WO2021241508A1 - 没食子酸生産能を有する形質転換体 - Google Patents
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
Definitions
- the present invention relates to a transformant having an ability to produce gallic acid, and a method for producing gallic acid or a salt thereof using the transformant.
- Gallic acid has a strong reducing property, so it is used as a developing agent for photographs and as a raw material for manufacturing blue ink.
- esters such as propyl gallate are used as antioxidants for fats and oils and butter.
- pyrogallol synthesized by decarboxylating gallic acid is used as an electronic material, an organic synthetic reagent, a photographic developer, a medium dye for woolen fabrics and the like.
- Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-213392
- Patent Document 2 US Pat. No. 6,472,190.
- the present invention relates to the following 1) and 2).
- 1) (A) Polypeptide having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity, (B) Polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid synthase activity, and (C) Polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity.
- 2) A method for producing gallic acid or a salt thereof, which comprises a step of culturing the transformant of 1) in the presence of a saccharide.
- the present invention relates to a transformant capable of producing gallic acid or a salt thereof using a saccharide as a raw material, and a method for producing gallic acid or a salt thereof using the transformant.
- gallic acid or a salt thereof can be produced in large quantities at low cost by a fermentation method having a low environmental load. Further, in the transformant of the present invention, each metabolic reaction from chorismic acid is not inhibited and is auxotrophic. Therefore, it is necessary to add aromatic amino acids and aromatic vitamins when culturing the transformant. There is no.
- the identity of the amino acid sequence or the nucleotide sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, the genetic information processing software GENETYX Ver. It is calculated by performing analysis with Unit size to homology (ktup) as 2 using 12 homology analysis (Search homology) programs.
- "at least 90% identity" with respect to an amino acid sequence or nucleotide sequence is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98. % Or more, more preferably 99% or more.
- amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added, or inserted means 1 or more and 10 or less, preferably 1 or more and 8 or less, and more preferably one.
- nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted is defined as 1 or more and 30 or less, preferably 1 or more and 24 or less, and more preferably 1.
- nucleotide sequence in which 15 or more, more preferably 1 or more and 9 or less nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted.
- addition of an amino acid or nucleotide includes addition of the amino acid or nucleotide to one end and both ends of the sequence.
- operable linkage between a control region and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region.
- Procedures for "operable linkage" between genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
- the term "original” used for a cell function, property, or trait is used to indicate that the function, property, or trait exists in the wild type of the cell.
- the term “foreign” is used to describe a function, property, or trait that is not originally present in the cell but is introduced from the outside.
- a “foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide introduced externally into a cell.
- the foreign gene or polynucleotide may be of the same species as the cell into which it was introduced or of a heterologous organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
- gallic acid means 3,4,5-trihydroxybenzoic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid), and as a salt of gallic acid, for example, as such a salt, for example.
- examples thereof include salts with alkali metals such as sodium and potassium, and salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium.
- the transformant having the ability to produce gallic acid or a salt thereof is (A) a polypeptide having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity, and (B) a poly having 3-hydroxybenzoic acid synthase activity. It is a microbial cell in which the expression of the peptide and the polypeptide having (C) 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity is enhanced. That is, in the transformant of the present invention, a route for returning chorismic acid, which is the final metabolite of the shikimate pathway, to protocatechuic acid is introduced, and gallic acid is produced from the protocatechuic acid (FIG. 1).
- the polypeptide having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity of (A) is a polypeptide that catalyzes the reaction of producing asbestosic acid from protocatechuic acid, and is shown by, for example, (A1) SEQ ID NO: 2.
- Examples thereof include a polypeptide consisting of an amino acid sequence thereof, or a polypeptide having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by (A2) SEQ ID NO: 2 and having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity. Be done.
- polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a variant of p-hydroxybenzoic acid hydroxylase (pobA) derived from Corynebacterium glutamicum, 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase. It is an active polypeptide (denoted as "pobA *" in FIG. 1).
- pobA p-hydroxybenzoic acid hydroxylase
- the polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid synthase activity of (B) is a polypeptide that catalyzes the reaction of producing 3-hydroxybenzoic acid from chorismic acid, and is, for example, the amino acid sequence shown in (B1) SEQ ID NO: 6.
- Examples thereof include a polypeptide consisting of (B2), an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and a polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid synthase activity.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is 3-hydroxybenzoic acid synthase derived from Streptomyces hygroscopicus and is known as "hyg5".
- the polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity of (C) is a polypeptide that catalyzes the reaction of producing protocatechuic acid from 3-hydroxybenzoic acid, and is, for example, the amino acid represented by (C1) SEQ ID NO: 8. Examples thereof include a polypeptide consisting of a sequence, or (C2) a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase derived from Comamonas testosteroni and is known as "mobA".
- the transformant of the present invention can further enhance the expression of the polypeptide having (D) 3-dehydroshikimic acid dehydratase activity from the viewpoint of increasing the production amount of gallic acid or a salt thereof.
- the polypeptide having 3-dehydroshikimic acid dehydratase activity of (D) is a polypeptide that catalyzes the reaction of producing protocatechuic acid from 3-dehydroshikimic acid, and is, for example, the amino acid sequence shown in (D1) SEQ ID NO: 10.
- Examples thereof include a polypeptide consisting of (D2), a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, and having 3-dehydroshikimic acid dehydratase activity.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is 3-dehydroshikimate dehydratase derived from Corynebacterium glutamicum, and is known as "qsuB".
- the transformant of the present invention further comprises a polypeptide having (E) 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP) synthase activity, and (F) a polypeptide having 3-dehydroquinate dehydratase activity. And (G) can enhance the expression of at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having transketolase activity.
- the polypeptide having DAHP synthase activity of (E) is a polypeptide that produces DAHP, which is the primary metabolite of the aromatic compound biosynthetic pathway, from erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate, for example.
- (E1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, or (E2) consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14.
- a polypeptide having DAHP synthase activity is a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 is a DAHP synthase derived from Corynebacterium glutamicum and is known as "aroF”.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 is a DAHP synthase derived from Corynebacterium glutamicum and is known as "aroG”.
- the polypeptide having 3-dehydroquinic acid dehydratase activity of (F) is a polypeptide that catalyzes the conversion of 3-dehydroquinic acid to 3-dehydroshikimic acid, and is, for example, the amino acid sequence shown in (F1) SEQ ID NO: 16.
- Examples thereof include a polypeptide consisting of, or a polypeptide consisting of (F2) an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 and having 3-dehydroquinic acid dehydratase activity.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 is 3-dehydroquinic acid dehydratase derived from Corynebacterium glutamicum and is known as "aroD".
- the polypeptide having transketolase activity of (G) has an activity of catalyzing two kinds of reactions.
- the first reaction was the conversion of D-xylulose-5-phosphate to glyceraldehyde-3-phosphate in the non-oxidizing pentose-phosphate pathway and D-ribose-5-phosphate (R5P).
- R5P D-ribose-5-phosphate
- the second reaction was the conversion of D-fructose-6-phosphate (F6P) to erythrose-4-phosphate (E4P) and the conversion of glyceraldehyde-3-phosphate to D-xylulose-5.
- F6P D-fructose-6-phosphate
- E4P erythrose-4-phosphate
- glyceraldehyde-3-phosphate D-xylulose-5.
- -A reaction that catalyzes the conversion to phosphoric acid.
- the polypeptide having transketolase activity includes, for example, a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by (G1) SEQ ID NO: 18 or at least 90% identity with the amino acid sequence represented by (G2) SEQ ID NO: 18. Examples thereof include polypeptides having an amino acid sequence and having transketolase activity.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 is a transketolase derived from Coryne
- amino acid sequences having at least 90% identity with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16 and 18 include SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12.
- polypeptide having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 of (A2) and having 3,4-dihydroxybenzoate hydroxylase activity are derived from bacteria of the genus Corinebacterium.
- polypeptide having 3,4-dihydroxybenzoate hydroxylase activity specifically, 4-hydroxybenzoate-3-monooxygenase derived from corynebacterium glutamicum, derived from corynebacterium suranareeae.
- 4-Hydroxybenzoate-3-monooxygenase, 4-hydroxybenzoate-3-monooxygenase derived from Corynebacterium crudilactis, and the like can be mentioned.
- polypeptide having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in (B2) and having 3-hydroxybenzoic acid synthase activity examples include 3 derived from Streptomyces bacteria. -Hydroxybenzoate synthase can be mentioned, and specific examples thereof include 3-hydroxybenzoic acid synthase derived from Streptomyces hygroscoipicas, imine deaminase derived from Streptomyces malaysiensis, and the like.
- polypeptide having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 of (C2) and having 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity include 3-derived from Comamonas spp.
- examples thereof include hydroxybenzoic acid hydroxylase, specific examples thereof include 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase derived from Comamonas testosteroni, phenol-2-monooxygenase derived from Comamonas thiooxydans, and the like.
- polypeptide having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in (D2) and having 3-dehydroshikimate dehydratase activity examples include 3 derived from Corynebacterium spp. -Dehydroshikimate dehydratase is mentioned, and specific examples thereof include 3-dehydroshikimate dehydratase derived from Corynebacterium glutamicum and 3-dehydroshikimate dehydratase derived from Corynebacterium slanaleae.
- Examples of the polypeptide having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 of (E2) and having DAHP synthase activity include DAHP derived from Corynebacterium spp. Examples thereof include DAHP synthase derived from Corynebacterium glutamicum, DAHP synthase derived from Corynebacterium slanaleae, DAHP synthase derived from Corynebacterium efficiens, and the like.
- Examples of the polypeptide having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 of (F2) and having 3-dehydroquinic acid dehydratase activity include 3-derived from Corynebacterium spp. Examples thereof include dehydroquinic acid dehydratase, specifically, 3-dehydroquinic acid dehydratase derived from Corynebacterium glutamicum, 3-dehydroquinic acid dehydratase derived from Corynebacterium kurdilactis, 3-dehydroquinic acid dehydratase derived from Corynebacterium deserti, and the like. Can be mentioned.
- Examples of the polypeptide having a transketolase activity having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 of (G2) include transketolase derived from Corynebacterium spp. Specific examples thereof include transketolase derived from Corynebacterium glutamicum, transketolase derived from Corynebacterium kurdiractis, and transketolase derived from Corynebacterium slanaleae.
- a method for introducing a mutation such as an amino acid deletion, substitution, addition, or insertion into the amino acid sequence of the polypeptide for example, a nucleotide deletion or substitution in the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence
- examples thereof include a method of introducing a mutation such as addition or insertion.
- a method for introducing a mutation into a nucleotide sequence for example, a chemical mutagen such as ethylmethanesulfonate, N-methyl-N-nitrosoguanidine, or nitrite, or a physical mutagen such as ultraviolet rays, X-rays, gamma rays, or ion beams.
- a polypeptide having (D) 3-dehydrocymic acid dehydratase activity optionally (E) a polypeptide having DAHP synthase activity, (F) a polypeptide having 3-dehydroquinate dehydratase activity, and ( G) As a transformed cell in which the expression of at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having transketolase activity is enhanced, specifically, the polynucleotide necessary for the expression of the polypeptide is expressed.
- the cells are introduced as possible, and the polypeptide may be foreign or may be originally possessed by the cell.
- a cell introduced so that the polynucleotide can be expressed and a cell in which the degree of expression of the polynucleotide is enhanced can be mentioned.
- Specific examples thereof include cells into which a vector or DNA fragment containing a control region operably linked to the polynucleotide is introduced, cells in which the control region of the polynucleotide is replaced with a strong control region, and the like. Be done.
- polynucleotide as the polynucleotide encoding the polypeptide having (a) 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity, the following (a1) or (a2) polynucleotide, (b) 3-hydroxy As a polynucleotide encoding a polypeptide having benzoate synthase activity, the following polynucleotide (b1) or (b2), and (c) a polynucleotide encoding a polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity, as described below.
- polynucleotide encoding a polynucleotide having the following (e1) or (e2) and as a polynucleotide encoding a polynucleotide having (f) 3-dehydroquinate dehydratase activity, the following (f1) or (f2) ), and (g) the polynucleotide encoding the polypeptide having transketolase activity include the following (g1) or (g2) polynucleotides (these polynucleotides are referred to as "polynucleotides of the present invention". Also referred to as "nucleotide").
- A1 a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or (a2) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
- the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 encodes the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, but the polypeptide consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It is the same as the polypeptide.
- (B1) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, or (b2) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and exhibiting 3-hydroxybenzoic acid synthase activity.
- (C1) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, or (c2) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, and having 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity.
- (D1) Consists of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9, or (d2) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and exhibits 3-dehydroshikimate dehydratase activity.
- a polynucleotide encoding a polypeptide having. It consists of a polynucleotide consisting of (e1) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or (e2) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
- a polynucleotide encoding a polypeptide having DAHP synthase activity (F1) It consists of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, or (f2) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, and has 3-dehydroquinate dehydratase activity.
- F1 It consists of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, or (f2) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, and has 3-dehydroquinate dehydratase activity.
- G1 A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, or (g2) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and having transketorase activity.
- the polynucleotide that encodes is not limited to, but not limited to, but not limited to, but not limited to SEQ ID NO: 17, or (g2) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and having transketorase activity. The polynucleotide that encodes.
- nucleotide sequences having at least 90% identity with the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 and 17 include SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7.
- examples thereof include nucleotide sequences in which one or more nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequences represented by 9, 11, 13, 15 and 17.
- the method for introducing a mutation such as a nucleotide deletion, substitution, addition, or insertion into a nucleotide sequence is as described above.
- the polynucleotide may be in the form of a single or double strand, or may be DNA or RNA.
- the DNA can be artificial DNA such as cDNA or chemically synthesized DNA.
- the above polynucleotide may be incorporated into a vector.
- the vector containing the polynucleotide of the invention is an expression vector.
- the vector is an expression vector capable of introducing the polynucleotide of the present invention into a host microorganism and expressing the polynucleotide in the host microorganism.
- the vector comprises the polynucleotide of the invention and a control region operably linked thereto.
- the vector may be a vector that can grow and replicate independently outside the chromosome, such as a plasmid, or may be a vector that is integrated into the chromosome.
- the vector examples include pUC-based vectors (Takarabio), pET-based vectors (Takarabio), pGEX-based vectors such as pBluescript II SK (-) (Stratagene), pUC18 / 19, pUC118 / 119, etc. GE Healthcare), pCold vector (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 (Mckenzie, T.
- the above-mentioned polynucleotide may be constructed as a DNA fragment containing it.
- the DNA fragment include a PCR amplified DNA fragment and a restriction enzyme cleavage DNA fragment.
- the DNA fragment can be an expression cassette containing the polynucleotide of the invention and a control region operably linked thereto.
- the control region contained in the vector or DNA fragment is a sequence for expressing the polynucleotide of the present invention in the host cell into which the vector or DNA fragment has been introduced, and is, for example, an expression control region such as a promoter or a terminator, or replication.
- the starting point and the like can be mentioned.
- the type of the control region can be appropriately selected depending on the type of the host microorganism into which the vector or DNA fragment is introduced. If necessary, the vector or DNA fragment may further carry a selectable marker such as an antibiotic resistance gene or an amino acid synthesis-related gene.
- Transformed cells into which the target vector or DNA fragment has been introduced can be selected using a selectable marker.
- a selectable marker is an antibiotic resistance gene
- cells into which the desired vector or DNA fragment has been introduced can be selected by culturing in the antibiotic-added medium.
- the selectable marker is an amino acid synthesis-related gene
- the cell into which the target vector or DNA fragment is introduced is selected using the presence or absence of the amino acid-requiring as an index. can do.
- the introduction of the target vector or DNA fragment can be confirmed by examining the DNA sequence of the transformed cells by PCR or the like.
- examples of the strong control region include, but are not limited to, T7 promoter, lac promoter, tac promoter, trp promoter, tu promoter, gap promoter and the like, which are known high expression promoters.
- a prokaryotic inducible promoter can be used as the strong control region, which is induced by the addition of the vanA promoter, resorcinol or 2,4-dihydroxybenzoic acid, which is induced by the addition of ferulic acid, vanillic acid or vanillin.
- the rhcH promoter, the pcaI promoter induced by the addition of 4-hydroxybenzoic acid, the promoter of the nagI (cg3351) gene induced by the addition of 3-hydroxybenzoic acid, and the benA (cg2637) gene induced by the addition of benzoic acid examples thereof include a promoter (hereinafter abbreviated as Pben), a promoter of the cg2118 gene or a promoter of the ptsS (cg2925) gene, which is induced by the addition of either fructose or sucrose, but the present invention is not particularly limited thereto.
- a DNA fragment containing the strong control region and the polynucleotide sequence of the selectable marker is introduced into the host cell, and homologous recombination or homologous recombination or Examples thereof include a method of selecting cells transformed by non-homologous recombination or the like.
- the host cells are Escherichia coli, bacillus, actinomycetes, Pseudomonas spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Fungi (Neurospora spp., Aspergillus spp.) , Trichoderma genus, etc.), yeast (Saccharomyces genus, Cryberomyces genus, Sizosaccalomyces genus, Yarrowia genus, Tricosporon genus, Rhodospolidium genus, Pikia genus, Candida genus, etc.), etc. , Radius fungi are preferred.
- coryneform bacteria As actinomycetes, a group of microorganisms defined as coryneform bacteria (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974)) are preferable, and specifically, Corynebacterium spp. And Brevibacterium spp. Examples thereof include fungi, Earthrobacter spp., Mycobacteria spp., Rhodococcus spp., Streptomyces spp., Micrococcus spp.
- Corynebacterium genus includes Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, and Corynebacterium alkano. Examples include Corynebacterium alkanolyticum. Examples of the genus Brevibacterium include Brevibacterium ammoniagenes. Examples of the genus Arthrobacter include Arthrobacter globiformis. Examples of Micrococcus spp. Examples include Micrococcus bovis, and Micrococcus spp. Examples include Micrococcus freudenreichii, Micrococcus leuteus, Micrococcus ureae, and Micrococcus ureae. Examples include Micrococcus roseus. Among the coryneform bacteria, Corynebacterium spp. Is preferable, and Corynebacterium glutamicum is more preferable.
- coryneform bacterium may be a mutant strain thereof or an artificial genetically modified organism in addition to the wild strain.
- gene disruption strains such as lactate dehydrogenase (LDH), phosphoenolpyruvate carboxylase, and malate dehydrogenase.
- the method for producing gallic acid or a salt thereof of the present invention is carried out by culturing the above-mentioned transformed cells in the presence of saccharides.
- Glucose is preferable as the saccharide, but monosaccharides such as fructose, mannose, arabinose, xylose, and galactose, as well as saccharides capable of producing glucose by metabolism can also be used.
- Such saccharides include oligosaccharides having glucose units or polysaccharides, and disaccharides such as cellobiose, sucrose (sucrose), lactose, maltose, trehalose, cellobiose, xylobiose; polysaccharides such as dextrin or soluble starch, etc. Can be mentioned. Further, for example, molasses can also be used as a raw material containing these raw material compounds.
- non-edible agricultural waste such as straw (rice straw, barley straw, wheat straw, rye straw, oat straw, etc.), bagasse, corn stover, energy crops such as switchgrass, napier grass, miscanthus, and wood chips.
- a saccharified solution containing a plurality of sugars such as glucose obtained by saccharifying used paper or the like with a saccharifying enzyme or the like can also be used.
- the medium for culturing the transformed cells is either a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. and can efficiently culture the transformed cells of the present invention. May be used.
- the carbon source the above-mentioned saccharides or sugar honeys and saccharified liquids containing them are used, but in addition to the above-mentioned saccharides, sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol and glycerin; acetic acid, citric acid, lactic acid and fumaric acid.
- the concentration of the saccharide as a raw material compound in the culture solution is preferably 1 to 20 w / v%, more preferably 2 to 10 w / v%, still more preferably 2 to 5 w / v%.
- nitrogen source examples include peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean lees alkaline extract, alkylamines such as methylamine, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, ammonia or a salt thereof (ammonium chloride,).
- alkylamines such as methylamine
- nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, ammonia or a salt thereof (ammonium chloride,).
- Inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium acetate), urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
- inorganic salts examples include primary potassium phosphate, secondary potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, calcium carbonate and the like.
- vitamins, antifoaming agents and the like can be added as needed. Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
- a medium [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004)], BT medium [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)], Examples thereof include CGXII medium [Patent No. 6322576], and in these media, the saccharide concentration may be set within the above range.
- the transformant Prior to the reaction or culture containing saccharides, it is preferable to culture the transformant in the same medium under aerobic conditions at a temperature of about 25 to 38 ° C. for about 12 to 48 hours to grow.
- the culture temperature or reaction temperature is preferably 15 to 45 ° C, more preferably 25 to 37 ° C.
- the culture or reaction time can be 24 hours to 168 hours, preferably 24 hours to 96 hours, more preferably 24 hours to 72 hours, with stirring or shaking as necessary.
- antibiotics such as ampicillin and kanamycin may be added to the medium during culturing as needed.
- the culture may be a batch type, a fed-batch type, or a continuous type. Of these, the batch type is preferable.
- the culture or reaction may be carried out under aerobic conditions or under reducing conditions, but it is preferably carried out under aerobic conditions.
- the reaction or culture When the reaction or culture is carried out under aerobic conditions, it is preferable to carry out the reaction or culture under conditions that suppress the excessive growth of the transformant from the viewpoint of the production efficiency of gallic acid or a salt thereof.
- the dissolved oxygen concentration In order to prevent the oxidation of gallic acid, it is preferable to culture under the condition that the dissolved oxygen concentration is low.
- the dissolved oxygen concentration is preferably 0.1 to 3 ppm, more preferably 0.1 to 1 ppm.
- the method for recovering and purifying gallic acid or a salt thereof from the culture is not particularly limited. That is, it can be carried out by combining a well-known ion exchange resin method, precipitation method, crystallization method, recrystallization method, concentration method and other methods.
- gallic acid or a salt thereof can be obtained by removing the bacterial cells by centrifugation or the like, removing the ionic substance with a cation and anion exchange resin, and concentrating the cells.
- Gallic acid or a salt thereof accumulated in the culture may be used as it is without isolation.
- the transformant according to ⁇ 1> which contains a polynucleotide encoding a peptide in an expressible state.
- the polypeptide having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity is the polypeptide represented by the following (A1) or (A2), and the polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid synthase activity is the following (A1) or (A2).
- B1 The polypeptide represented by B1) or (B2), wherein the polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity is the polypeptide represented by the following (C1) or (C2), according to ⁇ 2>. Peptide.
- A1 Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (A2) Polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity.
- B1 Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (B2) Polypeptide consisting of a peptide sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and 3-hydroxybenzoate synthase.
- Active polypeptide (C1) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 (C2) Polypeptide consisting of a peptide sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, 3-hydroxybenzoic acid Polypeptide having hydroxylase activity ⁇ 4> 3,4-Dihydroxybenzoic acid
- the polypeptide encoding the polypeptide having hydroxylase activity is the polynucleotide represented by the following (a1) or (a2), and is 3-hydroxy.
- the polynucleotide encoding a polypeptide having benzoate synthase activity is the polypeptide represented by (b1) or (b2) below, and the polynucleotide encoding a polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid hydroxylase activity is described below.
- the transformant according to ⁇ 2> which is the polypeptide represented by (c1) or (c2).
- A1 Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 (a2) Consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, 3, A polynucleotide encoding a polypeptide having 4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity (b1) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 (b2) At least 90% identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
- Nucleotide consisting of a nucleotide sequence comprising (c1) a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a polynucleotide encoding a polypeptide having 3-hydroxybenzoic acid synthase activity (c2) and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7.
- (D) a polypeptide having 3-dehydroshikimic acid dehydratase activity a polypeptide having 3-dehydroshikimic acid dehydratase activity.
- ⁇ 6> The transformant according to ⁇ 5>, which contains (D) a polynucleotide encoding a polypeptide having 3-dehydroshikimate dehydratase activity in an expressible state.
- ⁇ 7> The transformant according to ⁇ 6>, wherein the polypeptide having (D) 3-dehydroshikimate dehydratase activity is the polypeptide represented by the following (D1) or (D2).
- Polynucleotide encoding the peptide ⁇ 9> (E) a polypeptide having 3-deoxy-D-arabino-hepturosonate-7-phosphate synthase activity, (F) a polypeptide having 3-dehydroquinate dehydratase activity, and ( G) The transformant according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the expression of at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having transketolase activity is enhanced.
- the polypeptide represented by (F1) or (F2) below, and the polypeptide having transketolase activity is the polypeptide represented by (G1) or (G2) below, according to ⁇ 10>.
- Transketolase. (E1) Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 (E2) DAHP synthase consisting of a peptide sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14.
- Active Polypeptide F1 Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (F2) Polypeptide consisting of a peptide sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 and 3-dehydroquinate dehydratase.
- Active polypeptide G1 Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (G2) Polypeptide sequence consisting of a polypeptide sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 and transketolase activity.
- the polynucleotide encoding a polypeptide having 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase activity is the polynucleotide represented by the following (e1) or (e2).
- the polynucleotide encoding a polypeptide having 3-dehydroquinate dehydratase activity is the polynucleotide represented by the following (f1) or (f2), and the polynucleotide encoding a polypeptide having transketolase activity is described below (f1) or (f2).
- the transformant according to ⁇ 10> which is the polynucleotide represented by g1) or (g2).
- E1 Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13
- DAHP synthase consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
- a polynucleotide encoding an active polypeptide (f1) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 (f2) A nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
- a polynucleotide encoding a polypeptide having 3-dehydroquinate dehydratase activity (g1) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 (g2) Having at least 90% identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
- ⁇ 14> The transformant according to ⁇ 13>, wherein the coryneform bacterium is a Corynebacterium genus bacterium.
- ⁇ 15> The transformant according to ⁇ 14>, wherein the bacterium belonging to the genus Corynebacterium is Corynebacterium glutamicum.
- Example 1 Production of asbestosic acid (1) Preparation of a polypeptide-introduced transformant having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity 1) Polypeptide having a cg0620 gene region with 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity Construction of plasmid for replacement with gene The 5'side upstream region (SEQ ID NO: 19) of the cg0620 gene region was amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOs: 20 and 21), and the 3'side downstream of the cg0620 gene region. The region (base number 22) was amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOs: 23 and 24) to obtain a DNA fragment.
- SEQ ID NO: 19 The 5'side upstream region (SEQ ID NO: 19) of the cg0620 gene region was amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOs: 20 and 21), and the 3'side downstream of the cg0620 gene region.
- a DNA fragment (SEQ ID NO: 25) containing the promoter (hereinafter referred to as tu promoter) of the tuf gene (cg0587) possessed by the corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain was prepared by artificial gene synthesis, and two types of DNA primers (SEQ ID NO: 25) were prepared. Amplification was performed with SEQ ID NOs: 26 and 27) to obtain a DNA fragment.
- two types of DNA fragments (SEQ ID NOs: 28 and 29) containing a polypeptide gene having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity hereinafter abbreviated as hfm145VF
- Each DNA fragment was used as a template and amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOs: 30 and 31 and 32 and 33) to obtain two types of DNA fragments. Further, using pHKPsacB1 (which is referred to by Japanese Patent Application No. 2014-523757) as a template, amplification with two kinds of DNA primers (SEQ ID NOs: 34 and 35) was performed, and DpnI (Takara Bio) was obtained for the obtained PCR product. ) was performed.
- each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to form a plasmid pHKPsacB_cg0620-.
- Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt was prepared.
- the KC148sr strain was obtained by selection for canamycin resistance.
- the KC148sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 10 g / L sodium chloride) for 24 hours, and a part of the culture medium was smeared on LB agar medium containing 20% sucrose. By culturing, KC148 strain was obtained. As expected, the KC148 strain was a double cross-type homologous recombine in which the Ptu-hfm145VF-hfm145VFop gene was introduced into the cg0620 gene region by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using the primers of SEQ ID NOs: 36 and 37. I confirmed that there was.
- a DNA fragment (SEQ ID NO: 44) of the promoter described in the prior art was prepared by artificial gene synthesis (Eurofin Genomics) and used with two types of DNA primers (SEQ ID NOs: 27 and 45). Amplification was performed to obtain a DNA fragment.
- the 3-hydroxybenzoic acid-4-hydroxylase gene was prepared by artificial gene synthesis (Eurofin Genomics) (SEQ ID NO: 46) and amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOs: 47 and 48). A DNA fragment was obtained.
- a DNA fragment (SEQ ID NO: 49) containing the 3-hydroxybenzoic acid synthase gene was prepared by artificial gene synthesis (Eurofin Genomics), amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOs: 50 and 51), and amplified. A DNA fragment was obtained. Further, pHKPsacB1 (Japanese Patent Application No. 2014-523757) was used as a template, amplified with two kinds of DNA primers (SEQ ID NOs: 34 and 35), and the obtained PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
- each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to form a plasmid pHKPsacB_cg1625-. Ptytu-movA-hyg5 was produced.
- the KC152sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 10 g / L sodium chloride) for 24 hours, and a part of the culture solution was smeared on LB agar medium containing 20% sucrose. By culturing, KC152 strain was obtained.
- the KC152 strain was a double cross-type homologous recombine in which the Ptytu-movA-hyg5 gene was introduced into the cg1625 gene region by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using the primers of SEQ ID NOs: 52 and 53. I confirmed that there was.
- a UV detector (detection wavelength 280 nm) was used to detect gallic acid.
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Abstract
糖類を原料として没食子酸又はその塩を生産可能な形質転換体、及びこの形質転換体を用いて没食子酸又はその塩を製造する方法を提供する。 （Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された没食子酸又はその塩の生産能を有する形質転換体。
Description
本発明は、没食子酸生産能を有する形質転換体、及び当該形質転換体を用いた没食子酸又はその塩の製造方法に関する。
没食子酸は、還元性が強いことから、写真の現像剤や青インクの製造原料等に使用される。また、没食子酸プロピル等のエステルは、油脂やバターの酸化防止剤として使用されている。さらに、没食子酸を脱炭酸して合成されるピロガロールは、電子材料、有機合成試薬、写真の現像液、毛織物の媒染剤等として使用されている。
従来、没食子酸の製造方法としては、茶、没食子、五倍子からの抽出法が挙げられるが、当該方法は製造コストが高いことから、工業的に安価に製造する方法が求められていた。
斯かる状況下、微生物を利用した発酵生産により、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸等の原料から没食子酸を製造する方法が報告されている（特許文献１）。
斯かる状況下、微生物を利用した発酵生産により、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸等の原料から没食子酸を製造する方法が報告されている（特許文献１）。
そして、最近では、安価な原料であるグルコースを用いて没食子酸を生産する方法が所望され、例えばエシェリヒア属細菌又はクレブシェラ属細菌に、３－デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に変換する酵素（３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ）をコードする遺伝子とプロトカテク酸を没食子酸に変換する酵素（ｐ-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いて、糖類からプロトカテク酸を経由して、没食子酸を製造する方法（特許文献２）等が報告されている。
〔特許文献１〕特開２００９－２１３３９２号公報
〔特許文献２〕米国特許第６４７２１９０号明細書
〔特許文献２〕米国特許第６４７２１９０号明細書
本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）（Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された没食子酸又はその塩の生産能を有する形質転換体。
２）１）の形質転換体を糖類の存在下で培養する工程を含む、没食子酸又はその塩の製造方法。
１）（Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された没食子酸又はその塩の生産能を有する形質転換体。
２）１）の形質転換体を糖類の存在下で培養する工程を含む、没食子酸又はその塩の製造方法。
本発明は、糖類を原料として没食子酸又はその塩を生産可能な形質転換体、及びこの形質転換体を用いて没食子酸又はその塩を製造する方法を提供することに関する。
本発明者らは、没食子酸又はその塩を効率よく生産可能な形質転換体を得るべく研究を重ねた結果、従来行われていた３－デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に変換する反応とは別に、シキミ酸経路の最終代謝産物であるコリスミ酸からプロトカテク酸へ戻す経路を導入することで、没食子酸又はその塩を効率よく生産できる形質転換体が得られることを見出した。
本発明によれば、没食子酸又はその塩を、環境負荷の少ない発酵法によって、安価かつ大量に生産することが可能となる。また、本発明の形質転換体では、コリスミ酸からの各代謝反応は阻害されておらず非栄養要求性であることから、当該形質転換体の培養に際し芳香族アミノ酸や芳香族ビタミンを添加する必要がない。
本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本発明において、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また本明細書における「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらにより好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
本発明において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本発明において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞の野生型に存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
本発明において、「没食子酸」とは、３，４，５－トリヒドロキシ安息香酸（３，４，５－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）を意味し、没食子酸の塩としては、斯かる塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩等が挙げられる。
本発明において、没食子酸又はその塩の生産能を有する形質転換体は、（Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された微生物細胞である。
すなわち、本発明の形質転換体においては、シキミ酸経路の最終代謝産物であるコリスミ酸からプロトカテク酸へ戻す経路が導入され、当該プロトカテク酸から没食子酸が生産される（図１）。
ここで、（Ａ）の３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、プロトカテク酸から没食子酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｐｏｂＡ）の変異体である３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである（図１では「ｐｏｂＡ＊」と表記）。
すなわち、本発明の形質転換体においては、シキミ酸経路の最終代謝産物であるコリスミ酸からプロトカテク酸へ戻す経路が導入され、当該プロトカテク酸から没食子酸が生産される（図１）。
ここで、（Ａ）の３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、プロトカテク酸から没食子酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｐｏｂＡ）の変異体である３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである（図１では「ｐｏｂＡ＊」と表記）。
（Ｂ）の３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、コリスミ酸から３－ヒドロキシ安息香酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ストレプトマイセス ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）由来の３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼであり、「ｈｙｇ５」として知られている。
ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ストレプトマイセス ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）由来の３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼであり、「ｈｙｇ５」として知られている。
（Ｃ）の３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、３－ヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ｃ１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｃ２）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コマモナス テストステロニ（Comamonas testosteroni）由来の３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼであり、「ｍｏｂＡ」として知られている。
ここで、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コマモナス テストステロニ（Comamonas testosteroni）由来の３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼであり、「ｍｏｂＡ」として知られている。
また、本発明の形質転換体は、没食子酸又はその塩の生産量を高める点から、さらに（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの発現を強化することができる。
（Ｄ）の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、３－デヒドロシキミ酸からプロトカテク酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ｄ１）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｄ２）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼであり、「ｑｓｕＢ」として知られている。
（Ｄ）の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、３－デヒドロシキミ酸からプロトカテク酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ｄ１）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｄ２）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼであり、「ｑｓｕＢ」として知られている。
本発明の形質転換体は、さらに、（Ｅ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ活性を有するポリペプチド、（Ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのポリペプチドの発現を強化することができる。
（Ｅ）のＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドは、エリスロース－４－リン酸及びホスホエノールピルビン酸とから、芳香族化合物生合成経路の初発代謝産物であるＤＡＨＰを生成するポリペプチドであり、例えば、（Ｅ１）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｅ２）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来のＤＡＨＰシンターゼであり、「ａｒｏＦ」として知られている。
配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来のＤＡＨＰシンターゼであり、「ａｒｏＧ」として知られている。
（Ｅ）のＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドは、エリスロース－４－リン酸及びホスホエノールピルビン酸とから、芳香族化合物生合成経路の初発代謝産物であるＤＡＨＰを生成するポリペプチドであり、例えば、（Ｅ１）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｅ２）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来のＤＡＨＰシンターゼであり、「ａｒｏＦ」として知られている。
配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来のＤＡＨＰシンターゼであり、「ａｒｏＧ」として知られている。
（Ｆ）の３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、３－デヒドロキナ酸から３－デヒドロシキミ酸への変換を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ｆ１）配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｆ２）配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼであり、「ａｒｏＤ」として知られている。
配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼであり、「ａｒｏＤ」として知られている。
（Ｇ）のトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、２種の反応を触媒する活性を有する。一つ目の反応は、非酸化的ペントース・リン酸経路において、Ｄ－キシルロース－５－リン酸からグリセルアルデヒド－３－リン酸への変換と、Ｄ－リボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）からセドヘプツロース－７－リン酸（Ｓ７Ｐ）への変換とを触媒する反応である。これらの反応は可逆的で共役している。また、二つ目の反応は、Ｄ－フルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）からエリスロース－４－リン酸（Ｅ４Ｐ）への変換と、グリセルアルデヒド－３－リン酸からＤ－キシルロース－５－リン酸への変換を触媒する反応である。これらの反応は可逆的で共役している。トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えば、（Ｇ１）配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｇ２）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来のトランスケトラーゼであり、「ｔｋｔ」として知られている。
配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来のトランスケトラーゼであり、「ｔｋｔ」として知られている。
配列番号２、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列の例としては、配列番号２、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
（Ａ２）の配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来の３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来の４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼ、コリネバクテリウム スラナレアエ（Corynebacterium suranareeae）由来の４－ヒドロキシ安息香酸-３-モノオキシゲナーゼ、コリネバクテリウム クルディラクティス（Corynebacterium crudilactis）由来の４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼ等が挙げられる。
（Ｂ２）の配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばストレプトマイセス属細菌由来の３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼが挙げられ、具体的には、ストレプトマイセス ハイグロスコイピカス由来の３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ、ストレプトマイセス マレイシエンシス（Streptomyces malaysiensis）由来のイミンデアミナーゼ等が挙げられる。
（Ｃ２）の配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコマモナス属細菌由来の３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼが挙げられ、具体的には、コマモナス テストステロニ由来の３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、コマモナス チオオキシダンス（Comamonas thiooxydans）由来のフェノール-2-モノオキシゲナーゼ等が挙げられる。
（Ｄ２）の配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、コリネバクテリウム スラナレアエ由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ等が挙げられる。
（Ｅ２）の配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来のＤＡＨＰシンターゼが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来のＤＡＨＰシンターゼ、コリネバクテリウム スラナレアエ由来のＤＡＨＰシンターゼ、コリネバクテリウム エフィシエンス由来のＤＡＨＰシンターゼ等が挙げられる。
（Ｆ２）の配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来の３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、コリネバクテリウム クルディラクティス由来の３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、コリネバクテリウム デセルティ由来の３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ等が挙げられる。
（Ｇ２）の配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来のトランスケトラーゼが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来のトランスケトラーゼ、コリネバクテリウム クルディラクティス由来のトランスケトラーゼ、コリネバクテリウム スラナレアエ由来のトランスケトラーゼ等が挙げられる。
上記ポリペプチドのアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法としては、例えば、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法が挙げられる。ヌクレオチド配列への変異導入の手法としては、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学的変異原又は紫外線、Ｘ線、ガンマ線、イオンビーム等の物理的変異原による突然変異誘発、部位特異的変異導入法、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５８１－６２１，１９９５）に記載の方法、等が挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，６１－６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１－２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｔａｎ－ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。
本発明において、上記（Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、所望により（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、所望により（Ｅ）ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチド、（Ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞としては、具体的には、当該ポリペプチドの発現に必要なポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞であって、そのポリペプチドは外来のものであっても、当該細胞が本来有しているものであっても良い。例えば、当該ポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞、当該ポリヌクレオチドの発現の程度が増強された細胞が挙げられる。具体的には、当該ポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターやＤＮＡ断片が導入された細胞や、当該ポリヌクレオチドの制御領域が強制御領域に置換された細胞等が挙げられる。
ここで、ポリヌクレオチドとしては、（ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ａ１）又は（ａ２）のポリヌクレオチド、（ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ｂ１）又は（ｂ２）のポリヌクレオチド、（ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ｃ１）又は（ｃ２）のポリヌクレオチド、（ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ｄ１）又は（ｄ２）のポリヌクレオチド、（ｅ）ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ｅ１）又は（ｅ２）のポリヌクレオチド、（ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ｆ１）又は（ｆ２）のポリヌクレオチド、（ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、下記（ｇ１）又は（ｇ２）のポリヌクレオチド、が挙げられる（これらのポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）。
（ａ１）配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ａ２）配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、ここで、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするが、当該ポリペプチドは配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一である。
（ｂ１）配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｂ２）配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｃ１）配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｃ２）配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ１）配列番号９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｄ２）配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｅ１）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｅ２）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｆ１）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｆ２）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｇ１）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｇ２）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｂ１）配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｂ２）配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｃ１）配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｃ２）配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ１）配列番号９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｄ２）配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｅ１）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｅ２）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｆ１）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｆ２）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｇ１）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は（ｇ２）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の例としては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。ヌクレオチド配列にヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法は、上述したとおりである。上記ポリヌクレオチドは、１本鎖若しくは２本鎖の形態であり得、又はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。該ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等の人工ＤＮＡであり得る。
上記ポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれていてもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物に導入することができ、かつ宿主微生物内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ １５（２）：９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１－３３１，１９８５）、ｐＡＢ４－１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１－７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５－３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７－４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７－４５１，１９９０）等が挙げられる。
また、上記ポリヌクレオチドは、これを含むＤＮＡ断片として構築されていてもよい。該ＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点等が挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカーを有していてもよい。
宿主細胞へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の宿主細胞に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された細胞を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって形質転細胞のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
また、強制御領域としては、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、tｕプロモーター、ｇａｐプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
更に、強制御領域としては原核生物由来の誘導プロモーターを用いることができ、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により誘導がかかるｖａｎＡプロモーター、レゾルシノールまたは２，４－ジヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｒｈｃＨプロモーター、４－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｐｃａＩプロモーター、３－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｎａｇＩ（ｃｇ３３５１）遺伝子のプロモーター、安息香酸の添加により誘導がかかるｂｅｎＡ（ｃｇ２６３７）遺伝子のプロモーター（以下、Ｐｂｅｎと略す）、もしくはフラクトースまたはスクロースのいずれかの添加により誘導がかかるｃｇ２１１８遺伝子のプロモーターまたはｐｔｓＳ（ｃｇ２９２５）遺伝子のプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
宿主細胞のゲノム上に存在する前記ポリヌクレオチドの制御領域を強制御領域に置換する方法としては、強制御領域と選択マーカーのポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、相同組換え又は非相同組換え等により形質転換された細胞を選択する方法等が挙げられる。
更に、強制御領域としては原核生物由来の誘導プロモーターを用いることができ、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により誘導がかかるｖａｎＡプロモーター、レゾルシノールまたは２，４－ジヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｒｈｃＨプロモーター、４－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｐｃａＩプロモーター、３－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｎａｇＩ（ｃｇ３３５１）遺伝子のプロモーター、安息香酸の添加により誘導がかかるｂｅｎＡ（ｃｇ２６３７）遺伝子のプロモーター（以下、Ｐｂｅｎと略す）、もしくはフラクトースまたはスクロースのいずれかの添加により誘導がかかるｃｇ２１１８遺伝子のプロモーターまたはｐｔｓＳ（ｃｇ２９２５）遺伝子のプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
宿主細胞のゲノム上に存在する前記ポリヌクレオチドの制御領域を強制御領域に置換する方法としては、強制御領域と選択マーカーのポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、相同組換え又は非相同組換え等により形質転換された細胞を選択する方法等が挙げられる。
本発明において、宿主細胞は、没食子酸又はその塩の生産に適するものであれば、大腸菌、枯草菌、放線菌、シュードモナス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバチルス属細菌、真菌（ノイロスポラ属、アスペルギルス属、トリコデルマ属等）、酵母（サッカロマイセス属、クライベロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、トリコスポロン属、ロドスポリジウム属、ピキア属、キャンディダ属等）等、いずれを用いてもよいが、放線菌が好ましい。
放線菌としては、コリネ型細菌として定義されている一群の微生物（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974））が好ましく、具体的には、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、マイクロコッカス属菌、等が挙げられる。
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）等が挙げられる。
アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス等が挙げられ、マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）等が挙げられる。
コリネ型細菌のうち、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム グルタミカムである。
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）等が挙げられる。
アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス等が挙げられ、マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）等が挙げられる。
コリネ型細菌のうち、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム グルタミカムである。
また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）等の遺伝子の破壊株が挙げられる。
作製された形質転換体において、（Ａ）～（Ｇ）の各酵素の活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中の各酵素活性を測定することにより確認することができる。そして、作製された形質転換細胞を培養し、没食子酸又はその塩の生産性を評価し、適切な形質転換細胞を選択することにより、有用な没食子酸又はその塩の生産株を得ることができる。生産物の測定方法は、後記参考例に記載の方法にしたがって行うことができる。
本発明の没食子酸又はその塩の製造方法は、上述した形質転換細胞を糖類の存在下で培養することにより実施される。
糖類としては、グルコースが好適であるが、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース等の単糖類の他、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれ、セロビオース、スクロース(ショ糖)、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオース等の二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉等の多糖類等が挙げられる。
また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙等を糖化酵素等で糖化した、グルコース等の複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙等を糖化酵素等で糖化した、グルコース等の複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
形質転換細胞を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の形質転換細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、上記の糖類又はそれを含む糖蜜や糖化液が用いられるが、上記の糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
培養液中の原料化合物である糖類の濃度は、１～２０ｗ／ｖ％が好ましく、２～１０ｗ／ｖ％がより好ましく、２～５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
炭素源としては、上記の糖類又はそれを含む糖蜜や糖化液が用いられるが、上記の糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
培養液中の原料化合物である糖類の濃度は、１～２０ｗ／ｖ％が好ましく、２～１０ｗ／ｖ％がより好ましく、２～５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミン等のアルキルアミン類、アミノ酸等の含窒素有機化合物、アンモニアもしくはその塩（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物）、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用することができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。
さらに、必要に応じて、ビタミン類や消泡剤等を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
さらに、必要に応じて、ビタミン類や消泡剤等を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
コリネ型細菌用培地としては、Ａ培地〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、ＢＴ培地〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕、ＣＧＸＩＩ培地〔特許第６３２２５７６号〕等が挙げられ、これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
なお、糖類を含む反応又は培養に先立ち、同様の培地で、形質転換体を好気条件下で、温度約２５～３８℃で、約１２～４８時間培養して増殖させることが好ましい。
培養温度又は反応温度は、１５～４５℃が好ましく、２５～３７℃がより好ましい。
また、培養又は反応時間は、２４時間～１６８時間、好ましくは２４時間～９６時間、より好ましくは２４時間～７２時間、必要に応じ撹拌又は振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
培養又は反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、好気的条件下で行うのが好ましい。
好気的条件下で反応又は培養を行う場合、没食子酸又はその塩の生成効率の点から、形質転換体の過度の増殖を抑制する条件下で行うのが好ましい。
没食子酸の酸化を防ぐため、培養は溶存酸素濃度が低い条件で行うことが好ましい。具体的には溶存酸素濃度が０．１～３ｐｐｍが好ましく、０．１～１ｐｐｍがより好ましい。
また、培養又は反応時間は、２４時間～１６８時間、好ましくは２４時間～９６時間、より好ましくは２４時間～７２時間、必要に応じ撹拌又は振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
培養又は反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、好気的条件下で行うのが好ましい。
好気的条件下で反応又は培養を行う場合、没食子酸又はその塩の生成効率の点から、形質転換体の過度の増殖を抑制する条件下で行うのが好ましい。
没食子酸の酸化を防ぐため、培養は溶存酸素濃度が低い条件で行うことが好ましい。具体的には溶存酸素濃度が０．１～３ｐｐｍが好ましく、０．１～１ｐｐｍがより好ましい。
培養物からの没食子酸又はその塩の回収及び精製方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。例えば、菌体を遠心分離等で除去した後、カチオン及びアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば没食子酸又はその塩を取得することができる。培養物中に蓄積された没食子酸又はその塩は、そのまま単離することなく用いてもよい。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞（Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された没食子酸又はその塩の生産能を有する形質転換体。
＜２＞（Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、＜１＞に記載の形質転換体。
＜３＞３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ａ１）又は（Ａ２）で示されるポリペプチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｂ１）又は（Ｂ２）で示されるポリペプチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｃ１）又は（Ｃ２）で示されるポリペプチドである、＜２＞に記載の形質転換体。
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｃ１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｃ２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
＜４＞３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ａ１）又は（ａ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｂ１）又は（ｂ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｃ１）又は（ｃ２）で示されるポリヌクレオチドである、＜２＞に記載の形質転換体。
（ａ１）配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ２）配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ１）配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ２）配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
＜５＞さらに、（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の形質転換体。
＜６＞（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、＜５＞に記載の形質転換体。
＜７＞（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｄ１）又は（Ｄ２）で示されるポリペプチドである、＜６＞に記載の形質転換体。
（Ｄ１）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ２）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
＜８＞（ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｄ１）又は（ｄ２）で示されるポリヌクレオチドである、＜６＞に記載の形質転換体。
（ｄ１）配列番号９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２）配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
＜９＞さらに、（Ｅ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、（Ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのポリペプチドの発現が強化された＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の形質転換体。
＜１０＞（Ｅ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、（Ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、＜９＞に記載の形質転換体。
＜１１＞３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｅ１）又は（Ｅ２）で示されるポリペプチドであり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｆ１）又は（Ｆ２）で示されるポリペプチドであり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｇ１）又は（Ｇ２）で示されるポリペプチドである、＜１０＞に記載の形質転換体。
（Ｅ１）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｅ２）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｆ１）配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ２）配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｇ１）配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｇ２）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列からなり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチド
＜１２＞３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｅ１）又は（ｅ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｆ１）又は（ｆ２）で示されるポリヌクレオチドであり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｇ１）又は（ｇ２）で示されるポリヌクレオチドである、＜１０＞に記載の形質転換体。
（ｅ１）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ２）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ１）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ２）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ１）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｇ２）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
＜１３＞コリネ型細菌である、＜１＞～＜１２＞のいずれか１項に記載の形質転換体。
＜１４＞コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、＜１３＞に記載の形質転換体。
＜１５＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、＜１４＞に記載の形質転換体。
＜１６＞＜１＞～＜１５＞のいずれかに記載の形質転換体を糖類の存在下で培養する工程を含む、没食子酸又はその塩の製造方法。
＜１＞（Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された没食子酸又はその塩の生産能を有する形質転換体。
＜２＞（Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、＜１＞に記載の形質転換体。
＜３＞３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ａ１）又は（Ａ２）で示されるポリペプチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｂ１）又は（Ｂ２）で示されるポリペプチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｃ１）又は（Ｃ２）で示されるポリペプチドである、＜２＞に記載の形質転換体。
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｃ１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｃ２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
＜４＞３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ａ１）又は（ａ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｂ１）又は（ｂ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｃ１）又は（ｃ２）で示されるポリヌクレオチドである、＜２＞に記載の形質転換体。
（ａ１）配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ２）配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ１）配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ２）配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
＜５＞さらに、（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の形質転換体。
＜６＞（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、＜５＞に記載の形質転換体。
＜７＞（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｄ１）又は（Ｄ２）で示されるポリペプチドである、＜６＞に記載の形質転換体。
（Ｄ１）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ２）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
＜８＞（ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｄ１）又は（ｄ２）で示されるポリヌクレオチドである、＜６＞に記載の形質転換体。
（ｄ１）配列番号９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２）配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
＜９＞さらに、（Ｅ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、（Ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのポリペプチドの発現が強化された＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の形質転換体。
＜１０＞（Ｅ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、（Ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、＜９＞に記載の形質転換体。
＜１１＞３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｅ１）又は（Ｅ２）で示されるポリペプチドであり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｆ１）又は（Ｆ２）で示されるポリペプチドであり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｇ１）又は（Ｇ２）で示されるポリペプチドである、＜１０＞に記載の形質転換体。
（Ｅ１）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｅ２）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｆ１）配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ２）配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｇ１）配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｇ２）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列からなり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチド
＜１２＞３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｅ１）又は（ｅ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｆ１）又は（ｆ２）で示されるポリヌクレオチドであり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｇ１）又は（ｇ２）で示されるポリヌクレオチドである、＜１０＞に記載の形質転換体。
（ｅ１）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ２）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ１）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ２）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ１）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｇ２）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
＜１３＞コリネ型細菌である、＜１＞～＜１２＞のいずれか１項に記載の形質転換体。
＜１４＞コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、＜１３＞に記載の形質転換体。
＜１５＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、＜１４＞に記載の形質転換体。
＜１６＞＜１＞～＜１５＞のいずれかに記載の形質転換体を糖類の存在下で培養する工程を含む、没食子酸又はその塩の製造方法。
実施例１ 没食子酸の製造
（１）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド導入形質転換体の作製
１）ｃｇ０６２０遺伝子領域を３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子と置換するためのプラスミドの構築
ｃｇ０６２０遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号１９）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２０と２１）にて増幅し、またｃｇ０６２０遺伝子領域の３’側下流領域（塩基番号２２）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２３と２４）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（配列番号２５）を人工遺伝子合成にて作製し、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２６と２７）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子（以下、ｈｆｍ１４５ＶＦと略記する）を含むＤＮＡ断片を人工遺伝子合成にて２種類（配列番号２８と２９）作製した。それぞれのＤＮＡ断片を鋳型にし、それぞれ２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３０と３１および３２と３３）にて増幅して２種類のＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（これは特願２０１４－５２３７５７により参照される。）を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた６種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔを作製した。
（１）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド導入形質転換体の作製
１）ｃｇ０６２０遺伝子領域を３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子と置換するためのプラスミドの構築
ｃｇ０６２０遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号１９）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２０と２１）にて増幅し、またｃｇ０６２０遺伝子領域の３’側下流領域（塩基番号２２）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２３と２４）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（配列番号２５）を人工遺伝子合成にて作製し、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２６と２７）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子（以下、ｈｆｍ１４５ＶＦと略記する）を含むＤＮＡ断片を人工遺伝子合成にて２種類（配列番号２８と２９）作製した。それぞれのＤＮＡ断片を鋳型にし、それぞれ２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３０と３１および３２と３３）にて増幅して２種類のＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（これは特願２０１４－５２３７５７により参照される。）を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた６種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔを作製した。
２）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子導入株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔをＣＹ４４株（ＣＹ４４株は、特願２０１４－５２３７５７の参考例１４記載のｔｋｔ株であり、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤおよびｔｋｔ遺伝子の転写をtｕプロモーターによって制御することによって発現が強化されている。また、ｑｓｕＢ遺伝子の転写をＰｂｅｎプロモーターによって制御することによって発現が強化されている。）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１４８ｓｒ株を取得した。配列番号２０と３６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ１４８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ１４８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔがｃｇ０６２０遺伝子領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ１４８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１４８株を得た。配列番号３６と３７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ１４８株が予想通りＰｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐ遺伝子がｃｇ０６２０遺伝子領域に導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔをＣＹ４４株（ＣＹ４４株は、特願２０１４－５２３７５７の参考例１４記載のｔｋｔ株であり、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤおよびｔｋｔ遺伝子の転写をtｕプロモーターによって制御することによって発現が強化されている。また、ｑｓｕＢ遺伝子の転写をＰｂｅｎプロモーターによって制御することによって発現が強化されている。）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１４８ｓｒ株を取得した。配列番号２０と３６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ１４８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ１４８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔがｃｇ０６２０遺伝子領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ１４８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１４８株を得た。配列番号３６と３７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ１４８株が予想通りＰｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐ遺伝子がｃｇ０６２０遺伝子領域に導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（２）３－ヒドロキシ安息香酸－４－ヒドロキシラーゼおよび３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ及び形質転換体の作製
１）ｃｇ１６２５遺伝子領域を３－ヒドロキシ安息香酸－４－ヒドロキシラーゼ遺伝子および３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ遺伝子と置換するためのプラスミドの構築
ｃｇ１６２５遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号３８）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３９と４０）にて増幅し、またｃｇ１６２５遺伝子領域の３’側下流領域（塩基番号４１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４２と４３）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、先行文献記載のプロモーター（以下、ｔｙｔｕプロモーターと称する）ＤＮＡ断片（配列番号４４）を人工遺伝子合成（ユーロフィンジェノミクス）にて作製し、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２７と４５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、３－ヒドロキシ安息香酸－４－ヒドロキシラーゼ遺伝子を人工遺伝子合成（ユーロフィンジェノミクス）にて作製し（配列番号４６）、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４７と４８）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号４９）を人工遺伝子合成（ユーロフィンジェノミクス）にて作製し、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５０と５１）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（特願２０１４－５２３７５７）を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた６種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ１６２５－Ｐｔｙｔｕ－ｍｏｂＡ－ｈｙｇ５を作製した。
１）ｃｇ１６２５遺伝子領域を３－ヒドロキシ安息香酸－４－ヒドロキシラーゼ遺伝子および３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ遺伝子と置換するためのプラスミドの構築
ｃｇ１６２５遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号３８）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３９と４０）にて増幅し、またｃｇ１６２５遺伝子領域の３’側下流領域（塩基番号４１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４２と４３）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、先行文献記載のプロモーター（以下、ｔｙｔｕプロモーターと称する）ＤＮＡ断片（配列番号４４）を人工遺伝子合成（ユーロフィンジェノミクス）にて作製し、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２７と４５）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、３－ヒドロキシ安息香酸－４－ヒドロキシラーゼ遺伝子を人工遺伝子合成（ユーロフィンジェノミクス）にて作製し（配列番号４６）、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４７と４８）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号４９）を人工遺伝子合成（ユーロフィンジェノミクス）にて作製し、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５０と５１）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（特願２０１４－５２３７５７）を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３４と３５）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた６種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ１６２５－Ｐｔｙｔｕ－ｍｏｂＡ－ｈｙｇ５を作製した。
２）３－ヒドロキシ安息香酸－４－ヒドロキシラーゼ遺伝子および３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ遺伝子導入株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ１６２５－Ｐｔｙｔｕ－ｍｏｂＡ－ｈｙｇ５をＫＣ１４８株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１５２ｓｒ株を取得した。配列番号３９と５２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ１５２ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ１５２ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ１６２５－Ｐｔｙｔｕ－ｍｏｂＡ－ｈｙｇ５がｃｇ１６２５遺伝子領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ１５２ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１５２株を得た。配列番号５２と５３のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ１５２株が予想通りＰｔｙｔｕ－ｍｏｂＡ－ｈｙｇ５遺伝子がｃｇ１６２５遺伝子領域に導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ１６２５－Ｐｔｙｔｕ－ｍｏｂＡ－ｈｙｇ５をＫＣ１４８株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１５２ｓｒ株を取得した。配列番号３９と５２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ１５２ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ１５２ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ１６２５－Ｐｔｙｔｕ－ｍｏｂＡ－ｈｙｇ５がｃｇ１６２５遺伝子領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ１５２ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１５２株を得た。配列番号５２と５３のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ１５２株が予想通りＰｔｙｔｕ－ｍｏｂＡ－ｈｙｇ５遺伝子がｃｇ１６２５遺伝子領域に導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（３）形質転換株の培養
表に示すＣＧＸＩＩ培地１.５ｍＬに終濃度１ｍＭとなるよう安息香酸ナトリウムを添加し、上記で得られた形質転換株を接種し、３２℃で培養し２４時間目と３２時間目の培養液を回収し、培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中のグルコース濃度と没食子酸濃度を定量した。
表に示すＣＧＸＩＩ培地１.５ｍＬに終濃度１ｍＭとなるよう安息香酸ナトリウムを添加し、上記で得られた形質転換株を接種し、３２℃で培養し２４時間目と３２時間目の培養液を回収し、培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中のグルコース濃度と没食子酸濃度を定量した。
（４）結果
ＫＣ１４８株とＫＣ１５２株を比較すると、ＫＣ１５２株の方が消費糖収率の向上が確認され、ｍｏｂＡおよびｈｙｇ５を強化することが没食子酸生産に優位に働くことが示された。
ＫＣ１４８株とＫＣ１５２株を比較すると、ＫＣ１５２株の方が消費糖収率の向上が確認され、ｍｏｂＡおよびｈｙｇ５を強化することが没食子酸生産に優位に働くことが示された。
（５）消費糖収率の計算方法
培養後２４時間目と３２時間目の培養上清中のグルコース量から培養２４時間から３２時間におけるグルコース消費量を算出した。培養後２４時間目と３２時間目の培養上清中の没食子酸濃度から培養２４時間から３２時間における没食子酸生産量を算出した。以下の式を用いて消費糖収率（％）を算出した。
消費糖収率（％：ｇ／ｇ）＝ 没食子酸生産量／グルコース消費量×１００
培養後２４時間目と３２時間目の培養上清中のグルコース量から培養２４時間から３２時間におけるグルコース消費量を算出した。培養後２４時間目と３２時間目の培養上清中の没食子酸濃度から培養２４時間から３２時間における没食子酸生産量を算出した。以下の式を用いて消費糖収率（％）を算出した。
消費糖収率（％：ｇ／ｇ）＝ 没食子酸生産量／グルコース消費量×１００
（６）分析条件
回収した上清はアクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行ない、反応液をＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣの装置はＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。没食子酸の分析には、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。没食子酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。
グルコースの分析にはＩＣｓｅｐ ＩＯＮ－３００（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、東京化成工業）を用い、溶離液を３７ｍＭ硫酸溶液とし、流速０．５ｍＬ／分、カラム温度５０℃の条件で検出を行った。グルコースの検出にはＲＩを用いた。
回収した上清はアクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行ない、反応液をＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣの装置はＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。没食子酸の分析には、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。没食子酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。
グルコースの分析にはＩＣｓｅｐ ＩＯＮ－３００（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、東京化成工業）を用い、溶離液を３７ｍＭ硫酸溶液とし、流速０．５ｍＬ／分、カラム温度５０℃の条件で検出を行った。グルコースの検出にはＲＩを用いた。
Claims (16)
- （Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された没食子酸又はその塩の生産能を有する形質転換体。
- （Ａ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｂ）３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｃ）３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、請求項１に記載の形質転換体。
- ３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ａ１）又は（Ａ２）で示されるポリペプチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｂ１）又は（Ｂ２）で示されるポリペプチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｃ１）又は（Ｃ２）で示されるポリペプチドである、請求項２に記載の形質転換体。
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｃ１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｃ２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド - ３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ａ１）又は（ａ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｂ１）又は（ｂ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｃ１）又は（ｃ２）で示されるポリヌクレオチドである、請求項２に記載の形質転換体。
（ａ１）配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ２）配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ１）配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ２）配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド - さらに、（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの発現が強化された、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換体。
- （Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、請求項５に記載の形質転換体。
- （Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｄ１）又は（Ｄ２）で示されるポリペプチドである、請求項６に記載の形質転換体。
（Ｄ１）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ２）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド - （ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｄ１）又は（ｄ２）で示されるポリヌクレオチドである、請求項６に記載の形質転換体。
（ｄ１）配列番号９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２）配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド - さらに、（Ｅ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、（Ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのポリペプチドの発現が強化された請求項１～８のいずれか１項に記載の形質転換体。
- （Ｅ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、（Ｆ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド及び（Ｇ）トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、請求項９に記載の形質転換体。
- ３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｅ１）又は（Ｅ２）で示されるポリペプチドであり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｆ１）又は（Ｆ２）で示されるポリペプチドであり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドが下記の（Ｇ１）又は（Ｇ２）で示されるポリペプチドである、請求項１０に記載の形質転換体。
（Ｅ１）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｅ２）配列番号１２又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｆ１）配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ２）配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチド配列からなり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｇ１）配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｇ２）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列からなり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチド - ３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｅ１）又は（ｅ２）で示されるポリヌクレオチドであり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｆ１）又は（ｆ２）で示されるポリヌクレオチドであり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが下記の（ｇ１）又は（ｇ２）で示されるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の形質転換体。
（ｅ１）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ２）配列番号１１又は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、ＤＡＨＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ１）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ２）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ１）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｇ２）配列番号１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド - コリネ型細菌である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の形質転換体。
- コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、請求項１３に記載の形質転換体。
- コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、請求項１４に記載の形質転換体。
- 請求項１～１５のいずれか１項に記載の形質転換体を糖類の存在下で培養する工程を含む、没食子酸又はその塩の製造方法。
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