JP2009213392A - 改良型没食子酸合成酵素および没食子酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の(A)または(B)に記載の蛋白質を発現する微生物を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする没食子酸の製造方法。
(A)配列番号2もしくは配列番号2と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において199位のロイシンが他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
(B)配列番号22もしくは配列番号22と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において200位のロイシンが他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
【選択図】なし
Description
酸化酵素という)によりプロトカテク酸を没食子酸に変換することにより没食子酸を安価に製造する方法を提供することにある。本発明の別の課題は、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸などの安価な原料からプロトカテク酸を生産し、プロトカテク酸5位酸化酵素によりプロトカテク酸を没食子酸に変換することにより没食子酸を安価に製造する方法を提供することにある。
(A)配列番号2もしくは配列番号2と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において199位のロイシンが他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
(B)配列番号22もしくは配列番号22と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において200位のロイシンが他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
(A)配列番号2もしくは配列番号2と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において199位のロイシンが他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
(B)配列番号22もしくは配列番号22と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において200位のロイシンが他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
具体的には、例えば、配列番号6、8、10、12、14、16、18、22または24で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。ここで、配列番号6はシュードモナス・エルギノーサPAO株が保有する野生型パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素(配列番号2)の199位のロイシンがバリンに置換された蛋白質のアミノ酸配列である。また、配列番号2においては、199位のロイシンがバリン以外のアミノ酸に置換されてもよく、199位のロイシンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を配列番号8に示す。さらに、配列番号2においては、199位のロイシンの変異に加えて、385位のチロシンが他のアミノ酸に置換されてもよく、配列番号6または配列番号8の385位のチロシンがフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列をそれぞれ配列番号10と12に示す。また、配列番号6の385位のチロシンがアラニンまたはバリンに置換されたアミノ酸配列をそれぞれ配列番号14と18に示し、配列番号8の385位のチロシンがアラニンに置換されたアミノ酸配列をそれぞれ配列番号16に示す。
本発明で用いられるプロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質は、シュードモナス・エルギノーサPAO株に限定されず、配列番号22と24は、配列番号20で表されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032由来の野生型プロトカテク酸5位酸化酵素に上記変異点に対応するアミノ酸(コリネバクテリウム・グルタミカムでは200位と385位)を置換した蛋白質のアミノ酸配列である。
また、該蛋白質としては、配列番号2または22のいずれかのアミノ酸配列と80%以上の同一性、好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、199位または200位のロイシンが他のアミノ酸に置換され、プロトカテク酸5位酸化酵素活性を有する蛋白質(配列番号22については385位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない)をあげることができる。
用できる変異型プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を生産する形質転換体は、例えば該DNAをモレキュラー・クローニング第2版に記載の方法に従って、上記の微生物からプロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質をコードするDNAをクローニングし、変異を導入し、それをベクターDNAと連結することで組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを用いて宿主細胞を形質転換することにより取得することができる。以下に、DNAのクローニングと形質転換株の作製方法について詳しく述べる。
103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17, 9494 (1989)〕、pUC118(タカラバイオ社製)等を用いることができる。
好ましくは、テレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能(テレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力)を有する微生物を用いることができる。より好ましくは、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有するエシェリヒア(Escherichia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、コマモナス(Comamonas)属、バチルス属(Bacillus)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノボスフィンゴビウム(Novosphigobium)属またはバークホルデリア(Burkholderia)属の細菌をあげることができる。さらに好ましくは、テレフタル酸の代謝能を有するロドコッカス属細菌RHA1とコマモナス・テストステロニ(Comamonas testosteroni)E6をあげることができる。
このような微生物に変異型プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を発現させることにより、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を経て没食子酸を製造することができる。すなわち、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有し、かつ、変異型プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を発現する微生物を、それぞれ、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地中でこれらの化合物と反応させることにより、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸から生成したプロトカテク酸から没食子酸を得ることができる。
なお、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロト
カテク酸を生成するプロセスは別の微生物を用いて行ってもよい。すなわち、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有する微生物によってテレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸から生成したプロトカテク酸を、変異型プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を発現する微生物と反応させて没食子酸を得る方法も本発明の没食子酸の製造方法に含まれる。
ードするDNAを導入する。
本発明で用いられるテレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能(テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力)を有する微生物は、自然界からのサンプルをもとに、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を炭素源とする集積培養法を用いて取得することができる。好ましくは、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有するシュードモナス属、ロドコッカス属、コマモナス属、バチルス属、マイコバクテリウム属、ノボスフィンゴビウム属またはバークホルデリア属の細菌をあげることができる。
なお、ロドコッカス属RHA1のように、プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を発現する微生物はパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力も有しているため、プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を発現させた微生物をパラヒドロキシ安息香酸を含む培地で培養することにより、パラヒドロキシ安息香酸から没食子酸を製造することができる。
フタル酸から没食子酸を製造する場合、変異型プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質をコードするDNAを導入するフタル酸の代謝能(フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力)を有する微生物は、フタル酸ジオキシゲナーゼ、フタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタレート4,5-シス-ジヒドロキシジオール・ジヒドロゲナーゼ、4,5-ジヒドロキシフタレート脱炭酸酵素およびフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。
イソフタル酸から没食子酸を製造する場合、変異型プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質をコードするDNAを導入するイソフタル酸の代謝能(イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力)を有する微生物は、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。
これらの蛋白質を生産する能力を有する微生物は、これらの蛋白質をコードするDNAを組換えDNA技術を用いて単離した後、上記のプロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を発現する形質転換体を取得する方法と同じ方法用いて取得することもできる。
カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。没食子酸を生産するための原料としては、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を添加する。
する場合がある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、没食子酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常0.001〜0.05%(W/V)、好ましくは0.005〜0.02%である。
(1)シュードモナス・エルギノーサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列と相同性を有するコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の蛋白質の同定
シュードモナス・エルギノーサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素(HFM300)は、パラヒドロキシ安息香酸を酸化してプロトカテク酸を生成する活性を保有するが、プロトカテク酸5位酸化活性を生成する活性は全く保有していないと報告されている。また、プロトカテク酸から没食子酸を生成する活性を持つ酵素に関してはシュードモナス・エルギノーサPAO株が保有する野生型パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素(HFM300)の385位のチロシンをフェニルアラニンに変換した変異酵素HFM300Y385Fでのみ、活性を持つと報告されている〔Entsch, B, Palfey, B.A., Ballou, D. P. と Masey, V. J. Biol. Chem. 266, 17341-17349 (1991)〕。一方、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション(以下、NCBIと略記する)のジェンバンク(GenBank;以下、GBと略記する)データベースから、配列番号2に示すシュードモナス・エルギノーサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列を問い合わせ配列とするBLAST相同性解析法を用いて検索を行った。その結果、アミノ酸発酵の工業生産に利用されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のゲノム配列中にHFM300と40.1%の相同性を有する蛋白質HFM145(蛋白質の配列番号は20であり、GBアクセッション番号はNP_600305.1)を同定した。
蛋白質HFM145をコードするDNAをPCR法を用いてクローニングするために、菌株コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032(NBRC番号:12168)をNBRCから入手し、NBRCからの情報に従って培養し、これら培養菌体から染色体DNAをディーエヌイージー・ティシュ・キット(キアゲン社製(DNeasy tissue kit;Qiagen)を用いて単離精製した。
NCBIのGenBankデータベースより蛋白質HFM145をコードする塩基配列(GBアクセッション番号はNC_003450.3;配列番号19)をインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のDNAをPCR法を用いてクローニングするためのPCRプライマーを設計し、合成した。PCRプライマーの塩基配列は配列番号25と配列番号26に示した。
ロシュ・ダイアグノスティクス社から購入したエキスパンド・ハイ・フィデリティ・PCRシステム(Expand High Fidelity PCR System)およびロシュ・ダイアグノスティクス社から購入したジー・シー・リッチ・PCRシステム(GC Rich PCR System)を用いて、上記で得た染色体DNAを鋳型にし、上記PCRプライマーを用いて、添付の説明書に従って蛋白質HFM145をコードするDNAを増幅させた。なお、ジー・シー・リッチ・PCRシステムを用いたPCR反応はデメチルスルホオキシドと7-deasa-dGTPの存在下で実施した。
上記で得られた蛋白質HFM145をコードするDNA、すなわちHFM145遺伝子のDNAをクローンテック社から購入したBD・イン−フュージョン・PCR・クローニング・キット(BD In-Fusion PCR Cloning Kit)を用いて、大腸菌T7プロモーターを利用した大腸菌用発現ベクターであるプラスミドpROX1(ロシュ・アプライド・サイエンス社から入手した;塩基配列は配列番号27に示した)の制限酵素部位Nco Iと制限酵素部位Sma I の間にクローニングし、HFM145遺伝子を発現するプラスミドpROX_HFM145を得た。なお、これら発現プラスミドは、各野生型酵素のC末端にGly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His(配列番号28)の10アミノ酸のペプチドが付加された酵素蛋白質が発現する構造を有する。
上記で述べたプラスミドpROX_HFM145を大腸菌K-12 BL21(DE3)株にカルシウムイオンを用いる形質転換法を用いて導入することにより、形質転換株BL21/pROX__HFM145を造成した。なお、BL21(DE3)株は、大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 ナショナル・バイオ・リソース・プロジェクトより菌株番号ME9026として入手した。
形質転換株BL21/pROX_HFM145を5mlのLB培地で一晩培養した。プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度100ppmになるように加えた。新しいLB培地に1/100容量接種し、25℃で培養し対数増殖期にIPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)を終濃度1mMになるように添加し、3時間タンパク誘導を行った。タンパク誘導後、大腸菌を遠心によって集菌した。上清を捨て、500μlのHEPES緩衝液(50mM HEPES−NaOH(pH7.5)、10%グリセロール)に懸濁した。大腸菌懸濁液を超音波破砕機によって、細胞破砕を行った。大腸菌懸濁液は遠心分離(4℃、10分、20000×g)を行い、上清と沈殿物に分離し、上清を粗酵素液とした。粗酵素液のタンパク濃度をブラッドフォード法に基づいたバイオラッド(Bio-Rad)プロテイン・アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)を用いて計測し、1mg/mlになるようにHEPES緩衝液で希釈した。
反応液に加えて反応を開始した。酵素反応液は30℃で反応を行い、0分および30分後に1mlの酢酸エチルにて反応を停止した。さらに150μlのHEPES緩衝液と2N HCl 1.5μlを加えて、5分間激しく混和し、遠心分離(室温、5分、20000×g)を行った。二層に分離した反応液・酢酸エチル混和物の上層(酢酸エチル層)を800μl回収し、新しい1.5mlチューブに移した。
(1)ポリシストロン型発現プラスミドの構築
上記HFM145遺伝子を大腸菌 JM109株、大腸菌 JM109(DE3)株や大腸菌 BL21(DE3)株で遺伝子の転写・翻訳効率に依存しない効率よい発現を行うために、目的遺伝子の転写は疑似遺伝子に依存し、疑似遺伝子の翻訳効率を維持した状態で目的遺伝子も翻訳される発現系の構築を行った。より具体的にはT7プロモーター配列と疑似遺伝子及び目的遺伝子をHindIII部位とSphI部位を介してpUC19プラスミドDNA内に挿入するために、配列番号29〜32で表される4本の合成DNAを合成した。これら合成DNAをpUC19(タカラバイオ(株)社製)のHindIII部位とSphI部位の間に挿入し、発現ベクターpUTCH19を構築した。
シュードモナス・エルギノーサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子塩基配列データ(NC_002516)をNCBIのGenBankデータベースよりインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のDNAをPCR法を用いてクローニングするための配列番号33で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号34で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。シュードモナス・エルギノーサPAO株の染色体DNA(ATCC番号:47085D-5)をATCCから入手し、これを鋳型として、2種のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素(タカラ・バイオ社製)を用いたPCRによりパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子のDNAを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ(タカラ・バイオ社製)による3'末端にA残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的DNAを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素蛋白質HFM300をコードするDNAを運ぶプラスミドpT7Blue_HFM300を造成した。pT7Blue_HFM300から制限酵素HindIIIと制限酵素 XbaIにより各酵素蛋白質をコードするDNAを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM300を造成した。
、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM300Y385Fを造成した。
実施例1の結果から、酵素蛋白質HFM145を発現する形質転換株の培養抽出液を用いたときに、良好な没食子酸の生成が観察された。そこで、酵素蛋白質HFM145を効率よく発現するプラスミドの構築を行った。上記プラスミドpROX_HFM145から生産される酵素蛋白質HFM145は、いずれもC末端に10アミノ酸のペプチド(Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His(配列番号28))が付加されている。これらペプチドを除去した酵素蛋白質を発現するプラスミドを構築するために、配列番号37と38に示す2種類のPCRプライマーを設計し、合成した。
これまでにプロトカテク酸から没食子酸を生成する活性を持つことが証明された酵素は、酵素蛋白質HFM300の385番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異酵素蛋白質HFM300Y385Fのみであった。そこで、酵素蛋白質HFM145の385番目のチロシンをフェニルアランニンに置換した変異酵素蛋白質HFM145Y385Fを発現するプラスミドを上記で述べた方法と同様の方法により構築した。
プラスミドpUTCH_HFM300、pUTCH_HFM145およびpUTCH_HFM145Y385Fをそれぞれ大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM145およびJM109/pUTCH_HFM145Y385Fを造成した。これら形質転換体を、lacプロモーター誘導発現用培地であるオーバーナイト・エクスプレス・インスタントTB(Overnight Express Instant TB;Novagen社製;以下、OEI−TB培地と略す)を用いて、37℃で14時間培養した。集菌後、HEPES−グリシン緩衝液 0.5mlに懸濁した。この懸濁液に対して超音波破砕処理を加え、遠心した後、上清を回収して粗酵素液とした。続いて、粗酵素液の蛋白質濃度をブラッドフォード法により計測し、1mg/mlに調製した。
上記5で調製した粗酵素液の没食子酸合成酵素活性を次のようにして測定した。酵素反応は、プロトカテク酸(基質)500μM、FAD 10μM、FMN 10μM、NADH
2.5mM、NADP 2.5mM、粗酵素液68μgを含む100μlの反応液で30
℃で1時間行った。反応後、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。その結果、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM145およびJM109/pUTCH_HFM145Y385Fにおいて、それぞれ1mg蛋白質あたり、133μM、172μM、865μMの没食子酸が検出された。この活性測定結果より、各没食子酸合成酵素の活性比は下表のとおりであった。
e-PAGEL E-T1020L)のウェルにアプライし、20mAで80分間泳動した。ゲルをクマシブリリアントブルー溶液(ATTO EzStainAqua)を用いてタンパク染色を行った。蒸留水で十分に脱色し、スキャナーを用いて画像を電子的に取り込んだ。ベクターコントロールと比較して、新しく発現したタンパクの中にHFM酵素タンパクのアミノ酸配列から予想される分子量(約44kD)のシグナルが見られた。電子的に取り込んだ画像を画像処理ソフトウェアNIH ImageJ(http://www.bioarts.co.jp/~ijjp/ij/)で解析したところ、各HFM酵素タンパクの発現量はサンプル間で違いは観察されなかった。
(1)水酸化酵素HFM300の199位にアミノ酸置換を有する変異体におけるアミノ酸置換の種類
上述のように、シュードモナス・エルギノーサPAO株の水酸化酵素HFM300の385位のチロシン、またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の水酸化酵素HFM145の385位のチロシンに変異を導入することにより、没食子酸合成活性が向上することが示された。これら酵素の他のアミノ酸残基に変異を導入することにより、没食子酸合成活性を向上させることを下記のようにして試みた。具体的には、HFM300の199位のロイシン残基およびHFM145の200位のロイシン残基を他のアミノ酸残基に置換した8種類の変異体(表2に示す)を造成した。
酵素蛋白質HFM300の199位のロイシンをバリンに置換した変異酵素蛋白質HFM300_L199Vを発現するプラスミドを次のようにして構築した。酵素蛋白質HFM300をコードする塩基配列データ(配列番号1)をもとに変異酵素蛋白質HFM300_L199Vをコードする遺伝子を作製するために、配列番号41で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号42で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。水酸化酵素蛋白質HFM300をコードするDNAを運ぶプラスミドpUTCH_HFM300を鋳型として、2種のPCRプライマーとPfu酵素(ストラタジーン社製)を用いたPCRにより酵素蛋白質HFM300の199番目のロイシンをバリンに置換した変異酵素蛋白質HFM300_L199VのDNAを増幅し、タンパク発現ベクターにクローニングを行い、pUTCH_HFM300_L199Vを造成した。
(2)と同様に、配列番号43で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号44で表されるリバースPCRプライマーを用いる部位特異的変異導入PCR法により、酵素蛋白質HFM300の199番目のロイシンをグリシンに置換した変異酵素蛋白質HFM300_L199GをコードするDNAを増幅し、タンパク発現ベクターにクローニングを行い、pUTCH_HFM300__L199Gを造成した。
プラスミドpUTCH_HFM300_L199GおよびpUTCH_HFM300_L199Vをカルシウムイオンを用いる形質転換法を用いて大腸菌JM109導入することにより、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199GおよびJM109/ pUTCH_HFM300_L199Vを造成した。また、比較のためのコントロールとして、JM109/ pUTCH_HFM300も同時に実験に供した。これらの形質転換体を、lacプロモーター誘導発現用培地であるオーバーナイト・エクスプレス・インスタントTB(Overnight Express Instant TB;Novagen社製;以下、OEI−TB培地と略す)を用いて、37℃で14時間培養した。プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度100ppmになるように加えた。集菌後、HEPES−グリシン緩衝液 0.5mlに懸濁した。この懸濁液に対して超音波破砕処理を加え、遠心した後、上清を回収して粗酵素液とした。続いて、粗酵素液の蛋白質濃度をブラッドフォード法に基づいたバイオラッド(Bio-Rad)プロテイン・アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)を用いて計測し、1mg/mlになるようにHEPES緩衝液で希釈した。
上記で調製した粗酵素液の没食子酸合成酵素活性を次のようにして測定した。酵素反応は、プロトカテク酸(基質)500μM、FAD 10μM、FMN 10μM、NADH 2.5mM、NADP 2.5mM、粗酵素液68μgを含む100μlの反応液で30℃で1時間行った。反応後、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。
没食子酸合成反応は0.5mMの基質(プロトカテク酸またはパラヒドロキシ安息香酸)、0.01mM FAD、0.01mM FMN、2.5mM NADH、25mM NADPHを含むHEPES緩衝液中で100μlの反応系で行った。プロトカテク酸を基質にした場合、粗酵素68μgを反応液に加えて反応を開始した。酵素反応液は30℃で反応を行い0時間および1時間後に1mlの酢酸エチルにて反応を停止した。さらに150μlのHEPES緩衝液と2N HCl 1.5μlを加えて、5分間激しく混和し、遠心分離(室温、5分、20000×g)を行った。二層に分離した反応液・酢酸エチル混和物の上層(酢酸エチル層)を800μl回収し、新しい1.5mlチューブに移した。真空遠心乾燥機で乾燥後、10μl アセトニトリルを加え、5分間激しく混和し、さらに190μlの水で希釈し、孔径0.2μmのフィルター(Millex-LG)で濾過し、バイアル瓶に注入した。バイアル瓶はLC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)にセットし、LC−TOF型質量分析計による解析を行った。没食子酸はLC−TOF型質量分析計を用いて検出した。標品の没食子酸と比較して、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と質量分析計からの質量値を合わせて生産された没食子酸を同定した。
その結果、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199G、JM109/ pUTCH_HFM300_L199V、JM109/ pUTCH_HFM300において、それぞれ1mg蛋白質あたり・1時間当たりの活性は表3と表4のとおりであった。
(1)HFM300_L199G_Y385Fの造成
配列番号41で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号42で表されるリバースPCRプライマーを用いる部位特異的変異導入PCR法により、プラスミドpUTCH_HFM300_Y385Fを鋳型として、酵素蛋白質HFM300_Y385Fの199番目のロイシンをバリンに置換した変異酵素蛋白質HFM300_L199V_Y385FをコードするDNAを増幅し、タンパク発現ベクターにクローニングを行い、pUTCH_HFM300_L199V_Y385Fを造成した。
プラスミドpUTCH_HFM300_Y385Fを鋳型として、配列番号43で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号44で表されるリバースPCRプライマーを用いる部位特異的変異導入PCR法により、酵素蛋白質HFM300_Y385Fの199番目のロイシンをグリシンに置換した変異酵素蛋白質HFM300_L199G_Y385FをコードするDNAを増幅し、タンパク発現ベクターにクローニングを行い、pUTCH_HFM300_L199G_Y385Fを造成した。
同様に、配列番号45で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号46で表されるリバースPCRプライマーを用いる部位特異的変異導入PCR法により、プラスミドpUTCH_HFM300_L199Vを鋳型として、酵素蛋白質HFM300_Y385Fの385番目のチロシンをアラニンに置換した変異酵素蛋白質HFM300_L199V_Y385AをコードするDNAを増幅し、タンパク発現ベクターにクローニングを行い、pUTCH_HFM300_L199V_Y385Aを造成した。
同様に、配列番号45で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号46で表されるリバースPCRプライマーを用いる部位特異的変異導入PCR法により、プラスミドpUTCH_HFM300_L199Gを鋳型として、酵素蛋白質HFM300_L199Gの385番目のチロシンをアラニンに置換した変異酵素蛋白質HFM300_L199G_Y385AをコードするDNAを増幅し、タンパク発現ベクターにクローニングを行い、pUTCH_HFM300_L199G_Y385Aを造成した。
同様に、配列番号47で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号48で表されるリバースPCRプライマーを用いる部位特異的変異導入PCR法により、プラスミドpUTCH_HFM300_L199Vを鋳型として、酵素蛋白質HFM300_L199Vの385番目のチロシンをバリンに置換した変異酵素蛋白質HFM300_L199V_Y385VをコードするDNAを増幅し、タンパク発現ベクターにクローニングを行い、pUTCH_HFM300_L199V_Y385Vを造成した。
プラスミドpUTCH_HFM300_L199V_Y385F、pUTCH_HFM300_L199G_Y385F、pUTCH_HFM300_L199V_Y385A、pUTCH_HFM300_L199G_Y385AおよびpUTCH_HFM300_L199V_Y385をそれぞれ大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199V_Y385F、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199G_Y385F、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199V_Y385A、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199G_Y385Aおよび組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199V_Y385を造成した。また、比較のためのコントロールとして、JM109/ pUTCH_HFM300も同時に実験に供した。これらの形質転換体をlacプロモーター誘導発現用培地であるオーバーナイト・エクスプレス・インスタントTB(Overnight Express Instant TB;Novagen社製;以下、OEI−TB培地と略す)を用いて、37℃で14時間培養した。集菌後、HEPES−グリシン緩衝液 0.5mlに懸濁した。この懸濁液に対して超音波破砕処理を加え、遠心した後、上清を回収して粗酵素液とした。続いて、粗酵素液の蛋白質濃度をブラッドフォード法により計測し、1mg/mlに調製した。
上記(6)で調製した粗酵素液の没食子酸合成酵素活性を次のようにして測定した。酵素反応は、プロトカテク酸(基質)500μM、FAD 10μM、FMN 10μM、NADH 2.5mM、NADP 2.5mM、粗酵素液68μgを含む100μlの反応液で30℃で1時間行った。反応後、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。その結果、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199V_Y385F、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199G_Y385F、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199V_Y385A、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199G_Y385A、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM300_L199V_Y385、JM109/ pUTCH_HFM300において、それぞれ1mg蛋白質あたりの活性は表6と表7のとおりであった。
(1)二重変異酵素蛋白質HFM145_L200V_Y385Fを発現するプラスミドの造成
酵素蛋白質HFM300の二重変異導入によって、プロトカテク酸から没食子酸を生成する活性が大幅に増加することが明らかになったので、同様にHFM300の385位のチロシンに相当するHFM145の385位のチロシンをフェニルアラニンに変換し、かつHFM300の199位のロイシンに相当するHFM145の200位のロイシンをバリンに変換した二重変異導入酵素
の作製を以下のようにして行った。
まず、配列番号49と配列番号50に示す2種類のPCRプライマーを設計し、合成した。これらPCRプライマーとPrimeSTAR酵素(タカラ・バイオ社製)を用いた部位特異的変異導入PCR法によりpUTCH_HFM145_Y385FのプラスミドDNAを鋳型として、変異酵素蛋白質HFM145_Y385Fの200番目のロイシンをバリンに置換した二重変異導入酵素蛋白質HFM145_L200V_Y385FをコードするDNAを増幅し、タンパク発現ベクターにクローニングを行い、pUTCH_HFM145_L200V_Y385Fを造成した。
プラスミドpUTCH_HFM145_L200V_Y385Fを大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/ pUTCH_HFM145_L200V_Y385Fを造成した。また、比較のためにJM109/ pUTCH_HFM300及びJM109/pUTCH_HFM145_Y385Fも同時に実験に供した。これらの形質転換体を、OEI−TB培地を用いて、37℃で14時間培養した。集菌後、HEPES−グリシン緩衝液 0.5mlに懸濁した。この懸濁液に対して超音波破砕処理を加え、遠心した後、上清を回収して粗酵素液とした。続いて、粗酵素液の蛋白質濃度をブラッドフォード法により計測し、1mg/mlに調製した。
上記で調製した粗酵素液の没食子酸合成酵素活性を次のようにして測定した。酵素反応は、プロトカテク酸(基質)500μM、FAD 10μM、FMN 10μM、NADH 2.5mM、NADP 2.5mM、粗酵素液68μgを含む100μlの反応液で30℃で1時間行った。反応後、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。その結果、組換え大腸菌JM109/ HFM145_Y385F及び組換え大腸菌JM109/ HFM145_L200V_Y385F、JM109/ pUTCH_HFM300において、それぞれ1mg蛋白質あたりの活性は表9のとおりであった。
ロドコッカス属(Rhodococcus sp.)RHA1株のテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ酵素遺伝子の塩基配列データ(NC_008268、NC_008269、NC_008270、NC_008271)を
NCBIのGenBankデータベースよりインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のDNAをPCR法を用いてクローニングするための配列番号51で表されるフォワードPCRプライマーおよび配列番号52で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。Rhodococcus sp. RHA1株の染色体DNAを鋳型として、2種のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素(タカラ・バイオ社製)を用いたPCRによりテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ酵素遺伝子のDNAを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ(タカラ・バイオ社製)による3'末端にA残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的DNAを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼをコードするDNAを運ぶプラスミドpT7Blue_TPACB1を造成した。pT7Blue_TPACB1から制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIにより各酵素蛋白質をコードするDNAを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_TPACB1を造成した。
なお、Rhodococcus sp. RHA1株は長岡科学技術大学の福田雅夫博士より分与を受け、同博士から教授された方法に従って培養した。培養菌体から染色体DNAをディーエヌイージー・ティシュ・キット(キアゲン社製(DNeasy tissue kit;Qiagen)を用いて単離精製した。
pUTCH_TPACB1とpRTCH_HFM145_Y385F、pUTCH_TPACB1とpRTCH_HFM145_L200V_Y385F、pUTCH_TPACB1とpRTCH_HFM300、またはpUTCH_TPACB1とpRTCH_HFM300_Y385Fを用いて大腸菌JM109(DE3)を形質転換し、組換え大腸菌JM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)、JM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_L200V_Y385F)、JM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM300)、およびJM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM300_Y385F)を得た。
得られた組換え大腸菌JM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)、JM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_L200V_Y385F)、JM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM300)、およびJM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM300_Y385F)を5mlのOEI−TB培地を用いて37℃で16時間培養した。集菌後、LB培地(カナマイシン50ppm、アンピシリン100ppm、 IPTG 1mM、pH5.95)3mlに懸濁し、25℃で4時間培養した。菌懸濁液500μlを取り、1.5mlチューブに移した。テレフタル酸を終濃度1mMになるように添加した。0、2、20時間に菌懸濁液から100μlとり、1mlの酢酸エチル、150μLのHEPES緩衝液 5μlの2N HClを加え、激しく5分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層(酢酸エチル層)を800μlとり、新しい1.5mMチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを10μLのアセトニトリルで激しく懸濁し、190μLの水で希釈した。孔径0.2μmのフィルターで濾過し、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)で解析した。
Claims (19)
- 以下の(A)または(B)に記載の蛋白質を発現する微生物を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする没食子酸の製造方法。
(A)配列番号2もしくは配列番号2と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において199位のロイシンが他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。
(B)配列番号22もしくは配列番号22と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において200位のロイシンが他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性を有する蛋白質。 - 199位のロイシンまたは200位のロイシンを置換するアミノ酸がバリンまたはグリシンである、請求項1に記載の没食子酸の製造方法。
- 配列番号2もしくは配列番号2と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列において、さらに、385位のチロシンが他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする、請求項1または2に記載の没食子酸の製造方法。
- 385位のチロシンを置換するアミノ酸がフェニルアラニン、バリンまたはアラニンである、請求項3に記載の没食子酸の製造方法。
- 前記蛋白質が、配列番号6、8、10、12、14、16、18または24で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の没食子酸の製造方法。
- 前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびプロトカテク酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の没食子酸の製造法。
- 前記微生物がさらにテレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をテレフタル酸を含有する培地中でテレフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の没食子酸の製造方法。
- 前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびテレフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項7に記載の没食子酸の製造法。
- 前記微生物がさらにフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の没食子酸の製造方法。
- 前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項9に記載の没食子酸の製造法。
- 前記微生物がさらにイソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をイソフタル酸を含有する培地中でイソフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の没食子酸の製造方法。
- 前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびイソフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項11に記載の没食子酸の製造法。
- 前記微生物がさらにパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地中でパラヒドロキシ安息香酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の没食子酸の製造方法。
- 前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびパラヒドロキシ安息香酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項13に記載の没食子酸の製造法。
- テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするDNAを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項7または8記載の没食子酸の製造方法。
- フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするDNAを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項9または10記載の没食子酸の製造方法。
- イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするDNAを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項11または12記載の没食子酸の製造方法。
- 前記微生物が、前記(A)または(B)の蛋白質をコードするDNAが導入された微生物であることを特徴とする、請求項1から17のいずれか1項に記載の没食子酸の製造法。
- 微生物がエシェリヒア(Escherichia)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、シノリゾビウム(Sinorhizobium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、ノボスフィンゴビウム(Novosphingobium)属またはラルストニア(Ralstonia)属に属する微生物であることを特徴とする、請求項1から18のいずれか1項に記載の製造法。
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