JP2024014569A - ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】 優れた４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド及びその利用法を提供する。【解決手段】 配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン【選択図】なし
Description
本発明は４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド及びその利用に関する。
ポリベンズオキサゾール（ＰＢＯ）は耐熱性や力学強度に優れたエンジニアリングプラスチックとして知られており、繊維材料及び半導体素子の絶縁膜等に利用される（非特許文献１）。
ベンズオキサゾール骨格はｏ－アミノフェノール骨格とカルボン酸との縮合により生成される。そのため、これらの官能基を分子内に有する４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ）類はＰＢＯモノマーとして有用であると期待される。実際に、４，３－ＡＨＢＡを用いたポリベンズオキサゾールの合成と物性評価が検討されている（非特許文献２）。
近年、地球環境負荷軽減等に向けて再生可能資源を原料とした微生物発酵による化合物の製造方法が注目されている。例えば、４，３－ＡＨＢＡと類似した構造を有する３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸（３，４－ＡＨＢＡ）の微生物による生産とポリマー化の検討が行われている（特許文献１）。
４，３－ＡＨＢＡの製造に関してはこれまで化学的にニトロ芳香族を還元し合成する方法等が知られている（特許文献２）。微生物法による４，３－ＡＨＢＡ発酵生産を可能にする方策としては、微生物内での生合成が可能な４－アミノ安息香酸（４－ＡＢＡ）の３位を水酸化することが考えられるが、このような反応に関しては、一部の４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素がわずかに活性を有することが報告されているのみであった（非特許文献３，４）。
斯かる状況下、本出願人は、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する特定の４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素（ＨＦＭ１２２）、及び高い４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する該酵素の変異体を見出し、既に特許出願している（特許文献３～７）。
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Ｂａｒｒｉｅ Ｅｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２６２， Ｎｏ．１３， ｐｐ．６０６０－６０６８ （１９８７）
Ｄｏｍｅｎｉｃｏ Ｌ． Ｇａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．３５， Ｎｏ．２， ｐｐ．５６７－５７８ （１９９６）
本発明は、優れた４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド及びその利用法を提供することに関する。
本発明者らは、特定のアミノ酸配列を有する４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の変異体が、顕著に優れた４－アミノ安息香酸水酸化活性を有し、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造に有用であることを見出した。
すなわち、本発明は以下の１）～７）に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
２）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
３）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性の向上方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
４）１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
５）４）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
６）５）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
７）６）の形質転換細胞を培養する工程を含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
２）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
３）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性の向上方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
４）１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
５）４）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
６）５）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
７）６）の形質転換細胞を培養する工程を含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
本発明の４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドは顕著に優れた４－アミノ安息香酸水酸化活性を有することから、これを用いることにより、４－アミノ安息香酸類から効率よく４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を製造することができる。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト［ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ］、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとスレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
＜４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド＞
本発明の４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド（「本発明のポリペプチド」と称す）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸であるポリペプチドである。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
斯かるポリペプチドは、基準となるポリペプチド、すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が上記（ａ）～（ｅ）のアミノ酸に置換された、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が上記（ａ）～（ｅ）のアミノ酸に置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドである。
本発明の４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド（「本発明のポリペプチド」と称す）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸であるポリペプチドである。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
斯かるポリペプチドは、基準となるポリペプチド、すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が上記（ａ）～（ｅ）のアミノ酸に置換された、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が上記（ａ）～（ｅ）のアミノ酸に置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドである。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がロイシンでありかつ１０６位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がアラニンであるポリペプチド、１０６位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がアラニンでありかつ２０１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンであるポリペプチド、１０６位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がアラニンでありかつ２９４位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がセリンであるポリペプチドが好ましい。
本発明において、「４－アミノ安息香酸水酸化活性」とは、４－アミノ安息香酸類の水酸化を触媒する活性、好ましくは４－アミノ安息香酸類の３位の水酸化を触媒する活性を意味する。
４－アミノ安息香酸水酸化活性は、後述する実施例に示すとおり、本発明のポリペプチドを産生する微生物を培養し、生成する４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸量をＨＰＬＣ等により測定することによって決定することができる。
４－アミノ安息香酸水酸化活性は、後述する実施例に示すとおり、本発明のポリペプチドを産生する微生物を培養し、生成する４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸量をＨＰＬＣ等により測定することによって決定することができる。
斯かる本発明のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することにより製造できる。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドは、本発明のポリペプチドの「親」ポリペプチドである。
「親」ポリペプチドは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、本発明のポリペプチドとなる基準ポリペプチドを指す。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドは、本発明のポリペプチドの「親」ポリペプチドである。
「親」ポリペプチドは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、本発明のポリペプチドとなる基準ポリペプチドを指す。
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０９２０２６２．１）からなるポリペプチドであるＨＦＭ１２２は、４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．２）として知られている。４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼは、４－ヒドロキシ安息香酸の３位を水酸化してプロトカテク酸を生成する反応とその逆反応のいずれかまたは両方を促進する触媒活性を有する酵素であり、４－ヒドロキシ安息香酸類の水酸化を触媒する酵素（４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素）の一種である。
斯かるＨＦＭ１２２は、本出願人により、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有することが見出されており（前記特許文献３）、またＨＦＭ１２２の４７位、１０６位、２０１位、２２２位、２９４位のいずれかのアミノ酸残基が特定のアミノ酸に置換されたポリペプチドが、高い４－アミノ安息香酸水酸化活性を有することも見出されている（前記特許文献４～７）。
斯かるＨＦＭ１２２は、本出願人により、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有することが見出されており（前記特許文献３）、またＨＦＭ１２２の４７位、１０６位、２０１位、２２２位、２９４位のいずれかのアミノ酸残基が特定のアミノ酸に置換されたポリペプチドが、高い４－アミノ安息香酸水酸化活性を有することも見出されている（前記特許文献４～７）。
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、具体的には、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドが挙げられる。
該親ポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位又はこれに相当する位置にバリン残基を有するものが好ましく、１０６位又はこれに相当する位置にメチオニン残基を有するものが好ましく、２０１位又はこれに相当する位置にチロシン残基を有するものが好ましく、２２２位又はこれに相当する位置にチロシン残基を有するものが好ましく、２９４位又はこれに相当する位置にスレオニン残基を有するものが好ましく、４７位又はこれに相当する位置にバリン残基を有しかつ１０６位又はこれに相当する位置にメチオニン残基を有するもの、４７位又はこれに相当する位置にバリン残基を有しかつ２０１位又はこれに相当する位置にチロシン残基を有するもの、４７位又はこれに相当する位置にバリン残基を有しかつ２２２位又はこれに相当する位置にチロシン残基を有するもの、４７位又はこれに相当する位置にバリン残基を有しかつ２９４位又はこれに相当する位置にスレオニン残基を有するもの、１０６位又はこれに相当する位置にメチオニン残基を有しかつ２０１位又はこれに相当する位置にチロシン残基を有するもの、１０６位又はこれに相当する位置にメチオニン残基を有しかつ２９４位又はこれに相当する位置にスレオニン残基を有するものがより好ましく、４７位又はこれに相当する位置にバリン残基を有し、１０６位又はこれに相当する位置にメチオニン残基を有し、２０１位又はこれに相当する位置にチロシン残基を有し、２２２位又はこれに相当する位置にチロシン残基を有し、かつ２９４位又はこれに相当する位置にスレオニン残基を有するものがさらに好ましい。本発明のポリペプチドは、当該４７位又はこれに相当する位置のバリンをロイシンに置換しかつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンをアラニンに置換したもの、４７位又はこれに相当する位置のバリンをロイシンに置換しかつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンをフェニルアラニンに置換したもの、４７位又はこれに相当する位置のバリンをロイシンに置換しかつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンをフェニルアラニンに置換したもの、４７位又はこれに相当する位置のバリンをロイシンに置換しかつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンをセリンに置換したもの、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンをアラニンに置換しかつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンをフェニルアラニンに置換したもの、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンをアラニンに置換しかつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンをセリンに置換したものがより好ましく、４７位又はこれに相当する位置のバリンをロイシンに置換しかつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンをアラニンに置換したもの、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンをアラニンに置換しかつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンをフェニルアラニンに置換したもの、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンをアラニンに置換しかつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンをセリンに置換したものがさらに好ましい。
＜本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド＞
本発明において、親ポリペプチドのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
本発明において、親ポリペプチドのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、アジレント・テクノロジー社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述した４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドとして既述したＨＦＭ１２２をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号１に示した。
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
当該本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
＜ベクター又はＤＮＡ断片＞
得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主微生物に導入することができ、かつ宿主微生物内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主微生物に導入することができ、かつ宿主微生物内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（－）（アジレント・テクノロジー）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（メルク）、ｐＧＥＸ系ベクター（メルク）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ １５（２）：９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１－３３１，１９８５）、ｐＡＢ４－１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１－７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５－３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７－４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７－４５１，１９９０）等が挙げられる。
また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、これを含むＤＮＡ断片として構築されていてもよい。該ＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主細胞内で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点等が挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカー（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）を有していてもよい。
上記ベクター又はＤＮＡ断片には、４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が含まれていてもよい。４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドとしては、例えば、４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ（４－ａｍｉｎｏ－４－ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｐａｂＡＢ）や４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ（４－ａｍｉｎｏ－４－ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｌｙａｓｅ，ｐａｂＣ）等が挙げられる。
上記ベクター又はＤＮＡ断片には、４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が含まれていてもよい。４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドとしては、例えば、４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ（４－ａｍｉｎｏ－４－ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｐａｂＡＢ）や４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ（４－ａｍｉｎｏ－４－ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｌｙａｓｅ，ｐａｂＣ）等が挙げられる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと上記制御領域や、マーカー遺伝子配列との連結は、上述したＳＯＥ－ＰＣＲ法やシームレスクローニング法などの方法によって行うことができる。ベクターへの遺伝子配列の導入手順は、当該分野で周知である。プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御領域の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。
該制御領域の好適な例としては、野生型に比較して発現を強化できる強制御領域、例えば公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｕｆプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
＜形質転換細胞＞
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
斯かる形質転換細胞は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞であり、当該ポリヌクレオチドの発現が強化された細胞、ひいては本発明のポリペプチドの発現が強化された細胞であると言える。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
斯かる形質転換細胞は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞であり、当該ポリヌクレオチドの発現が強化された細胞、ひいては本発明のポリペプチドの発現が強化された細胞であると言える。
宿主細胞としては、真菌、酵母、放線菌、大腸菌、枯草菌等、いずれを用いてもよいが、大腸菌、放線菌が好ましい。放線菌としては、コリネバクテリウム属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、プロピオニバクテリウム属菌等が挙げられ、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである。
中でも、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となる４－アミノ安息香酸類を供給できる微生物が好ましく、４－アミノ安息香酸類の供給能が強化された微生物がより好ましい。微生物の４－アミノ安息香酸類の供給能を強化する方法としては、例えば、４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターを微生物に導入する方法や、微生物が本来有する４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドの制御領域を強発現プロモーターに置換する方法などが挙げられる。
中でも、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となる４－アミノ安息香酸類を供給できる微生物が好ましく、４－アミノ安息香酸類の供給能が強化された微生物がより好ましい。微生物の４－アミノ安息香酸類の供給能を強化する方法としては、例えば、４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターを微生物に導入する方法や、微生物が本来有する４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドの制御領域を強発現プロモーターに置換する方法などが挙げられる。
宿主へのベクター又はＤＮＡ断片の導入の方法としては、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
また、ポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。該ＤＮＡ断片は、上述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター配列の下流に導入されてもよく、あるいは、予め該ＤＮＡ断片と上述した制御領域とを作動可能に連結した断片を作製し、当該連結断片を宿主のゲノムに導入してもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチドが適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）と予め連結されていてもよい。
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の宿主微生物に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって形質転換細胞のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
斯くして得られた形質転換細胞は、これを適切な培地で培養すれば、当該細胞に導入されたポリヌクレオチドが発現して、本発明のポリペプチドが生成される。すなわち、当該形質転換細胞は、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド産生菌となり得る。そして、後述する実施例に示すとおり、本発明の形質転換細胞を培養した場合、親ポリペプチドを産生する形質転換細胞を用いた場合に比べて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産性が顕著に向上する。本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドのアミノ酸配列の特定の２箇所のアミノ酸残基が所定のアミノ酸であるアミノ酸配列からなる。本発明の形質転換細胞を培養した場合、親ポリペプチドのアミノ酸配列の該特定の２箇所のうちの一方の位置だけが所定のアミノ酸であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを産生する形質転換細胞を用いた場合に比べて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産性が顕著に向上し、その向上率は後者のポリペプチドから予想される生産能向上率をさらに上回るものである。
すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換する変異、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換する変異は、４－アミノ安息香酸水酸化活性の相乗的な向上に有用であり、ひいては４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産性の相乗的な向上に有用である。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
そして、本発明の形質転換細胞は、４－アミノ安息香酸水酸化活性が顕著に向上されたポリペプチドの産生菌であり、有用な４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産株である。
すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換する変異、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換する変異は、４－アミノ安息香酸水酸化活性の相乗的な向上に有用であり、ひいては４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産性の相乗的な向上に有用である。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
そして、本発明の形質転換細胞は、４－アミノ安息香酸水酸化活性が顕著に向上されたポリペプチドの産生菌であり、有用な４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産株である。
＜４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造＞
本発明の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法は、本発明の形質転換細胞を培養する工程を含み、培地中から４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を回収することにより４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を取得できる。
本発明において、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類としては、具体的には下記の一般式（１）：
本発明の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法は、本発明の形質転換細胞を培養する工程を含み、培地中から４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を回収することにより４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を取得できる。
本発明において、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類としては、具体的には下記の一般式（１）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミノ基（－ＮＨ２）、フッ素原子（－Ｆ）、塩素原子（－Ｃｌ）、臭素原子（－Ｂｒ）、ヨウ素原子（－Ｉ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、メチル基（－ＣＨ３）、エチル基（－ＣＨ２ＣＨ３）を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミノ基（－ＮＨ２）、フッ素原子（－Ｆ）、塩素原子（－Ｃｌ）、臭素原子（－Ｂｒ）、ヨウ素原子（－Ｉ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、メチル基（－ＣＨ３）又はエチル基（－ＣＨ２ＣＨ３）を示し、Ｘ１及びＸ２は水素原子又はヒドロキシ基であって少なくとも一方はヒドロキシ基を示す。〕
で示される４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸誘導体が挙げられる。
で示される４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸誘導体が挙げられる。
Ｒ１で示される官能基としては、水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、フッ素原子（－Ｆ）又はメチル基（－ＣＨ３）が好ましい。
Ｒ２で示される官能基としては、水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、フッ素原子（－Ｆ）又はメチル基（－ＣＨ３）が好ましい。
Ｒ１及びＲ２は、共に水素原子であるのがより好ましい。
また、Ｘ１及びＸ２は、共にヒドロキシ基であってもよいが、Ｘ１又はＸ２の何れか一方がヒドロキシ基であるのが好ましい。
Ｒ２で示される官能基としては、水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、フッ素原子（－Ｆ）又はメチル基（－ＣＨ３）が好ましい。
Ｒ１及びＲ２は、共に水素原子であるのがより好ましい。
また、Ｘ１及びＸ２は、共にヒドロキシ基であってもよいが、Ｘ１又はＸ２の何れか一方がヒドロキシ基であるのが好ましい。
なお、当該培地には、必要に応じて、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となる４－アミノ安息香酸類を存在させることができる。
ここで、４－アミノ安息香酸類としては、下記一般式（２）：
ここで、４－アミノ安息香酸類としては、下記一般式（２）：
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じものを示す。〕
で示される４－アミノ安息香酸誘導体が挙げられる。
で示される４－アミノ安息香酸誘導体が挙げられる。
形質転換細胞を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の形質転換細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えば、グルコース等の糖類、グリセリン等のポリオール類、エタノール等のアルコール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミン等のアルキルアミン類、またはアンモニアもしくはその塩等を使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤等も必要に応じて使用してもよい。
培養は、通常、１０℃～４０℃で、６時間～９６時間、好ましくは２４時間～９６時間、より好ましくは４８時間～９６時間、必要に応じ撹拌または振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養物からの４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の回収及び精製方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。例えば、菌体を遠心分離等で除去した後、カチオン及びアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を取得することができる。培養物中に蓄積された４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類は、そのまま単離することなく用いてもよい。
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜２＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸に置換された、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸に置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜３＞アミノ酸残基の置換が４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換である、＜２＞のポリペプチド。
＜４＞配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜５＞アミノ酸残基の置換が４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換である、＜４＞の方法。
＜６＞配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性の向上方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜７＞アミノ酸残基の置換が４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換である、＜６＞の方法。
＜８＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドを用いて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を製造する場合において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産性向上方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜９＞アミノ酸残基の置換が４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換である、＜８＞の方法。
＜１０＞＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜１１＞＜１０＞のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜１２＞＜１１＞のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜１３＞大腸菌又はコリネバクテリム属菌である、＜１２＞記載の形質転換細胞。
＜１４＞４－アミノ安息香酸類を供給可能な微生物である、＜１２＞又は＜１３＞の形質転換細胞。
＜１５＞４－アミノ安息香酸類の供給能が向上した、＜１２＞又は＜１３＞の形質転換細胞。
＜１６＞４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターが導入された微生物である、＜１５＞の形質転換細胞。
＜１７＞４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドの制御領域が強発現プロモーターに置換された微生物である、＜１５＞の形質転換細胞。
＜１８＞＜１２＞～＜１７＞のいずれかの形質転換細胞を培養する工程を含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
＜１９＞炭素源として糖類を含む培地で培養される、＜１８＞の方法。
＜２０＞４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を培地から回収する工程を含む、＜１８＞又は＜１９＞の方法。
＜２１＞培養が４－アミノ安息香酸類の存在下で行われる、＜１８＞～＜２０＞のいずれかの方法。
＜２２＞４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類が、下記の一般式（１）：
＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜２＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸に置換された、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸に置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜３＞アミノ酸残基の置換が４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換である、＜２＞のポリペプチド。
＜４＞配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜５＞アミノ酸残基の置換が４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換である、＜４＞の方法。
＜６＞配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性の向上方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜７＞アミノ酸残基の置換が４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換である、＜６＞の方法。
＜８＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドを用いて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を製造する場合において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産性向上方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン
＜９＞アミノ酸残基の置換が４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２２２位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、４７位又はこれに相当する位置のバリンのロイシンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２０１位又はこれに相当する位置のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１０６位又はこれに相当する位置のメチオニンのアラニンへの置換かつ２９４位又はこれに相当する位置のスレオニンのセリンへの置換である、＜８＞の方法。
＜１０＞＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜１１＞＜１０＞のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜１２＞＜１１＞のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜１３＞大腸菌又はコリネバクテリム属菌である、＜１２＞記載の形質転換細胞。
＜１４＞４－アミノ安息香酸類を供給可能な微生物である、＜１２＞又は＜１３＞の形質転換細胞。
＜１５＞４－アミノ安息香酸類の供給能が向上した、＜１２＞又は＜１３＞の形質転換細胞。
＜１６＞４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターが導入された微生物である、＜１５＞の形質転換細胞。
＜１７＞４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドの制御領域が強発現プロモーターに置換された微生物である、＜１５＞の形質転換細胞。
＜１８＞＜１２＞～＜１７＞のいずれかの形質転換細胞を培養する工程を含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
＜１９＞炭素源として糖類を含む培地で培養される、＜１８＞の方法。
＜２０＞４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を培地から回収する工程を含む、＜１８＞又は＜１９＞の方法。
＜２１＞培養が４－アミノ安息香酸類の存在下で行われる、＜１８＞～＜２０＞のいずれかの方法。
＜２２＞４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類が、下記の一般式（１）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、又はエチル基を示し、Ｘ１及びＸ２は水素原子又はヒドロキシ基であって少なくとも一方はヒドロキシ基を示す。〕
で示される４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸誘導体である＜１８＞～＜２１＞のいずれかの方法。
＜２３＞４－アミノ安息香酸類が、下記の一般式（２）：
で示される４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸誘導体である＜１８＞～＜２１＞のいずれかの方法。
＜２３＞４－アミノ安息香酸類が、下記の一般式（２）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、又はエチル基を示す。〕
で示される４－アミノ安息香酸誘導体である＜２１＞又は＜２２＞の方法。
で示される４－アミノ安息香酸誘導体である＜２１＞又は＜２２＞の方法。
以下、試験例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例１ ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産
（１）ＨＦＭ１２２又はＨＦＭ１２２変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
以下の試験例において、ＰＣＲはＫＯＤ Ｏｎｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を使用して行った。ＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いてＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片の連結にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いた。連結されたＤＮＡ断片を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ ＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｌｅｎｎｏｘ ２０ｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩 ５０μｇ／ｍＬ、寒天 １．５％）に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーをＴＢＫｍ液体培地（Ｄｉｆｃｏ Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４７．６ ｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩 ５０μｇ／ｍＬ）７５０μＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた菌体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドを調製した。得られたプラスミドのＤＮＡ配列解析はサンガー法により行った（ユーロフィンジェノミクス）。
（１）ＨＦＭ１２２又はＨＦＭ１２２変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
以下の試験例において、ＰＣＲはＫＯＤ Ｏｎｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を使用して行った。ＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いてＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片の連結にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いた。連結されたＤＮＡ断片を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ ＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｌｅｎｎｏｘ ２０ｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩 ５０μｇ／ｍＬ、寒天 １．５％）に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーをＴＢＫｍ液体培地（Ｄｉｆｃｏ Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４７．６ ｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩 ５０μｇ／ｍＬ）７５０μＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた菌体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドを調製した。得られたプラスミドのＤＮＡ配列解析はサンガー法により行った（ユーロフィンジェノミクス）。
（ａ）プラスミドｐＫＣＧ１の作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０５８株から抽出されたプラスミドｐＨＭ１５１９（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903, (1984)）を鋳型に、プライマーｐＨＭ１５１９－Ｆｗ（配列番号３、CGTCGCTGATCGCCCTCGCGAC）とｐＨＭ１５１９－Ｒｖ（配列番号４、TTGGGAGCAGTCCTTGTGCGCTTACGAG）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ）を鋳型に、プライマーｐＨＳＧ２９９－Ｆｗ（配列番号５、AAGGACTGCTCCCAATACGGTTATCCACAGAATCA）とｐＨＳＧ２９９－Ｒｖ（配列番号６、GGGCGATCAGCGACGACTGGCCGTCGTTTTACAAC）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。これらのＰＣＲ産物を連結することでプラスミドｐＫＣＧ１を得た。
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０５８株から抽出されたプラスミドｐＨＭ１５１９（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903, (1984)）を鋳型に、プライマーｐＨＭ１５１９－Ｆｗ（配列番号３、CGTCGCTGATCGCCCTCGCGAC）とｐＨＭ１５１９－Ｒｖ（配列番号４、TTGGGAGCAGTCCTTGTGCGCTTACGAG）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ）を鋳型に、プライマーｐＨＳＧ２９９－Ｆｗ（配列番号５、AAGGACTGCTCCCAATACGGTTATCCACAGAATCA）とｐＨＳＧ２９９－Ｒｖ（配列番号６、GGGCGATCAGCGACGACTGGCCGTCGTTTTACAAC）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。これらのＰＣＲ産物を連結することでプラスミドｐＫＣＧ１を得た。
（ｂ）プラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１の作製
プラスミドｐＫＣＧ１を鋳型に、プライマーｐＨＭ１５１９－Ｆｗ（配列番号３）とｐＫＣＧ１ｖｅｃ－Ｒｖ（配列番号７、GGATCTAAACGATCTACTGGCCGTCGTTTTACAAC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を増幅した。続いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムを鋳型に、ｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕｆプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片をプライマーＰｔｕｆ－Ｆｗ（配列番号８、AGATCGTTTAGATCCGAAGGAAAACGTCGAAAAGC）とＰｔｕｆ－Ｒｖ（配列番号９、TGTATGTCCTCCTGGACTTCGTGGTGGCTAC）を用いたＰＣＲにて増幅した。さらに、人工合成により作製したターミネーター配列を含むＤＮＡ断片（配列番号１０、GGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTT）を鋳型に、プライマーＴ１－Ｆｗ（配列番号１１、CCAGGAGGACATACAGGTAGTGTGGGGTCTCCCCA）とＴ１－Ｒｖ（配列番号１２、GGGCGATCAGCGACGAAATCCGCTCCCGGCGGATT）を用いたＰＣＲにて増幅した。これらのＰＣＲ産物を連結することでプラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１を得た。
プラスミドｐＫＣＧ１を鋳型に、プライマーｐＨＭ１５１９－Ｆｗ（配列番号３）とｐＫＣＧ１ｖｅｃ－Ｒｖ（配列番号７、GGATCTAAACGATCTACTGGCCGTCGTTTTACAAC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を増幅した。続いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムを鋳型に、ｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕｆプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片をプライマーＰｔｕｆ－Ｆｗ（配列番号８、AGATCGTTTAGATCCGAAGGAAAACGTCGAAAAGC）とＰｔｕｆ－Ｒｖ（配列番号９、TGTATGTCCTCCTGGACTTCGTGGTGGCTAC）を用いたＰＣＲにて増幅した。さらに、人工合成により作製したターミネーター配列を含むＤＮＡ断片（配列番号１０、GGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTT）を鋳型に、プライマーＴ１－Ｆｗ（配列番号１１、CCAGGAGGACATACAGGTAGTGTGGGGTCTCCCCA）とＴ１－Ｒｖ（配列番号１２、GGGCGATCAGCGACGAAATCCGCTCCCGGCGGATT）を用いたＰＣＲにて増幅した。これらのＰＣＲ産物を連結することでプラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１を得た。
（ｃ）プラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１＿ＨＦＭ１２２の作製
プラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１を鋳型に、プライマーｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１ｖｅｃ－Ｆｗ（配列番号１３、GGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGC）とｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１ｖｅｃ－Ｒｖ（配列番号１４、TGTATGTCCTCCTGGACTTCGTGGTGGCTAC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を増幅した。続いて、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドＨＦＭ１２２をコードする遺伝子（配列番号１）を人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーＨＦＭ１２２－Ｆｗ（配列番号１５、CCAGGAGGACATACAATGCGCACTCAGGTGGCTAT）とＨＦＭ１２２－Ｒｖ（配列番号１６、AGACCCCACACTACCTTATACGAGTGGCAGTCCTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物を連結することでプラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１＿ＨＦＭ１２２を得た。構築したプラスミドにおいては、ｔｕｆプロモーターの制御下に野生型ＨＦＭ１２２をコードする遺伝子が連結されている。
プラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１を鋳型に、プライマーｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１ｖｅｃ－Ｆｗ（配列番号１３、GGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGC）とｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１ｖｅｃ－Ｒｖ（配列番号１４、TGTATGTCCTCCTGGACTTCGTGGTGGCTAC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を増幅した。続いて、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドＨＦＭ１２２をコードする遺伝子（配列番号１）を人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーＨＦＭ１２２－Ｆｗ（配列番号１５、CCAGGAGGACATACAATGCGCACTCAGGTGGCTAT）とＨＦＭ１２２－Ｒｖ（配列番号１６、AGACCCCACACTACCTTATACGAGTGGCAGTCCTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物を連結することでプラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１＿ＨＦＭ１２２を得た。構築したプラスミドにおいては、ｔｕｆプロモーターの制御下に野生型ＨＦＭ１２２をコードする遺伝子が連結されている。
（ｄ）変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
プラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１＿ＨＦＭ１２２を鋳型として、相補的プライマーＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｆ（配列番号１７、GCTGGTCTCCTGGAACGTATCACGGTG）、ＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｒ（配列番号１８、TTCCAGGAGACCAGCCCGAACTCGGCC）を用いたＰＣＲにてプラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを構築した。
同様に、プライマーＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ ＦおよびＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｒに代えて表１の「プライマー」に示すプライマーを用いたＰＣＲにて各酵素変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを得た。
プラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１＿ＨＦＭ１２２を鋳型として、相補的プライマーＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｆ（配列番号１７、GCTGGTCTCCTGGAACGTATCACGGTG）、ＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｒ（配列番号１８、TTCCAGGAGACCAGCCCGAACTCGGCC）を用いたＰＣＲにてプラスミドｐＫＣＧ１＿ＰｔｕｆＴ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを構築した。
同様に、プライマーＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ ＦおよびＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｒに代えて表１の「プライマー」に示すプライマーを用いたＰＣＲにて各酵素変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを得た。
（２）４－アミノ安息香酸の生合成能力が強化された宿主細胞の作製
（ａ）ｃｇ１８２９（ａｒｏＣ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入したプラスミドの構築
ｃｇ１８２９遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号２７）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２８と２９）にて増幅し、またｃｇ１８２９遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号３０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３１と３２）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕｆプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号３３）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ａｒｏＣを作製した。
（ａ）ｃｇ１８２９（ａｒｏＣ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入したプラスミドの構築
ｃｇ１８２９遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号２７）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２８と２９）にて増幅し、またｃｇ１８２９遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号３０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３１と３２）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕｆプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号３３）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ａｒｏＣを作製した。
（ｂ）ｃｇ１８２９（ａｒｏＣ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ａｒｏＣをＫＣ３１５株（特願２０２１－２０１８７７）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３６７ｓｒ株を取得した。配列番号２８と３８のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３６７ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ３６７ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ａｒｏＣが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ３６７ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３６７株を得た。配列番号３８と３９のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３６７株が予想通りｃｇ１８２９（ａｒｏＣ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ａｒｏＣをＫＣ３１５株（特願２０２１－２０１８７７）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３６７ｓｒ株を取得した。配列番号２８と３８のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３６７ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ３６７ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ａｒｏＣが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ３６７ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３６７株を得た。配列番号３８と３９のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３６７株が予想通りｃｇ１８２９（ａｒｏＣ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（ｃ）ｃｇ１７７４（ｔｋｔ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入したプラスミドの構築
ｃｇ１７７４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号４０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４１と４２）にて増幅し、またｃｇ１７７４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（塩基番号４３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４４と４５）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕｆプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号３３）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｔｋｔを作製した。
ｃｇ１７７４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号４０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４１と４２）にて増幅し、またｃｇ１７７４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（塩基番号４３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４４と４５）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕｆプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号３３）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｔｋｔを作製した。
（ｄ）ｃｇ１７７４（ｔｋｔ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｔｋｔをＫＣ３６７株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３７６ｓｒ株を取得した。配列番号４１と４６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３７６ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ３７６ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｔｋｔがｃｇ１７７４のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ３７６ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３７６株を得た。配列番号４６と４７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３７６株が予想通りｃｇ１７７４（ｔｋｔ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｔｋｔをＫＣ３６７株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３７６ｓｒ株を取得した。配列番号４１と４６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３７６ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ３７６ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｔｋｔがｃｇ１７７４のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ３７６ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３７６株を得た。配列番号４６と４７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３７６株が予想通りｃｇ１７７４（ｔｋｔ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（ｅ）ｃｇ０６４４（ｐｐｓＡ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入したプラスミドの構築
ｃｇ０６４４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号４８）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４９と５０）にて増幅し、またｃｇ０６４４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（塩基番号５１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５２と５３）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕｆプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号３３）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐｐｓＡを作製した。
ｃｇ０６４４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号４８）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４９と５０）にて増幅し、またｃｇ０６４４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（塩基番号５１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５２と５３）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕｆプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号３３）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐｐｓＡを作製した。
（ｆ）ｃｇ０６４４（ｐｐｓＡ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐｐｓＡをＫＣ３７６株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４０８ｓｒ株を取得した。配列番号４９と５４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４０８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４０８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐｐｓＡが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４０８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４０８株を得た。配列番号５４と５５のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４０８株が予想通りｃｇ０６４４（ｐｐｓＡ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐｐｓＡをＫＣ３７６株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４０８ｓｒ株を取得した。配列番号４９と５４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４０８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４０８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐｐｓＡが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４０８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４０８株を得た。配列番号５４と５５のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４０８株が予想通りｃｇ０６４４（ｐｐｓＡ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（ｇ）ｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）遺伝子領域を欠損するためのプラスミドの構築
ｃｇ０５０２遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号５６）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５７と５８）にて増幅し、またｃｇ０５０２遺伝子領域の３’側下流領域（塩基番号５９）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６０と６１）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｑｓｕＢを作製した。
ｃｇ０５０２遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号５６）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５７と５８）にて増幅し、またｃｇ０５０２遺伝子領域の３’側下流領域（塩基番号５９）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６０と６１）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｑｓｕＢを作製した。
（ｈ）ｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）遺伝子領域を欠損した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｑｓｕＢをＫＣ４０８株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ５２５ｓｒ株を取得した。配列番号５７と６２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ５２５ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ５２５ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｑｓｕＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ５２５ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４１８株を得た。配列番号６２と６３のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ５２５株が予想通りｃｇ（ｑｓｕＢ）遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｑｓｕＢをＫＣ４０８株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ５２５ｓｒ株を取得した。配列番号５７と６２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ５２５ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ５２５ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｑｓｕＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ５２５ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４１８株を得た。配列番号６２と６３のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ５２５株が予想通りｃｇ（ｑｓｕＢ）遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（ｉ）ｃｇ１１３４（ｐａｂＡＢ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入するためのプラスミドの構築
ｃｇ１１３４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号６４）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６５と６６）にて増幅し、またｃｇ１１３４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号６７）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６８と６９）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕｆプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号３３）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐａｂＡＢを作製した。
ｃｇ１１３４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号６４）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６５と６６）にて増幅し、またｃｇ１１３４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号６７）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６８と６９）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕｆプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号３３）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３６と３７）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐａｂＡＢを作製した。
（ｊ）ｃｇ１１３４（ｐａｂＡＢ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐａｂＡＢをＫＣ５２５株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ５５１ｓｒ株を取得した。配列番号６５と７０のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ５５１ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ５５１ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐａｂＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ５５１ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ５５１株を得た。配列番号７０と７１のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ５５１株が予想通りｃｇ１１３４（ｐａｂＡＢ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐａｂＡＢをＫＣ５２５株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ５５１ｓｒ株を取得した。配列番号６５と７０のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ５５１ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ５５１ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕｆ－ｐａｂＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ５５１ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ５５１株を得た。配列番号７０と７１のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ５５１株が予想通りｃｇ１１３４（ｐａｂＡＢ）プロモーター領域にｔｕｆプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（３）プラスミドの宿主細胞への導入
上記で得られた各プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣ５５１株をエレクトロポレーション法（ＥＬＥＰＯ２１、ネッパジーン）により形質転換した。得られた形質転換細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３０℃で２日間静置し、得られたコロニーを形質転換株とした。
上記で得られた各プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣ５５１株をエレクトロポレーション法（ＥＬＥＰＯ２１、ネッパジーン）により形質転換した。得られた形質転換細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３０℃で２日間静置し、得られたコロニーを形質転換株とした。
（４）形質転換株の培養
上記で得られた形質転換株をそれぞれ表２に示すＣＧＴＧ１５培地（カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬを含む）７５０μＬに接種し、３０℃で４８時間培養した後、遠心分離により菌体を除去したものを培養上清とした。形質転換株の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能を下記式（数１）に従い算出し、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能の向上率を下記式（数２）に従い算出した。ここで、「ＷＴ」は「野生型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株」を示し、「ＭＴ」は「変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株」を示す。
上記で得られた形質転換株をそれぞれ表２に示すＣＧＴＧ１５培地（カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬを含む）７５０μＬに接種し、３０℃で４８時間培養した後、遠心分離により菌体を除去したものを培養上清とした。形質転換株の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能を下記式（数１）に従い算出し、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能の向上率を下記式（数２）に従い算出した。ここで、「ＷＴ」は「野生型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株」を示し、「ＭＴ」は「変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株」を示す。
（数１）
４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能＝培養上清中の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸量／培養上清中の４－アミノ安息香酸量
（数２）
生産能向上率＝ＭＴの４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能／ＷＴの４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能
４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能＝培養上清中の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸量／培養上清中の４－アミノ安息香酸量
（数２）
生産能向上率＝ＭＴの４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能／ＷＴの４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能
（５）結果
表３に示す通り、各変異型酵素を導入した菌株は野生型酵素を導入した菌株よりも４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産能が向上した。特に、ＨＦＭ１２２のアミノ酸配列においていずれか２つの位置のアミノ酸が置換されたものをコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株の生産能向上率（２重変異体の生産能向上率）のうち、Ｖ４７Ｌ＿Ｍ１０６Ａ変異体、Ｖ４７Ｌ＿Ｙ２０１Ｆ変異体、Ｖ４７Ｌ＿Ｙ２２２Ｆ変異体、Ｖ４７Ｌ＿Ｔ２９４Ｓ変異体、Ｍ１０６Ａ＿Ｙ２０１Ｆ変異体、Ｍ１０６Ａ＿Ｔ２９４Ｓ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株の生産能向上率は、いずれか１つの位置のアミノ酸が置換されたものをコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株の生産能向上率（１重変異体の生産能向上率）から下記式（数３）によって予想される２重変異体の生産能向上率と比較して、さらに上回る結果であった。
表３に示す通り、各変異型酵素を導入した菌株は野生型酵素を導入した菌株よりも４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産能が向上した。特に、ＨＦＭ１２２のアミノ酸配列においていずれか２つの位置のアミノ酸が置換されたものをコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株の生産能向上率（２重変異体の生産能向上率）のうち、Ｖ４７Ｌ＿Ｍ１０６Ａ変異体、Ｖ４７Ｌ＿Ｙ２０１Ｆ変異体、Ｖ４７Ｌ＿Ｙ２２２Ｆ変異体、Ｖ４７Ｌ＿Ｔ２９４Ｓ変異体、Ｍ１０６Ａ＿Ｙ２０１Ｆ変異体、Ｍ１０６Ａ＿Ｔ２９４Ｓ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株の生産能向上率は、いずれか１つの位置のアミノ酸が置換されたものをコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株の生産能向上率（１重変異体の生産能向上率）から下記式（数３）によって予想される２重変異体の生産能向上率と比較して、さらに上回る結果であった。
（数３）
予想される２重変異体の生産能向上率＝一方の１重変異体の生産能向上率＋他方の１重変異体の生産能向上率
予想される２重変異体の生産能向上率＝一方の１重変異体の生産能向上率＋他方の１重変異体の生産能向上率
参考例１ ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量
４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量はＨＰＬＣにより行った。培養上清を０．１％リン酸にて１０倍希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行いＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの装置は、Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。分析カラムには、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。４－アミノ安息香酸及び４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。標準試料〔４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（東京化成工業）、４－アミノ安息香酸（東京化成工業）〕を用いて濃度検量線を作成し、濃度検量線に基づいて定量を行なった。
４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量はＨＰＬＣにより行った。培養上清を０．１％リン酸にて１０倍希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行いＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの装置は、Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。分析カラムには、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。４－アミノ安息香酸及び４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。標準試料〔４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（東京化成工業）、４－アミノ安息香酸（東京化成工業）〕を用いて濃度検量線を作成し、濃度検量線に基づいて定量を行なった。
Claims (12)
- 配列番号２で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン - 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン - 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４７位と１０６位、４７位と２０１位、４７位と２２２位、４７位と２９４位、１０６位と２０１位、若しくは１０６位と２９４位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性の向上方法。
（ａ）４７位又はこれに相当する位置：ロイシン
（ｂ）１０６位又はこれに相当する位置：アラニン
（ｃ）２０１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｄ）２２２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（ｅ）２９４位又はこれに相当する位置：セリン - 請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項４記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
- 請求項５記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
- 大腸菌又はコリネバクテリム属菌である、請求項６記載の形質転換細胞。
- ４－アミノ安息香酸類を供給可能な微生物である、請求項６又は７記載の形質転換細胞。
- 請求項６～８のいずれか１項記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
- ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を培地から回収する工程を含む、請求項９記載の方法。
- 培養が４－アミノ安息香酸類の存在下で行われる、請求項９又は１０記載の方法。
- ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類が、下記の一般式（１）：
で示される４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸誘導体であり、
４－アミノ安息香酸類が、下記の一般式（２）：
で示される４－アミノ安息香酸誘導体である、請求項９～１１のいずれか１項記載の方法。
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