JP2021185829A - 新規プロモーター - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNA;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも96%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するDNA;及び
(c)配列番号1のヌクレオチド配列に対して1個以上5個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するDNA、
を提供する。
別の一態様において、本発明は、前記プロモーターを含む発現ベクターを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記プロモーターを含むDNA発現カセットを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記発現ベクター又は前記DNA発現カセットを含む、コリネバクテリウムを提供する。
別の一態様において、本発明は、
前記コリネバクテリウムを培養すること;及び
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法を提供する。
(a)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNA;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも96%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するDNA;及び
(c)配列番号1のヌクレオチド配列に対して1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するDNA。
(a)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNA;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも96%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するDNA;及び
(c)配列番号1のヌクレオチド配列に対して1個以上5個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するDNA。
〔2〕好ましくは、前記プロモーターがコリネバクテリウムにおいてプロモーター活性を有する、〔1〕記載のプロモーター。
〔4〕好ましくは、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記プロモーターとを含む、〔3〕記載の発現ベクター。
〔5〕前記目的物質が、好ましくは芳香族化合物であり、より好ましくは没食子酸、プロトカテク酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ピリジンジカルボン酸、カテコール、及び4−ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される少なくとも1種である、〔4〕記載の発現ベクター。
〔7〕好ましくは、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記プロモーターとを含む、〔6〕記載のDNA断片。
〔8〕前記目的物質が、好ましくは芳香族化合物であり、より好ましくは没食子酸、プロトカテク酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ピリジンジカルボン酸、カテコール、及び4−ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される少なくとも1種である、〔7〕記載のDNA断片。
〔9〕好ましくはDNA発現カセットである、〔6〕〜〔8〕のいずれか1項記載のDNA断片。
〔11〕好ましくはコリネバクテリウムであり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである、〔10〕記載の形質転換体。
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。
〔13〕前記目的物質が、好ましくは芳香族化合物であり、より好ましくは没食子酸、プロトカテク酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ピリジンジカルボン酸、カテコール、及び4−ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される少なくとも1種である、〔12〕記載の方法。
1)プロモーター配列の合成
特許文献1に開示されるコリネバクテリム・グルタミカムの伸長因子tuのプロモーター(tuプロモーター)のヌクレオチド配列(配列番号2)、及びコリネバクテリウム・エフィシェンス由来の伸長因子tuのプロモーターのヌクレオチド配列を、データベース(GenBank:[www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/])から取得した。該コリネバクテリム・グルタミカム由来のtuプロモーターの配列と、該コリネバクテリウム・エフィシェンス由来のプロモーター配列をキメラ化して、配列番号1のプロモーター(以下、tytuプロモーターと呼ぶ)配列を設計した。設計したプロモーター配列をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して化学合成した。
コリネバクテリム・グルタミカムATCC13032株のゲノム(GenBank:ACCESSION No:NC_006958)に、プロモーターと、異種タンパク質EtbC(2,3−dihydroxy−ethylbenzene 1,2−dioxygenase)をコードする遺伝子etbc(配列番号3)を導入し、該プロモーター制御下でEtbCを発現する形質転換株を作製した。
pHKPsacB1(WO2014/007273参照)を鋳型に、プライマーpHKPsacB1−F及びpHKPsacB1−R(表1)を用いてベクター断片を増幅した。ATCC13032株ゲノムDNAを鋳型に、プライマー3324locus−F及び3324locus−R(表1)を用いてGene ID:cg3324で示される遺伝子領域(以下、cg3324領域という)のDNA断片を増幅した。pHKPsacB1ベクター断片とcg3324領域のDNA断片を、In−Fusion HD cloning kit(clontech社)にて連結し、pHKBsacB−cg3324を作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ECOS Competent E.Coli DH5α株(ニッポンジーン社)に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するLB寒天培地に塗布して37℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、Sapphire Amp(TaKaRa社)を用いてコロニーPCRを行った。プライマーはsacB−1及びkmter−F(表1)を用いた。目的遺伝子を持つプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンンを含むLB液体培地2mLに接種し、37℃で一晩培養した。得られた培養液よりNucleoSpin Plasmid EasyPure(TaKaRa社)を用いてプラスミドの精製を行い、pHKBsacB−cg3324を得た。
1)で得られたプラスミドptu−etbc及びptytu−etbcを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムDRHG145株(WO2014/007273参照)にエレクトロポレーション法(Bio−rad)により形質転換した。カナマイシン耐性で選択することにより、ゲノムのcg3324領域にプラスミドptu−etbc及びptytu−etbcがそれぞれ導入された、tu−etbc株及びtytu−etbc株を取得した。
プロモーターに連結したレポーター遺伝子(etbc)の発現量に基づいて、プロモーター活性を評価した。
上記で得られたtu−etbc株及びtytu−etbc株をLB寒天培地に画線し、30℃で2日間培養した。前培養では、得られた菌株を、CGXII培地8mLを入れた試験管に植菌し、32℃、200rpmで24時間培養した。本培養では、CGXII培地8mLを入れた試験管に、前培養液をOD600が2.5となるよう植菌し、32℃、200rpmで24時間培養した。
1)で得た本培養液0.5mLを採取し、遠心分離により上清を除いて菌体を回収し、液体窒素に投入して凍結した。培養液の採取は培養4時間目、8時間後、及び24時間後に行った。回収した菌体からtotal RNAを抽出した。終濃度40mMでジチオトレイトールを加えたBuffer RLT(RNeasy mini kitに同梱)600μLに菌体を懸濁した。2mL破砕用チューブ(安井器械社)に、硝酸処理したYGB01グラスビーズ0.1mm(安井器械社)を700mg入れ、菌体懸濁液を添加し、次いでマルチビーズショッカー(安井器械社)(2500rpmでの破砕60秒及び休止60秒のサイクルを6回)にかけ、菌体を破砕した。得られた菌体破砕液から、RNeasy mini kit(Qiagen社)を用いて、添付のマニュアルに従ってtotal RNAを抽出した。ゲノムDNAの消化はRNase−Free DNase Set(Qiagen社)を用いて行った。
2)で得たtotal RNA0.6〜1μgを、PrimeScrip RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa社)を用いて、添付のマニュアルに従って逆転写した。RNaseH(invitrogen社)を用いて、反応物中の鋳型RNAを消化した。定量PCRによりetbc遺伝子の発現量を測定した。定量PCRは、Brilliant Ultra−Fast SYBR Green QPCR Master Mix(Agilent Technologies社)を用い、リアルタイムPCR装置はMx3000P QPCR System(Agilent Technologies社)を用いて、添付のマニュアルに従って行った。解析ソフトはMxPro ET QPCR Software(Agilent Technologies社)を用いた。内在性コントロール遺伝子としてrRNA遺伝子を使用した。プライマーは、etbc遺伝子に対してetbc−rt−F1及びetbc−rt−R1を用い、rRNA遺伝子に対してrRNA−rt−F1及びrRNA−rt−R1を用いた(表2)。etbc遺伝子の発現量は、tu−etbc株の発現量を100としたときの相対値で示した。
1)で得た本培養液を採取し、OD600が約0.5〜0.6となるよう0.85%塩化ナトリウム水溶液にて適宜希釈した。培養液の採取は培養8時間後、及び24時間後に行った。希釈した培養液を、Assay Plate 96well(AGC テクノガラス社)に200μLずつ分注し、1Mカテコールを2μLずつ添加して混合後、30℃で10分間静置した。その後、VersaMax Microplate Reader(Molecular Devices社)にてOD375を測定した。カテコールにEtbCタンパク質が反応すると、メタ開裂が起こり2−オキシムコン酸セミアルデヒドが生成し発色する。EtbC酵素活性は、OD600/OD375比と定義した。tu−etbc株での酵素活性を100としたときの相対酵素活性を求めた。
Claims (10)
- 下記(a)〜(c)から選択されるDNAからなるプロモーター:
(a)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNA;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも96%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するDNA;及び
(c)配列番号1のヌクレオチド配列に対して1個以上5個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するDNA。 - 請求項1記載のプロモーターを含む発現ベクター。
- 目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記プロモーターとを含む、請求項2記載の発現ベクター。
- 前記目的物質が芳香族化合物である、請求項3記載の発現ベクター。
- 請求項1記載のプロモーターを含むDNA発現カセット。
- 目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記プロモーターとを含む、請求項5記載のDNA発現カセット。
- 前記目的物質が芳香族化合物である、請求項6記載のDNA発現カセット。
- 請求項2〜4のいずれか1項記載の発現ベクター又は請求項5〜7のいずれか1項記載のDNA発現カセットを含む、コリネバクテリウム。
- コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項8記載のコリネバクテリウム。
- 請求項8又は9記載のコリネバクテリウムを培養すること;及び
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。
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