WO2021241218A1 - 新規プロモーター - Google Patents

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WO2021241218A1
WO2021241218A1 PCT/JP2021/017980 JP2021017980W WO2021241218A1 WO 2021241218 A1 WO2021241218 A1 WO 2021241218A1 JP 2021017980 W JP2021017980 W JP 2021017980W WO 2021241218 A1 WO2021241218 A1 WO 2021241218A1
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WO
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promoter
gene
dna
nucleotide sequence
seq
Prior art date
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PCT/JP2021/017980
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English (en)
French (fr)
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雄一 壺井
史員 高橋
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花王株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring

Definitions

  • the present invention relates to a novel promoter.
  • Patent Document 1 discloses a promoter of the elongation factor tu as a highly active promoter that functions in Corynebacterium spp. (Patent Document 1) Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-21155
  • the present invention comprises a promoter consisting of DNA selected from the following (a) to (c): (A) DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (B) DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 96% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and having promoter activity; and (c) 1 or more and 5 or less relative to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. DNA in which the nucleotide consists of a deleted, substituted, added, or inserted nucleotide sequence and has promoter activity, I will provide a.
  • the invention provides an expression vector comprising said promoter.
  • the invention provides a DNA expression cassette containing the promoter.
  • the invention provides a corynebacterium comprising said expression vector or said DNA expression cassette.
  • the invention is described. Culturing the Corynebacterium; and recovering the target substance from the culture obtained by the culture. To provide a method for producing a target substance, including.
  • the identity of an amino acid sequence or nucleotide sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, the genetic information processing software GENETY Ver. It is calculated by performing analysis with Unit size to homology (ktup) as 2 using 12 homology analysis programs.
  • amino acid sequence or nucleotide sequence is 96% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, still more preferably 99. It means the identity of 5.5% or more.
  • nucleotide sequence in which one or several nucleotides have been deleted, substituted, added, or inserted is preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, and further. Preferably, it refers to a nucleotide sequence in which one or two nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted.
  • addition of a nucleotide includes addition of the nucleotide to one end and both ends of the sequence.
  • the "corresponding position" or “corresponding region” on the nucleotide sequence aligns the target sequence and the reference sequence (for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) so as to give the maximum homology (for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1). It can be determined by making it (alignment). Nucleotide sequence alignment can be performed using known algorithms and the procedure is known to those of skill in the art. For example, alignment can be performed by using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) with default settings.
  • Crystal W is, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www.]) operated by the National Institute of Genetics. It can be used on the website of dbj.nig.ac.jp/searches-j.html]).
  • the position of the target sequence aligned to any position in the reference sequence by the above alignment is considered to be the "corresponding position" to that arbitrary position.
  • a region sandwiched by corresponding positions or a region consisting of corresponding motifs is regarded as a corresponding region.
  • upstream and downstream with respect to a gene mean upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • upstream sequence and downstream sequence refer to sequences located on the 5'side and 3'side of the gene in the DNA sense strand, respectively.
  • promoter linked upstream of a gene means that the promoter is present on the 5'side of the gene in the DNA sense strand.
  • operable linkage between a gene and a control region such as a promoter means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region. It means that you are. Procedures for "operable linkage" between genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • promoter activity means an activity that promotes transcription of DNA (gene) into mRNA. Promoter activity can be confirmed by using an appropriate reporter gene. For example, the promoter activity can be confirmed by linking a DNA encoding a detectable protein downstream of the promoter, that is, a reporter gene, and measuring the production amount of the gene product of the reporter gene.
  • reporter genes include ⁇ -galactosidase (LacZ) gene, ⁇ -glucuronidase (GUS) gene, luciferase gene, ⁇ -lactamase gene, and EtbC (2,3-dihydroxy-ethylbenzene 1,2-dioxygene).
  • the promoter activity can also be confirmed by measuring the expression level of mRNA transcribed from the reporter gene by quantitative RT-PCR or the like.
  • the present invention relates to a novel promoter, an expression vector containing the promoter, a DNA expression cassette and a transformant, and a method for producing a target substance using the transformant.
  • the promoter of the present invention has high transcriptional activity and can significantly improve the transcription amount of the gene to be controlled. According to the promoter of the present invention, the efficiency of microbiological production of the target substance can be improved.
  • promoter of the present invention examples include promoters composed of DNA selected from the following (a) to (c).
  • the promoter of the present invention is a promoter containing a fragment derived from the promoter of the elongation factor tu of Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 2, also referred to as the tu promoter in the present specification below). Further, the promoter of the present invention contains a nucleotide sequence not derived from the tu promoter of Corynebacterium glutamicum. Preferred examples of the nucleotide sequence not derived from the tu promoter are 5'-CCGTGACATCTGTC-3'(SEQ ID NO: 3), whereas the number does not affect the promoter activity of the promoter of the present invention, preferably 3 or less.
  • a nucleotide sequence in which two or less nucleotides are deleted, substituted, added or inserted can be mentioned.
  • Such a nucleotide sequence is preferably located in the region corresponding to the 139-152 nucleotide region of SEQ ID NO: 1 in the promoter of the present invention.
  • a promoter consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 has about 85% sequence identity with the tu promoter and contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the 139-152 nucleotide region.
  • the promoter of the present invention has promoter activity at least in Corynebacterium.
  • the promoter of the present invention has improved promoter activity as compared to the tu promoter.
  • the method for obtaining the promoter of the present invention is not particularly limited, and can be obtained by a usual chemical synthesis method or genetic engineering method.
  • the promoter DNA of the present invention can be artificially synthesized based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a commercially available DNA synthesis service provided by GenScript, etc. can be used.
  • the promoter of the present invention can also be produced by introducing a mutation into the DNA of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the mutagenesis method include ultraviolet irradiation and a site-specific mutagenesis method.
  • SOE Splicing overlap extension
  • ODA ODA method
  • Kunkel Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 488, and the like.
  • the promoter of the present invention can be obtained by selecting a mutated DNA having a desired promoter activity.
  • a DNA having promoter activity can be selected by operably linking the target gene downstream of the mutated DNA and analyzing the expression level of the target gene.
  • nucleotide sequence Alternatively, methods of deleting, substituting, adding, or inserting nucleotides to a nucleotide sequence are described, for example, in Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995).
  • a promoter consisting of a nucleotide sequence having at least 96% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or one or more nucleotides deleted from the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a promoter consisting of a substituted, added, or inserted nucleotide sequence can be obtained.
  • the promoter of the present invention has a function of controlling the expression of a gene located downstream thereof.
  • a DNA fragment having an expression control region excellent in transcriptional activity can be obtained.
  • the DNA fragment may contain a cis element or a terminator that enhances the transcriptional activity of the promoter.
  • the DNA fragment may contain a selectable marker gene such as a drug resistance gene or an auxotrophic marker gene.
  • the DNA fragment containing the target gene and the promoter of the present invention is a DNA expression cassette for expressing the target gene.
  • the above-mentioned DNA fragment containing the promoter of the present invention can be constructed so as to have a restriction enzyme recognition sequence at both ends.
  • the restriction enzyme recognition sequence can be used to introduce the promoter of the present invention into a vector.
  • the promoter of the present invention can be introduced into a vector by cleaving the vector with a restriction enzyme and adding a DNA fragment containing the promoter of the present invention and having a restriction enzyme cleavage sequence at the end thereof (restriction). Enzyme method).
  • the DNA fragment containing the promoter of the present invention may be directly introduced into the genome of the host cell.
  • a DNA fragment containing the promoter of the present invention may be introduced upstream of a gene of interest in the genome of a host cell.
  • a DNA expression cassette containing the above-mentioned target gene and the promoter of the present invention may be introduced into the genome of a host cell.
  • the promoter of the present invention by incorporating the promoter of the present invention into an expression vector capable of expressing the target gene, an expression vector capable of improving the expression of the target gene at the transcription level can be obtained.
  • the promoter of the invention can be operably linked upstream of the DNA encoding the gene of interest.
  • the expression vector having the promoter of the present invention may be a vector for introduction into the chromosome of a host cell or a vector retained extrachromosomally. Those that can replicate in the host cell are preferred.
  • Examples of the expression vector include a vector for Escherichia coli, a vector for corynebacterium, and the like, and for example, a plasmid, cosmid, fasmid, phage, transposon, BAC vector, and the like can be used.
  • Examples of preferred vectors are pET21-a (+), pUC18 / 19, pUC118 / 119, pBR322, pMW218 / 219, pZ1 (Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55: 684-688), pEKEx1 (G), pEKEx1 102: 93-98), pHS2-1 (Gene, 991, 107: 69-74), pCLiK5MCS (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-522218), pCG2 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-35197), pNG2 (FEMS Microbiology Letters). , 1990, 66: 119-124), pAG1 (Japanese Patent Laid-Open No. 61-5229), pHKPsacB1 (WO2014 / 007273) and the like.
  • the target gene located downstream of the promoter of the present invention is not particularly limited.
  • the target gene is a gene encoding a target substance or an enzyme involved in its synthesis.
  • the target gene may be a heterologous gene encoding a heterologous expression product, a gene derived from the same species introduced from the outside, a gene encoding an expression product originally possessed by the host cell, or any other gene. It may be a gene encoding a protein, peptide, nucleic acid, etc.
  • substances encoded by the target gene include enzymes, hormones, cytokines, other bioactive peptides, transporters, non-coding RNAs and the like.
  • enzymes include oxidative enzyme, transfer enzyme (Transphase), hydrolyze enzyme (Hydrolase), desorption enzyme (Lyase), isomerase (Isomerase), synthase (Ligase or Synthese), and glycolysis.
  • Examples thereof include enzymes of the system, enzymes of the pentotholic acid circuit, enzymes of the TCA circuit, enzymes involved in the synthesis of aromatic compounds, and the like.
  • Preferred examples of the target gene include enzymes involved in the synthesis of aromatic compounds in host cells, for example, gallic acid synthase (described in JP-A-2009-0655839, JP-A-2009-213392), AroF, AroG, and the like.
  • Examples thereof include genes encoding PabAB, PabC and the like.
  • aromatic compounds include gallic acid, protocatechuic acid (PCA), aminohydroxybenzoic acid (AHBA), pyridinedicarboxylic acid (PDCA), catechol, 4-hydroxybenzoic acid and the like.
  • the expression vector or DNA fragment containing the promoter of the present invention is subjected to general transformation methods such as electroporation method, transformation method, transfection method, conjugation method, protoplast method, particle gun method, Agrobacterium method and the like.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the transformant into a host cell using the above.
  • the host cell into which the vector or DNA fragment is introduced is not particularly limited as long as the promoter of the present invention can function as a promoter in the cell, but a bacterium is preferable, and a corynebacterium is more preferable. ..
  • Examples of corynebacterium include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium halotolerans. Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium callunae and the like are preferable, and Corynebacterium glutamicum is more preferable.
  • Coryneform bacteria such as Corynebacterium glutamicum have the same bacterial name (Liebl W et al, Int J System Bacteriol, 1911, 41: 255-260; Kazuo Komagata et al., Fermentation and Industry, 1987, 45. : 944-963).
  • the above transformant can be used for the production of the target substance.
  • a transformant containing an expression vector or DNA fragment having a gene encoding a target substance or an enzyme involved in its synthesis and a promoter of the present invention operably linked upstream of the gene is cultured to obtain the present invention.
  • the gene is expressed under the control of the promoter of the present invention to produce a target substance.
  • Examples of the target substance are as described above, but preferred examples are those involved in the production of the substance encoded by the target gene described above and the product synthesized by the action of the substance, for example, the aromatic compound described above.
  • Examples include aromatic compounds produced by enzymes.
  • aromatic compounds include gallic acid, protocatechuic acid (PCA), aminohydroxybenzoic acid (AHBA), pyridinedicarboxylic acid (PDCA), catechol, 4-hydroxybenzoic acid and the like.
  • the culture conditions of the transformant are not particularly limited as long as the cells of the transformant can proliferate and the target substance can be produced.
  • preferred media include LB medium, CGXII medium (Journal of Bacteriology, 1993, 175: 5595-5603), and the culture conditions include a culture temperature of 15 ° C. The temperature is about 45 ° C., and the culture time is 1 to 7 days.
  • preferred media include LB medium, M9 medium and the like, and culture conditions include a culture temperature of 15 ° C to 45 ° C and a culture time of 1 to 7 days.
  • the target substance can be obtained by recovering the target substance from the culture. If necessary, the recovered target substance may be further purified.
  • the method for recovering or purifying the target substance from the culture is not particularly limited, and the method may be carried out according to a known recovery or purification method. For example, the culture is collected, and if necessary, the cells are crushed by ultrasonic waves or pressurization, and then the cell components are removed by a tilting method, filtration, centrifugation, etc., and then an image containing the remaining target substance is contained. All you have to do is collect the minutes.
  • the target substance can be purified by subjecting the recovered fraction to a method such as dialysis, salting out, ion exchange method, distillation, solvent extraction, or a combination thereof, if necessary.
  • the transformant may be cultured and the target substance may be recovered by any of a batch method, a semi-batch method and a continuous method.
  • the DNAs (a) to (c) contain the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the region corresponding to the nucleotide region 139 to 152 of SEQ ID NO: 1, or are in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. Containing a nucleotide sequence in which no more than 3 nucleotides have been deleted, substituted, added or inserted. promoter.
  • the promoter according to [1], wherein the promoter preferably has promoter activity in Corynebacterium.
  • the expression vector according to [3] preferably comprising a gene encoding a target substance or an enzyme involved in its synthesis and the promoter linked upstream of the gene.
  • the gene is preferably a gene encoding an enzyme involved in the synthesis of an aromatic compound, and the aromatic compound is preferably gallic acid, protocatechuic acid, aminohydroxybenzoic acid, pyridinedicarboxylic acid, catechol, and.
  • the expression vector according to [4] which is at least one selected from the group consisting of 4-hydroxybenzoic acid.
  • [6] A DNA fragment containing the promoter according to [1] or [2].
  • the DNA fragment according to [6] preferably comprising a gene encoding a target substance or an enzyme involved in its synthesis and the promoter linked upstream of the gene.
  • the gene is preferably a gene encoding an enzyme involved in the synthesis of an aromatic compound, and the aromatic compound is preferably gallic acid, protocatechuic acid, aminohydroxybenzoic acid, pyridinedicarboxylic acid, catechol, and.
  • the DNA fragment according to [7] which is at least one selected from the group consisting of 4-hydroxybenzoic acid.
  • the transformant according to [10] preferably Corynebacterium, more preferably Corynebacterium glutamicum.
  • [12] Culturing the transformant according to [10] or [11]; and recovering the target substance from the culture obtained by the culture.
  • a method for producing a target substance including. [13]
  • the target substance is preferably an aromatic compound, and more preferably at least selected from the group consisting of gallic acid, protocatechuic acid, aminohydroxybenzoic acid, pyridinedicarboxylic acid, catechol, and 4-hydroxybenzoic acid.
  • the method according to [12] which is one type.
  • Example 1 Synthesis of promoter 1) Synthesis of promoter sequence The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the promoter (tu promoter) of the corinebacterium glutamicum elongation factor tu disclosed in Patent Document 1 and the extension derived from corynebacterium efficience. The nucleotide sequence of the promoter of the factor tu was obtained from the database (GenBank: [www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]).
  • tu promoter The sequence of the tu promoter derived from the Corynebacterium glutamicum and the promoter sequence derived from the Corynebacterium efficience were chimerized to design the promoter sequence of SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as "tytu promoter").
  • the designed promoter sequence was chemically synthesized using an artificial gene synthesis service manufactured by GenScript.
  • Example 2 Preparation of Transformed Strain
  • a promoter and a heterologous protein EtbC (2,3-dihydroxy-ethylbenzene 1,2-dioxygenase) are encoded into the genome (GenBank: ACCESSION No: NC_006958) of the corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain. (SEQ ID NO: 3) was introduced to prepare a transformant expressing EtbC under the promoter control.
  • pHKPsacB1 vector fragment and the DNA fragment in the cg3324 region were ligated with an In-Fusion HD cloning kit (clontech) to prepare pHKBsacB-cg3324.
  • ECOS Compentent E The cells were transformed into E. coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene), and the obtained extracellular fluid was applied to LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37 ° C.
  • colony PCR was performed using Sapphire Amp (TaKaRa). Primers used were sacB-1 and kmter-F (Table 1).
  • the transformant in which the introduction of the plasmid having the target gene was confirmed was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured at 37 ° C. overnight. From the obtained culture broth, a plasmid was purified using NucleoSpin plasmid EasyPure (TaKaRa) to obtain pHKBsacB-cg3324.
  • the vector fragment was amplified using pHKPsacB-cg3324 as a template and primers pHKPsacB-cg3324-F and pHKPsacB-cg3324-R (Table 1).
  • Linker sequence connecting the 3'side of the vector fragment and the 5'side of the promoter (linker 1, SEQ ID NO: 4), linker sequence connecting the 3'side of the promoter and the 5'side of the etbc gene (linker 2, sequence)
  • the linker sequence (linker 3, SEQ ID NO: 6) connecting the 3'side of the etbc gene and the 5'side of the vector sequence, and the DNA sequence of the etbc gene (SEQ ID NO: 7) were artificially synthesized.
  • the etbc gene fragment was amplified using the primers etbc-F and etbc-R (Table 1).
  • the linker 3 DNA fragment was amplified using the linker 3-F and Linker 3-R (Table 1) using the linker 3 DNA as a template.
  • a vector fragment, an etbc gene fragment, and a linker 3 DNA fragment were ligated with an In-Fusion HD cloning kit (clontech) to prepare a petbc-ter.
  • the vector fragment was amplified using the primers pHKPsacB-cg3324-R and etbc-F2 (Table 1) using petbc-ter as a template.
  • the linker 1 DNA fragment was amplified using the linker 1 DNA as a template and the primers Linker 1-F and Linker 1-R (Table 1).
  • the linker 2 DNA fragment was amplified using the linker 2-F and Linker 2-R (Table 1) using the linker 2 DNA as a template.
  • the vector fragment, the linker 1 DNA fragment, and the linker 2 DNA fragment were ligated with an In-Fusion HD cloning kit (clontech) to prepare a petbc.
  • the vector fragment was amplified using the primers Linker1-R and Linker2-F2 (Table 1) using petbc as a template.
  • the tu promoter fragment was amplified using the primers pro-F and pro-R (Table 1).
  • the tytu promoter fragment was amplified using the primers pro-F and pro-R (Table 1).
  • the vector fragment and the tu promoter fragment were ligated with an In-Fusion HD cloning kit (clontech) to prepare a plasmid ptu-etbc.
  • a plasmid ptytu-etbc was prepared from the vector fragment and the tytu promoter fragment.
  • Example 2 Evaluation of promoter activity The promoter activity was evaluated based on the expression level of the reporter gene (etbc) linked to the promoter.
  • RNA was extracted from the recovered cells.
  • the cells were suspended in 600 ⁇ L of Buffer RLT (included in Qiagen's RNeasy mini kit) to which dithiothreitol was added at a final concentration of 40 mM.
  • etbc-rt-F1 and etbc-rt-R1 were used for the etbc gene, and rRNA-rt-F1 and rRNA-rt-R1 were used for the rRNA gene (Table 2).
  • the expression level of the etbc gene is shown as a relative value when the expression level of the tu-etbc strain is 100.
  • Table 3 shows the relative expression levels of the etbc gene. At each time, the expression level of the etbc gene in the tytu-etbc strain was higher than that in the tu-etbc strain, indicating that the activity of the tytu promoter was higher than that of the tu promoter.
  • the main culture solution obtained in 1) was collected and appropriately diluted with a 0.85% sodium chloride aqueous solution so that the OD600 was about 0.5 to 0.6.
  • the culture broth was collected 8 hours and 24 hours after culturing.
  • the diluted culture solution was dispensed into Assay Plate 96well (AGC Technoglass Co., Ltd.) in an amount of 200 ⁇ L each, 1M catechol was added in an amount of 2 ⁇ L each, mixed, and then allowed to stand at 30 ° C. for 10 minutes. Then, OD375 was measured with a VersaMax Microplate Reader (Molecular Devices).
  • EtbC enzyme activity was defined as an OD600 / OD375 ratio.
  • the relative enzyme activity when the enzyme activity in the tu-etbc strain was set to 100 was determined.
  • Table 4 shows the relative enzyme activity of EtbC. At each time, the EtbC activity in the tytu-etbc strain was higher than that in the tu-etbc strain, indicating that the activity of the tytu promoter was higher than that of the tu promoter.

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Abstract

高活性なプロモーターの提供。下記（ａ）～（ｃ）から選択されるＤＮＡからなるプロモーター：（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して１個以上５個以下のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。

Description

新規プロモーター
　本発明は、新規プロモーターに関する。
　微生物による物質の工業生産において、目的物質の生産性向上は重要な課題の一つである。従来、微生物による物質生産性向上のための生物工学的研究が進められてきた。その１つは、高活性プロモーターに関する研究である。特許文献１には、コリネバクテリウム属菌で機能する高活性なプロモーターとして、伸長因子ｔｕのプロモーターが開示されている。
（特許文献１）特開２００８－２１２１５５号公報
　一態様において、本発明は、下記（ａ）～（ｃ）から選択されるＤＮＡからなるプロモーター：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して１個以上５個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ、
を提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記プロモーターを含む発現ベクターを提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記プロモーターを含むＤＮＡ発現カセットを提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記発現ベクター又は前記ＤＮＡ発現カセットを含む、コリネバクテリウムを提供する。
　別の一態様において、本発明は、
　前記コリネバクテリウムを培養すること；及び
　該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法を提供する。
発明の詳細な説明
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９６％の同一性」とは、９６％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。
　本明細書における「１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下、さらに好ましくは１個又は２個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、ヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのヌクレオチドの付加が含まれる。
　本明細書において、ヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。ヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、または相当するモチーフからなる領域は、相当する領域とみなされる。
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、遺伝子の「上流配列」「下流配列」とは、それぞれＤＮＡセンス鎖において該遺伝子の５'側及び３’側に位置する配列をいう。例えば、「遺伝子の上流に連結されたプロモーター」とは、ＤＮＡセンス鎖において遺伝子の５'側にプロモーターが存在することを意味する。
　本明細書において、遺伝子と、プロモーター等の制御領域との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、「プロモーター活性」とは、ＤＮＡ（遺伝子）のｍＲＮＡへの転写を促進する活性を意味する。プロモーター活性は、適当なレポーター遺伝子を用いることにより確認することができる。例えば、プロモーターの下流に検出可能なタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、レポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子の遺伝子産物の生産量を測定することにより、プロモーター活性を確認可能である。レポーター遺伝子の例としては、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ラクタマーゼ遺伝子、ＥｔｂＣ（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ　１，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子等の発色基質に対して作用する酵素の遺伝子や、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子、などが挙げられる。あるいは、プロモーター活性は、レポーター遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲ等で測定することによっても確認することができる。
　本発明は、新規プロモーター、該プロモーターを含有する発現ベクター、ＤＮＡ発現カセット及び形質転換体、ならびに該形質転換体を用いた目的物質の製造方法に関する。
　本発明のプロモーターは、転写活性が高く、制御対象とする遺伝子の転写量を顕著に向上させることができる。本発明のプロモーターによれば、目的物質の微生物学的生産の効率を向上させることができる。
　本発明のプロモーターとしては、以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるＤＮＡからなるプロモーターが挙げられる。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
　本発明のプロモーターは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の伸長因子ｔｕのプロモーター（配列番号２、以下の本明細書においてｔｕプロモーターともいう）に由来するフラグメントを含むプロモーターである。さらに本発明のプロモーターは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のｔｕプロモーターに由来しないヌクレオチド配列を含む。該ｔｕプロモーターに由来しないヌクレオチド配列の好ましい例としては、５’－CCGTGACATCTGTC－３’（配列番号３）、及びこれに対して本発明のプロモーターのプロモーター活性に影響しない程度、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。このようなヌクレオチド配列は、好ましくは本発明のプロモーターにおける配列番号１の１３９～１５２番ヌクレオチド領域に相当する領域に位置する。例えば、配列番号１のヌクレオチド配列からなるプロモーターは、ｔｕプロモーターと約８５％の配列同一性を有し、且つ１３９～１５２番ヌクレオチド領域に配列番号３のヌクレオチド配列を含む。本発明のプロモーターは、少なくともコリネバクテリウムにおいてプロモーター活性を有するものである。好ましくは、本発明のプロモーターは、ｔｕプロモーターと比較して、プロモーター活性が向上している。
　本発明のプロモーターの取得方法としては、特に制限されず、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて、本発明のプロモーターＤＮＡを人工合成することができる。ＤＮＡの人工合成には、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から提供される市販のＤＮＡ合成サービスを利用することができる。
　本発明のプロモーターはまた、配列番号１のヌクレオチド配列のＤＮＡに突然変異を導入することによって製造することができる。突然変異導入の手法としては、例えば、紫外線照射及び部位特異的変異導入法が挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　７７，６１－６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１－２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔａｎ－ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒTM　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。突然変異導入したＤＮＡから所望のプロモーター活性を有するものを選択することによって、本発明のプロモーターを取得することができる。例えば、変異導入したＤＮＡの下流に目的遺伝子を作動可能に連結し、該目的遺伝子の発現量解析を行うことにより、プロモーター活性を有するＤＮＡを選択することができる。
　あるいは、ヌクレオチド配列に対するヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入の方法は、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，５８１－６２１，１９９５）に記載されている。
　上述の手法を用いることによって、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプロモーター、又は、配列番号１の配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなるプロモーターを取得することができる。
　本発明のプロモーターは、その下流に配置された遺伝子の発現を制御する機能を有する。本発明のプロモーターを利用することによって、転写活性に優れた発現制御領域を有するＤＮＡ断片を得ることができる。例えば、目的遺伝子と、その上流に作動可能に連結された本発明のプロモーターとを含むＤＮＡ断片を構築することができる。該ＤＮＡ断片には、本発明のプロモーター及び目的遺伝子の他に、該プロモーターの転写活性を向上させるようなシスエレメント、又はターミネーターが含まれていてもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子などの選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。好ましくは、該目的遺伝子と本発明のプロモーターとを含むＤＮＡ断片は、該目的遺伝子を発現するためのＤＮＡ発現カセットである。
　上述した本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片は、両末端に制限酵素認識配列を有するように構築することができる。該制限酵素認識配列を使用して、本発明のプロモーターをベクターに導入することができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、本発明のプロモーターを含み端部に制限酵素切断配列を有するＤＮＡ断片を添加することによって、本発明のプロモーターをベクターに導入することができる（制限酵素法）。
　本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片は、宿主細胞のゲノムに直接導入してもよい。例えば、本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片を、宿主細胞のゲノムにおける目的遺伝子の上流に導入してもよい。また例えば、上述した目的遺伝子と本発明のプロモーターとを含むＤＮＡ発現カセットを、宿主細胞のゲノムに導入してもよい。
　あるいは、本発明のプロモーターを、目的遺伝子の発現を可能とする発現ベクターに組み込むことで、当該目的遺伝子の発現を転写レベルで向上させることができる発現ベクターが得られる。該発現ベクターにおいては、本発明のプロモーターは、目的遺伝子をコードするＤＮＡの上流に作動可能に連結され得る。本発明のプロモーターを有する発現ベクターは、宿主細胞の染色体に導入するためのベクターであっても、染色体外に保持されるベクターであってもよい。宿主細胞内で複製可能なものが好ましい。
　発現ベクターの例としては、大腸菌用ベクター、コリネバクテリウム用ベクターなどが挙げられ、例えばプラスミド、コスミド、ファスミド、ファージ、トランスポゾン、ＢＡＣベクターなどを用いることができる。好ましいベクターの例としては、ｐＥＴ２１－ａ（＋）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１８／２１９、ｐＺ１（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，５５：６８４－６８８）、ｐＥＫＥｘ１（Ｇｅｎｅ，１９９１，１０２：９３－９８）、ｐＨＳ２－１（Ｇｅｎｅ，１９９１，１０７：６９－７４）、ｐＣＬｉＫ５ＭＣＳ（特表２００５－５２２２１８号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＮＧ２（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９０，６６：１１９－１２４）、ｐＡＧ１（特開昭６１－５２２９０号公報）、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（ＷＯ２０１４／００７２７３）などが挙げられる。
　上記発現ベクターやＤＮＡ断片において、本発明のプロモーターの下流に配置される目的遺伝子は特に限定されない。例えば、目的遺伝子は、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子である。目的遺伝子は、異種発現産物をコードする異種遺伝子であっても、外部から導入された同種由来の遺伝子であっても、宿主細胞が本来有する発現産物をコードする遺伝子であっても、その他の任意のタンパク質、ペプチド、核酸などをコードする遺伝子であってもよい。目的遺伝子がコードする物質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、その他生理活性ペプチド、トランスポーター、ノンコーディングＲＮＡなどが挙げられる。酵素の例としては、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ又はＳｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、解糖系の酵素、ペントースリン酸回路の酵素、ＴＣＡ回路の酵素、芳香族化合物の合成に関与する酵素、などが挙げられる。目的遺伝子の好ましい例としては、宿主細胞の芳香族化合物の合成に関与する酵素、例えば没食子酸合成酵素（特開２００９－０６５８３９号公報、特開２００９－２１３３９２号公報に記載）、ＡｒｏＦ、ＡｒｏＧ、ＰａｂＡＢ、ＰａｂＣなどをコードする遺伝子、などが挙げられる。芳香族化合物の例としては、没食子酸、プロトカテク酸（ＰＣＡ）、アミノヒドロキシ安息香酸（ＡＨＢＡ）、ピリジンジカルボン酸（ＰＤＣＡ）、カテコール、４－ヒドロキシ安息香酸などが挙げられる。
　本発明のプロモーターを含む発現ベクター又はＤＮＡ断片を、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いて宿主細胞に導入することによって、本発明の形質転換体を得ることができる。
　上記ベクターやＤＮＡ断片を導入する宿主細胞としては、その細胞内で、本発明のプロモーターがプロモーターとして機能し得るものであれば特に限定されないが、好ましくは細菌、より好ましくはコリネバクテリウムが挙げられる。コリネバクテリウムの例としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）などが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカムに菌名が統一されている（Ｌｉｅｂｌ　Ｗ　ｅｔ　ａｌ，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９１，４１：２５５－２６０；駒形和男ら，発酵と工業，１９８７，４５：９４４－９６３）。
　上記形質転換体は、目的物質の製造に利用することができる。例えば、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に作動可能に連結された本発明のプロモーター、を有する発現ベクター又はＤＮＡ断片を含む形質転換体を培養して、本発明のプロモーターの制御下で該遺伝子を発現させ、目的物質を生産させる。
　目的物質の例は上述したとおりであるが、好ましい例としては、上述した目的遺伝子にコードされる物質、及び該物質の働きで合成される生成物、例えば上述した芳香族化合物の生産に関与する酵素により生成される、芳香族化合物が挙げられる。芳香族化合物の例としては、没食子酸、プロトカテク酸（ＰＣＡ）、アミノヒドロキシ安息香酸（ＡＨＢＡ）、ピリジンジカルボン酸（ＰＤＣＡ）、カテコール、４－ヒドロキシ安息香酸などが挙げられる。
　形質転換体の培養条件は、該形質転換体の細胞の増殖及び目的物質の生産が可能な条件であれば特に限定されない。例えば、形質転換体がコリネバクテリウムの場合、好ましい培地としては、ＬＢ培地、ＣＧＸII培地（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９３，１７５：５５９５－５６０３）などが挙げられ、培養条件としては、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日が挙げられる。形質転換体が大腸菌の場合、好ましい培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地などが挙げられ、培養条件としては、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日が挙げられる。
　培養後、培養物から目的物質を回収することにより、目的物質を取得することができる。必要に応じて、回収した目的物質をさらに精製してもよい。培養物から目的物質を回収又は精製する方法は、特に限定されず、公知の回収又は精製方法に従って行えばよい。例えば、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、次いで傾斜法、ろ過、遠心分離などにより細胞成分を除去した後、残った目的物質を含む画分を回収すればよい。必要に応じて回収した画分を透析、塩析、イオン交換法、蒸留、溶剤抽出等の方法、又はこれらの組み合わせにかけることで、目的物質を精製することができる。本発明による目的物質の製造方法において、形質転換体の培養及び目的物質の回収は、回分式、半回分式及び連続式のいずれの方法で行ってもよい。
　本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕下記（ａ）～（ｃ）から選択されるＤＮＡからなるプロモーター：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して１個以上５個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ、
であって、
　好ましくは、該（ａ）～（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１の１３９～１５２番ヌクレオチド領域に相当する領域に、配列番号３のヌクレオチド配列を含むか、又は、配列番号３のヌクレオチド配列に対して３個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加又は挿入されたヌクレオチド配列を含む、
プロモーター。
〔２〕好ましくは、前記プロモーターがコリネバクテリウムにおいてプロモーター活性を有する、〔１〕記載のプロモーター。
〔３〕〔１〕又は〔２〕記載のプロモーターを含む発現ベクター。
〔４〕好ましくは、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記プロモーターとを含む、〔３〕記載の発現ベクター。
〔５〕前記遺伝子が、好ましくは芳香族化合物の合成に関わる酵素をコードする遺伝子であり、該芳香族化合物が、好ましくは没食子酸、プロトカテク酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ピリジンジカルボン酸、カテコール、及び４－ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される少なくとも１種である、〔４〕記載の発現ベクター。
〔６〕〔１〕又は〔２〕記載のプロモーターを含むＤＮＡ断片。
〔７〕好ましくは、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記プロモーターとを含む、〔６〕記載のＤＮＡ断片。
〔８〕前記遺伝子が、好ましくは芳香族化合物の合成に関わる酵素をコードする遺伝子であり、該芳香族化合物が、好ましくは没食子酸、プロトカテク酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ピリジンジカルボン酸、カテコール、及び４－ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される少なくとも１種である、〔７〕記載のＤＮＡ断片。
〔９〕好ましくはＤＮＡ発現カセットである、〔６〕～〔８〕のいずれか１項記載のＤＮＡ断片。
〔１０〕〔３〕～〔５〕のいずれか１項記載の発現ベクター、又は〔６〕～〔９〕のいずれか１項記載のＤＮＡ断片を含む、形質転換体。
〔１１〕好ましくはコリネバクテリウムであり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである、〔１０〕記載の形質転換体。
〔１２〕〔１０〕又は〔１１〕記載の形質転換体を培養すること；及び
　該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。
〔１３〕前記目的物質が、好ましくは芳香族化合物であり、より好ましくは没食子酸、プロトカテク酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ピリジンジカルボン酸、カテコール、及び４－ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１２〕記載の方法。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１　プロモーターの合成
１）プロモーター配列の合成
　特許文献１に開示されるコリネバクテリム・グルタミカムの伸長因子ｔｕのプロモーター（ｔｕプロモーター）のヌクレオチド配列（配列番号２）、及びコリネバクテリウム・エフィシェンス由来の伸長因子ｔｕのプロモーターのヌクレオチド配列を、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ：[www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]）から取得した。該コリネバクテリム・グルタミカム由来のｔｕプロモーターの配列と、該コリネバクテリウム・エフィシェンス由来のプロモーター配列をキメラ化して、配列番号１のプロモーター（以下、ｔｙｔｕプロモーターと呼ぶ）配列を設計した。設計したプロモーター配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して化学合成した。
実施例２　形質転換株の作製
　コリネバクテリム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ：ＮＣ＿００６９５８）に、プロモーターと、異種タンパク質ＥｔｂＣ（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ　１，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子ｅｔｂｃ（配列番号３）を導入し、該プロモーター制御下でＥｔｂＣを発現する形質転換株を作製した。
１）プロモーター活性評価用プラスミドの作製
　ｐＨＫＰｓａｃＢ１（ＷＯ２０１４／００７２７３参照）を鋳型に、プライマーｐＨＫＰｓａｃＢ１－Ｆ及びｐＨＫＰｓａｃＢ１－Ｒ（表１）を用いてベクター断片を増幅した。ＡＴＣＣ１３０３２株ゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー３３２４ｌｏｃｕｓ－Ｆ及び３３２４ｌｏｃｕｓ－Ｒ（表１）を用いてＧｅｎｅ　ＩＤ：ｃｇ３３２４で示される遺伝子領域（以下、ｃｇ３３２４領域という）のＤＮＡ断片を増幅した。ｐＨＫＰｓａｃＢ１ベクター断片とｃｇ３３２４領域のＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＨＫＢｓａｃＢ－ｃｇ３３２４を作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（ＴａＫａＲａ社）を用いてコロニーＰＣＲを行った。プライマーはｓａｃＢ－１及びｋｍｔｅｒ－Ｆ（表１）を用いた。目的遺伝子を持つプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＨＫＢｓａｃＢ－ｃｇ３３２４を得た。
　ｐＨＫＰｓａｃＢ－ｃｇ３３２４を鋳型に、プライマーｐＨＫＰｓａｃＢ－ｃｇ３３２４－Ｆ及びｐＨＫＰｓａｃＢ－ｃｇ３３２４－Ｒ（表１）を用いてベクター断片を増幅した。ベクター断片の３’側とプロモーターの５’側の間をつなぐリンカー配列（リンカー１、配列番号４）、プロモーターの３’側とｅｔｂｃ遺伝子の５’側の間をつなぐリンカー配列（リンカー２、配列番号５）及びｅｔｂｃ遺伝子の３’側とベクター配列の５’側の間をつなぐリンカー配列（リンカー３、配列番号６）、及びｅｔｂｃ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号７）をそれぞれ人工合成した。ｅｔｂｃ遺伝子ＤＮＡを鋳型に、プライマーｅｔｂｃ－Ｆ及びｅｔｂｃ－Ｒ（表１）を用いてｅｔｂｃ遺伝子断片を増幅した。リンカー３ＤＮＡを鋳型に、プライマーＬｉｎｋｅｒ３－Ｆ及びＬｉｎｋｅｒ３－Ｒ（表１）を用いてリンカー３ＤＮＡ断片を増幅した。ベクター断片とｅｔｂｃ遺伝子断片とリンカー３ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐｅｔｂｃ－ｔｅｒを作製した。
　ｐｅｔｂｃ－ｔｅｒを鋳型に、プライマーｐＨＫＰｓａｃＢ－ｃｇ３３２４－Ｒ及びｅｔｂｃ－Ｆ２（表１）を用いてベクター断片を増幅した。リンカー１ＤＮＡを鋳型に、プライマーＬｉｎｋｅｒ１－Ｆ及びＬｉｎｋｅｒ１－Ｒ（表１）を用いてリンカー１ＤＮＡ断片を増幅した。リンカー２ＤＮＡを鋳型に、プライマーＬｉｎｋｅｒ２－Ｆ及びＬｉｎｋｅｒ２－Ｒ（表１）を用いてリンカー２ＤＮＡ断片を増幅した。ベクター断片とリンカー１ＤＮＡ断片とリンカー２ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐｅｔｂｃを作製した。
　ｐｅｔｂｃを鋳型に、プライマーＬｉｎｋｅｒ１－Ｒ及びＬｉｎｋｅｒ２－Ｆ２（表１）を用いてベクター断片を増幅した。ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーｐｒｏ－Ｆ及びｐｒｏ－Ｒ（表１）を用いてｔｕプロモーター断片を増幅した。ｔｙｔｕプロモーターＤＮＡを鋳型に、プライマーｐｒｏ－Ｆ及びｐｒｏ－Ｒ（表１）を用いてｔｙｔｕプロモーター断片を増幅した。ベクター断片とｔｕプロモーター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、プラスミドｐｔｕ－ｅｔｂｃを作成した。同様にベクター断片とｔｙｔｕプロモーター断片からプラスミドｐｔｙｔｕ－ｅｔｂｃを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２）形質転換株の作製
　１）で得られたプラスミドｐｔｕ－ｅｔｂｃ及びｐｔｙｔｕ－ｅｔｂｃを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＲＨＧ１４５株（ＷＯ２０１４／００７２７３参照）にエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。カナマイシン耐性で選択することにより、ゲノムのｃｇ３３２４領域にプラスミドｐｔｕ－ｅｔｂｃ及びｐｔｙｔｕ－ｅｔｂｃがそれぞれ導入された、ｔｕ－ｅｔｂｃ株及びｔｙｔｕ－ｅｔｂｃ株を取得した。
実施例２　プロモーター活性の評価
　プロモーターに連結したレポーター遺伝子（ｅｔｂｃ）の発現量に基づいて、プロモーター活性を評価した。
１）菌株の培養
　上記で得られたｔｕ－ｅｔｂｃ株及びｔｙｔｕ－ｅｔｂｃ株をＬＢ寒天培地に画線し、３０℃で２日間培養した。前培養では、得られた菌株を、ＣＧＸII培地８ｍＬを入れた試験管に植菌し、３２℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。本培養では、ＣＧＸII培地８ｍＬを入れた試験管に、前培養液をＯＤ６００が２．５となるよう植菌し、３２℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。
２）ＲＮＡの抽出
　１）で得た本培養液０．５ｍＬを採取し、遠心分離により上清を除いて菌体を回収し、液体窒素に投入して凍結した。培養液の採取は培養４時間目、８時間後、及び２４時間後に行った。回収した菌体からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。終濃度４０ｍＭでジチオトレイトールを加えたＢｕｆｆｅｒ　ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔに同梱）６００μＬに菌体を懸濁した。２ｍＬ破砕用チューブ（安井器械社）に、硝酸処理したＹＧＢ０１グラスビーズ０．１ｍｍ（安井器械社）を７００ｍｇ入れ、菌体懸濁液を添加し、次いでマルチビーズショッカー（安井器械社）（２５００ｒｐｍでの破砕６０秒及び休止６０秒のサイクルを６回）にかけ、菌体を破砕した。得られた菌体破砕液から、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、添付のマニュアルに従ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの消化はＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。
３）定量ＰＣＲによる転写量測定
　２）で得たｔｏｔａｌ　ＲＮＡ０．６～１μｇを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ社）を用いて、添付のマニュアルに従って逆転写した。ＲＮａｓｅＨ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、反応物中の鋳型ＲＮＡを消化した。定量ＰＣＲによりｅｔｂｃ遺伝子の発現量を測定した。定量ＰＣＲは、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＱＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、リアルタイムＰＣＲ装置はＭｘ３０００Ｐ　ＱＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、添付のマニュアルに従って行った。解析ソフトはＭｘＰｒｏ　ＥＴ　ＱＰＣＲ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。内在性コントロール遺伝子としてｒＲＮＡ遺伝子を使用した。プライマーは、ｅｔｂｃ遺伝子に対してｅｔｂｃ－ｒｔ－Ｆ１及びｅｔｂｃ－ｒｔ－Ｒ１を用い、ｒＲＮＡ遺伝子に対してｒＲＮＡ－ｒｔ－Ｆ１及びｒＲＮＡ－ｒｔ－Ｒ１を用いた（表２）。ｅｔｂｃ遺伝子の発現量は、ｔｕ－ｅｔｂｃ株の発現量を１００としたときの相対値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｅｔｂｃ遺伝子の相対発現量を表３に示す。各時間において、ｔｙｔｕ－ｅｔｂｃ株でのｅｔｂｃ遺伝子発現量はｔｕ－ｅｔｂｃ株と比べて高く、ｔｙｔｕプロモーターの活性がｔｕプロモーターより高いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
４）ＥｔｂＣ酵素活性の測定
　１）で得た本培養液を採取し、ＯＤ６００が約０．５～０．６となるよう０．８５％塩化ナトリウム水溶液にて適宜希釈した。培養液の採取は培養８時間後、及び２４時間後に行った。希釈した培養液を、Ａｓｓａｙ　Ｐｌａｔｅ　９６ｗｅｌｌ（ＡＧＣ　テクノガラス社）に２００μＬずつ分注し、１Ｍカテコールを２μＬずつ添加して混合後、３０℃で１０分間静置した。その後、ＶｅｒｓａＭａｘ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）にてＯＤ３７５を測定した。カテコールにＥｔｂＣタンパク質が反応すると、メタ開裂が起こり２－オキシムコン酸セミアルデヒドが生成し発色する。ＥｔｂＣ酵素活性は、ＯＤ６００／ＯＤ３７５比と定義した。ｔｕ－ｅｔｂｃ株での酵素活性を１００としたときの相対酵素活性を求めた。
　ＥｔｂＣの相対酵素活性を表４に示す。各時間において、ｔｙｔｕ－ｅｔｂｃ株でのＥｔｂＣ活性はｔｕ－ｅｔｂｃ株と比べて高く、ｔｙｔｕプロモーターの活性がｔｕプロモーターより高いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (11)

  1. 　下記（ａ）～（ｃ）から選択されるＤＮＡからなるプロモーター：
    （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
    （ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して１個以上５個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
  2. 　請求項１記載のプロモーターを含む発現ベクター。
  3. 　目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記プロモーターとを含む、請求項２記載の発現ベクター。
  4. 　前記遺伝子が芳香族化合物の合成に関わる酵素をコードする遺伝子である、請求項３記載の発現ベクター。
  5. 　請求項１記載のプロモーターを含むＤＮＡ発現カセット。
  6. 　目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記プロモーターとを含む、請求項５記載のＤＮＡ発現カセット。
  7. 　前記遺伝子が芳香族化合物の合成に関わる酵素をコードする遺伝子である、請求項６記載のＤＮＡ発現カセット。
  8. 　請求項２～４のいずれか１項記載の発現ベクター又は請求項５～７のいずれか１項記載のＤＮＡ発現カセットを含む、コリネバクテリウム。
  9. 　コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項８記載のコリネバクテリウム。
  10. 　請求項８又は９記載のコリネバクテリウムを培養すること；及び
    　該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
    を含む、目的物質の製造方法。
  11. 　前記目的物質が芳香族化合物である、請求項１０記載の方法。 
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