JP2024003706A - 芳香族化合物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】形質転換されたコリネ型細菌を用いて芳香族化合物を効率よく製造する方法を提供する。【解決手段】シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。【選択図】なし
Description
本発明は、改変コリネ型細菌を用いた芳香族化合物の製造方法に関する。
近年、安価な原料であるグルコースから、微生物を用いて没食子酸を始め、有用な芳香族化合物を生産することが所望されている。微生物は、芳香族化合物を生合成する代謝経路（シキミ酸経路）を保有する。すなわち、解糖系で作られるホスホエノールピルビン酸がペントースリン酸経路から供給されるエリスロース４－リン酸と結合して３－デオキシ－Ｄ－アラビノペプツロソン酸７－リン酸（ＤＡＨＰ）となり、３－デヒドロキナ酸（ＤＨＱ）、３－デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）を経てシキミ酸となる。さらに、シキミ酸はアデノシン３リン酸からリン酸基が転移して、３－ホスホシキミ酸となり、３－ホスホエノ－ルピルビルシキミ酸を経てコリスミ酸となる。シキミ酸経路では炭素６員環が形成された後、二重結合の形成が行われ、ＤＨＳから誘導されるプロトカテク酸からは、没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰＤＣＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、カテコール、パラアミノ安息香酸（４－ＡＢＡ）、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ）等の芳香族化合物が生産される（図１）。
このうち、没食子酸は、還元性が強いことから、写真の現像剤や青インクの製造原料等に使用され、また、没食子酸プロピル等のエステルは、油脂やバターの酸化防止剤として使用されている。さらに、没食子酸を脱炭酸して合成されるピロガロールは、電子材料、有機合成試薬、写真の現像液、毛織物の媒染剤等として使用されることから、没食子酸を効率よく生産させることは有益である。また、耐熱性や力学強度に優れたエンジニアリングプラスチックであるポリベンズオキサゾール（ＰＢＯ）は、繊維材料及び半導体素子の絶縁膜等に利用されるが（非特許文献１）、その製造原料となり得る４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ）類も近年注目されている。また、紫外線吸収剤や医薬品の原料の他、ポリマー原料にもなり得るパラアミノ安息香酸（４－ＡＢＡ）は、従来化学合成されているが、多大なエネルギーを必要とするため、環境調和型なプロセスである発酵生産技術が望まれている。
一方、コリネ型細菌は好気性細菌であり、呼吸に酸素を電子受容体として利用する。コリネ型細菌の呼吸鎖の末端酸化酵素には、シトクロームａａ３型酸化酵素とシトクロームｂｄ型酸化酵素の２種類があることが知られている（非特許文献２）。
従来、コリネ型細菌の呼吸鎖関連酵素と物質生産との関係については、例えばシトクロームｂｄ型酸化酵素を破壊した株でＴＣＡ回路派生物であるリジンの生産性が向上したこと（非特許文献３）、シトクロームｂｄ型酸化酵素を過剰発現させた株でジアセチルの生産性が向上したこと（非特許文献４）が報告されている。また、特許文献１には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする酸化還元酵素に使用可能なＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を増やすべく、呼吸経路を不活性化するように操作された微生物が開示されている。
従来、コリネ型細菌の呼吸鎖関連酵素と物質生産との関係については、例えばシトクロームｂｄ型酸化酵素を破壊した株でＴＣＡ回路派生物であるリジンの生産性が向上したこと（非特許文献３）、シトクロームｂｄ型酸化酵素を過剰発現させた株でジアセチルの生産性が向上したこと（非特許文献４）が報告されている。また、特許文献１には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする酸化還元酵素に使用可能なＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を増やすべく、呼吸経路を不活性化するように操作された微生物が開示されている。
しかしながら、シトクロームｂｄ型酸化酵素の機能を抑制又は欠失させた場合に、芳香族化合物の生産性が向上することについては、これまでに全く知られていない。
村瀬浩貴，SENI GAKKAISHI(繊維と工業), Vol.66, No.6 (2010)
Michael Bott et al., Journal of Biotechnology,Vol.104, Issues 1-3,2003,129-153,
Armin Kabus et al., American Society for Microbiology Applied and Environmental Microbiology Vol.73, 2006, No.3, 861-868
Cong Chen et al., Journal of Biotechnology Vol.332, 2021, 20-28
本発明は、形質転換されたコリネ型細菌を用いて芳香族化合物を効率よく製造する方法を提供することに関する。
本発明者らは、コリネ型細菌の呼吸鎖の末端酸化酵素の一つであるｂｄ型酸化酵素の機能を抑制又は欠失させた形質転換体において、没食子酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸を始めとする芳香族化合物の生産性が向上することを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）～２）に係るものである。
１）シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
２）シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌であって、少なくとも下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）：
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されている、コリネ型細菌。
１）シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
２）シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌であって、少なくとも下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）：
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されている、コリネ型細菌。
本発明によれば、環境負荷の少ない発酵法によって、没食子酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸のような芳香族化合物又はその塩を効率よく製造することが可能になる。
本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本発明において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また、「１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらにより好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本発明において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
本発明において、芳香族化合物とは、コリネ型細菌内で生合成される有機芳香族化合物であり、具体的にはシキミ酸経路を介して合成される芳香族化合物、好ましくは、３－デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）やコリスミ酸から誘導される芳香族化合物を指す（図１）。
具体的には、プロトカテク酸、カテコール、没食子酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、パラヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、２，３－ジヒドロキシ安息香酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸等が挙げられる。
このうち、ＤＨＳから誘導されるプロトカテク酸；プロトカテク酸から誘導される没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰＤＣＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、カテコール；コリスミ酸から誘導されるパラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸（４－ＡＢＡ）、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、チロシン、トリプトファン等が好ましく、より好ましくは、没食子酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸が挙げられる。
具体的には、プロトカテク酸、カテコール、没食子酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、パラヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、２，３－ジヒドロキシ安息香酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸等が挙げられる。
このうち、ＤＨＳから誘導されるプロトカテク酸；プロトカテク酸から誘導される没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰＤＣＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、カテコール；コリスミ酸から誘導されるパラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸（４－ＡＢＡ）、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、チロシン、トリプトファン等が好ましく、より好ましくは、没食子酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸が挙げられる。
当該芳香族化合物の塩としては、塩基付加塩、酸付加塩等を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩等が挙げられ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩等が挙げられる。
本発明の芳香族化合物又はその塩の製造方法は、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失されたコリネ型細菌が用いられる。
「シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体」は、コリネ型細菌の好気呼吸関連酵素であり、具体的には、呼吸鎖の末端酸化酵素の一つである。
コリネ型細菌は、呼吸鎖の末端酸化酵素としてｂｄ型酸化酵素とａａ３型酸化酵素を有することが知られている。ｂｄ型酸化酵素複合体は、サブユニットＩとサブユニットＩＩからなることが示されており、Ｎ末端配列の解析に基づいて、それぞれＣｙｄＡとＣｙｄＢに相当することが示されている（Kusumoto et al.2000, Arch Microbiol 173:390-397）。
ａａ３酸化酵素は４つのサブユニットからなることが知られており（ＣｔａＤ、ＣｔａＣ、ＣｔａＥ、ＣｔａＦ）、チトクロムｂｃ１複合体（ＱｃｒＢ、ＱｃｒＡ、ＱｃｒＣ）と複合体を形成していることが知られている。(前記非特許文献２)
ｂｄ酸化酵素とｂｃ１－ａａ３複合体のプロトン排出効率は、それぞれＨ＋／Ｏ比が２および６であることが知られており、１分子の酸素当たりに汲みだせるプロトン排出効率はｂｄ型酸化酵素の方が低いため、最終的に得られるＡＴＰの合成効率も低いことが報告されている（Matsushita K. (2013) Respiratory Chain and Energy Metabolism of Corynebacterium glutamicum. In: Yukawa H., Inui M. (eds) Corynebacterium glutamicum. Microbiology Monographs, vol 23. Springer, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-642-29857-8_11）。
「シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体」は、コリネ型細菌の好気呼吸関連酵素であり、具体的には、呼吸鎖の末端酸化酵素の一つである。
コリネ型細菌は、呼吸鎖の末端酸化酵素としてｂｄ型酸化酵素とａａ３型酸化酵素を有することが知られている。ｂｄ型酸化酵素複合体は、サブユニットＩとサブユニットＩＩからなることが示されており、Ｎ末端配列の解析に基づいて、それぞれＣｙｄＡとＣｙｄＢに相当することが示されている（Kusumoto et al.2000, Arch Microbiol 173:390-397）。
ａａ３酸化酵素は４つのサブユニットからなることが知られており（ＣｔａＤ、ＣｔａＣ、ＣｔａＥ、ＣｔａＦ）、チトクロムｂｃ１複合体（ＱｃｒＢ、ＱｃｒＡ、ＱｃｒＣ）と複合体を形成していることが知られている。(前記非特許文献２)
ｂｄ酸化酵素とｂｃ１－ａａ３複合体のプロトン排出効率は、それぞれＨ＋／Ｏ比が２および６であることが知られており、１分子の酸素当たりに汲みだせるプロトン排出効率はｂｄ型酸化酵素の方が低いため、最終的に得られるＡＴＰの合成効率も低いことが報告されている（Matsushita K. (2013) Respiratory Chain and Energy Metabolism of Corynebacterium glutamicum. In: Yukawa H., Inui M. (eds) Corynebacterium glutamicum. Microbiology Monographs, vol 23. Springer, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-642-29857-8_11）。
本発明において、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体としては、好適には、下記（Ａ）又は（Ｂ）で示されるシトクロームｂｄ型酸化酵素活性を有するポリペプチド複合体が挙げられる。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される複合体
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドから構成される複合体
ここで、（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩを指し、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩを指す。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される複合体
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドから構成される複合体
ここで、（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩを指し、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩを指す。
（Ａ）のポリペプチドにおいて、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上である。
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列の例としては、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列の例としては、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体活性を有することは、例えば、前記記載の非特許文献を参考にするなどして測定することができる（Kusumoto et al.2000, Arch Microbiol 173:390-397）。具体的には菌体から膜タンパク質としてシトクロームｂｄ型酸化酵素を抽出し、カラムなどを用いて精製することで得られた酵素を用いて、キノールをキノンに酸化する反応を測定することにより確認することができる。
（Ｂ）の配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つシトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つシトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム クレナタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ）、コリネバクテリウム クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム ＳＰ．Ｓａ１ＹＶＡ５（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．Ｓａ１ＹＶＡ５）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｄａｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｔｔｉｎｇｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｄａｖａｒｉａｎｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｅ由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩ及びシトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩ等が挙げられる。
上記ポリペプチドのアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法としては、例えば、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法が挙げられる。ヌクレオチド配列への変異導入の手法としては、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学的変異原又は紫外線、Ｘ線、ガンマ線、イオンビーム等の物理的変異原による突然変異誘発、部位特異的変異導入法、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５８１－６２１，１９９５）に記載の方法、等が挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，６１－６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１－２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｔａｎ－ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。
本発明において、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌（「形質転換体」とも称する）としては、宿主細菌におけるシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現が低下又は喪失し、当該タンパク質のシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体としての機能が抑制又は欠失している細菌株、好ましくは、変異を導入することによりシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現が親細菌に比べて低下又は喪失し、当該タンパク質のシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体としての機能が低下又は喪失された細菌株（変異導入株）が挙げられる。
本発明において、タンパク質の「発現」とは、当該タンパク質をコードする遺伝子から、翻訳産物が産生され、且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。変異を導入することによりシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現が低下又は喪失したとは、遺伝子レベル、転写レベル、転写後調節レベル、翻訳レベル、翻訳後修飾レベルでの改変により、結果として、形質転換体内に存在するシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体タンパク質量が低下又は喪失した状態、好ましくは親細菌におけるそれに比べて有意に低下又は喪失した状態を意味する。
本発明において、タンパク質の「発現」とは、当該タンパク質をコードする遺伝子から、翻訳産物が産生され、且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。変異を導入することによりシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現が低下又は喪失したとは、遺伝子レベル、転写レベル、転写後調節レベル、翻訳レベル、翻訳後修飾レベルでの改変により、結果として、形質転換体内に存在するシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体タンパク質量が低下又は喪失した状態、好ましくは親細菌におけるそれに比べて有意に低下又は喪失した状態を意味する。
「シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現が親細菌に比べて低下した」とは、形質転換体内に存在するシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現量が親細菌に比べて低下していること、より具体的には親細菌と比較して、当該タンパク質の発現量が、通常５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下に低下し、それによりその活性もまた同様に低下していることを意味する。最も好ましくは、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現量が０％、すなわちシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現喪失である。
尚、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現量の比較は、ウェスタンブロッティングや免疫組織染色等の周知の免疫学的手法により当該ポリペプチドの発現量を測定することにより実施される。
尚、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現量の比較は、ウェスタンブロッティングや免疫組織染色等の周知の免疫学的手法により当該ポリペプチドの発現量を測定することにより実施される。
上記シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現が低下又は喪失した改変コリネ型細菌は、具体的には、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の機能を抑制することにより取得することができる。ここで、機能の抑制は、機能の完全抑制（阻害）及び不完全抑制のいずれでも良い。
シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子とは、ＯＲＦを含む転写領域及び当該遺伝子のプロモーター等の転写調節領域からなるＤＮＡを意味する。本発明において、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子としては、好適には下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド、が挙げられる。
シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子とは、ＯＲＦを含む転写領域及び当該遺伝子のプロモーター等の転写調節領域からなるＤＮＡを意味する。本発明において、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子としては、好適には下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド、が挙げられる。
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド。
ここで、（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩをコードする遺伝子ｃｇ１３０１（ｃｙｄＡ)を指し、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩをコードする遺伝子ｃｇ１３００（ｃｙｄＢ)を指す。
（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド。
ここで、（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩをコードする遺伝子ｃｇ１３０１（ｃｙｄＡ)を指し、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩをコードする遺伝子ｃｇ１３００（ｃｙｄＢ)を指す。
配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の例としては、配列番号１又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列に対して１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。ヌクレオチド配列にヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法は、上述したとおりである。上記ポリヌクレオチドは、１本鎖若しくは２本鎖の形態であり得、又はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。該ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等の人工ＤＮＡであり得る。
斯かるシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の機能の抑制は、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子のコード領域、非コード領域、転写又は翻訳開始領域に対して欠失又は不活性化する変異を導入すること（シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の欠失又は不活性化）、或いはシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の転写産物を分解する活性を有するポリヌクレオチド、当該転写産物からタンパク質への翻訳を抑制するポリヌクレオチドの導入により転写や翻訳を抑制することにより行なうことができる。
一態様として、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の欠失又は不活性化は、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他のヌクレオチド配列と置き換えること、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の配列中に他のポリヌクレオチド断片を挿入すること、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の転写又は翻訳開始領域に変異を与えること、等によって実現することができる。好適には、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させるか又は不活性化させる。より具体的な例としては、細胞のゲノム上のシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を特異的に欠失又は不活性化させる方法、及び、菌体細胞中の当該遺伝子にランダムな欠失又は不活性化変異を与えた後、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現量や活性評価、又は遺伝子解析を行って所望の変異を有する細胞を選択する方法が挙げられる。
シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の特異的な欠失又は不活性化には、例えば相同組換えによる方法が挙げられる。すなわち、ポリヌクレオチドの置換や挿入等によって不活性化変異を導入したシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子のＤＮＡ断片、又はシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の外側領域を含むがシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を含まないＤＮＡ断片を構築し、これを親細菌内に組み込んで親細菌のゲノムのシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を含む領域に相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上のシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させることが可能である。
或いは、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の一部領域を含むＤＮＡ断片を有する組換えベクター（プラスミド等）を親細菌内に組み込み、親細菌のゲノムのシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の一部領域を相同組換えにより分断することによって、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を不活性化することも可能である。
菌体中の遺伝子をランダムに欠失又は不活性化させる方法としては、不活性化変異を導入した遺伝子をランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を細胞に導入し、該細胞のゲノム上の遺伝子との間に相同組換えを起こさせる方法、細胞に紫外線、γ線等を照射して突然変異を誘発する方法などが挙げられる。遺伝子の不活性化変異とは、サイレンス変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異等により、標的とする遺伝子が本来有する機能が失われる変異を意味する。例えば、不活性化変異を導入した遺伝子はタンパク質を発現しないか、又は本来の活性が損なわれたタンパク質を発現する。
或いは、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の一部領域を含むＤＮＡ断片を有する組換えベクター（プラスミド等）を親細菌内に組み込み、親細菌のゲノムのシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の一部領域を相同組換えにより分断することによって、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を不活性化することも可能である。
菌体中の遺伝子をランダムに欠失又は不活性化させる方法としては、不活性化変異を導入した遺伝子をランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を細胞に導入し、該細胞のゲノム上の遺伝子との間に相同組換えを起こさせる方法、細胞に紫外線、γ線等を照射して突然変異を誘発する方法などが挙げられる。遺伝子の不活性化変異とは、サイレンス変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異等により、標的とする遺伝子が本来有する機能が失われる変異を意味する。例えば、不活性化変異を導入した遺伝子はタンパク質を発現しないか、又は本来の活性が損なわれたタンパク質を発現する。
不活性化変異を導入したシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を作製する方法としては、部位特異的変異導入が挙げられる。部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。例えば、導入すべきヌクレオチド変異を含む２組のプライマーを用いたシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を鋳型とするＰＣＲにより、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子を含む領域の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を作製し、次いでこれらをＳＯＥ－ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結することにより、所望の変異を含むＤＮＡ断片を構築することができる。あるいは、部位特異的変異導入には、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版 新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ８２－８８）、又はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ II Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。鋳型とするシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子は、宿主細菌から、常法により調製してもよく、又は化学合成してもよい。
ＤＮＡ断片やベクターを宿主細菌に導入するには、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の技術を適用することができる。例えばコリネ型細菌に適用可能な方法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５－１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５－１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１－１１５）、Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）などが挙げられる。
また、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の転写産物を分解する活性を有するポリヌクレオチド、或いは当該転写産物からタンパク質への翻訳を抑制するポリヌクレオチドとしては、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相補的又は実質的に相補的なヌクレオチド配列或いはその一部を含むポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡ、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子のｍＲＮＡに対するsｉＲＮＡ、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム等が挙げられる。
シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の機能が抑制された細菌は、そのゲノム配列を確認することにより選択することができる。あるいは、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現量又は活性を指標に、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体をコードする遺伝子の機能が抑制された細菌を選択することができる。
本発明において、宿主細菌はコリネ型細菌である。コリネ型細菌としては、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）において、コリネ型細菌として定義されている一群の微生物が挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、マイクロコッカス属菌、等が挙げられる。
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、コリネバクテリウム クレナタム（Corynebacterium crenatum）、コリネバクテリウム クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム カルナエ（Corynebacterium callunae）等が挙げられる。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）等が挙げられる。
アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス等が挙げられ、マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）等が挙げられる。
コリネ型細菌のうち、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム グルタミカムである。
上記微生物細胞は野生株であってもよいが、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、コリネバクテリウム クレナタム（Corynebacterium crenatum）、コリネバクテリウム クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム カルナエ（Corynebacterium callunae）等が挙げられる。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）等が挙げられる。
アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス等が挙げられ、マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）等が挙げられる。
コリネ型細菌のうち、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム グルタミカムである。
上記微生物細胞は野生株であってもよいが、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。
本発明において、宿主として用いられるコリネ型細菌は、芳香族化合物又はその塩の生産に適するものであればよいが、芳香族化合物又はその塩の生産効率の観点、特にプロトカテク酸、没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、カテコール、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸、４―アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸等の３－デヒドロシキミ酸やコリスミ酸から誘導される芳香族化合物又はその塩の生産効率の点から、３－デヒドロシキミ酸生産活性、更にはコリスミ酸生産活性が向上したコリネ型細菌を用いるのが好ましい。具体的には、３－デヒドロシキミ酸及びコリスミ酸から誘導される化合物の生産効率を高める点から、下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されたコリネ型細菌を宿主として用いるのが好ましい。
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
したがって、本発明の改変コリネ型細菌は、好ましくはシトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌であって、少なくとも下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）：
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されている、コリネ型細菌である。
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されている、コリネ型細菌である。
ここで、（Ｃ）の３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、プロトカテク酸から没食子酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ｃ１）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｃ２）配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｐｏｂＡ）の変異体である３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである（図１では「ｐｏｂＡ＊」と表記）。
また、（Ｃ２）の配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来の３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来の４－ヒドロキシ安息香酸-３-モノオキシゲナーゼ、コリネバクテリウム スラナレアエ（Corynebacterium suranareeae）由来の４－ヒドロキシ安息香酸-３-モノオキシゲナーゼ、コリネバクテリウム クルディラクティス（Corynebacterium crudilactis）由来の４－ヒドロキシ安息香酸-３-モノオキシゲナーゼ等が挙げられる。
ここで、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｐｏｂＡ）の変異体である３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである（図１では「ｐｏｂＡ＊」と表記）。
また、（Ｃ２）の配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来の３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来の４－ヒドロキシ安息香酸-３-モノオキシゲナーゼ、コリネバクテリウム スラナレアエ（Corynebacterium suranareeae）由来の４－ヒドロキシ安息香酸-３-モノオキシゲナーゼ、コリネバクテリウム クルディラクティス（Corynebacterium crudilactis）由来の４－ヒドロキシ安息香酸-３-モノオキシゲナーゼ等が挙げられる。
（Ｄ）の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、３－デヒドロシキミ酸からプロトカテク酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ｄ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｄ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼであり、「ｑｓｕＢ」として知られている。
また、（Ｄ２）の配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、コリネバクテリウム スラナレアエ由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ等が挙げられる。
ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼであり、「ｑｓｕＢ」として知られている。
また、（Ｄ２）の配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばコリネバクテリウム属細菌由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼが挙げられ、具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、コリネバクテリウム スラナレアエ由来の３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ等が挙げられる。
（Ｅ）のコリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドとしては、（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ（４－ａｍｉｎｏ－４－ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ（４－ａｍｉｎｏ－４－ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｌｙａｓｅ）が挙げられる。したがって、コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドの発現強化は、これらのいずれか１以上のポリペプチドの発現を強化する態様が挙げられる。
パラアミノ安息香酸は、コリスミ酸から４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸を経て生成される。コリスミ酸から４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸への変換には、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントＩＩ（ＰａｂＡ）とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントＩ（ＰａｂＢ）が関与し、４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸は４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ（ＰａｂＣ）によってパラアミノ安息香酸に変換される。
上記（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼは、コリスミ酸から４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（ＥＩ－１）配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩ－２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
上記（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼは、４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（ＥＩＩ－１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩＩ－２）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼであり、「ｐａｂＡＢ」として知られ、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼであり、「ｐａｂＣ」として知られている。
パラアミノ安息香酸は、コリスミ酸から４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸を経て生成される。コリスミ酸から４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸への変換には、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントＩＩ（ＰａｂＡ）とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントＩ（ＰａｂＢ）が関与し、４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸は４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ（ＰａｂＣ）によってパラアミノ安息香酸に変換される。
上記（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼは、コリスミ酸から４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（ＥＩ－１）配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩ－２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
上記（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼは、４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（ＥＩＩ－１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩＩ－２）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼであり、「ｐａｂＡＢ」として知られ、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム グルタミカム由来の４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼであり、「ｐａｂＣ」として知られている。
（Ｆ）のパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドを有するポリペプチドは、パラアミノ安息香酸から４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸を生成する反応を触媒するポリペプチドであり、例えば、（Ｆ１）配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｆ２）配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、カウロバクター ビブリオイデス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ）由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼの変異体であるパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである（図１では「ｐｈｂｈ＊」と表記）。
また、（Ｆ２）配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばカウロバクター属細菌由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼが挙げられ、具体的には、カウロバクター リゾスファエラエ（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、カウロバクター スピーシー（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ等が挙げられる。
ここで、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、カウロバクター ビブリオイデス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ）由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼの変異体であるパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである（図１では「ｐｈｂｈ＊」と表記）。
また、（Ｆ２）配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばカウロバクター属細菌由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼが挙げられ、具体的には、カウロバクター リゾスファエラエ（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、カウロバクター スピーシー（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）由来のパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ等が挙げられる。
このうち、没食子酸の生産においては、（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが発現強化された宿主を用いるのが好ましく、更に、（Ｄ）デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが発現強化された宿主を用いるのがより好ましい。
また、パラアミノ安息香酸の生産においては、（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドが発現強化された宿主を用いるのが好ましく、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産においては、（Ｆ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが発現強化された宿主を用いるのが好ましく、さらに（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドが発現強化された宿主を用いるのがより好ましい。
また、パラアミノ安息香酸の生産においては、（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドが発現強化された宿主を用いるのが好ましく、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産においては、（Ｆ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが発現強化された宿主を用いるのが好ましく、さらに（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドが発現強化された宿主を用いるのがより好ましい。
また、本発明において宿主として用いられるコリネ型細菌としては、３－デヒドロシキミ酸生産もしくはコリスミ酸生産活性を向上させる点から、さらに、例えば以下の（Ｇ）～（Ｏ）に示されるポリペプチドの発現が強化されたコリネ型細菌を用いるのが好ましい。
（Ｇ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｈ）３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）５－シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｋ）シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｌ）３－ホスホシキミ酸－１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｍ）コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｎ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｏ）ペントースリン酸経路に関わる酵素群：グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース－５－リン酸イソメラーゼ、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼから選ばれる１以上。
（Ｇ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｈ）３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）５－シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｋ）シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｌ）３－ホスホシキミ酸－１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｍ）コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｎ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｏ）ペントースリン酸経路に関わる酵素群：グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース－５－リン酸イソメラーゼ、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼから選ばれる１以上。
上記ポリペプチドの発現が強化された宿主コリネ型細菌は、具体的には、当該ポリペプチドの発現に必要なポリヌクレオチドが発現可能なように導入されたコリネ型細菌であって、そのポリペプチドは外来のものであっても、当該細菌が本来有しているものであっても良い。例えば、当該ポリヌクレオチドが発現可能なように導入されたコリネ型細菌、当該ポリヌクレオチドの発現の程度が増強されたコリネ型細菌が挙げられる。具体的には、当該ポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターやＤＮＡ断片が導入されたコリネ型細菌や、当該ポリヌクレオチドの制御領域が強制御領域に置換されたコリネ型細菌等が挙げられる。
ここで、強制御領域としては、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、tｕプロモーター、ｇａｐプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
更に、強制御領域としては原核生物由来の誘導プロモーターを用いることができ、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により誘導がかかるｖａｎＡプロモーター、レゾルシノールまたは２，４－ジヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｒｈｃＨプロモーター、４－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｐｃａＩプロモーター、３－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｎａｇＩ（ｃｇ３３５１）遺伝子のプロモーター、安息香酸の添加により誘導がかかるｂｅｎＡ（ｃｇ２６３７）遺伝子のプロモーター（以下、Ｐｂｅｎと略す）、もしくはフラクトースまたはスクロースのいずれかの添加により誘導がかかるｃｇ２１１８遺伝子のプロモーターまたはｐｔｓＳ（ｃｇ２９２５）遺伝子のプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
宿主細胞のゲノム上に存在する前記ポリヌクレオチドの制御領域を強制御領域に置換する方法としては、強制御領域と選択マーカーのポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、相同組換え又は非相同組換え等により形質転換された細胞を選択する方法等が挙げられる。
ここで、強制御領域としては、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、tｕプロモーター、ｇａｐプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
更に、強制御領域としては原核生物由来の誘導プロモーターを用いることができ、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により誘導がかかるｖａｎＡプロモーター、レゾルシノールまたは２，４－ジヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｒｈｃＨプロモーター、４－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｐｃａＩプロモーター、３－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｎａｇＩ（ｃｇ３３５１）遺伝子のプロモーター、安息香酸の添加により誘導がかかるｂｅｎＡ（ｃｇ２６３７）遺伝子のプロモーター（以下、Ｐｂｅｎと略す）、もしくはフラクトースまたはスクロースのいずれかの添加により誘導がかかるｃｇ２１１８遺伝子のプロモーターまたはｐｔｓＳ（ｃｇ２９２５）遺伝子のプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
宿主細胞のゲノム上に存在する前記ポリヌクレオチドの制御領域を強制御領域に置換する方法としては、強制御領域と選択マーカーのポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、相同組換え又は非相同組換え等により形質転換された細胞を選択する方法等が挙げられる。
斯くして、作製された改変コリネ型細菌を培養し、芳香族化合物又はその塩の生産性を評価し、適切な形質転換体を選択することにより、有用な芳香族化合物又はその塩の生産菌を得ることができる。生産物の測定方法は、後記実施例に記載の方法にしたがって行うことができる。
本発明の芳香族化合物又はその塩の製造方法は、上述した改変コリネ型細菌を培養、好ましくは糖類の存在下で培養し、目的の芳香族化合物又はその塩を回収することにより実施される。
糖類としては、グルコースが好適であるが、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース等の単糖類の他、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれ、セロビオース、スクロース(ショ糖)、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオース等の二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉等の多糖類等が挙げられる。
また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙等を糖化酵素等で糖化した、グルコース等の複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
糖類としては、グルコースが好適であるが、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース等の単糖類の他、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれ、セロビオース、スクロース(ショ糖)、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオース等の二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉等の多糖類等が挙げられる。
また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙等を糖化酵素等で糖化した、グルコース等の複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
形質転換体を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の改変コリネ型細菌の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、上記の糖類又はそれを含む糖蜜や糖化液が用いられるが、上記の糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
培養液中の原料化合物である糖類の濃度は、１～２０ｗ／ｖ％が好ましく、２～１０ｗ／ｖ％がより好ましく、２～５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
炭素源としては、上記の糖類又はそれを含む糖蜜や糖化液が用いられるが、上記の糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
培養液中の原料化合物である糖類の濃度は、１～２０ｗ／ｖ％が好ましく、２～１０ｗ／ｖ％がより好ましく、２～５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミン等のアルキルアミン類、アミノ酸等の含窒素有機化合物、アンモニアもしくはその塩（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物）、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用することができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。
さらに、必要に応じて、ビタミン類や消泡剤等を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
さらに、必要に応じて、ビタミン類や消泡剤等を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
コリネ型細菌用培地としては、Ａ培地〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、ＢＴ培地〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕、ＣＧＸＩＩ培地〔特許第６３２２５７６号〕等が挙げられ、これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
なお、糖類を含む反応又は培養に先立ち、同様の培地で、形質転換体を好気条件下で、温度約２５～３８℃で、約１２～４８時間培養して増殖させることが好ましい。
培養温度又は反応温度は、１５～４５℃が好ましく、２５～３７℃がより好ましい。
また、培養又は反応時間は、２４時間～１６８時間、好ましくは２４時間～９６時間、より好ましくは２４時間～７２時間、必要に応じ撹拌又は振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
培養又は反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、好気的条件下で行うのが好ましい。
好気的条件下で反応又は培養を行う場合、芳香族化合物又はその塩の生成効率の点から、形質転換体の過度の増殖を抑制する条件下で行うのが好ましい。
また、培養又は反応時間は、２４時間～１６８時間、好ましくは２４時間～９６時間、より好ましくは２４時間～７２時間、必要に応じ撹拌又は振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
培養又は反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、好気的条件下で行うのが好ましい。
好気的条件下で反応又は培養を行う場合、芳香族化合物又はその塩の生成効率の点から、形質転換体の過度の増殖を抑制する条件下で行うのが好ましい。
培養物からの芳香族化合物又はその塩の回収及び精製方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。例えば、菌体を遠心分離等で除去した後、カチオン及びアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば芳香族化合物又はその塩を取得することができる。培養物中に蓄積された芳香族化合物又はその塩は、そのまま単離することなく用いてもよい。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
＜２＞改変コリネ型細菌が、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現が親細菌に比べて低下又は喪失した細菌株である、＜１＞の方法。
＜３＞シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体が下記（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される複合体、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドから構成される複合体、
で示されるシトクロームｂｄ型酸化酵素活性を有するポリペプチド複合体である、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞改変コリネ型細菌が、下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させるか又は不活性化してなる細菌株である、＜２＞又は＜３＞方法。
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド。
＜５＞宿主として、少なくとも下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）：
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されたコリネ型細菌を用いる、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｃ１）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｃ２）配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである、＜５＞の方法。
＜７＞（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｄ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｄ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドである、＜５＞の方法。
＜８＞（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドが、（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼから選ばれる１以上である、＜５＞の方法。
＜９＞（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼが、（ＥＩ－１）配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩ－２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであり、（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼが、（ＥＩＩ－１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩＩ－２）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドである、＜８＞の方法。
＜１０＞（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｆ１）配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｆ２）配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである、＜５＞の方法。
＜１１＞宿主として、さらに下記の（Ｇ）～（Ｏ）：
（Ｇ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｈ）３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）５－シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｋ）シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｌ）３－ホスホシキミ酸－１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｍ）コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｎ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｏ）ペントースリン酸経路に関わる酵素群：グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース－５－リン酸イソメラーゼ、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼから選ばれる１以上、
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されたコリネ型細菌を用いる、＜５＞～＜１０＞のいずれかの方法。
＜１２＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、カテコール、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、＜１＞～＜１１＞のいずれかの方法。
＜１３＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、＜１＞～＜１１＞のいずれかの方法。
＜１４＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、＜１＞～＜１１＞のいずれかの方法。
＜１５＞コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、＜１＞～＜１４＞のいずれかの方法。
＜１６＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウム ハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム、コリネバクテリウム カルナエ、コリネバクテリウム クレナタム又はコリネバクテリウム クルジラクチスである、＜１＞～＜１４＞のいずれかの方法。
＜１７＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、＜１＞～＜１４＞のいずれかの方法。
＜１＞シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
＜２＞改変コリネ型細菌が、シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の発現が親細菌に比べて低下又は喪失した細菌株である、＜１＞の方法。
＜３＞シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体が下記（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される複合体、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドから構成される複合体、
で示されるシトクロームｂｄ型酸化酵素活性を有するポリペプチド複合体である、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞改変コリネ型細菌が、下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させるか又は不活性化してなる細菌株である、＜２＞又は＜３＞方法。
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド。
＜５＞宿主として、少なくとも下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）：
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されたコリネ型細菌を用いる、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｃ１）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｃ２）配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである、＜５＞の方法。
＜７＞（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｄ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｄ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドである、＜５＞の方法。
＜８＞（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドが、（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼから選ばれる１以上である、＜５＞の方法。
＜９＞（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼが、（ＥＩ－１）配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩ－２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであり、（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼが、（ＥＩＩ－１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩＩ－２）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドである、＜８＞の方法。
＜１０＞（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｆ１）配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｆ２）配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである、＜５＞の方法。
＜１１＞宿主として、さらに下記の（Ｇ）～（Ｏ）：
（Ｇ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｈ）３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）５－シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｋ）シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｌ）３－ホスホシキミ酸－１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｍ）コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｎ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｏ）ペントースリン酸経路に関わる酵素群：グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース－５－リン酸イソメラーゼ、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼから選ばれる１以上、
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されたコリネ型細菌を用いる、＜５＞～＜１０＞のいずれかの方法。
＜１２＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、カテコール、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、＜１＞～＜１１＞のいずれかの方法。
＜１３＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、＜１＞～＜１１＞のいずれかの方法。
＜１４＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、＜１＞～＜１１＞のいずれかの方法。
＜１５＞コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、＜１＞～＜１４＞のいずれかの方法。
＜１６＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウム ハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム、コリネバクテリウム カルナエ、コリネバクテリウム クレナタム又はコリネバクテリウム クルジラクチスである、＜１＞～＜１４＞のいずれかの方法。
＜１７＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、＜１＞～＜１４＞のいずれかの方法。
＜１８＞シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌であって、少なくとも下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）：
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されている、コリネ型細菌。
＜１９＞シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体が下記（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される複合体、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドから構成される複合体、
で示されるシトクロームｂｄ型酸化酵素活性を有するポリペプチド複合体である、＜１８＞のコリネ型細菌。
＜２０＞下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させるか又は不活性化してなる、＜１８＞又は＜１９＞のコリネ型細菌。
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド。
＜２１＞（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｃ１）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｃ２）配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである、＜１８＞～＜２０＞のいずれかのコリネ型細菌。
＜２２＞（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｄ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｄ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドである、＜１８＞～＜２０＞のいずれかのコリネ型細菌。
＜２３＞（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドが、（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼから選ばれる１以上である、＜１８＞～＜２０＞のいずれかのコリネ型細菌。
＜２３＞（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼが、（ＥＩ－１）配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩ－２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであり、（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼが、（ＥＩＩ－１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩＩ－２）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドである、＜２２＞のコリネ型細菌。
＜２４＞（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｆ１）配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｆ２）配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである、＜１８＞～＜２０＞のいずれかのコリネ型細菌。
＜２５＞さらに下記の（Ｇ）～（Ｏ）：
（Ｇ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｈ）３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）５－シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｋ）シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｌ）３－ホスホシキミ酸－１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｍ）コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｎ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｏ）ペントースリン酸経路に関わる酵素群：グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース－５－リン酸イソメラーゼ、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼから選ばれる１以上、
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化された、＜１８＞～＜２４＞のいずれかのコリネ型細菌。
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されている、コリネ型細菌。
＜１９＞シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体が下記（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される複合体、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドから構成される複合体、
で示されるシトクロームｂｄ型酸化酵素活性を有するポリペプチド複合体である、＜１８＞のコリネ型細菌。
＜２０＞下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させるか又は不活性化してなる、＜１８＞又は＜１９＞のコリネ型細菌。
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される複合体をコードするポリヌクレオチド。
＜２１＞（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｃ１）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｃ２）配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３，４ージヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである、＜１８＞～＜２０＞のいずれかのコリネ型細菌。
＜２２＞（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｄ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｄ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドである、＜１８＞～＜２０＞のいずれかのコリネ型細菌。
＜２３＞（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチドが、（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼから選ばれる１以上である、＜１８＞～＜２０＞のいずれかのコリネ型細菌。
＜２３＞（ＥＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼが、（ＥＩ－１）配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩ－２）配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであり、（ＥＩＩ）４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼが、（ＥＩＩ－１）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ＥＩＩ－２）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドである、＜２２＞のコリネ型細菌。
＜２４＞（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、（Ｆ１）配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｆ２）配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つパラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである、＜１８＞～＜２０＞のいずれかのコリネ型細菌。
＜２５＞さらに下記の（Ｇ）～（Ｏ）：
（Ｇ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｈ）３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）５－シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｋ）シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｌ）３－ホスホシキミ酸－１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｍ）コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｎ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｏ）ペントースリン酸経路に関わる酵素群：グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース－５－リン酸イソメラーゼ、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼから選ばれる１以上、
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化された、＜１８＞～＜２４＞のいずれかのコリネ型細菌。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
＜コリスミ酸生産活性向上株の作製＞
１）ｃｇ１８２９（ａｒｏＣ) プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入したプラスミドの構築
ｃｇ１８２９遺領域の５’側上流領域（配列番号１０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１１と１２）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ１８２９遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号１３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１４と１５）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１６）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１７と１８）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（特願２０１４－５２３７５７を参照）を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＣを作製した。
１）ｃｇ１８２９（ａｒｏＣ) プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入したプラスミドの構築
ｃｇ１８２９遺領域の５’側上流領域（配列番号１０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１１と１２）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ１８２９遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号１３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１４と１５）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１６）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１７と１８）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（特願２０１４－５２３７５７を参照）を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＣを作製した。
２）ｃｇ１８２９（ａｒｏＣ) プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＣをＫＣ３１５株（特願２０２１－２０１８７７）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３６７ｓｒ株を取得した。配列番号１１と２１のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３６７ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ３６７ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＣが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ３６７ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３６７株を得た。配列番号２１と２２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３６７株が予想通りｃｇ１８２９（ａｒｏＣ） プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＣをＫＣ３１５株（特願２０２１－２０１８７７）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３６７ｓｒ株を取得した。配列番号１１と２１のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３６７ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ３６７ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＣが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ３６７ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３６７株を得た。配列番号２１と２２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３６７株が予想通りｃｇ１８２９（ａｒｏＣ） プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
３）ｃｇ１７７４（ｔｋｔ) プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入したプラスミドの構築
ｃｇ１７７４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号２３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２４と２５）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ１７７４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（塩基番号２６）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２７と２８）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１６）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１７と１８）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｔｋｔを作製した。
ｃｇ１７７４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号２３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２４と２５）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ１７７４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（塩基番号２６）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号２７と２８）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１６）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１７と１８）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｔｋｔを作製した。
４）ｃｇ１７７４（ｔｋｔ) プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｔｋｔをＫＣ３６７株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３７６ｓｒ株を取得した。配列番号２４と２９のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３７６ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ３７６ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｔｋｔがｃｇ１７７４のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ３７６ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３７６株を得た。配列番号２９と３０のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３７６株が予想通りｃｇ１７７４（ｔｋｔ） プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｔｋｔをＫＣ３６７株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３７６ｓｒ株を取得した。配列番号２４と２９のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３７６ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ３７６ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｔｋｔがｃｇ１７７４のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ３７６ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３７６株を得た。配列番号２９と３０のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３７６株が予想通りｃｇ１７７４（ｔｋｔ） プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
５）ｃｇ０６４４（ｐｐｓＡ) プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入したプラスミドの構築
ｃｇ０６４４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号３１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３２と３３）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ０６４４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（塩基番号３４）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３５と３６）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１６）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１７と１８）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｐｐｓＡを作製した。
ｃｇ０６４４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号３１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３２と３３）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ０６４４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（塩基番号３４）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号３５と３６）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１６）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１７と１８）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｐｐｓＡを作製した。
６）ｃｇ０６４４（ｐｐｓＡ) プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｐｐｓＡをＫＣ３７６株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４０８ｓｒ株を取得した。配列番号３２と３７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４０８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４０８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｔｋｔが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４０８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４０８株を得た。配列番号３７と３８のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４０８株が予想通りｃｇ０６４４（ｔｋｔ） プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｐｐｓＡをＫＣ３７６株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４０８ｓｒ株を取得した。配列番号３２と３７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４０８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４０８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ｔｋｔが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４０８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４０８株を得た。配列番号３７と３８のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４０８株が予想通りｃｇ０６４４（ｔｋｔ） プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
＜４－アミノ安息香酸（４－ＡＢＡ）の生産性評価＞
（１）４－ＡＢＡ生産株の作製
１）ｃｇ１１３４(ｐａｂＡＢ) プロモーター領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを導入するためのプラスミドの構築
ｃｇ１１３４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号３９）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４０と４１）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ１１３４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号４２）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４３と４４）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号４５）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４６と４７）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｃｇ２８７５－ｐａｂＡＢを作製した。
（１）４－ＡＢＡ生産株の作製
１）ｃｇ１１３４(ｐａｂＡＢ) プロモーター領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを導入するためのプラスミドの構築
ｃｇ１１３４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号３９）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４０と４１）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ１１３４遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号４２）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４３と４４）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号４５）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４６と４７）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｃｇ２８７５－ｐａｂＡＢを作製した。
２）ｃｇ１１３４（ｐａｂＡＢ) プロモーター領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｃｇ２８７５－ｐａｂＡＢをＫＣ４０８株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４１２ｓｒ株を取得した。配列番号４０と４８のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４１２ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４１２ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｃｇ２８７５－ｐａｂＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４１２ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４１２株を得た。配列番号４８と４９のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４１２株が予想通りｃｇ１１３４（ｐａｂＡＢ) プロモーター領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｃｇ２８７５－ｐａｂＡＢをＫＣ４０８株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４１２ｓｒ株を取得した。配列番号４０と４８のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４１２ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４１２ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｃｇ２８７５－ｐａｂＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４１２ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４１２株を得た。配列番号４８と４９のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４１２株が予想通りｃｇ１１３４（ｐａｂＡＢ) プロモーター領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（２）４－ＡＢＡ生産ｃｙｄＡＢ破壊株の作製
１）ｃｇ１３００－１３０１(ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域を欠損するためのプラスミドの構築
ｃｇ１３００遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号５０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５１と５２）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ１３０１遺伝子領域の３’側下流領域（塩基番号５３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５４と５５）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢを作製した。
１）ｃｇ１３００－１３０１(ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域を欠損するためのプラスミドの構築
ｃｇ１３００遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号５０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５１と５２）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ１３０１遺伝子領域の３’側下流領域（塩基番号５３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５４と５５）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢを作製した。
２）ｃｇ１３００－１３０１（ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域を欠損した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢをＫＣ４１２株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４１８ｓｒ株を取得した。配列番号５１と５６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４１８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４１８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４１８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４１８株を得た。配列番号５６と５７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４１８株が予想通りｃｇ１３００－１３０１（ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢをＫＣ４１２株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４１８ｓｒ株を取得した。配列番号５１と５６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４１８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４１８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４１８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４１８株を得た。配列番号５６と５７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４１８株が予想通りｃｇ１３００－１３０１（ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（３）４－ＡＢＡ生産ｃｔａＣＦ破壊株の作製
１）ｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域を欠損するためのプラスミドの構築
ｃｇ２４０８遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号５８）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５９と６０）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ２４０９遺伝子領域の３’側領域（塩基番号６１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６２と６３）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦを作製した。
１）ｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域を欠損するためのプラスミドの構築
ｃｇ２４０８遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号５８）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号５９と６０）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ２４０９遺伝子領域の３’側領域（塩基番号６１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６２と６３）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦを作製した。
２）ｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域を欠損した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦをＫＣ４１２株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４６９ｓｒ株を取得した。配列番号５９と６４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４６９ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４６９ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４６９ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４６９株を得た。配列番号６４と６５とのプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４６９株が予想通りｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦをＫＣ４１２株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４６９ｓｒ株を取得した。配列番号５９と６４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４６９ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４６９ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４６９ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４６９株を得た。配列番号６４と６５とのプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４６９株が予想通りｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（４）形質転換株の培養
１）上記で得られた形質転換株をＬＢプレートに画線し、３０℃で３日間培養した。プレート上に生育した菌体を、ＣＧＴＧ１５培地（表４）６ｍＬに植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間振盪培養（前培養）を行った。ＣＧＴＧ１５培地（構成成分からurea除く）を、Ｂｉｏ Ｊｒ．８（エイブル株式会社）の培養槽に６０ｍＬ仕込んだ。前記前培養液を１．２ｍＬ植菌し、３２℃、ｐＨ６．９，７００ｒｐｍ、６０ｍＬ／ｍｉｎの通気量の条件で３０時間振盪培養を行い、芳香族化合物の生産性を評価した。培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中の濃度を定量した。結果を表に示した。
１）上記で得られた形質転換株をＬＢプレートに画線し、３０℃で３日間培養した。プレート上に生育した菌体を、ＣＧＴＧ１５培地（表４）６ｍＬに植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間振盪培養（前培養）を行った。ＣＧＴＧ１５培地（構成成分からurea除く）を、Ｂｉｏ Ｊｒ．８（エイブル株式会社）の培養槽に６０ｍＬ仕込んだ。前記前培養液を１．２ｍＬ植菌し、３２℃、ｐＨ６．９，７００ｒｐｍ、６０ｍＬ／ｍｉｎの通気量の条件で３０時間振盪培養を行い、芳香族化合物の生産性を評価した。培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中の濃度を定量した。結果を表に示した。
２）結果
比較すると、ＫＣ４１８株において４－ＡＢＡ濃度が向上していることが確認され、ｃｙｄＡＢ遺伝子の破壊効果は生産には好影響を及ぼすことが示された。また、ＫＣ４６９は４－ＡＢＡ濃度が低下していることが確認され、ｃｔａＣＦ遺伝子の破壊効果は生産には悪影響を及ぼすことが示された（表１－１、表１－２）。
比較すると、ＫＣ４１８株において４－ＡＢＡ濃度が向上していることが確認され、ｃｙｄＡＢ遺伝子の破壊効果は生産には好影響を及ぼすことが示された。また、ＫＣ４６９は４－ＡＢＡ濃度が低下していることが確認され、ｃｔａＣＦ遺伝子の破壊効果は生産には悪影響を及ぼすことが示された（表１－１、表１－２）。
＜４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ）の生産性評価＞
（１）４，３－ＡＨＢＡ生産菌の作製
１）ｃｇ２４８４遺伝子領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターと結合させたＨＦＭ１２２変異体遺伝子を導入するためのプラスミドの構築
ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２（特願２０１９－２０３５２３を参照）を鋳型に２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６３と６４）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。ＨＦＭ１２２変異体遺伝子の２種類の断片（配列番号６８と６９）を遺伝子合成し（ユーロフィンゲノミクスおよびジェンスクリプト）、それぞれ２種類のＤＮＡプライマー（配列番号７０と７１および７２と７３）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２を作製した。
ｃｇ２４８４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号７４）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号７５と７６）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ２４８４遺伝子領域の３’側領域（配列番号７７）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号７８と７９）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号４５）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４６と４７）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、上記プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２を鋳型に２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６９と８０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた５種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Δｃｇ２４８４：：Ｐｃｇ２８７５－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２を作製した。
（１）４，３－ＡＨＢＡ生産菌の作製
１）ｃｇ２４８４遺伝子領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターと結合させたＨＦＭ１２２変異体遺伝子を導入するためのプラスミドの構築
ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２（特願２０１９－２０３５２３を参照）を鋳型に２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６３と６４）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。ＨＦＭ１２２変異体遺伝子の２種類の断片（配列番号６８と６９）を遺伝子合成し（ユーロフィンゲノミクスおよびジェンスクリプト）、それぞれ２種類のＤＮＡプライマー（配列番号７０と７１および７２と７３）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２を作製した。
ｃｇ２４８４遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号７４）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号７５と７６）を用いたＰＣＲにて増幅し、またｃｇ２４８４遺伝子領域の３’側領域（配列番号７７）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号７８と７９）を用いたＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号４５）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号４６と４７）を用いたＰＣＲにて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、上記プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２を鋳型に２種類のＤＮＡプライマー（配列番号６９と８０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１９と２０）を用いたＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた５種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Δｃｇ２４８４：：Ｐｃｇ２８７５－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２を作製した。
２）ｃｇ２４８４遺伝子領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターと結合させたＨＦＭ１２２変異体遺伝子を導入した株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Δｃｇ２４８４：：Ｐｃｇ２８７５－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２をＫＣ４１２株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４１７ｓｒ株を取得した。配列番号６７と８１のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４１７ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４１７ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Δｃｇ２４８４：：Ｐｃｇ２８７５－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２が導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４１７ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４１７株を得た。配列番号８１と８２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４１７株が予想通りｃｇ２４８４遺伝子領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターと結合させたＨＦＭ１２２変異体遺伝子を導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Δｃｇ２４８４：：Ｐｃｇ２８７５－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２をＫＣ４１２株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４１７ｓｒ株を取得した。配列番号６７と８１のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４１７ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４１７ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Δｃｇ２４８４：：Ｐｃｇ２８７５－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ１－ＨＦＭ１２２ＬＡ＿ＯＰＴ２が導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４１７ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４１７株を得た。配列番号８１と８２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４１７株が予想通りｃｇ２４８４遺伝子領域にｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターと結合させたＨＦＭ１２２変異体遺伝子を導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（２）４，３－ＡＨＢＡ生産ｃｙｄＡＢ破壊株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢをＫＣ４１７株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４２７ｓｒ株を取得した。配列番号５１と５６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４２７ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４２７ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４２７ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４２７株を得た。配列番号５６と５７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４２７株が予想通りｃｇ１３００－１３０１（ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢをＫＣ４１７株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４２７ｓｒ株を取得した。配列番号５１と５６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４２７ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４２７ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４２７ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４２７株を得た。配列番号５６と５７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４２７株が予想通りｃｇ１３００－１３０１（ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（３）４，３－ＡＨＢＡ生産ｃｔａＣＦ破壊株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦをＫＣ４１７株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４７０ｓｒ株を取得した。配列番号５９と６４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４７０ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４７０ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４７０ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４７０株を得た。配列番号６４と６５のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４７０株が予想通りｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦをＫＣ４１７株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４７０ｓｒ株を取得した。配列番号５９と６４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４７０ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４７０ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４７０ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４７０株を得た。配列番号６４と６５のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４７０株が予想通りｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（４）形質転換株の培養
１）上記で得られた形質転換株をＬＢプレートに画線し、３０℃で３日間培養した。プレート上に生育した菌体を、ＣＧＴＧ１５培地６ｍＬに植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間振盪培養（前培養）を行った。ＣＧＴＧ１５培地（構成成分からｕｒｅａ除く）を、Ｂｉｏ Ｊｒ．８（エイブル株式会社）の培養槽に６０ｍＬ仕込んだ。前記前培養液を１．２ｍＬ植菌し、３２℃、ｐＨ６．９，７００ｒｐｍ、６０ｍＬ／ｍｉｎの通気量の条件で３０時間振盪培養を行い、芳香族化合物の生産性を評価した。培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中の濃度を定量した。結果を表に示した。
１）上記で得られた形質転換株をＬＢプレートに画線し、３０℃で３日間培養した。プレート上に生育した菌体を、ＣＧＴＧ１５培地６ｍＬに植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間振盪培養（前培養）を行った。ＣＧＴＧ１５培地（構成成分からｕｒｅａ除く）を、Ｂｉｏ Ｊｒ．８（エイブル株式会社）の培養槽に６０ｍＬ仕込んだ。前記前培養液を１．２ｍＬ植菌し、３２℃、ｐＨ６．９，７００ｒｐｍ、６０ｍＬ／ｍｉｎの通気量の条件で３０時間振盪培養を行い、芳香族化合物の生産性を評価した。培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中の濃度を定量した。結果を表に示した。
２）結果
比較すると、ＫＣ４２７株において４，３－ＡＨＢＡ濃度が向上していることが確認され、ｃｙｄＡＢ遺伝子の破壊効果は生産には好影響を及ぼすことが示された。また、ＫＣ４７０は４，３－ＡＨＢＡ濃度が低下していることが確認され、ｃｔａＣＦ遺伝子の破壊効果は生産には悪影響を及ぼすことが示された。
比較すると、ＫＣ４２７株において４，３－ＡＨＢＡ濃度が向上していることが確認され、ｃｙｄＡＢ遺伝子の破壊効果は生産には好影響を及ぼすことが示された。また、ＫＣ４７０は４，３－ＡＨＢＡ濃度が低下していることが確認され、ｃｔａＣＦ遺伝子の破壊効果は生産には悪影響を及ぼすことが示された。
＜没食子酸（ＧＡＬ）の生産性評価＞
（１）ＧＡＬ生産ｃｙｄＡＢ破壊株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢをＫＣ１４８株（特願2020-94649）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ２０１ｓｒ株を取得した。配列番号５１と５６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ２０１ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ２０１ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ２０１ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ２０１株を得た。配列番号５６と５７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ２０１株が予想通りｃｇ１３００－１３０１（ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（１）ＧＡＬ生産ｃｙｄＡＢ破壊株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢをＫＣ１４８株（特願2020-94649）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ２０１ｓｒ株を取得した。配列番号５１と５６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ２０１ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ２０１ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｙｄＡＢが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ２０１ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ２０１株を得た。配列番号５６と５７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ２０１株が予想通りｃｇ１３００－１３０１（ｃｙｄＡＢ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（２）ＧＡＬ生産ｃｔａＣＦ破壊株の作製
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦをＫＣ１４８株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４６８ｓｒ株を取得した。配列番号５９と６４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４６８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４６８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４６８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４６８株を得た。配列番号６４と６５のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４６８株が予想通りｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦをＫＣ１４８株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ４６８ｓｒ株を取得した。配列番号５９と６４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ４６８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ４６８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｃｔａＣＦが導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
ＫＣ４６８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ４６８株を得た。配列番号６４と６５のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ４６８株が予想通りｃｇ２４０８－２４０９（ｃｔａＣＦ)遺伝子領域が欠損されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（３）形質転換株の培養
１）上記で得られた形質転換株をＬＢプレートに画線し、３０℃で３日間培養した。プレート上に生育した菌体を、ＣＧＴＧ１５培地６ｍＬに植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間振盪培養（前培養）を行った。ＣＧＴＧ１５培地（構成成分からｕｒｅａ除く）に安息香酸ナトリウムを終濃度１ｍＭとなるように添加し、Ｂｉｏ Ｊｒ．８（エイブル株式会社）の培養槽に６０ｍＬ仕込んだ。前記前培養液を１．２ｍＬ植菌し、３２℃、ｐＨ６．９，６００ｒｐｍ、６０ｍＬ／ｍｉｎの通気量の条件で３０時間振盪培養を行い、ＧＡＬの生産性を評価した。培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中の濃度を定量した。結果を表に示した。
１）上記で得られた形質転換株をＬＢプレートに画線し、３０℃で３日間培養した。プレート上に生育した菌体を、ＣＧＴＧ１５培地６ｍＬに植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間振盪培養（前培養）を行った。ＣＧＴＧ１５培地（構成成分からｕｒｅａ除く）に安息香酸ナトリウムを終濃度１ｍＭとなるように添加し、Ｂｉｏ Ｊｒ．８（エイブル株式会社）の培養槽に６０ｍＬ仕込んだ。前記前培養液を１．２ｍＬ植菌し、３２℃、ｐＨ６．９，６００ｒｐｍ、６０ｍＬ／ｍｉｎの通気量の条件で３０時間振盪培養を行い、ＧＡＬの生産性を評価した。培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中の濃度を定量した。結果を表に示した。
２）結果
比較すると、ＫＣ２０１株においてＧＡＬ濃度が向上していることが確認され、ｃｙｄＡＢ遺伝子の破壊効果は生産には好影響を及ぼすことが示された。また、ＫＣ４６８はＧＡＬ濃度が低下していることが確認され、ｃｔａＣＦ遺伝子の破壊効果は生産には悪影響を及ぼすことが示された。
比較すると、ＫＣ２０１株においてＧＡＬ濃度が向上していることが確認され、ｃｙｄＡＢ遺伝子の破壊効果は生産には好影響を及ぼすことが示された。また、ＫＣ４６８はＧＡＬ濃度が低下していることが確認され、ｃｔａＣＦ遺伝子の破壊効果は生産には悪影響を及ぼすことが示された。
（４）分析条件
回収した上清はアクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行ない、反応液をＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣの装置はＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。没食子酸の分析には、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。没食子酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。
グルコースの分析にはＩＣｓｅｐ ＩＯＮ－３００（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、東京化成工業）を用い、溶離液を３７ｍＭ硫酸溶液とし、流速０．５ｍＬ／分、カラム温度５０℃の条件で検出を行った。グルコースの検出にはＲＩを用いた。
回収した上清はアクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行ない、反応液をＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣの装置はＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。没食子酸の分析には、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。没食子酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。
グルコースの分析にはＩＣｓｅｐ ＩＯＮ－３００（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、東京化成工業）を用い、溶離液を３７ｍＭ硫酸溶液とし、流速０．５ｍＬ／分、カラム温度５０℃の条件で検出を行った。グルコースの検出にはＲＩを用いた。
Claims (11)
- シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
- シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体が下記（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される複合体、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩとして機能するポリペプチド及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、シトクロームｂｄ型酸化酵素サブユニットＩＩとして機能するポリペプチドから構成される複合体、
で示されるシトクロームｂｄ型酸化酵素活性を有するポリペプチド複合体である、請求項１記載の方法。 - 宿主として、少なくとも下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）：
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されたコリネ型細菌を用いる、請求項１又は２に記載の方法。 - 宿主として、さらに下記の（Ｇ）～（Ｏ）：
（Ｇ）３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｈ）３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）５－シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｋ）シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｌ）３－ホスホシキミ酸－１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｍ）コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｎ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｏ）ペントースリン酸経路に関わる酵素群：グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース－５－リン酸イソメラーゼ、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼから選ばれる１以上、
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されたコリネ型細菌を用いる、請求項３に記載の方法。 - 芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、カテコール、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、請求項１に記載の方法。
- 芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、請求項１に記載の方法。
- 芳香族化合物又はその塩が没食子酸、４－アミノ安息香酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、請求項１に記載の方法。
- コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、請求項１に記載の方法。
- コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウム ハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム、コリネバクテリウム カルナエ、コリネバクテリウム クレナタム又はコリネバクテリウム クルジラクチスである、請求項８に記載の方法。
- コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、請求項８に記載の方法。
- シトクロームｂｄ型酸化酵素複合体の機能が抑制又は欠失された改変コリネ型細菌であって、少なくとも下記の（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）：
（Ｃ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）３－デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）コリスミ酸からパラアミノ安息香酸を生合成するために必要なポリペプチド
（Ｆ）パラアミノ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
から選ばれる１以上のポリペプチドの発現が強化されている、コリネ型細菌。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022103038A JP2024003706A (ja) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | 芳香族化合物の製造方法 |
| PCT/JP2023/023872 WO2024005033A1 (ja) | 2022-06-27 | 2023-06-27 | 芳香族化合物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022103038A JP2024003706A (ja) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | 芳香族化合物の製造方法 |
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|---|---|
| JP2024003706A true JP2024003706A (ja) | 2024-01-15 |
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ID=89382299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022103038A Pending JP2024003706A (ja) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | 芳香族化合物の製造方法 |
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|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2021185831A (ja) * | 2020-05-29 | 2021-12-13 | 花王株式会社 | 没食子酸生産能を有する形質転換体 |
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2022
- 2022-06-27 JP JP2022103038A patent/JP2024003706A/ja active Pending
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