JP2019195330A - 遺伝子操作された微生物からのムコン酸の生成 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年1月30日に出願された米国特許仮出願第61/632,777号の優先権を主張する。
株および接種材料の調製:本発明において用いられる細菌株およびプラスミドの一覧を、表1に提供する。本明細書に開示される株コンストラクションの全ての特定例は、野生型大腸菌C株(ATCC8739)または大腸菌K−12株(YMC9もしくはMM294)から誘導されるが、本明細書に開示される遺伝子エレメントを、任意の他の好適な大腸菌株中で集合させることができ、本明細書に開示される遺伝子エレメントの発現カセットまたは適切な類似体および相同体を、発酵プロセスによるcis,cis−ムコン酸の商業生産のために用いることができる他の種の細菌、古細菌、酵母、藻類、および糸状菌などの、任意の他の好適な微生物中で集合させることができる。
大腸菌のtyrR遺伝子を、化学的もしくは放射線突然変異誘発およびスクリーニング(例えば、PCRおよびDNA配列決定による)または類似体耐性(例えば、4−フルオロチロシンに対する耐性)に関する選択、トランスポゾン突然変異誘発、バクテリオファージMu突然変異誘発、または形質転換などのいくつかの周知の方法のいずれか1つにより突然変異させることができる。好ましい実施形態においては、tyrR遺伝子中の突然変異は、ヌル突然変異(検出可能な活性を無くする突然変異)であり、より好ましい実施形態においては、tyrR遺伝子少なくとも一部が検出される。これを、例えば、線状DNA分子を用いる2工程の形質転換法を用いることにより達成することができる(Jantama et al, 2008a; Jantama et al, 2008b)。第1の工程においては、camR、sacBカセットがtyrR遺伝子座に組込まれて、二重組換えおよびクロラムフェニコール耐性の選択により、tyrRオープンリーディングフレームの多くまたは全部が置きかわる。第2の工程においては、欠失型のtyrR遺伝子を含む線状DNAが、二重組換え、LBなどの富栄養培地中の5%スクロースに対する耐性の選択により組込まれる。正確な欠失は、診断的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により同定および確認される。tyrRを欠失させる目的は、aroGおよびaroFの発現を増加させることである。同様の結果を達成する代替的な手法は、aroGおよび/またはaroFの前の天然プロモーターを、強力な構成的プロモーターと置きかえ、必要に応じて、転写ターミネーターを付加することである。これをどのように達成するかに関するさらなる詳細は、一般に、以下の実施例4に与えられる。
フィードバック耐性AroG酵素(3−デオキシ−D−アラビノヘプツロソネート−7−リン酸シンターゼまたはDAHPS)をもたらすaroG遺伝子中の突然変異は、当業界で周知である(Shumilin et al, 1999; Kikuchi et al, 1997; Shumilin et al, 2002)。また、そのような突然変異を作出、同定、および特性評価する方法も周知である(Ger et al., 1994, Hu et al., 2003)。好ましい突然変異は、フェニルアラニンによる阻害に対する完全な耐性をもたらすものである。公知の公開されたフィードバック耐性突然変異のいずれかを、いくつかの周知の方法のいずれかにより染色体中またはプラスミド上に含まれるaroG遺伝子中に導入することができ、その一例は、所望の突然変異をPCRプライミングオリゴヌクレオチドの一部として合成する突然変異誘発性PCRである(Hu et al., 2003)。突然変異の正確な導入は、DNA配列決定により確認される。大腸菌Cに由来する野生型aroG遺伝子の配列を、配列番号18に与える。好ましい突然変異は、例えば、コドン150をCCAからCTAに変化させることによる、AroGのアミノ酸150をプロリンからロイシンに変化させる点突然変異である(Hu et al, 2003)。より好ましい実施形態においては、コドン150を、大腸菌における好ましいコドンである、CCAからCTGに変化させる。コードされたDAHPシンターゼは最大3mMでフェニルアラニンによる阻害に対して完全に耐性であり、それは野生型酵素と同様の比活性を有するため(Hu et al, 2003)、aroGのこの特定の対立遺伝子が好ましい。
本実施例においては、多コピープラスミド上でのaroBおよびaroGの過剰発現の効果ならびにムコン酸経路において機能的なタンパク質をコードする遺伝子の発現を調査した。シキメートデヒドロゲナーゼをコードするaroE遺伝子中に欠失を含む株MYR34を、これらの試験における親株として用いた。aroEの染色体コピーの欠失を、実施例1に上記されたものと同様の様式で達成した。MYR34を、シキミ酸経路において機能的なDAHPシンターゼタンパク質をコードするaroG遺伝子を過剰発現するプラスミドpCP32AMPを用いて形質転換した場合、DHSの蓄積が有意に増加した。MYR34を、構成的プロモーターからaroBを発現するプラスミドを用いて形質転換した場合、DHSの蓄積の有意な増加は見られなかった。しかしながら、大腸菌株MYR34を、aroBとaroG遺伝子の両方を発現するプラスミドを用いて形質転換した場合、aroGのみを用いて形質転換されたMYR34について観察されたものよりもDHSの蓄積が増加し、かくして、これはaroBがDHS生成における第2のボトルネックであることを示唆している(図5)。
tktAによりコードされるトランスケトラーゼは、ペントースリン酸経路における重要な酵素であり、ムコン酸の生成における重要な中間体の1つであるエリスロース−4−リン酸の生成を制限すると考えられる。トランスケトラーゼをコードするtktAの過剰発現は、多コピープラスミド上で遺伝子にその天然プロモーターを導入することにより(Sprenger et al, 1995, 1995a)、芳香族経路への流動を改善することが知られている(Draths et al., 1992)。しかしながら、そのようなプラスミドは不安定であり、維持のために抗生物質選択を必要とすることが多い。先行技術における別の手法は、1個のさらなるコピーのtktA遺伝子を、宿主株の染色体に付加することであった(Niu et al., 2002)。しかしながら、天然プロモーターは理想にあまり近いものではないため、天然プロモーターを含む1個のさらなるコピーのtktAは、芳香族経路をエリスロース−4−リン酸で飽和させるには十分なものではない。そのようなものとして、このプロセスは実質的な改善を必要とする。
talB遺伝子は大腸菌において優勢なトランスアルドラーゼをコードするが、talA遺伝子はまた、少量のトランスアルドラーゼもコードする。トランスアルドラーゼの過剰生成は、芳香族経路への流動を改善することが知られている(Lu and Liao, 1997; Sprenger, 1995; Sprenger et al, 1995b)。先行技術においては、これは、天然プロモーターからの多コピープラスミド上のtal遺伝子(現在はtalB遺伝子として知られる)の過剰発現により達成された(Lu et al., 1997, Sprenger et al., 1995b)。しかしながら、そのようなプラスミドは不安定であり、維持のために抗生物質選択を必要とする。かくして、改善されたプロセスが必要である。talBの改善された発現を、例えば、染色体中の天然のtalBプロモーターを、強力な構成的プロモーター、例えば、バチルス・サブチリスファージSPO1に由来するP15もしくはP26プロモーター(それぞれ、配列番号1および配列番号2)、またはバクテリオファージラムダに由来するPRプロモーター(配列番号3)で置換することにより得ることができる。これは、camR、sacBカセットを用いて、第1の工程において天然の染色体talBプロモーターを置きかえる以外は実施例1に記載のように2つの工程において達成される。第2の工程において、強力な構成的プロモーターは、強力な構成的プロモーターの下流側のtalBコード領域の5’末端の少なくとも50塩基および強力な構成的プロモーターの上流側の天然のtalBプロモーターのすぐ上流の相同な少なくとも50塩基対に隣接した強力な構成的プロモーターを含む線状DNAで形質転換し、スクロース耐性について選択することにより導入される。talA遺伝子を、同様の方法により過剰発現させることもできるが、talB遺伝子は優勢な活性をコードするため、それを過剰発現させるのが好ましい(Sprenger, 1995; Sprenger et al, 1995b)。過剰発現のために設計された発現カセットの構築に関するさらなる詳細については、実施例4を参照されたい。
大腸菌により生成された内因性DHSのムコン酸への変換を証明するために、異種遺伝子、アシネトバクター種ADP1に由来するcatAX、クレブシエラ・ニューモニアに由来するaroY、およびアシネトバクター種ADP1に由来するquiCを、低コピープラスミドpCL1921(Lerner and Inouye, 1990)中に強力な構成的プロモーター(それぞれ、P15、PR、およびP26)の下でクローニングして、「ムコンプラスミド」pMG37を作成した。空のベクター(pCL1921)またはpMG37を担持するMYR34株誘導体を、2%グルコースを含有する振とうフラスコ培地(芳香族アミノ酸およびビタミンを添加したNBS最少培地)中、37℃で17h増殖させた。上清を回収し、HPLCにより分析した。DHSの蓄積を示すMYR34/pCL1921とは対照的に、MYR34/pMG37はムコン酸の生成を示す(図12)。後者の株からは有意な量のDHS、またはPCAおよびカテコールなどの中間生成物は検出されなかったが、これは、pMG37から発現された異種遺伝子が機能的であり、十分であったことを示唆している。
3つの異なるaroZ相同体および類似体を、DHSをムコン酸生成経路に向かわせるその能力について比較した(図13)。アシネトバクター種ADP1に由来するquiC、バチルス・チューリンゲンシスに由来するasbF、およびニューロスポラ・クラッサに由来するqa−4は、AroZ様活性を有するタンパク質をコードすると報告されている(Elsemore and Ornston, 1995; Fox et al, 1995; Rutledge, 1984)。これらの遺伝子はそれぞれ、大腸菌における発現のためにコドン最適化され、GeneArt(Invitrogen)によって合成され、それぞれP15およびPRプロモーターからcatAXおよびaroY遺伝子も発現する低コピー「ムコンプラスミド」中の強力な構成的P26プロモーターの下にクローニングされた。MYR34/pCL1921、MYR34/pMG37(aroZとしてquiCを有するムコンプラスミド)、MYR34/pMG47(aroZとしてasbFを有するムコンプラスミド)、およびMYR34/pMG70(aroZとしてasbFを有するムコンプラスミド)を、2%グルコース、芳香族アミノ酸および芳香族ビタミンを含有する最少培地を含む振とうフラスコ中、37℃で48h増殖させた。上清を回収し、HPLCにより分析した。予想通り、空のベクターで形質転換したMYR34はDHSを蓄積し、ムコン酸を生成しなかった。検査した2つのaroZ相同体および1つの類似体は、ムコン酸生成にDHSを向かわせることにおいて機能的であったが、その程度は異なっていた。quiC遺伝子を発現するMYR34誘導体は最も強固であり、DHSのムコン酸へのほぼ100%の変換を示し、有意でない量のDHS保持を示した。真菌のaroZ相同体qa−4を発現するMYR34誘導体は、次いで、DHSのムコン酸への約80%の変換および20%のDHS保持を示した。最後に、asbF遺伝子を発現するMYR34誘導体は、DHSのムコン酸へのわずかに50%の変換および50%のDHS保持を示した。総合すると、本発明者らの振とうフラスコアッセイ条件下では、quiC遺伝子の発現および/または活性は、他のaroZ相同体のものと比較して最も高いと考えられた。
adhE遺伝子座の構成的プロモーターから発現される染色体のみに組込まれた単一コピーのcatA−X、aroYおよびquiCを含む株により、ムコン酸を生成させることができる。
MYR352株におけるカテコールの蓄積およびムコン酸の非効率的生成は、catAX遺伝子産物(複数可)の用量および/または活性が限られていることに起因する。上記のように、MYR352は、強力な構成的プロモーターの下にΔaroE、Δack::P15−aroBならびに染色体に組込まれた単一コピーのcatAX、aroYおよびquiC遺伝子を含む。この株を、中コピーの空ベクター対照(YEp24)またはaroG/tktA発現プラスミド(pCP50)を用いて形質転換して、芳香族アミノ酸合成経路への炭素の流動を増加させ、多量のDHSを生成させた。上記のように2%グルコースを添加した振とうフラスコ培地中、37℃で72h、形質転換された株を増殖させることにより、カテコール中間体の蓄積が得られた。この結果は、catAX活性がMYR352において不十分であり得ることを示唆していた。この仮説を確認するために、低コピープラスミドから発現された1つまたは複数のムコン酸経路遺伝子がMYR352/pCP50中でのカテコール蓄積を軽減する能力を試験した(図15)。具体的には、MYR352/pCP50を、低コピーの空ベクター対照(pCL1921)またはムコン酸生成経路の3つ全部の遺伝子、2つの遺伝子、もしくは1つの遺伝子を発現するプラスミドを用いてさらに形質転換した。誘導体株を、上記のように振とうフラスコ実験においてアッセイした。aroYのみ(pMG27から)またはquiCのみ(pMG39から)の量の増加はカテコール蓄積を軽減しなかったが、ムコン酸経路遺伝子の全部の発現(pMG37から)またはcatAXおよびaroYの同時発現(pMG33から)により、カテコールのムコン酸への変換の成功が得られた。さらに、catAXのみの発現(pMG31から)は、ムコン酸の生成にとって十分なものであり、カテコールの蓄積を防止した。
cis,cis−ムコン酸を生成するための先行技術のプロセスにおいて、宿主株は、ヌル突然変異であるaroE353という名称のaroE遺伝子中の突然変異を含む。結果として、この株は、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン)ならびにシキメート経路から作られた芳香族ビタミン(p−ヒドロキシ安息香酸、p−アミノ安息香酸、および2,3−ジヒドロキシ安息香酸)の供給を必要とする。芳香族アミノ酸は、商業的に魅力的なプロセスにおいて供給するにはあまりにも高価である。そのようなものとして、先行技術のプロセスは、実質的な改善を必要とする。これを、本発明者らがaroE*と呼ぶ漏れやすい型のaroE遺伝子を導入することにより達成することができる。漏れやすい突然変異は、ヌル表現型をもたらすaroEコード配列中の1個のアミノ酸を変化させるミスセンス突然変異を最初に作成することにより得られる。これを、任意の形態の突然変異誘発および上記に列挙された6つの芳香族化合物の同時的栄養要求性のスクリーニングにより達成することができる。好ましい方法は、TaqDNAポリメラーゼ、鋳型としての野生型大腸菌CゲノムDNA、ならびにaroEコード領域の約1000塩基対上流および1000塩基対下流にハイブリダイズするPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、変異性PCR突然変異誘発により、aroE突然変異遺伝子のプールを作出することである。線状DNA分子の得られるプールを用いて、cis,cis−ムコン酸を生成し、aroEコード領域(関連する例については実施例4を参照されたい)を置きかえた組込まれたcamR、sacBカセットを含む大腸菌C誘導体を形質転換し、スクロース耐性について選択する。次いで、形質転換体を、クロラムフェニコール耐性を喪失した、上記に列挙された6つの芳香族化合物を要求する栄養要求株についてスクリーニングする。いくつかの独立した栄養要求株を拾い、6つの芳香族化合物を含まない最少グルコースプレート上に約107、108、または109個の細胞(最少グルコース培地中で洗浄)を塗布することにより、復帰突然変異性(revertability)について試験する。プレート上にコロニーとして生じる復帰突然変異体を拾い、cis,cis−ムコン酸の生成について試験するが、それらは実質的なレベルの芳香族アミノ酸を生成しない。そのような復帰突然変異体はaroE遺伝子中に1つまたは複数の突然変異を担持する株であり、AroE酵素は増殖のための十分な芳香族アミノ酸およびビタミンを提供するが、余剰のこれらの芳香族化合物は提供しない。漏れやすいaroE突然変異体を得るための別の方法は、aroE353およびaroE24(両方ともColi Genetic Stock Center、Yale University、New Haven、CT、USAから入手可能である)などの古典的な復帰突然変異性aroE突然変異体の1つを、cis,cis−ムコン酸生成株中に導入し、上記のような復帰突然変異体を選択することである。
芳香族経路の第1の関連する工程における基質の1つは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)である。PEPは、細菌ホスホトランスフェラーゼ系(PTS)によりグルコースおよびいくつかの他の糖を移入するためのリン酸およびエネルギーの供給源でもある。かくして、細菌がPTS依存的糖上で増殖している場合、PEPに関するPTSと芳香族経路との競合が存在する。そのようなものとして、芳香族経路への流動の増加における有意な改善を、PTSを欠失させ、糖取込みのための代替経路を提供することにより達成することができる。この問題に対する1つの解決法は、PTSを、グルコース取込みのために合理的に良好に動作するプロトン共輸送体である大腸菌GalPパーミアーゼと置きかえることである(米国特許第6,692,794号)。しかしながら、プロトン共輸送体は依然として、パーミアーゼを駆動するのに必要なプロトン勾配を維持するためにエネルギーを使用する。そのようなものとして、プロセスにおけるさらなる改善が必要である。
aroB遺伝子の発現は、cis,cis−ムコン酸生成にとって律速であると報告されている(Niu et al., 2002)。先行技術においては、これは、第2のコピーのaroB遺伝子にその天然のプロモーターを組込むことにより解決されたと言われている。しかしながら、aroB遺伝子の天然のプロモーターおよびリボソーム結合部位は理想からは遠いため、これはaroB制限を軽減するには不十分である。そのようなものとして、このプロセスは実質的な改善を必要とする。
芳香族経路における第1の関連する工程にとって必要とされるエリスロース−4−リン酸は、ペントースリン酸経路(PPP)の非酸化的部分から誘導される。炭素がPPPに進入することができる2つの異なる経路が存在する。第1は、酵素グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf遺伝子によりコードされる)、6−ホスホグルコノラクトナーゼ(pgl遺伝子によりコードされる)、および6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(gnd遺伝子によりコードされる)によるグルコース−6−リン酸に由来し、リブロース−5−リン酸が得られる。これらの3つの工程の最後において、1個の炭素がCO2として失われる。PPPへのこの経路は、PPPの酸化的分岐と呼ばれる。次いで、リブロース−5−リン酸は、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼの作用により様々な他の糖リン酸に変換される。リブロース−5−リン酸から始まる、この群の可逆的反応は、PPPの非酸化的分岐と呼ばれる。炭素がPPPに進入することができる第2の経路は、フルクトース−6−リン酸およびグリセルアルデヒド(glyceraldehye)−3−リン酸(両方とも解糖としても知られる、Embden−Myerhoff経路に由来する)を介するものであり、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼにより組合せ、再配置されて、様々な他の糖リン酸を与え、その1つはエリスロース−4−リン酸である。炭素がこの第2の経路を介してPPPに進入する場合、CO2は失われない。グルコースからのcis,cis−ムコン酸の収率を改善するために、PPPに進入する全ての炭素がフルクトース−6−リン酸およびグリセルアルデヒド−3−リン酸から非酸化的経路を介して来なければならないように、PPPの酸化的分岐を遮断することによりCO2の喪失を防止することができる。PPPの酸化的分岐の遮断は、tyrR遺伝子を欠失させるための実施例1に開示されたものと同様の2工程の方法を用いて、zwf遺伝子を欠失させることにより達成される。
PEPがcis,cis−ムコン酸への経路上の律速中間体ではないことを確保することが望ましい。これは、例えば、他の実施例において上記のpps遺伝子の過剰発現カセットを組込むことにより達成される、酵素PEPシンテターゼによるPEPへのピルビン酸の再利用を増加させることにより達成される。別の手法は、大腸菌においてpykAおよびpykF遺伝子によりコードされるピルビン酸キナーゼによるPEPの消費を制限することである。この場合、手法は、酵素(複数可)の活性を低下させることである。これは、ピルビン酸キナーゼ(tyrRについて実施例1に記載されたような)をコードする1つもしくは複数の遺伝子を欠失させるか、または例えば、ピルビン酸キナーゼ活性のレベルが低下するように、プロモーター、リボソーム結合部位、もしくはコード配列を突然変異させることにより、1つもしくは複数のこれらの遺伝子の発現の強度を低下させることにより達成される。例えば、大腸菌pykA遺伝子の前のRBSは、5’CGGAGTATTACATGである。ATG翻訳開始コドンには下線を付ける。RBS配列を、同時的な1塩基変化によるAGGAGGのコンセンサスRBSとあまり類似しないようにするように、この配列をCaGAGTATTACATG、CaaAGTATTACATG、CaatGTATTACATG、CaataTATTACATGなどに突然変異させることができる。次いで、それぞれの突然変異型を、pykA遺伝子座で染色体中に導入し、野生型を置きかえ、cis,cis−ムコン酸生成レベルを改善のために測定する。
大腸菌Cから誘導される株は唯一の炭素源としてスクロース上で増殖しない。しかしながら、それらを遺伝子操作して、その全体が参照により本明細書に組込まれるPCT特許出願PCT/US11/064598に開示されたようにそうすることができる。そのようなものとして、cis,cis−ムコン酸生成株を、上記の出願に開示されたようにスクロース上で増殖するように操作することができる。
実施例1〜15に記載の全ての特徴を、次々に特徴を導入することによって1株の大腸菌中で組合わせることができる。得られる株は、改善されたcis,cis−ムコン酸生成株を含む。次いで、得られる株は、上記のそれぞれの過剰発現カセットの第2のコピーを同時に、第1のコピーの位置とは別の位置に組込むことによりさらに改善することができる。便利で安全な位置の一例は、リボソームRNAをコードするrrfFのターミネーターからすぐ下流のBsrB1制限部位である。所望のカセットは、プラスミドpMH17FのユニークなBsrB1部位中に平滑線状DNAとして連結される(配列番号17)。一例は、pcatAXという名称のプラスミドを得るためのcatAX発現カセットのライゲーションである。平行して、camR、sacBカセットを、pMH17F中への平滑断片としてライゲートして、pMH28Fを得る(配列番号19)。PCRによるか、または制限酵素切断によりpMH28から誘導される線状DNAを用いて、rrfF部位にcamR、sacBカセットを置く。次に、PCRによるか、または制限酵素切断によりpcatAXから誘導される線状DNAを用いて、スクロース上での選択を用いて、rrfF遺伝子座に第2のコピーのcatAXカセットを導入する。次いで、得られる株を、cis,cis−ムコン酸生成のためのその祖父母株と比較して、catAXが律速段階であったことを決定する。同様の方法により、実施例2〜15に由来するそれぞれのカセットを、律速段階について試験する。段階が律速であるとわかった場合、1つまたは複数のさらなるコピーの関連カセットを、染色体中のさらに他の適切な位置に組込み、プラスミドまたは誘導的プロモーターを必要とすることなく、cis,cis−ムコン酸生成のさらなる改善をもたらす。
上記の実施例1〜15に開示される遺伝子操作された微生物により、cis,cis−ムコン酸を生成させることができる。増殖培地は広く変化してもよく、微生物の十分な増殖を支援する任意の培地であってもよい。好ましい培地は、ミネラル塩およびグルコース、キシロース、ラクトース、グリセロール、アセテート、アラビノース、ガラクトース、マンノース、マルトース、またはスクロースなどの非芳香族炭素源を含有する最少培地である(好ましい最少増殖培地の例については上記を参照されたい)。操作された微生物と増殖培地とのそれぞれの組合せについて、温度、pH、通気速度、およびpHを維持するために用いられる化合物(複数可)などの、発酵パラメータを体系的に変化させる日常的な実験により、cis,cis−ムコン酸を生成させるための適切な条件を決定する。cis,cis−ムコン酸が生成されるにつれて、1つまたは複数の化合物を発酵器中に供給して、pHが低くなり過ぎるのを防がなければならない。酸を中和するための好ましい化合物としては、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムの酸化物、水酸化物、炭酸塩、および重炭酸塩などのアルカリ塩、またはそのようなアルカリ塩の2つ以上の組合せが挙げられる。
3つの異なるaroZ相同体および類似体を、DHSをムコン酸生成経路に向かわせるその能力について比較した(図13)。アシネトバクター種ADP1に由来するquiC、バチルス・チューリンゲンシスに由来するasbF、およびニューロスポラ・クラッサに由来するqa−4は、AroZ様活性を有するタンパク質をコードすると報告されている(Elsemore and Ornston, 1995; Fox et al, 1995; Rutledge, 1984)。これらの遺伝子はそれぞれ、大腸菌における発現のためにコドン最適化され、GeneArt(Invitrogen)によって合成され、それぞれP15およびPRプロモーターからcatAXおよびaroY遺伝子も発現する低コピー「ムコンプラスミド」中の強力な構成的P26プロモーターの下にクローニングされた。MYR34/pCL1921、MYR34/pMG37(aroZとしてquiCを有するムコンプラスミド)、MYR34/pMG47(aroZとしてasbFを有するムコンプラスミド)、およびMYR34/pMG70(aroZとしてqa−4を有するムコンプラスミド)を、2%グルコース、芳香族アミノ酸および芳香族ビタミンを含有する最少培地を含む振とうフラスコ中、37℃で48h増殖させた。上清を回収し、HPLCにより分析した。予想通り、空のベクターで形質転換したMYR34はDHSを蓄積し、ムコン酸を生成しなかった。検査した2つのaroZ相同体および1つの類似体は、ムコン酸生成にDHSを向かわせることにおいて機能的であったが、その程度は異なっていた。quiC遺伝子を発現するMYR34誘導体は最も強固であり、DHSのムコン酸へのほぼ100%の変換を示し、有意でない量のDHS保持を示した。真菌のaroZ相同体qa−4を発現するMYR34誘導体は、次いで、DHSのムコン酸への約80%の変換および20%のDHS保持を示した。最後に、asbF遺伝子を発現するMYR34誘導体は、DHSのムコン酸へのわずかに50%の変換および50%のDHS保持を示した。総合すると、本発明者らの振とうフラスコアッセイ条件下では、quiC遺伝子の発現および/または活性は、他のaroZ相同体のものと比較して最も高いと考えられた。
Claims (34)
- 非芳香族炭素源から出発してcis,cis−ムコン酸を生成する遺伝子操作された微生物であって、ムコン酸経路において機能するタンパク質をコードする全ての遺伝子が前記微生物の染色体DNA中に組込まれた、遺伝子操作された微生物。
- ムコン酸経路において機能するタンパク質をコードする前記遺伝子が、aroZ、qa−4、asbF、quiC、aroY、およびcatAXからなる群から選択される、請求項1に記載の遺伝子操作された微生物。
- アシネトバクター属の細菌のQuiC酵素、または前記QuiC酵素の相同体をコードする遺伝子を含む、請求項1に記載の遺伝子操作された微生物生物。
- シキミ酸経路において機能するタンパク質をコードする1つまたは複数の外因性遺伝子を含む、請求項1に記載の遺伝子操作された微生物。
- シキミ酸経路において機能するタンパク質をコードする1つまたは複数の前記外因性遺伝子が前記生物の染色体DNA中に組込まれた、請求項4に記載の遺伝子操作された微生物。
- シキミ酸経路において機能するタンパク質をコードする前記外因性遺伝子が、aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe、およびrpiからなる群から選択される、請求項4に記載の遺伝子操作された微生物。
- ムコン酸経路またはシキミ酸経路において機能するタンパク質をコードする前記遺伝子がいずれも、誘導のために供給化学物質を必要とするプロモーターから発現されない、請求項4に記載の遺伝子操作された生物。
- 芳香族アミノ酸生合成の負の調節因子タンパク質の活性が実質的に低下したか、または排除された、請求項1に記載の遺伝子操作された宿主細菌。
- 芳香族アミノ酸生合成の負の調節因子タンパク質がTyrRタンパク質またはTyrRタンパク質の相同体である、請求項8に記載の遺伝子操作された微生物。
- 芳香族アミノ酸生合成の負の調節因子タンパク質をコードする遺伝子が突然変異された、請求項8に記載の遺伝子操作された微生物。
- 漏れやすいAroE酵素をコードするaroE遺伝子を含む、請求項1に記載の遺伝子操作された生物。
- シキミ酸経路において活性な少なくとも1つの酵素が、前記微生物の代謝物による阻害に対して実質的に耐性である、請求項1に記載の遺伝子操作された微生物生物。
- フェニルアラニンによる阻害に対して実質的に耐性であるDAHPシンターゼ酵素をコードするaroG*遺伝子を含む、請求項12に記載の遺伝子操作された生物。
- aroG*20−893、aroG*20−897、aroG*20−899、aroG*20−901、aroG*111、aroG*211、aroG*212、aroG*311、aroG*312、aroG*411、aroG*412、およびaroG*511からなるセットから選択されるDAHPシンターゼ酵素をコードするaroG*遺伝子を含む、請求項12に記載の遺伝子操作された生物。
- 細菌である、請求項1に記載の遺伝子操作された微生物。
- 大腸菌Cから誘導される、請求項1に記載の遺伝子操作された微生物。
- PEP依存的ホスホトランスフェラーゼ系が欠損し、グルコース移入のためのGalPタンパク質に基づく系が欠損し、機能的グルコース促進拡散タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌。
- 機能的グルコース促進拡散タンパク質がglf遺伝子によりコードされるGlfタンパク質である、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- グルコキナーゼをコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- 非芳香族炭素源から出発してcis,cis−ムコン酸を生成するムコン酸経路において機能するタンパク質をコードする1つまたは複数の外因性遺伝子をさらに含む、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- ムコン酸経路において機能するタンパク質をコードする前記遺伝子が、aroZ、qa−4、asbF、quiC、aroYおよびcatAXからなる群から選択される、請求項20に記載の遺伝子操作された細菌。
- シキミ酸経路において機能するタンパク質をコードする1つまたは複数の染色体に組込まれた外因性遺伝子をさらに含む、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- シキミ酸経路において機能するタンパク質をコードする前記外因性遺伝子が、aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe、およびrpiからなる群から選択される、請求項22に記載の遺伝子操作された細菌。
- 芳香族アミノ酸生合成の負の調節因子タンパク質の活性が実質的に低下したか、または排除された、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- 芳香族アミノ酸生合成の負の調節因子タンパク質がTyrRタンパク質またはTyrRタンパク質の相同体である、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- 芳香族アミノ酸生合成の負の調節因子タンパク質をコードする遺伝子が欠失または突然変異された、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- シキミ酸経路において活性な少なくとも1つの酵素が前記微生物の代謝物による阻害に対して実質的に耐性である、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- 前記微生物が大腸菌Cから誘導される、請求項17に記載の遺伝子操作された細菌。
- ムコン酸経路およびシキミ酸経路において機能するタンパク質をコードする外因性遺伝子が、誘導のために供給化学物質を必要とするプロモーターから発現されない、非芳香族炭素源から出発してcis,cis−ムコン酸を生成する遺伝子操作された微生物。
- 細菌である、請求項29に記載の遺伝子操作された微生物。
- 大腸菌である、請求項29に記載の遺伝子操作された微生物。
- 漏れやすいAroE酵素をコードするaroE遺伝子を含む、非芳香族炭素源から出発してcis,cis−ムコン酸を生成する遺伝子操作された微生物。
- 細菌である、請求項32に記載の遺伝子操作された微生物。
- 大腸菌である、請求項32に記載の遺伝子操作された微生物。
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