WO2021241219A1 - 没食子酸合成酵素 - Google Patents

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WO2021241219A1
WO2021241219A1 PCT/JP2021/017981 JP2021017981W WO2021241219A1 WO 2021241219 A1 WO2021241219 A1 WO 2021241219A1 JP 2021017981 W JP2021017981 W JP 2021017981W WO 2021241219 A1 WO2021241219 A1 WO 2021241219A1
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gallic acid
acid
transformant
amino acid
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雄一 壺井
史員 高橋
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花王株式会社
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a gallic acid synthase and a method for producing gallic acid using the same.
  • Gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid) has a strong reducing power and is used as a reducing agent and a developing agent for photographs. It is also used in the production of ink because it has the property of being colored by the formation of iron salts. Furthermore, many derivatives such as gallic acid esters are obtained from gallic acid, and they are widely used in various fields such as food field and electronic material field.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose an enzyme having an enzymatic activity of oxidizing the 5-position of protocatechuic acid derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain as an enzyme for converting protocatechuic acid into gallic acid. ing.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-065839
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-213392
  • the invention provides a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence and having the ability to convert protocatechuic acid to gallic acid.
  • the invention provides a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • the invention provides a vector containing the polynucleotide.
  • the invention provides a transformant containing said polynucleotide or vector.
  • the invention provides a method for producing gallic acid, which comprises converting protocatechuic acid to gallic acid with the polypeptide.
  • the identity of an amino acid sequence or nucleotide sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, the genetic information processing software GENETY Ver. It is calculated by performing analysis with Unit size to homology (ktup) as 2 using 12 homology analysis programs.
  • amino acid sequence or nucleotide sequence is 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97. % Or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, still more preferably 99.5% or more, still more preferably 99.7% or more.
  • the "corresponding position" or “corresponding region” on an amino acid sequence or nucleotide sequence provides maximum homology between the target sequence and the reference sequence (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2). It can be determined by aligning with. Alignment of amino acid sequences or nucleotide sequences can be performed using known algorithms, the procedure of which is known to those of skill in the art. For example, alignment can be performed by using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) with default settings.
  • Crystal W is, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www.]) operated by the National Institute of Genetics. It can be used on the website of dbj.nig.ac.jp/searches-j.html]).
  • the position of the target sequence aligned to any position in the reference sequence by the above alignment is considered to be the "corresponding position" to that arbitrary position.
  • a region sandwiched by corresponding positions or a region consisting of corresponding motifs is regarded as a corresponding region.
  • the similarity of amino acid sequences means the ratio (%) of the number of positions where the same or similar amino acid residues are present in both sequences when the two amino acid sequences are aligned to the total number of amino acid residues. ..
  • the similar amino acid residue means an amino acid residue that has properties similar to each other in terms of polarity and charge among the 20 kinds of amino acids constituting the protein and causes so-called conservative substitution.
  • Groups of such similar amino acid residues are well known to those of skill in the art, including, for example, arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; leucine and isoleucine, respectively. , Not limited to these.
  • amino acid residue refers to 20 amino acid residues constituting a protein, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or).
  • cysteine Cys or C
  • glutamine Gln or Q
  • glutamine Glu or E
  • glycine Gly or G
  • histidine His or H
  • isoleucine Ile or I
  • leucine Leu or L
  • Lysine Lys or K
  • methionine Met or M
  • phenylalanine Phe or F
  • proline Pro or P
  • serine Ser or S
  • threonin Thr or T
  • tryptophan Trp or W
  • Tyrosine Tyr or Y
  • valine Val or V
  • a regulatory region such as a promoter and a "operable linkage" of a gene means that the gene and the regulatory region are linked so that the gene can be expressed under the control of the regulatory region. To say. Procedures for "operable linkage" between genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • upstream and downstream with respect to a gene mean upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • gene located downstream of the promoter means that the gene is present on the 3'side of the promoter in the DNA sense strand, and upstream of the gene means 5'of the gene in the DNA sense strand. Means the area on the side.
  • gallic acid synthase refers to an enzyme that catalyzes the synthetic reaction of gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid).
  • examples of gallic acid synthases include enzymes that have the function of converting protocatechuic acid to gallic acid, and a more detailed example catalyzes the reaction of oxidizing the 5-position of protocatechuic acid to convert it to gallic acid. Enzymes can be mentioned.
  • the present invention provides a novel gallic acid synthase and a method for producing gallic acid using the same.
  • the polypeptide of the present invention is a highly active gallic acid synthase having a function of converting protocatechuic acid into gallic acid.
  • the present invention is useful for the production of biochemical gallic acid.
  • the present invention provides a polypeptide that functions as a gallic acid synthase.
  • the polypeptide of the invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence.
  • the polypeptide of the present invention has a function of converting protocatechuic acid into gallic acid. More specifically, the polypeptide of the present invention has a function of converting protocatechuic acid into gallic acid by oxidizing the 5-position of protocatechuic acid.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by an ordinary chemical synthesis method or a genetic engineering method.
  • the polypeptide of the present invention can be chemically synthesized based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a commercially available peptide synthesis service provided by GenScript, etc. can be used.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is mutated and introduced into the amino acid sequence of 4-hydroxybenzoate-3-monooxygenase (NCBI: WP_040354425.1) derived from Corynebacterium ammoniagenes. Can be obtained by.
  • a gene encoding the polypeptide of the present invention by mutating into a gene encoding 4-hydroxybenzoic acid-3-monooxygenase (WP_0403534425.1) derived from Corinebacterium ammoniagenes (for example, SEQ ID NO: 6).
  • WP_0403534425.1 4-hydroxybenzoic acid-3-monooxygenase derived from Corinebacterium ammoniagenes (for example, SEQ ID NO: 6).
  • Polynucleotide can be prepared and a mutant polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be expressed from the obtained gene.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be produced by introducing a mutation into the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • various mutagenesis techniques known in the art can be used. For example, in a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (for example, the polynucleotide of SEQ ID NO: 6), the nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated is mutated to the nucleotide sequence encoding the amino acid residue after the mutation.
  • the desired mutant polypeptide can be obtained.
  • the desired mutant polypeptide can be obtained by chemically synthesizing a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the target mutant polypeptide and expressing it.
  • the polypeptide of the invention consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is Val at the position corresponding to position 208 of SEQ ID NO: 2 and Ph at the position corresponding to position 397. Has.
  • Introduction of the desired mutation into a gene can basically be carried out using various site-specific mutation introduction methods well known to those skilled in the art.
  • the site-specific mutagenesis method can be performed by any method such as an inverse PCR method or an annealing method.
  • a commercially available site-directed mutagenesis kit (for example, Stratage II Site-Directed Mutagenesis Kit, QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit, etc.) can also be used.
  • Site-specific mutagenesis into a gene can most generally be performed using a mutagenizing primer containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • the mutation primer is annealed to a region containing a nucleotide sequence encoding an amino acid residue to be mutated in a target gene, and the mutated amino acid is replaced with a nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated. It may be designed to include a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding a residue. Nucleotide sequences (codons) encoding amino acid residues before and after mutation can be appropriately recognized and selected by those skilled in the art based on ordinary textbooks and the like.
  • SOE splicing by overflow extension
  • SOE is a DNA fragment obtained by amplifying the upstream side and the downstream side of the mutation site separately using two complementary primers containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • -A method of linking to one by PCR (Gene, 1989, 77 (1): p61-68) can also be used.
  • the template DNA containing the target gene can be prepared by extracting genomic DNA from corynebacterium ammoniagenes by a conventional method or by extracting RNA and synthesizing cDNA by reverse transcription.
  • a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the target polypeptide may be chemically synthesized and used as a template DNA.
  • the primer for mutation can be prepared by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids R4search, 1989, 17: 7059-7071). Such primer synthesis can also be carried out using, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer (manufactured by ABI, etc.).
  • a primer set containing the mutation primer and performing site-specific mutation introduction as described above using the above target gene as a template DNA a polynucleotide encoding the target mutant polypeptide can be obtained.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotides of the invention may include single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA or other artificial nucleic acids.
  • the DNA, cDNA and RNA may be chemically synthesized.
  • the polynucleotide of the present invention may also contain a nucleotide sequence of an untranslated region (UTR) in addition to the open reading frame (ORF). Further, the polynucleotide of the present invention may be codon-optimized according to the species of the transformant for producing the polypeptide of the present invention.
  • Examples of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or a polynucleotide containing a nucleotide sequence having at least 90% identity with the sequence.
  • the present invention also provides a DNA fragment containing a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention.
  • the DNA fragment comprises a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention and a control region operably linked upstream thereof.
  • the control region contained in the DNA fragment preferably contains a promoter, and may further contain a cis element, a terminator, or the like that enhances the transcriptional activity of the promoter.
  • the DNA fragment may contain a selectable marker gene such as a drug resistance gene and an auxotrophic marker gene.
  • the DNA fragment is a DNA expression cassette for expressing the polynucleotide encoding the polypeptide of the invention.
  • the DNA fragment can have restriction enzyme recognition sequences at both ends.
  • the restriction enzyme recognition sequence can be used to introduce the DNA fragment into a vector.
  • the vector can be introduced into the vector by cleaving the vector with a restriction enzyme and adding a DNA fragment having the restriction enzyme cleavage sequence to the vector (restriction enzyme method).
  • the present invention also provides a vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention.
  • the vector can be prepared by inserting the polynucleotide of the present invention into an arbitrary vector by a conventional method.
  • the type of the vector is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid, cosmid, fasmid, phage, transposon, and BAC vector.
  • the vector may be a vector for introduction into the chromosome of a host cell or a vector retained outside the chromosome. Those that can be amplified in the host cell are preferable.
  • the vector is not limited, but is preferably a vector for bacteria, and more preferably a vector for bacteria belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium.
  • preferred vectors are, but are not limited to, pET21-a (+), pUC18 / 19, pUC118 / 119, pBR322, pMW218 / 219, pZ1 (Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55: 648-688).
  • PEKEx1 Gene, 1911, 102: 93-98
  • pHS2-1 Gene, 991, 107: 69-74
  • pCLiK5MCS Japanese Patent Laid-Open No.
  • the vector is preferably an expression vector.
  • Expression vectors are various elements essential for gene expression in host organisms such as transcription promoters and terminators; cis elements such as polylinkers and enhancers; polyA addition signals; ribosome binding sequences (SD sequences); drug resistance genes, nutritional requirements. Selective marker genes such as marker genes, etc., may contain useful sequences, etc., as needed.
  • the present invention also provides a transformant comprising the polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide of the present invention or a vector containing the same.
  • the transformant can be produced by introducing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, or a DNA fragment or vector containing the same, into a host.
  • the host of the transformant is not particularly limited, but preferably a bacterium, more preferably a bacterium belonging to the genus Escherichia or the genus Corynebacterium.
  • Escherichia is Escherichia coli.
  • Examples of corynebacterium include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerans, and Corynebacterium alkanolithum (Corynebacterium halotolerans). Corynebacterium alkanolyticum), Corynebacterium callunae, etc.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium ammoniagenes are more preferable, and Corynebacterium glutamicum is even more preferable.
  • Corynebacterium flavum Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium lilium.
  • Coryneform bacteria such as Corynebacterium glutamicum have the same bacterial name (Liebl W et al, Int J System Bacteriol, 1911, 41: 255-260; Kazuo Komagata et al., Fermentation and Industry, 1987, 45. : 944-963).
  • transformation methods such as electroporation, transformation, transfection, conjugation, protoplasts, particle gun, and Agrobacterium, are used to introduce polynucleotides and vectors into host cells.
  • Well-known transformation techniques such as can be applied.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention. Therefore, the present invention also provides a method for producing a polypeptide of the present invention using the transformant of the present invention. More specifically, the method for producing a polypeptide of the present invention comprises culturing a transformant of the present invention.
  • preferred media include LB medium, M9 medium and the like, and culture conditions include a culture temperature of 15 ° C to 45 ° C and a culture time of 1 to 7 days. ..
  • preferred media include LB medium, CGXII medium (Journal of Bacteriology, 1993, 175: 5595-5603), and the culture conditions include a culture temperature of 15 ° C to 45.
  • the temperature and culture time may be 1 to 7 days.
  • the polypeptide of the present invention may be expressed from a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention or a transcript thereof using a cell-free translation system.
  • the "cell-free translation system” is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which a reagent such as an amino acid necessary for protein translation is added to a suspension obtained by mechanically destroying a host cell. It is composed of.
  • polypeptides of the invention produced in the transformant or cell-free translation system can be used in common methods used for protein purification, such as cell disruption, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography. , Affinity chromatography and the like can be recovered from a culture solution, a cell disruption solution, a cell-free translation system reaction solution, or the like by using it alone or in combination as appropriate.
  • the polypeptide of the present invention is a gallic acid synthase, which is a conventionally known gallic acid synthase derived from corinebacterium (for example, SEQ ID NO: 1: Disclosed in Patent Document 2, Corinebacterium glutamicum ATCC13032 strain). Compared with the parahydroxybenzoic acid hydroxylase (HFM145), a mutant enzyme in which Leu at position 200 is replaced with Val and Tyr at position 385 is replaced with Phe), gallic acid synthesis activity (converts protocatechuic acid to gallic acid). High activity).
  • SEQ ID NO: 1 Disclosed in Patent Document 2, Corinebacterium glutamicum ATCC13032 strain.
  • the gallic acid synthesis activity (activity to convert protocatechuic acid to gallic acid) of the polypeptide of the present invention can be 110% or more with respect to the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the gallic acid synthesis activity of a polypeptide can be measured, for example, by quantifying the gallic acid produced by the reaction of the substrate protocatechuic acid with the polypeptide. Chromatography can be used, for example, to quantify gallic acid.
  • the present invention also provides a method for producing gallic acid using the polypeptide of the present invention.
  • the method for producing gallic acid according to the present invention comprises converting protocatechuic acid into gallic acid by the polypeptide of the present invention.
  • the method comprises adding the polypeptide of the invention to a solution containing the substrate protocatechuic acid to convert protocatechuic acid to gallic acid.
  • the polypeptide of the present invention may be used in the form of a purified polypeptide or a solution containing the same, or the above-mentioned transformant cell disrupted solution, cell extract, etc. of the present invention described above. Alternatively, they may be used in the form of their supernatants, or their solutions or suspensions.
  • the method for producing gallic acid according to the present invention comprises culturing the above-mentioned transformant of the present invention in a medium containing the substrate protocatechuic acid, whereby the transformant of the present invention expressed.
  • the polypeptide converts protocatechuic acid to gallic acid.
  • the method for producing gallic acid according to the present invention comprises producing a transformant of the present invention having the ability to produce protocatechuic acid and culturing it. That is, by using a microorganism capable of producing protocatechuic acid as a host and introducing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, or a DNA fragment or vector containing the same, the polypeptide of the present invention and the substrate are introduced.
  • Protocatechuic acid is produced as a transformant.
  • gallic acid is produced from the produced polypeptide of the present invention and protocatechuic acid.
  • the initial concentration of protocatechuic acid in the reaction solution (or culture) is preferably about 0.1 to 500 mM, and the concentration of the polypeptide of the present invention is preferably about 1 mg / L to 10 g / L.
  • the temperature of the reaction solution is preferably 10 to 60 ° C., more preferably 15 to 50 ° C., and the pH in the reaction solution is preferably pH 5 to 10, more preferably pH 6 to 9.
  • the reaction solution may contain a buffer, a pH adjuster, a coenzyme and the like. When the reaction solution is a culture, it is preferable that the temperature and pH conditions and the composition of the medium follow the culture conditions of the transformant.
  • the present invention also includes the following substances, manufacturing methods, uses, methods, etc. as exemplary embodiments. However, the present invention is not limited to these embodiments.
  • the gallic acid synthesis activity is higher than that of the enzyme of SEQ ID NO: 1. More preferably, the gallic acid synthesis activity is 110% or more with respect to the enzyme of SEQ ID NO: 1.
  • the gallic acid synthesis activity is an activity of converting protocatechuic acid into gallic acid.
  • [4] A polynucleotide encoding the polypeptide according to any one of [1] to [3].
  • [5] A vector containing the polynucleotide according to [4].
  • [6] A DNA fragment containing the polynucleotide according to [4].
  • [7] The DNA fragment according to [6], which is preferably a DNA expression cassette.
  • [8] A transformant containing the polynucleotide described in [5], the vector described in [5], or the DNA fragment described in [6] or [7].
  • the transformant according to [8] preferably a bacterium belonging to the genus Escherichia or the genus Corynebacterium, and more preferably a bacterium belonging to the genus Corynebacterium.
  • the transformant according to [8] or [9] wherein the transformant has the ability to produce protocatechuic acid.
  • a method for producing gallic acid which comprises converting protocatechuic acid into gallic acid by the polypeptide according to any one of [1] to [3].
  • the method according to [11] preferably comprising culturing the transformant according to [8] or [9] in the medium containing the protocatechuic acid.
  • Example 1 Preparation of gallic acid synthase 1
  • Preparation of gene encoding gallic acid synthase Cg145 In Patent Document 2, Parahydroxybenzoic acid hydroxylase (Genbank Accession No .: NP_600305) of Corinebacterium glutamicum ATCC13032 strain is described.
  • a mutant enzyme (disclosed as SEQ ID NO: 22 in Patent Document 2) in which Leu at position 200 is replaced with Val and Tyr at position 385 is replaced with Phe with respect to the amino acid sequence of 1) is gallic acid from protocatechuic acid. It is disclosed that the conversion activity to acid is high.
  • the mutant enzyme is referred to as Cg145, and the amino acid sequence thereof is disclosed as SEQ ID NO: 1.
  • DNA encoding parahydroxybenzoic acid hydroxylase (Genbank Accession No .: NP_600305.1) was amplified by PCR from the genomic DNA of the Corinebacterium glutamicum ATCC13032 strain and subcloned. The above amino acid substitution was introduced into the obtained DNA by PCR to prepare the DNA of SEQ ID NO: 5 encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) was designed in which Leu at position 208 of the amino acid sequence of WP_040354425.1 was replaced with Val and Tyr at position 397 was replaced with Phe.
  • SEQ ID NO: 3 was designed from WP_015650893.1
  • SEQ ID NO: 4 was designed from WP_006769907.1.
  • the polypeptides set forth in SEQ ID NOs: 2, 3 and 4 are referred to as Ca145, Cc145 and Ce145, respectively.
  • DNAs encoding the polypeptides of SEQ ID NOs: 2, 3 and 4 (SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, respectively) were commissioned by GenScript to be artificially synthesized.
  • the Ca145 gene fragment is amplified by PCR using the plasmids into which the DNA encoding Ca145 (SEQ ID NO: 6) has been introduced, and the primers pET-Ca145-F and pET-Ca145-R (Table 1). bottom.
  • the pET21-a (+) vector fragment and the Ca145 gene fragment were ligated with an In-Fusion HD cloning kit (clontech) to obtain pET21-Ca145.
  • the Cc145 gene fragment is amplified by PCR using the plasmid into which the DNA encoding Cc145 (SEQ ID NO: 7) has been introduced and the primers pET-Cc145-F and pET-Cc145-R (Table 1). bottom.
  • the pET21-a (+) vector fragment and the Cc145 gene fragment were ligated with an In-Fusion HD cloning kit (clontech) to obtain pET21-Cc145.
  • the Ce145 gene fragment is amplified by PCR using the plasmid into which the DNA encoding Ce145 (SEQ ID NO: 8) has been introduced and the primers pET-Ce145-F and pET-Ce145-R (Table 1). bottom.
  • the pET21-a (+) vector fragment and the Ce145 gene fragment were ligated with an In-Fusion HD cloning kit (clontech) to obtain pET21-Ce145.
  • the cells were disrupted using an xTractor buffer kit (TaKaRa), subsequently centrifuged at 4 ° C. and 14500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected. The obtained supernatant was used as an enzyme solution containing gallic acid synthase. The protein concentration of the enzyme solution was quantified using the TaKaRa Bradford Protein Assay Kit (TaKaRa).
  • Example 2 Enzyme activity measurement Obtained in Example 1 diluted appropriately with 100 ⁇ L of a substrate solution (a mixture of 60 ⁇ L of 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) solution, 20 ⁇ L of 20 mM NADH solution, and 20 ⁇ L of 20 mM protocatechuic acid solution). 100 ⁇ L of the enzyme solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. 10 ⁇ L of the reaction solution was sampled and mixed with 190 ⁇ L of 37 mM sulfuric acid to stop the reaction. The amount of gallic acid produced in this solution was quantified according to the method of Reference Example 1. The activity of each gallic acid synthase was measured from the amount of gallic acid produced per protein concentration. Table 2 shows the relative activity of each gallic acid synthase when the activity of Cg145 is 100. Compared with the known enzyme Cg145, Ca145 had an 18% higher gallic acid conversion activity.
  • a substrate solution a mixture of 60 ⁇ L of 100 mM Tris-
  • a concentration calibration curve was prepared using a standard sample (gallic acid, Kanto Chemical Co., Inc., product number 40205), and gallic acid was quantified based on the concentration calibration curve.
  • the reaction solution and standard sample of Example 2 subjected to HPLC analysis were appropriately diluted with 37 mM sulfuric acid, and then insoluble matter was removed using AcroPrep 96-well Filter Plates (0.2 ⁇ m GHP membrane, Paul). rice field.

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Abstract

没食子酸合成酵素の提供。配列番号２のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、プロトカテク酸を没食子酸へと変換する機能を有するポリペプチド。該ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを用いた没食子酸の製造方法。

Description

没食子酸合成酵素
　本発明は、没食子酸合成酵素、及びこれを用いた没食子酸の製造方法に関する。
　没食子酸（３，４，５－トリヒドロキシ安息香酸）は、還元力が強く、還元剤、写真の現像剤に用いられている。また、鉄塩の形成により着色する性質があるためインクの製造等にも用いられている。さらに、没食子酸からは没食子酸エステル等の数多くの誘導体が得られ、それらは食品分野、電子材料分野等の様々な分野において広く用いられている。
　微生物を利用して、芳香族カルボン酸やグルコース等の安価な原料から没食子酸を製造する方法が報告されている。特許文献１、２には、プロトカテク酸を没食子酸へと変換する酵素として、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株由来の、プロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する酵素が開示されている。
（特許文献１）特開２００９－０６５８３９号公報
（特許文献２）特開２００９－２１３３９２号公報
　一態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、プロトカテク酸を没食子酸へと変換する機能を有するポリペプチドを提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含有する形質転換体を提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記ポリペプチドによりプロトカテク酸を没食子酸に変換することを含む、没食子酸の製造方法を提供する。
発明の詳細な説明
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．７％以上の同一性をいう。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、または相当するモチーフからなる領域は、相当する領域とみなされる。
　当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。
　本明細書において、「没食子酸合成酵素」とは、没食子酸（３，４，５－トリヒドロキシ安息香酸）の合成反応を触媒する酵素をいう。没食子酸合成酵素の例としては、プロトカテク酸を没食子酸に変換する機能を有する酵素が挙げられ、より詳細な例としては、プロトカテク酸の５位を酸化して没食子酸に変換する反応を触媒する酵素が挙げられる。
　本発明は、新規な没食子酸合成酵素、及びこれを用いた没食子酸の製造方法を提供する。本発明のポリペプチドは、プロトカテク酸を没食子酸に変換する機能を有する、高活性な没食子酸合成酵素である。本発明は、生化学的な没食子酸の製造に有用である。
　本発明は、没食子酸合成酵素として機能するポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。本発明のポリペプチドは、プロトカテク酸を没食子酸へと変換する機能を有する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、プロトカテク酸の５位を酸化することで、プロトカテク酸を没食子酸に変換する機能を有する。
　本発明のポリペプチドは、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列に基づいて、本発明のポリペプチドを化学合成することができる。ペプチドの化学合成には、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から提供される市販のペプチド合成サービスを利用することができる。あるいは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）由来の４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼ（ＮＣＢＩ：ＷＰ＿０４０３５４４２５．１）のアミノ酸配列に変異導入することで取得することができる。例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼ（ＷＰ＿０４０３５４４２５．１）をコードする遺伝子に変異導入して本発明のポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、配列番号６のポリヌクレオチド）を作製し、得られた遺伝子から配列番号２のアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドを発現させることができる。
　配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに突然変異を導入することによって製造することができる。ポリペプチドのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（例えば、配列番号６のポリヌクレオチド）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、さらにその変異遺伝子を発現させることにより、目的の変異ポリペプチドを得ることができる。あるいは、目的とする変異ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を化学合成し、これを発現させることで目的の変異ポリペプチドを得ることができる。好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドは、配列番号２の２０８位に相当する位置にＶａｌ及び３９７位に相当する位置にＰｈｅを有する。
　遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
　遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、標的遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
　標的遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスから、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、目的とするポリペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を化学合成し、鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。
　変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、上記の標的遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上述のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
　したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（［ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／］）から入手可能である。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例としては、配列番号６のヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片を提供する。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、その上流に作動可能に連結された制御領域とを含む。該ＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、好ましくはプロモーターを含み、さらに該プロモーターの転写活性を向上させるシスエレメント、ターミネーターなどを含んでいてもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子等の選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるためのＤＮＡ発現カセットである。
　該ＤＮＡ断片は、両末端に制限酵素認識配列を有することができる。該制限酵素認識配列を使用して、該ＤＮＡ断片をベクターに導入することができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、該制限酵素切断配列を有するＤＮＡ断片を添加することによって、該ＤＮＡ断片をベクターに導入することができる（制限酵素法）。
　本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。該ベクターは、該本発明のポリヌクレオチドを常法により任意のベクター中に挿入することにより作製することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、コスミド、ファスミド、ファージ、トランスポゾン、ＢＡＣベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、宿主細胞の染色体に導入するためのベクターであっても、染色体外に保持されるベクターであってもよい。宿主細胞内で増幅可能なものが好ましい。
　該ベクターは、限定ではないが、好ましくは細菌用ベクターであり、より好ましくはエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）又はコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌用のベクターである。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＥＴ２１－ａ（＋）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１８／２１９、ｐＺ１（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，５５：６８４－６８８）、ｐＥＫＥｘ１（Ｇｅｎｅ，１９９１，１０２：９３－９８）、ｐＨＳ２－１（Ｇｅｎｅ，１９９１，１０７：６９－７４）、ｐＣＬｉＫ５ＭＣＳ（特表２００５－５２２２１８号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＮＧ２（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９０，６６：１１９－１２４）、ｐＡＧ１（特開昭６１－５２２９０号公報）、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（ＷＯ２０１４／００７２７３）などが挙げられる。
　本発明のポリペプチドを組換え生産する場合、当該ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター等の宿主生物における遺伝子発現に必須な各種エレメント；ポリリンカー、エンハンサー等のシスエレメント；ポリＡ付加シグナル；リボソーム結合配列（ＳＤ配列）；薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子等の選択マーカー遺伝子、などの有用な配列を必要に応じて含み得る。
　本発明はまた、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含有するベクターを含む、形質転換体を提供する。該形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するＤＮＡ断片もしくはベクターを宿主に導入することにより製造することができる。
　当該形質転換体の宿主としては、特に限定されないが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する細菌が挙げられる。エシェリヒアの例としては、大腸菌が挙げられる。コリネバクテリウムの例としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）などが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスがより好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカムがさらに好ましい。なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカムに菌名が統一されている（Ｌｉｅｂｌ　Ｗ　ｅｔ　ａｌ，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９１，４１：２５５－２６０；駒形和男ら，発酵と工業，１９８７，４５：９４４－９６３）。
　ポリヌクレオチドやベクターの宿主細胞への導入には、一般的な形質転換方法、例えば、エレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法などの周知の形質転換技術を適用することができる。
　本発明の形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。したがって、本発明はまた、本発明の形質転換体を用いる本発明のポリペプチドの製造方法を提供する。より詳細には、本発明のポリペプチドの製造方法は、本発明の形質転換体を培養することを含む。例えば、形質転換体が大腸菌の場合、好ましい培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地などが挙げられ、培養条件としては、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日が挙げられる。形質転換体がコリネバクテリウムの場合、好ましい培地としては、ＬＢ培地、ＣＧＸII培地（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９３，１７５：５５９５－５６０３）などが挙げられ、培養条件としては、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日が挙げられる。
　あるいは、本発明のポリペプチドは、無細胞翻訳系を使用して、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
　当該形質転換体又は無細胞翻訳系で製造された本発明のポリペプチドは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、細胞の破砕、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、無細胞翻訳系の反応液などから回収することができる。
　本発明のポリペプチドは、没食子酸合成酵素であり、従来知られたコリネバクテリウム由来の没食子酸合成酵素（例えば、配列番号１：特許文献２に開示される、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素（ＨＦＭ１４５）の２００位のＬｅｕをＶａｌへと置換し、３８５位のＴｙｒをＰｈｅに置換した変異酵素）と比べて、没食子酸合成活性（プロトカテク酸を没食子酸に変換する活性）が高い。好ましくは、本発明のポリペプチドの没食子酸合成活性（プロトカテク酸を没食子酸に変換する活性）は、配列番号１のポリペプチドに対して１１０％以上であり得る。ポリペプチドの没食子酸合成活性は、例えば、基質であるプロトカテク酸と該ポリペプチドとの反応で生成した没食子酸を定量することで測定することができる。没食子酸の定量には、例えばクロマトグラフィーを用いることができる。
　したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドを用いた没食子酸の製造方法を提供する。本発明による没食子酸の製造方法は、本発明のポリペプチドによりプロトカテク酸を没食子酸に変換することを含む。より詳細な例において、該方法は、基質であるプロトカテク酸を含む液に本発明のポリペプチドを加え、プロトカテク酸を没食子酸に変換させることを含む。該方法において、本発明のポリペプチドは、精製されたポリペプチドやそれを含む溶液の形態で用いられてもよく、あるいは上述した本発明の形質転換体の菌体破砕液、菌体抽出液、又はそれらの上清、又はそれらの溶液や懸濁液の形態で用いられてもよい。あるいは、本発明による没食子酸の製造方法は、基質であるプロトカテク酸を含有する培地で上述した本発明の形質転換体を培養することを含み、これによって、該形質転換体の発現する本発明のポリペプチドによりプロトカテク酸が没食子酸に変換される。あるいは、本発明による没食子酸の製造方法は、プロトカテク酸の産生能を有する本発明の形質転換体を製造し、これを培養することを含む。すなわち、プロトカテク酸の産生能を有する微生物を宿主として、これに本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するＤＮＡ断片もしくはベクターを導入することで、本発明のポリペプチドと、基質であるプロトカテク酸を産生する形質転換体を製造する。該形質転換体を培養することで、産生された本発明のポリペプチドとプロトカテク酸から没食子酸が製造される。反応液（又は培養物）中におけるプロトカテク酸の初期濃度は、０．１～５００ｍＭ程度が好ましく、本発明のポリペプチドの濃度は、１ｍｇ/Ｌ～１０ｇ/Ｌ程度が好ましい。反応液の温度は、好ましくは１０～６０℃、より好ましくは１５～５０℃であり、反応液中のｐＨは、好ましくはｐＨ５～１０、より好ましくはｐＨ６～９である。該反応液は、緩衝剤、ｐＨ調整剤、補酵素などを含有していてもよい。反応液が培養物の場合、温度やｐＨの条件、及び培地の組成は、形質転換体の培養条件に従うことが好ましい。
　本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕配列番号２のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロトカテク酸を没食子酸へと変換する機能を有するポリペプチド。
〔２〕好ましくは、配列番号２の２０８位に相当する位置にＶａｌ、及び３９７位に相当する位置にＰｈｅを有する、〔１〕記載のポリペプチド。
〔３〕好ましくは、配列番号１の酵素と比べて没食子酸合成活性が高く、
　より好ましくは、配列番号１の酵素に対して没食子酸合成活性が１１０％以上であり、
　ここで、該没食子酸合成活性がプロトカテク酸を没食子酸に変換する活性である、
〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド。
〔４〕〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔５〕〔４〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔６〕〔４〕記載のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片。
〔７〕好ましくはＤＮＡ発現カセットである、〔６〕記載のＤＮＡ断片。
〔８〕〔５〕記載のポリヌクレオチド、〔５〕記載のベクター、あるいは〔６〕又は〔７〕記載のＤＮＡ断片を含有する、形質転換体。
〔９〕好ましくはエシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する細菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム属に属する細菌である、〔８〕記載の形質転換体。
〔１０〕好ましくは、前記形質転換体がプロトカテク酸の産生能を有する、〔８〕又は〔９〕記載の形質転換体。
〔１１〕〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドによりプロトカテク酸を没食子酸に変換することを含む、没食子酸の製造方法。
〔１２〕好ましくは、前記プロトカテク酸を含有する培地で〔８〕又は〔９〕記載の形質転換体を培養することを含む、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは、〔８〕又は〔９〕記載の形質転換体を培養することを含み、該形質転換体がプロトカテク酸の産生能を有する、〔１１〕記載の方法。
　以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　没食子酸合成酵素の調製
１）没食子酸合成酵素Ｃｇ１４５をコードする遺伝子の調製
　特許文献２には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：ＮＰ＿６００３０５．１）のアミノ酸配列に対して２００位のＬｅｕをＶａｌへと置換し、３８５位のＴｙｒをＰｈｅに置換した変異酵素（特許文献２に配列番号２２として開示される）が、プロトカテク酸から没食子酸への変換活性が高いことが開示されている。以下の実施例では、該変異酵素をＣｇ１４５と称し、そのアミノ酸配列を配列番号１として開示する。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡから、パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：ＮＰ＿６００３０５．１）をコードするＤＮＡをＰＣＲにて増幅してサブクローニングした。得られたＤＮＡにＰＣＲにより上記のアミノ酸置換を導入して、配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号５のＤＮＡを調製した。
２）没食子酸合成酵素Ｃａ１４５、Ｃｃ１４５及びＣｅ１４５をコードする遺伝子の調製
　Ｇｅｎｂａｎｋデータベースより、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・カルナエ及びコリネバクテリウム・エフィシェンス由来の４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列（それぞれ、ＷＰ＿０４０３５４４２５．１、ＷＰ＿０１５６５０８９３．１、及びＷＰ＿００６７６９９０７．１）を取得した。各アミノ酸配列に対して、Ｃｇ１４５と同様に、配列番号１の２００位に相当する位置のＬｅｕをＶａｌに、３８５位に相当する位置のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列を設計した。すなわち、ＷＰ＿０４０３５４４２５．１のアミノ酸配列の２０８位ＬｅｕをＶａｌに、３９７位ＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列（配列番号２）を設計した。同様に、ＷＰ＿０１５６５０８９３．１から配列番号３を、ＷＰ＿００６７６９９０７．１から配列番号４を設計した。以下の実施例では、配列番号２、３及び４で示されるポリペプチドをそれぞれＣａ１４５、Ｃｃ１４５、及びＣｅ１４５と称する。配列番号２、３及び４のポリペプチドをコードするＤＮＡ（それぞれ配列番号６、７及び８）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に依頼して人工的に合成した。
３）発現ベクターの作製
　上記１）及び２）で調製したＤＮＡを、それぞれｐＥＴ２１－ａ（＋）プラスミド（ＭＥＲＣＫ社）に導入した。ｐＥＴ２１－ａ（＋）を鋳型にプライマーＨｉｓ－ｐＥＴ２１ａ－Ｆ及びｐＥＴ２１ａ－Ｒ（表１）を用いたＰＣＲにより、ｐＥＴ２１－ａ（＋）ベクター断片を増幅した。Ｃｇ１４５をコードするＤＮＡ（配列番号５）を導入したプラスミドを鋳型に、プライマーｐＥＴ－Ｃｇ１４５－Ｆ及びｐＥＴ－Ｃｇ１４５－Ｒ（表１）を用いたＰＣＲにより、Ｃｇ１４５遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ用酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いた。ｐＥＴ２１－ａ（＋）ベクター断片とＣｇ１４５遺伝子断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＴ２１－Ｃｇ１４５を得た。
　同様の手順で、Ｃａ１４５をコードするＤＮＡ（配列番号６）を導入したプラスミドを鋳型に、プライマーｐＥＴ－Ｃａ１４５－ＦとｐＥＴ－Ｃａ１４５－Ｒ（表１）を用いたＰＣＲにより、Ｃａ１４５遺伝子断片を増幅した。ｐＥＴ２１－ａ（＋）ベクター断片とＣａ１４５遺伝子断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＴ２１－Ｃａ１４５を得た。
　同様の手順で、Ｃｃ１４５をコードするＤＮＡ（配列番号７）を導入したプラスミドを鋳型に、プライマーｐＥＴ－Ｃｃ１４５－ＦとｐＥＴ－Ｃｃ１４５－Ｒ（表１）を用いたＰＣＲにより、Ｃｃ１４５遺伝子断片を増幅した。ｐＥＴ２１－ａ（＋）ベクター断片とＣｃ１４５遺伝子断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＴ２１－Ｃｃ１４５を得た。
　同様の手順で、Ｃｅ１４５をコードするＤＮＡ（配列番号８）を導入したプラスミドを鋳型に、プライマーｐＥＴ－Ｃｅ１４５－ＦとｐＥＴ－Ｃｅ１４５－Ｒ（表１）を用いたＰＣＲにより、Ｃｅ１４５遺伝子断片を増幅した。ｐＥＴ２１－ａ（＋）ベクター断片とＣｅ１４５遺伝子断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＴ２１－Ｃｅ１４５を得た。
　得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、細胞液を、アンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一晩静置した。得られたコロニーを鋳型にして、Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（ＴａＫａＲａ社）を酵素として用い、コロニーＰＣＲを行った。プライマーはＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ－２及びＴ７ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ－２（表１）を用いた。目的遺伝子の導入が確認されたプラスミドを持つ形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いてプラスミドを精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
４）各没食子酸合成酵素の発現
　上記３）で得られたプラスミドをＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ液体培養液２ｍＬにそれぞれの形質転換体を接種し、３７℃で一晩培養した。続いてこの培養液１ｍＬを、アンピシリンを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｉｎｓｔａｎｔ　ＬＢ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ社）液体培養液１０ｍＬに接種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、菌体を回収した。ｘＴｒａｃｔｏｒ　ｂｕｆｆｅｒ　ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて菌体を破砕し、続いて４℃、１４５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。得られた上清を、没食子酸合成酵素を含む酵素溶液として用いた。ＴａＫａＲａ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて、該酵素溶液のタンパク質濃度を定量した。
実施例２　酵素活性測定
　１００μＬの基質溶液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液６０μＬと、２０ｍＭ　ＮＡＤＨ溶液２０μＬと、２０ｍＭのプロトカテク酸溶液２０μＬの混合液）に、適宜希釈した実施例１で得た酵素溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間静置した。反応液１０μＬをサンプリングし、１９０μＬの３７ｍＭ硫酸と混合することで反応を停止させた。この溶液の没食子酸生成量を参考例１の方法に従って定量した。タンパク質濃度当たりの没食子酸生成量から、各没食子酸合成酵素の活性を測定した。Ｃｇ１４５の活性を１００としたときの各没食子酸合成酵素の相対活性を表２に示した。公知の酵素Ｃｇ１４５と比較して、Ｃａ１４５は、没食子酸変換活性が１８％高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
参考例１　没食子酸の定量
　ＨＰＬＣにより没食子酸を定量した。ＨＰＬＣ装置は、Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス社）を用いた。分析カラムは、Ｌ－カラム　ＯＤＳ（４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、×化学物質評価研究機構）を用いた。溶離液Ａに０．１Ｍリン酸二水素カリウムを含む０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂに７０％メタノールを用い、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件でのグラジエント溶出により没食子酸を分離した。没食子酸の検出には、ＵＶ検出器（検出波長２１０ｎｍ）を用いた。標準試料（没食子酸、関東化学社、製品番号４０２０５）を用いて濃度検量線を作成し、濃度検量線に基づいて没食子酸の定量を行った。ＨＰＬＣ分析に供した実施例２の反応溶液及び標準試料は、３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、ＡｃｒｏＰｒｅｐ　９６－ｗｅｌｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｔｅｓ（０．２μｍ　ＧＨＰ膜、ポール社）を用いて不溶物の除去を行なった。

Claims (10)

  1. 　以下のポリペプチド：
    　配列番号２のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロトカテク酸を没食子酸へと変換する機能を有するポリペプチド、
    によりプロトカテク酸を没食子酸に変換することを含む、没食子酸の製造方法。
  2. 　プロトカテク酸を含有する培地で、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することを含む、請求項１記載の方法。
  3. 　前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することを含み、該形質転換体がプロトカテク酸の産生能を有する、請求項１記載の方法。
  4. 　前記形質転換体が、前記ポリヌクレオチドを含有するベクター、又は前記ポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ発現カセットを含有する、請求項２又は３記載の方法。
  5. 　前記形質転換体がエシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する細菌である、請求項２～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　前記ポリペプチドが配列番号１の酵素と比べて没食子酸合成活性が高い、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　以下のポリペプチド：
    　配列番号２のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロトカテク酸を没食子酸へと変換する機能を有するポリペプチド、
    をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体。
  8. 　前記ポリヌクレオチドを含有するベクター、又は前記ポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ発現カセットを含有する、請求項７記載の形質転換体。
  9. 　エシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する細菌である、請求項７又は８記載の形質転換体。
  10. 　前記ポリペプチドが配列番号１の酵素と比べて没食子酸合成活性が高い、請求項７～９のいずれか１項記載の形質転換体。 
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