJ4는 모균주 KFCC-10881에 비하여 라이신 생산이 약 7% 가량 증가되었음을 확인할 수 있었다. 또한 6개의 라이신 생합성 유전자들과 함께 pyc 유전자가 추가삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-CJ5는 모균주 KFCC-10881에 비하여 라이신 생산이 약 8% 가량 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC -10881 유래 3 카피의 lysC / asd 삽입균주 개발
실시예 4에서 제작된 pDZ-2lysC/asd 재조합 벡터를 실시예 6에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ4에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 2 카피의lysC/asd 유전자의 바로 옆에 1 카피의 lysC/asd 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 3개로 증가시킨 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ6를 얻었다. 연속적으로 삽입된 lysC/asd 유전자는 3 카피의 lysC/asd 연결부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (표 13)를 이용한 PCR로 최종 확인하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
3lysC-F ggg cga att ctg cag at 38
3lysC-R atc tgc aga att cgc cc 39
라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ6의 아스파테이트 키나제 활성을 이미 공지된 Pechere J-F와 Capony J-P의 아스파르틸 하이드록사메이트를 이용한 측정법(Anal Biochem 22: 536-539, 1968)으로 측정한 결과, KFCC10881-CJ6균주가 KFCC10881-CJ4보다 약 2.1배 가량 높은 활성을 갖게 되었음을 확인하였다. (표 14)
균주 아스파테이트 키나제 활성(Fold)
KFCC10881-CJ4 1
KFCC10881-CJ5 2.1
실시예 10: 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC -10881 유래 3 카피의 dapA / dapB 삽입균주 개발
실시예 5에서 제작된 pDZ-2dapA/dapB 재조합 벡터를 실시예9에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ6에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 2 카피의 dapA/dapB 유전자의 바로 옆에 1카피의 dapA/dapB 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 3개로 증가시킨 라이신 생산주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ7을 얻었다. 연속적으로 삽입된 dapA/dapB 유전자는 3 카피의 dapA/dapB 연결부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (표 15)를 이용한 PCR로 최종 확인하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
3lysC-F aaa cgc caa tga gag ctc tca 40
3lysC-R ctt ggc gct tgt gag ctc tga 41
실시예 11: 라이신 생합성 유전자 복합 삽입균주에서의 라이신 생산
실시예 10에서 최종적으로 제작된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리아 글루타미쿰 KFCC-10881-CJ7을 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC-10881-CJ4와 KFCC-10881-CJ7을 접종하고 30 ℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 상기 배양된1 ml씩의 종 배양액을 각각 접종하고 30 ℃에서 120 시간 동안 (200 rpm)으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지 및 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
종배지 ( pH 7.0)
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
생산배지 ( pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-CJ4와 KFCC-10881-CJ7에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 (표 16)와 같았다.
균주 라이신 (g/l)
배치1 배치2 배치3
KFCC-10881-CJ4 46.4 46.8 45.9
KFCC-10881-CJ7 51.8 51.2 51.7
상기의 표 16에서 나타낸 바와 같이, 3개의 라이신 생합성 유전자가 각각 3카피씩 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-CJ7은 모균주 KFCC-10881-CJ4에 비하여 라이신 생산이 약 11% 가량 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 12: 라이신 생합성 유전자 프로모터 교체용 벡터의 제작 및 이를 이용한 각 유전자 프로모터 교체균주 제작
본 실시예에서는 pDZ를 기본 벡터로 사용하여, 라이신 생합성 유전자들의 각 프로모터들이 외래의 강력한 CJ7 프로모터로 교체된 균주를 제작하였다. CJ7 프로모터는 서열번호 로 표시되는 염기서열을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터로서 당사에서 개발하여 보유하고 있는 것으로(특허 등록번호 KR-0620092), 이를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881의 lysC를 염색체 상에서 발현시킬 경우 고유 프로모터를 이용할 때 보다 아스파테이트 키나제 활성이 약 2배 가량 증가됨을 확인하였다.
상기와 같은 특성을 갖는 CJ7 프로모터를 라이신 생산균주 염색체 상에 삽입하기 위한 벡터의 제작 과정은 다음과 같다.
우선 pDZ 벡터를 제한 효소 XbaI과 NdeI으로 처리하여 CJ7 프로모터를 연결하기 위한 벡터를 준비하였다. 코리네박테리움 암모니아게네스의 염색체 DNA 를 주형으로 CJ7 프로모터 부위를 PCR 증폭하기 위해 사용한 프라이머는 서열번호 42와 43(표17)으로서, 이를 이용하여 CJ7 프로모터 PCR 증폭시 5’-말단에는 제한효소 XbaI 인식부위를, 3’-말단에는 제한효소 NdeI 인식부위가 삽입되도록 하였다. CJ7 프로모터 PCR 증폭 산물을 제한효소 XbaI과 NdeI을 처리한 후 앞서 준비한 pDZ 벡터에 연결함으로써 CJ7 프로모터를 염색체상에 삽입하기 위한 1차 플라스미드로서 pDZ-PCJ7을 제작하였다.(도 7)
프라이머 염기서열 서열번호
PCJ7-F-XbaI tct aga　aga aac atc cca gcg cta c 42
PCJ7-R-NdeI cat atg　gag tgt ttc ctt tcg ttg 43
실시예 2에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 염색체상에서 각 유전자 고유 프로모터와 CJ7 프로모터와의 교체에 필요한 2종의 DNA 단편들, 즉 각 유전자 고유 프로모터 부분 약 300bp와 +2 코돈에서부터 하류쪽으로 약 300bp 가량의 ORF 일부분을 확보하였다. 이 때 사용한 프라이머들을 이용하여 각 유전자 고유 프로모터 부분 PCR 증폭 산물의 양쪽 말단에는 제한효소 XbaI 인식부위를, 각 유전자 ORF 단편의 양쪽 말단에는 NdeI 인식부위를 삽입하였다. 이들을 각각 pDZ-PCJ7에 클로닝하기 위하여 각 유전자 프로모터 부분 PCR 증폭 산물들에는 제한효소 XbaI을, 각 유전자 ORF 부분 PCR 증폭 산물들에는 제한효소 NdeI을 각각 처리하여 준비하였다. 그 다음 pDZ-PCJ7에 제한효소 XbaI을 처리한 후 각 유전자 프로모터 부분 PCR 증폭 산물들을 연결하였고, 여기에 다시 제한효소 NdeI을 처리한 후 각 해당 유전자 ORF 부분 PCR 증폭 산물들을 순서대로 연결함으로써, 목표 유전자 재조합을 위한 두 부분의 DNA 단편 사이에 CJ7 프로모터가 연결된 형태로 클로닝된 플라스미드를 확보하였다. 이들은 각각 pDZ-PCJ7-aspB, pDZ-PCJ7-lysCasd, pDZ-PCJ7-dapA, pDZ-PCJ7-dapB, pDZ-PCJ7-argSlysA 및 pDZ-PCJ7-pyc라 명명하였고 라이신 생산균주의 형질전환에 사용하였다.(도 8, 9, 10, 11, 12, 13)
상기 플라스미드들을 이용한 목표 유전자 재조합 방법은 다음과 같다. 우선 pDZ-PCJ7-aspB를 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 형질전환 후 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 aspB 유전자의 프로모터 부위에 CJ7 프로모터가 삽입된 균주를 획득하였다. 이와 동일한 방법으로 나머지 재조합용 플라스미드들을 순서대로 형질전환함으로써, 결과적으로 aspB, lysCasd, dapA, dapB 및 argSlysA 유전자의 프로모터 부위에 CJ7 프로모터가 삽입된 균주 KFCC-10881-PCJ7-5를 제작하였고, 이에 추가로 pyc 유전자의 프로모터까지 CJ7 프로모터로 교체된 균주 KFCC-10881-PCJ7-6도 제작하였다.
실시예 13: 라이신 생합성 유전자 프로모터 교체균주에서의 라이신 생산
실시예 11에서 최종적으로 제작된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-PCJ7-5와 KFCC-10881-PCJ7-6을 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC-10881과 KFCC-10881-PCJ7-5 및 KFCC-10881-PCJ7-6를 각각 접종하고 30 ℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 배양된 종 배양액 각각을 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml씩 접종하고 30 ℃에서 120 시간 동안 (200 rpm)으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지 및 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
종배지 ( pH 7.0)
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
생산배지 ( pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881과 KFCC-10881-PCJ7-5 및 KFCC-10881-PCJ7-6에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 (표 18)와 같다.
균주 라이신 (g/l)
배치1 배치2 배치3
KFCC-10881 43.5 44.2 43.8
KFCC-10881-PCJ7-5 51.4 51.8 51.1
KFCC-10881-PCJ7-6 52 52.1 51.7
상기의 표 18에서 나타낸 바와 같이, 6개의 라이신 생합성 유전자 프로모터가 CJ7 프로모터로 교체되어 전체적인 발현량이 증가된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-PCJ7-5와 여기에 추가로 pyc 유전자의 프로모터를 CJ7으로 교체한 KFCC-10881-PCJ7-6은 모균주 KFCC-10881에 비하여 라이신 생산이 각각 17.4%, 18.6% 가량 증가됨을 확인할 수 있었다.
실시예 14: 라이신 생합성 유전자 추가삽입 균주 및 프로모터 교체균주들에 서의 라이신 생합성 효소들의 활성 측정
실시예 6과 10 및 12에서 제작된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ4, KFCC10881-CJ7 및 KFCC-10881-PCJ7-5에서의 라이신 생합성 효소들의 활성 증가 정도를 확인하기 위하여 효소활성 측정이 비교적 용이한 아스파테이트 키나제와 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 활성을 측정하였다. 아스파테이트 키나제 활성 측정은 공지된 Pechere J-F와 Capony J-P의 측정법(Anal Biochem 22: 536-539, 1968)으로, 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 활성은 공지된 J. Cremer 등의 측정법으로 측정한 결과, 아래와 같이 최초 모균주 KFCC10881대비 효소활성이 증가하였음을 확인했다.(표 19)
균주 효소 활성(Fold)
아스파테이트 키나제 디아미노피멜레이트 디카르복실라제
KFCC-10881 1 1
KFCC-10881-CJ4 1.7 1.8
KFCC-10881-CJ6 3.2 1.9
KFCC-10881-PCJ7-5 2.3 5.8
도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 나타내는 도면이다.
도 2는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2aspB를 나타내는 도면이다.
도 3은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2lysC/asd를 나타내는 도면이다.
도 4는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2dapA/dapB 벡터를 나타내는 도면이다.
도 5는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2lysA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 6은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2pyc 벡터를 나타내는 도면이다.
도 7은 pDZ-PCJ7 벡터를 나타내는 도면이다.
도 8은 pDZ-PCJ7/aspB 벡터를 나타내는 도면이다.
도 9는 pDZ-PCJ7/lysC 벡터를 나타내는 도면이다.
도 10은 pDZ-PCJ7/dapA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 11은 pDZ-PCJ7/dapB 벡터를 나타내는 도면이다.
도 12는 pDZ-PCJ7/lysA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 13은 pDZ-PCJ7/pyc 벡터를 나타내는 도면이다.
<110> CJ CORPORATION <120> A CORYNEBACTERIA HAVING ENHANCED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND A METHOD OF PRODUCING L-LYCINE USING THE SAME <150> KR1020060089672 <151> 2006-09-15 <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for aspB amplification <400> 1 cccggggcgg ttcagctaga gttatgc 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for aspB amplification <400> 2 aagcttttag ttagcgtaat gctccgc 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for aspB amplification <400> 3 aagcttgcgg ttcagctaga gttatgc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for aspB amplification <400> 4 gctagcttag ttagcgtaat gctccgc 27 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for lysCasd amplification <400> 5 ttgcacggat cccagggtag ttgactaaag 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse 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tcgatcgcgt tgtggttcct gctgcaacga aggtggaagg tggcgacttg atcgtcgtcg 3780 tttcctaaac ctttctgtaa aaagccccgc gtcttcctca tggaggaggc ggggcttttt 3840 gggccaagat gggagatggg tgagttggat ttggtctgat tcgacacttt taagggcaga 3900 gatttgaaga tggagaccaa ggctc 3925 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 38 gggcgaattc tgcagat 17 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 39 atctgcagaa ttcgccc 17 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 40 aaacgccaat gagagctctc a 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 41 cttggcgctt gtgagctctg a 21 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 42 tctagaagaa acatcccagc gctac 25 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 43 catatggagt gtttcctttc gttg 24 <210> 44 <211> 318 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 44 agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60 gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120 catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180 cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240 agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300 caacgaaagg aaacactc 318 <210> 45 <211> 301 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 45 caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt 60 gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg 120 caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg 180 gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc 240 tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta 300 a 301 <210> 46 <211> 285 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 46 aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg 60 atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag 120 cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag 180 atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc 240 aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca 285 <210> 47 <211> 291 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 47 gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa 60 gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc 120 gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac 180 caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc 240 aactaattct ccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c 291 <210> 48 <211> 312 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 48 actgggaggg taggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg 60 ttaccctcct aggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg 120 cgggatgctc aaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt 180 gtaactggca cgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct 240 caagtgccgt gacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca 300 ggaggacata ca 312 <210> 49 <211> 249 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 49 tcggacatat acggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa 60 ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc 120 gcagtgtagg gaacctcggt actatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct 180 ttgaagtaat tctcccaggc aatagctttt gacgtactcc gcttcccaac tttttaggag 240 acaactacc 249 <210> 50 <211> 332 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 50 ggcttcatcg tcgtctttga tccgatgcga gtccattaac ccaaactcct taaagcccgt 60 aaaacggggg tattccaaca cggttatcca cagtttaacc gttattcggg ggtaatccta 120 acccaaatca ttacggaaac tccaatctgg ctcacaatat cctccatgat tctagggaca 180 cccaatcagg tgcacccgct tcctgcgaca acgagtcaaa ctcggcaaag ccctcaacct 240 gtcggtctag aatatatata ccgcccggtc tagtgttgtg gtgtacacta acgataaacc 300 aacaaagttg tctattaaga ggaggccatt tc 332

Claims (15)

  1. 아스파테이트 아미노트란스퍼라제, 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로피콜리네이트 리덕타제 및 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 미생물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 파이루베이트 카르복실라제의 내재적 활성도 증가된 것인 미생물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 효소들은 각각 코리네형 박테리아의 aspB, lysC, asd, dapA, dapB 및 lysA 유전자의 발현량 증가에 의해 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 코리네박테리아 속 미생물.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 미생물은 코리네형 박테리아의 pyc 유전자의 발현량 증가에 의해 상기 파이루베이트 카르복실라아제의 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 코리네박테리아 속 미생물.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 각 유전자의 발현양 증가는 상기 미생물의 내재적 상기 각 유전자 외에 상기 각 유전자 1 카피 이상이 외래로부터 코리네형 박 테리아에 도입되어 이루어진 것인 미생물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 외래 유전자가 도입되는 코리네형 박테리아는 수탁번호 KFCC10881인 것을 특징으로 하는 미생물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 aspB, lysC, asd, dapA, dapB, lysA 및 pyc 유전자는 각각 서열번호 25,26,27,28,29, 30 및 37의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 미생물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 각 유전자의 도입은 각각 도 2, 3, 4, 5및 6의 개열지도를 갖는 벡터를 코리네형 박테리아에 형질전환하여 이루어지는 것인 미생물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 외래로부터 도입된 각 유전자는 염색체 내에 삽입되는 것인 미생물.
  10. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 수탁번호가 KCCM10770P인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJ4인 것을 특징으로 하는 미생물.
  11. 제 3항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 유전자의 발현양 증가는 상기 각 유전자에 대한 외래 프로모터의 도입에 의해 이루어지는 것인 미생물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 외래 프로모터가 서열번호 44내지 50으로 표시되는 염기서열 중 어느 하나를 갖는 것인 미생물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 외래 프로모터가 서열번호 44로 표시되는 염기서열을 가지는 것인 미생물.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 외래 프로모터가 도 8 내지 도 13 으로 나타낸 벡터 중 어느 하나 이상을 코리네형 박테리아에 도입함으로써 도입되는 것인 미생물.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 세포 또는 세포 배양물로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.
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