CN108314712A - L-苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L‑苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为ThrF蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与L‑苏氨酸转运相关的由序列1衍生的蛋白质。编码ThrF蛋白的基因也属于本发明的保护范围，将其命名为thrF基因。本发明还保护ThrF蛋白的应用：作为L‑苏氨酸转运蛋白；促进L‑苏氨酸转运；促进L‑苏氨酸转运至微生物体外生产L‑苏氨酸。本发明具有重大的应用价值。

Description

L-苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用。

背景技术

L-苏氨酸是必需氨基酸之一，在医药、食品以及饲料领域有广泛的应用。食品领域，是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。医药领域，对人体皮肤具有持水作用，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。饲料领域，广泛用作仔猪饲料、种猪饲料、肉鸡饲料、对虾饲料和鳗鱼饲料等的添加物，可调整饲料中氨基酸平衡促进生长，可改善肉质，可降低畜禽粪便和尿液中的含氮量、畜禽舍中氨气浓度及释放速度。

氨基酸的转运是细胞生命活动的重要环节之一。在原核以及真核细胞中都存在氨基酸转运系统。细胞通过內运系统从外部环境摄取氨基酸用于细胞内物质的合成，为生命活动提供碳源和氮源以及能源。通过外运系统将代谢物分泌到细胞外。大多数氨基酸可以通过发酵法生产。基于对氨基酸转运系统的了解，可以在氨基酸生产菌株的理性改造方面定向对其进行修饰，从而实现提高产量的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种L-苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，获自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)，命名为ThrF蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与L-苏氨酸转运相关的由序列1衍生的蛋白质。

上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使(b)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码ThrF蛋白的基因也属于本发明的保护范围，将其命名为thrF基因。

thrF基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列7所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码L-苏氨酸转运相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与L-苏氨酸转运相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有thrF基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有thrF基因的重组表达载体。使用thrF基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用thrF基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因。

所述重组表达载体具体可为如下重组质粒：在pXMJ19载体的多克隆位点(例如XbaI和Kpn I酶切位点之间)插入thrF基因得到的重组质粒。

本发明还保护ThrF蛋白的应用，为如下(c1)至(c7)中的至少一种：

(c1)作为L-苏氨酸转运蛋白；

(c2)促进L-苏氨酸转运；

(c3)促进L-苏氨酸转运至微生物体外；

(c4)促进L-苏氨酸转运至细菌体外；

(c5)促进L-苏氨酸转运至谷氨酸棒杆菌体外；

(c6)促进L-苏氨酸转运至谷氨酸棒杆菌m-85菌体外；

(c7)生产L-苏氨酸。

本发明还保护一种重组微生物，是将thrF基因导入目的微生物得到的。所述目的微生物为可以生产L-苏氨酸的微生物。所述目的微生物可为细菌，具体可为谷氨酸棒杆菌，更具体可为谷氨酸棒杆菌m-85。thrF基因具体可通过所述重组表达载体导入目的微生物。所述目的微生物还可为后续所述的重组菌A或重组菌B。

本发明还保护所述重组微生物在生产L-苏氨酸中的应用。

本发明还保护一种生产L-苏氨酸的方法，包括如下步骤：发酵所述重组微生物，从发酵上清中获得L-苏氨酸。所述发酵的条件具体可为：30℃、300rpm振荡培养。所述发酵的时间具体可为72小时。所述发酵采用的培养基为以葡萄糖为碳源的培养基。所述发酵采用的培养基具体可为(仅为示例)(pH7.0)：葡萄糖80g、(NH₄)₂SO₄20g、KH₂PO₄1.5g、MgSO₄·7H₂O0.4g、MnCl₂·4H₂O 10mg、FeSO₄·7H₂O 10mg、生物素50μg、硫胺素200μg、L-甲硫氨酸37.5mg、CaCO₃20g，用水定容至1L。

本发明还保护一种生产L-苏氨酸的试剂盒，包括所述重组微生物。所述试剂盒还可包括常规的或自行优化设计的发酵培养基。所述试剂盒还可包括常规的或自行优化设计的种子培养基。所述种子培养基具体可为(仅为示例)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、葡萄糖10g、尿素2g，用水定容至1L。所述发酵培养基具体可为(仅为示例)(pH7.0)：葡萄糖80g、(NH₄)₂SO₄20g、KH₂PO₄1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.4g、MnCl₂·4H₂O10mg、FeSO₄·7H₂O 10mg、生物素50μg、硫胺素200μg、L-甲硫氨酸37.5mg、CaCO₃20g，用水定容至1L。

本发明还保护一种重组菌，为重组菌A或重组菌B。

所述重组菌A是将目的菌基因组中的thrF基因沉默，得到的重组菌。

将目的菌基因组中的thrF基因沉默的实现方式具体可为同源重组。将目的菌基因组中的thrF基因沉默的实现方式具体包括如下步骤：将特异DNA分子A或含有所述特异DNA分子A的重组质粒A导入所述目的菌，然后筛选得到基因组中thrF基因全部或部分敲除的重组菌。所述特异DNA分子A通过同源重组将thrF基因全部或部分敲除。所述特异DNA分子A具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。所述重组质粒A具体可为将pK18mobsacB载体Pst I和EcoR I酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

所述重组菌B是将目的菌基因组中的thrF基因和thrE基因沉默，得到的重组菌。

thrE基因为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列5所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码L-苏氨酸转运相关蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与L-苏氨酸转运相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

将目的菌基因组中的thrF基因和thrE基因沉默的实现方式具体可为同源重组。将目的菌基因组中的thrF基因和thrE基因沉默的实现方式具体包括如下步骤：将元件A和元件元件B导入所述目的菌(可同时导入，也可分步导入)，然后筛选得到基因组中thrF基因全部或部分敲除且thrE基因全部或部分敲除的重组菌。所述元件A为特异DNA分子A或含有所述特异DNA分子A的重组质粒A。所述特异DNA分子A通过同源重组将thrF基因全部或部分敲除。所述特异DNA分子A具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。所述重组质粒A具体可为将pK18mobsacB载体Pst I和EcoR I酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述元件B为特异DNA分子B或含有所述特异DNA分子B的重组质粒B。所述特异DNA分子B通过同源重组将thrE基因全部或部分敲除。所述特异DNA分子B具体可为序列表的序列6所示的DNA分子。所述重组质粒B具体可为将pK18mobsacB载体Pst I和SmaI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

所述目的菌可为细菌，具体可为谷氨酸棒杆菌，更具体可为谷氨酸棒杆菌RES167。

本发明从谷氨酸棒杆菌RES167中发现一个新蛋白，命名为ThrF蛋白，具有转运L-苏氨酸的功能。thrF基因缺失的重组菌株转运L-苏氨酸的能力降低，表达thrF基因的重组菌转运L-苏氨酸的能力提高。将thrF基因导入产L-苏氨酸的出发菌株，可以显著增加发酵上清液中的L-苏氨酸产量。

本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例2的步骤二的电泳图。

图2为实施例2的步骤四的电泳图。

图3为实施例2的步骤五的电泳图。

图4为实施例3的结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pMD19-T simple：宝生物工程(大连)有限公司，TAKARA Code：D104。

pK18mobsacB载体：Schafer A et al.,Gene，145(1):69-73，1994。

pXMJ19载体：Jakoby M et al.,Biotechnology Techniques，13(6):437-441，1999。

谷氨酸棒杆菌m-85(又称钝齿棒状杆菌m-85)：微生物学报22：276-283，1982。

实施例1、ThrF蛋白及其编码基因的发现

经过大量序列分析、功能验证等预实验，从谷氨酸棒杆菌RES167中发现一个新蛋白，命名为ThrF蛋白。ThrF蛋白如序列表的序列1所示。

将编码ThrF蛋白的基因命名为thrF基因，其编码框如序列表的序列2所示。

实施例2、重组菌的构建

一、重组质粒pK18ΔthrF的构建

1、提取谷氨酸棒杆菌RES167的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用2262Fk和2262Rk组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2262Fk：5’-CATTCTGCAG GGGGACGCATCAACGGTTT-3'；

2262Rk：5’-GCGTGAATTC AAGGATCCAAACCCAGCA-3'。

3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物中,Pst I酶切识别序列和EcoR I酶切识别序列之间为序列表的序列3所示的DNA分子。

4、将步骤2得到的PCR扩增产物连接至克隆载体pMD19-T simple，得到重组质粒T-thrFk。经测序，重组质粒T-thrFk中具有序列表的序列3所示的DNA分子。

5、取重组质粒T-thrFk，用限制性内切酶Hind III酶切，然后回收大片段并进行自连，得到重组质粒T-ΔthrFk。经测序，重组质粒T-ΔthrFk中，Pst I酶切识别序列和EcoR I酶切识别序列之间为序列表的序列4所示的DNA分子。

序列表的序列4中，第1-909位核苷酸为上游臂(其中第1-658位核苷酸为thrF基因编码框上游的658个核苷酸，第659-909位为thrF基因编码框中5’端的251个核苷酸)，第910-1804位核苷酸为下游臂(为thrF基因编码框下游的895个核苷酸)。

实际操作用，也可以直接人工合成序列表的序列4所示的双链DNA分子，然后连接至克隆载体pMD19-T simple，得到所述重组质粒T-ΔthrFk。

6、取重组质粒T-ΔthrFk，用限制性内切酶Pst I和EcoR I进行双酶切，回收约1.8kb的片段。

7、取pK18mobsacB载体，用限制性内切酶Pst I和EcoR I进行双酶切，回收约5.6kb的载体骨架。

8、将步骤6得到的片段与步骤7得到的载体骨架连接，得到重组质粒pK18ΔthrF。根据测序结果，对重组质粒pK18ΔthrF进行结构描述如下：将pK18mobsacB载体Pst I和EcoR I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列4所示的双链DNA分子。

二、重组菌RES167ΔthrF(thrF基因敲除菌)的构建

序列表的序列4所示的DNA分子可以与谷氨酸棒杆菌RES167的基因组DNA中的thrF基因中的5’端区段和下游片段发生同源重组，从而得到thrF基因部分缺失(缺失区段为thrF基因中第252bp到672bp以及其下游的73bp的核苷酸)的重组菌。

1、将重组质粒pK18ΔthrF电击转化谷氨酸棒杆菌RES167，转化液涂布于含10μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，筛选具有卡那霉素抗性的转化子涂布于含20g/100mL蔗糖的LB固体培养基平板，挑取单菌落，获得纯培养的菌株。

2、取步骤1得到的菌株，分别点种到LB固体培养基平板和含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，选择满足如下条件的菌株：在LB固体培养基平板上生长，但在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上不生长。

3、取步骤2得到的菌株，采用2262Fk和2262Rk组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行电泳，满足如下标准的菌株为thrF基因缺失的目标重组菌：PCR扩增产物约为1.8kb。

电泳结果见图1(自上而下，第一个箭头标注的条带约2.3kb，第二个箭头标注的条带约1.8kb)。图1中，泳道1为谷氨酸棒杆菌RES167进行步骤3的PCR扩增产物，泳道2为步骤2得到的菌株的PCR扩增产物。结果表明，得到了thrF基因缺失的目标重组菌，将其命名为重组菌RES167ΔthrF。

三、重组质粒pK18ΔthrE的构建

在谷氨酸棒杆菌中已经报道了一个与苏氨酸外运相关的蛋白-ThrE蛋白。编码ThrE蛋白的基因即thrE基因，其编码框如序列表的序列5所示。为避免由于thrE基因的存在对ThrF蛋白的功能鉴定发生干扰，需要将谷氨酸棒杆菌RES167中的thrE基因沉默。

1、提取谷氨酸棒杆菌RES167的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用2533uFk和2533uRk组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2533uFk：5’-GAGCTGCAG AAGGAATATCCCGGAGAACCG-3'；

2533uRk：5’-AGACGCCTAAGCAGGTTGATTTCCGCTGGAAAACATTTTGCAAG-3'。

3、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用2533dFk和2533dRk组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2533dFk：5’-CTTGCAAAATGTTTTCCAGCGGAAATCAACCTGCTTAGGCGTCT-3'；

2533dRk：5’-TGTCCCGGG CGTTGCGTTTGAAAAGCCCT-3'。

4、将步骤2得到的PCR扩增产物和步骤3得到的PCR扩增产物混合后作为模板，采用2533uFk和2533dRk组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

5、将步骤4得到的PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物中,Pst I酶切识别序列和Sma I酶切识别序列之间为序列表的序列6所示的DNA分子。序列表的序列6中，第1-700位核苷酸为上游臂(thrE基因编码框上游的700个核苷酸)，第701-1400位核苷酸为下游臂(thrE基因编码框下游的700个核苷酸)。

6、将步骤4得到的PCR扩增产物连接至克隆载体pMD19-T simple，得到重组质粒T-ΔthrE。经测序，重组质粒T-ΔthrE中，Pst I酶切识别序列和Sma I酶切识别序列之间为序列表的序列6所示的DNA分子。

实际操作用，也可以直接人工合成序列表的序列6所示的双链DNA分子，然后连接至克隆载体pMD19-T simple，得到所述重组质粒T-ΔthrE。

7、取重组质粒T-ΔthrE，用限制性内切酶Pst I和Sma I进行双酶切，回收约1.4kb的片段。

8、取pK18mobsacB载体，用限制性内切酶Pst I和Sma I进行双酶切，回收约5.6kb的载体骨架。

9、将步骤7得到的片段与步骤8得到的载体骨架连接，得到重组质粒pK18ΔthrE。根据测序结果，对重组质粒pK18ΔthrE进行结构描述如下：将pK18mobsacB载体Pst I和SmaI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列6所示的双链DNA分子。

四、重组菌RES167ΔthrE(thrE基因敲除菌)的构建

序列表的序列6所示的DNA分子可以与谷氨酸棒杆菌RES167的基因组DNA中的thrE基因的上游片段和下游片段发生同源重组，从而得到thrE基因缺失(缺失区段为序列表的序列5所示核苷酸)的重组菌。

1、将重组质粒pK18ΔthrE电击转化谷氨酸棒杆菌RES167，转化液涂布于含10μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，筛选具有卡那霉素抗性的转化子涂布于含20g/100mL蔗糖的LB固体培养基平板，挑取单菌落，获得纯培养的菌株。

2、取步骤1得到的菌株，分别点种到LB固体培养基平板和含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，选择满足如下条件的菌株：在LB固体培养基平板上生长，但在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上不生长。

3、取步骤2得到的菌株，采用2533uFk和2533dRk组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行电泳，满足如下标准的菌株为thrE基因缺失的目标重组菌：PCR扩增产物约为1.4kb。

电泳结果见图2(自上而下，第一个箭头标注的条带约2.9kb，第二个箭头标注的条带约1.4kb)。图2中，泳道1为谷氨酸棒杆菌RES167进行步骤3的PCR扩增产物，泳道2为步骤2得到的菌株的PCR扩增产物。结果表明，得到了thrE基因缺失的目标重组菌，将其命名为重组菌RES167ΔthrE。

五、重组菌RES167ΔthrFΔthrE(thrF基因和thrE基因双敲除菌)的构建

1、将重组质粒pK18ΔthrE电击转化重组菌RES167ΔthrF，转化液涂布于含10μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，筛选具有卡那霉素抗性的转化子涂布于含20g/100mL蔗糖的LB固体培养基平板，挑取单菌落，获得纯培养的菌株。

2、取步骤1得到的菌株，分别点种到LB固体培养基平板和含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，选择满足如下条件的菌株：在LB固体培养基平板上生长，但在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上不生长。

3、取步骤2得到的菌株，采用2262Fk和2262Rk组成的引物对或2533uFk和2533dRk组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行电泳，满足如下标准的菌株为thrF基因和thrE基因双缺失的目标重组菌：采用2262Fk和2262Rk组成的引物对时的PCR扩增产物约为1.8kb，且，采用2533uFk和2533dRk组成的引物对时的PCR扩增产物约为1.4kb。

电泳结果见图3(自上而下，第一个箭头标注的条带约2.9kb，第二个箭头标注的条带约2.3kb，第三个箭头标注的条带约1.8kb，第四个箭头标注的条带约1.4kb)。图3中，泳道1为谷氨酸棒杆菌RES167采用2262Fk和2262Rk组成的引物对时的PCR扩增产物，泳道2为步骤2得到的菌株采用2262Fk和2262Rk组成的引物对时的PCR扩增产物，泳道3为谷氨酸棒杆菌RES167采用2533uFk和2533dRk组成的引物对时的PCR扩增产物，泳道4为步骤2得到的菌株采用2533uFk和2533dRk组成的引物对时的PCR扩增产物。

结果表明，得到了thrF基因和thrE基因双缺失的目标重组菌，将其命名为重组菌RES167ΔthrFΔthrE。

六、重组质粒pZZT2的构建

1、提取谷氨酸棒杆菌RES167的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用2262F和2262R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2262F：5’-CTTTCTAGAAAGGAGGACAACC GTGGAGTGGACCGCTTTTGG-3'

2262R：5’-CTCGGTACCTTA TTACCCGAGTAAACCGGTCA-3'

3、将步骤2得到的PCR扩增产物连接至克隆载体pMD19-T simple，得到重组质粒T-thrF。经测序，重组质粒T-thrF中，XbaI酶切识别序列和Kpn I酶切识别序列之间为序列表的序列7所示的DNA分子。

实际操作用，也可以直接人工合成序列表的序列7所示的双链DNA分子，然后连接至克隆载体pMD19-T simple，得到所述重组质粒T-thrF。

4、取重组质粒T-thrF，用限制性内切酶XbaI和Kpn I进行双酶切，回收约0.7kb的片段。

5、取pXMJ19载体，用限制性内切酶XbaI和Kpn I进行双酶切，回收约6.6kb的载体骨架。

6、将步骤4得到的片段与步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pZZT2。根据测序结果，对重组质粒pZZT2进行结构描述如下：将pXMJ19载体XbaI和Kpn I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列7所示的双链DNA分子。序列表的序列7中，第14-685位核苷酸编码ThrF蛋白。

七、重组菌RES167ΔthrFΔthrE/pZZT2的构建

将重组质粒pZZT2导入重组菌RES167ΔthrFΔthrE，得到的重组菌命名为重组菌RES167ΔthrFΔthrE/pZZT2。

八、重组菌m-85/pZZT2的构建

将重组质粒pZZT2导入谷氨酸棒杆菌m-85，得到的重组菌命名为重组菌m-85/pZZT2。

九、重组菌m-85/pXMJ19的构建

将pXMJ19载体导入谷氨酸棒杆菌m-85，得到的重组菌命名为重组菌m-85/pXMJ19。

实施例3、HPLC法测定ThrF蛋白作为L-苏氨酸转运蛋白的活力

试验菌株分别为：谷氨酸棒杆菌RES167、重组菌RES167ΔthrF、重组菌RES167ΔthrE、重组菌RES167ΔthrFΔthrE或重组菌RES167ΔthrFΔthrE/pZZT2。

培养基甲：在MMI培养基中加入葡萄糖，使葡萄糖的浓度为20mM。

培养基乙：在MMI培养基中加入苏氨酸三肽(苏氨酸三肽由连续三个苏氨酸残基组成)和葡萄糖，使苏氨酸三肽的浓度为1mM，葡萄糖的浓度为20mM。

MMI培养基(pH7.5)：Na₂HPO₄·12H₂O 2.0g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.03g、微量元素溶液2mL、生物素50μg、硫胺素50μg，用水定容至1L。

微量元素溶液(pH6.0)：EDTA 0.500g、ZnSO₄·7H₂O 0.220g、CaC1₂ 0.055g、MnCl₂·4H₂O0.051g、FeSO₄·7H₂O 0.0499g、(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.011g、CuSO₄·5H₂O0.0157g、CoCl₂·6H₂O0.0161g，H₂O 1000m1。

1、将试验菌株接种至LB液体培养基，培养至细胞生长到指数期，离心收集细胞。

2、取步骤1得到的细胞，用培养基甲洗涤两次，然后悬浮于培养基乙中，得到OD_600nm值为7.5-9.5的悬浮液。OD_600nm值为7.5-9.5的悬浮液，相当于细胞干重1.7mg/mL-2.0mg/mL。

3、取步骤2的悬浮液，30℃、150rpm振荡反应，分别于不同反应时间取样，立即进行离心(4℃、12000rpm、3min)，收集上清液。

4、取步骤3得到的上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

5、取步骤4得到的滤液，进行HPLC。

HPLC相关参数如下：

Agilent 1200型HPLC仪；

Agilent Zorbax Eclipse-AAA色谱柱，4.6×75mm,3.5μm，OPA法自动柱前衍生；

流动相由溶液A和溶液B组成，流动相的流速为2mL/min；溶液A为40mM磷酸二氢钠水溶液(pH 7.8)，流动相B由45体积份乙腈、45体积份甲醇和10体积份水组成。洗脱过程参照安捷伦公司操作指南进行。

L-苏氨酸标准品(纯度>99.0％)：北京鼎国生物技术有限公司。

标准品的保留时间为6.63min,滤液上样后在相同保留时间出峰，证明步骤3得到的上清液中含有L-苏氨酸。根据标准品制作标准曲线，通过标准曲线和峰面积计算不同取样时间收集的上清液中的L-苏氨酸含量。

细胞外运L-苏氨酸的活力为每毫克细胞干重分泌L-苏氨酸的微摩尔数。

细胞外运L-苏氨酸的活力的结果见图4。图4中，◆代表谷氨酸棒杆菌RES167、□代表重组菌RES167ΔthrF、△代表重组菌RES167ΔthrE、■代表重组菌RES167ΔthrFΔthrE、▲代表重组菌RES167ΔthrFΔthrE/pZZT2。

结果表明：与谷氨酸棒杆菌RES167相比，重组菌RES167ΔthrF分泌L-苏氨酸的活力降低，提示ThrF蛋白可能与L-苏氨酸的外运相关；与重组菌RES167ΔthrFΔthrE相比，重组菌RES167ΔthrFΔthrE/pZZT2分泌L-苏氨酸的活力大幅升高。结果表明，ThrF蛋白具有外运L-苏氨酸的功能。

实施例4、利用重组菌m-85/pZZT2制备L-苏氨酸

试验菌株分别为：重组菌m-85/pZZT2或重组菌m-85/pXMJ19。

种子培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、葡萄糖10g、尿素2g，用水定容至1L。

发酵培养基(pH7.0)：葡萄糖80g、(NH₄)₂SO₄ 20g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.4g、MnCl₂·4H₂O 10mg、FeSO₄·7H₂O 10mg、生物素50μg、硫胺素200μg、L-甲硫氨酸37.5mg、CaCO₃20g，用水定容至1L。

1、将试验菌株接种至种子培养基，30℃、300rpm振荡培养16小时，得到种子液。

2、取1.5mL种子液，接种至15mL发酵培养基，30℃、300rpm振荡培养72小时。

3、完成步骤2后，4℃、8000rpm离心3min，收集上清液。

4、取步骤3得到的上清液，用无菌水适当稀释，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

5、取步骤4得到的滤液，进行HPLC。

HPLC相关参数同实施例3的步骤5。

重组菌m-85/pZZT2作为试验菌株，完成步骤2的体系中的L-苏氨酸浓度为4.62g/L。重组菌m-85/pXMJ19作为试验菌株，完成步骤2的体系中的L-苏氨酸浓度为1.73g/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> L-苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用

<130> GNCYX170190

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）

<400> 1

Met Glu Trp Thr Ala Phe Gly Thr Leu Ile Leu Leu Asn Leu Val Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Pro Gly Pro Asp Thr Phe Phe Leu Leu Arg Leu Ala Thr

20 25 30

Arg Ser Arg Ala His Ala Ile Ala Gly Val Ala Gly Ile Val Thr Gly

35 40 45

Leu Thr Val Trp Val Thr Leu Thr Val Val Gly Ala Ala Ala Leu Leu

50 55 60

Thr Thr Tyr Pro Ser Ile Leu Gly Ile Ile Gln Leu Val Gly Gly Thr

65 70 75 80

Tyr Leu Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ser Ala Ser Arg Glu

85 90 95

Leu Ile Asp Ala Arg Gln Phe Arg Phe Asn Ala Asp Ala Arg Pro Ile

100 105 110

Pro Asp Ala Val Glu Ala Leu Gly Thr Arg Thr Gln Val Tyr Arg Gln

115 120 125

Gly Leu Ala Thr Asn Leu Ser Asn Pro Lys Val Val Met Tyr Phe Ala

130 135 140

Ala Ile Leu Ala Pro Leu Met Pro Ala His Pro Ser Pro Val Leu Ala

145 150 155 160

Phe Ser Ile Ile Val Ala Ile Leu Val Gln Thr Phe Val Thr Phe Ser

165 170 175

Ala Val Cys Leu Ile Val Ser Thr Glu Arg Val Arg Lys Ala Met Leu

180 185 190

Arg Ala Gly Pro Trp Phe Asp Leu Leu Ala Gly Val Val Phe Leu Val

195 200 205

Val Gly Val Thr Leu Leu Tyr Glu Gly Leu Thr Gly Leu Leu Gly

210 215 220

<210> 2

<211> 672

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）

<400> 2

gtggagtgga ccgcttttgg caccctgatt ctgctcaatt tggtgggcag tttatccccg 60

gggcctgata cctttttcct cctccgctta gccacccgct ccagagcgca cgcgatcgct 120

ggcgtcgccg gcatcgtcac cggactcacg gtgtgggtga cgctgacggt cgtgggagca 180

gcggcgctgc tcaccactta tccgtcgatt ctcggaatca tccagctcgt cggcggcacg 240

tacctaagct tcattgggta caagttgctg cgctcggcgt cgagagagct tatcgacgcc 300

cgccagttcc gtttcaacgc cgatgcccga cctatcccgg atgcggtaga agcactggga 360

acccgcactc aggtatatcg acaaggtttg gccaccaacc tgtcaaaccc taaagttgtc 420

atgtacttcg cggcaattct ggctccgttg atgccagcgc acccatcacc ggtgctggcg 480

ttctctatca tcgtggcgat tttagtgcag acctttgtta ccttctctgc tgtgtgcctc 540

attgtctcta cggagcgtgt gcgcaaagca atgctgcgtg caggtccctg gtttgacctg 600

cttgctggcg ttgtcttcct cgttgtgggt gtgactctgc tgtatgaagg cctgaccggt 660

ttactcgggt aa 672

<210> 3

<211> 2298

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）

<400> 3

ggggacgcat caacggtttt gagctggcca aagaattggg catgccgccg ttcgtggtgg 60

agaagactgc gaaagtggcc cgaaactggt cgggagatgc ggtcagcgag gccgtgattt 120

tgatggccga tctggatgcc gctgtaaaag gacaaagtgg cgatcctgaa tttgccatcg 180

aatctgccgt gagaagagtt gcagagctgg cgaggcggta acgctgaacg gcggcgggta 240

agatatttga gcatgacaca atcagattta cccgatgatg ttcaggaatt ggtcactaag 300

atctttggac tggcacgtga tgggggagca gaatccgcag caaccctcgg tgcatatgtc 360

gacaacggcg ttgacgttaa cctgtccaac caagatggca acactttgct catgctcgca 420

gcatatgcag gacatgctga tgtcgtgcag gcgttgattg agcgtggcgc cgatgtggat 480

cgcgtgaaca accgcaatca gacgccgctg gcgggcgcga tctttaagaa ggaagaagcc 540

gtcattgagg cactgcttgc tggtggtgct gacccatacg ctggaactcc aactgctgtt 600

gataccgcca agatgtttgg ccgcgaggat ctcgtagctc gcttcgagtc ataggccggt 660

ggagtggacc gcttttggca ccctgattct gctcaatttg gtgggcagtt tatccccggg 720

gcctgatacc tttttcctcc tccgcttagc cacccgctcc agagcgcacg cgatcgctgg 780

cgtcgccggc atcgtcaccg gactcacggt gtgggtgacg ctgacggtcg tgggagcagc 840

ggcgctgctc accacttatc cgtcgattct cggaatcatc cagctcgtcg gcggcacgta 900

cctaagcttc attgggtaca agttgctgcg ctcggcgtcg agagagctta tcgacgcccg 960

ccagttccgt ttcaacgccg atgcccgacc tatcccggat gcggtagaag cactgggaac 1020

ccgcactcag gtatatcgac aaggtttggc caccaacctg tcaaacccta aagttgtcat 1080

gtacttcgcg gcaattctgg ctccgttgat gccagcgcac ccatcaccgg tgctggcgtt 1140

ctctatcatc gtggcgattt tagtgcagac ctttgttacc ttctctgctg tgtgcctcat 1200

tgtctctacg gagcgtgtgc gcaaagcaat gctgcgtgca ggtccctggt ttgacctgct 1260

tgctggcgtt gtcttcctcg ttgtgggtgt gactctgctg tatgaaggcc tgaccggttt 1320

actcgggtaa aggcataaaa aatggcttcc aatcaaaact gataggaagc cattttcaaa 1380

agagccaaaa attagccaag cttgttgaaa gcggtagcca tgttggactt cttgttagca 1440

gcgttgttga tgtggaagac acccttggtt actgccttgt ccagtgcgcg ggaagcggta 1500

cggagctgag cctgagctgc atccttgtcg cctgcttcaa tcgcagcgtt gaacttgcgg 1560

atctcggtgc ggactgcgga gcgaactgcc tggttacgca gacgagcctt ctcgttggtc 1620

ttgttacgct tgatctgaga cttgatgttt gccatcgcaa atacctcttg aactttctag 1680

ttaaagttgt gtacaaaccc atcgaggagt gtttctcccg cagttttaaa taaactgctt 1740

ggcataaagt gcaacgaacc caaggtcctg tccgcatgtc actggaatgc tcacatcaaa 1800

gatggacaac agcgttcaag agtatcagtg atgttgccca attaccaaat aaatgttaga 1860

cccagttgaa atcgttgcgg aggcggttgg cgatacgctc aaagcgcccc ggggggacga 1920

ctgttccttg gcgccggata cccaattcgg gtacctccag aacgcggtcg agtcgtaccc 1980

aactttggcg acctcgaggg tcccagctgc cagatccaat gtcgatccag tcttcatcag 2040

tgcggtgctc ggggttgcag gaaatgagca gacctaaaat ggcgtttcgg tttcttccaa 2100

caacaacgat ggcacgttta cggggtggtt gctgggggcc atcggctggt gcccaaatcc 2160

acactacttc accggggtct gtttgcccat ccatatcagg cgcataaaag atcagccgtg 2220

ccattgattc ggtcggcatg acggaaattt caggcttttc atgcagcaaa gaatgatcgt 2280

tgctgggttt ggatcctt 2298

<210> 4

<211> 1804

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggacgcat caacggtttt gagctggcca aagaattggg catgccgccg ttcgtggtgg 60

agaagactgc gaaagtggcc cgaaactggt cgggagatgc ggtcagcgag gccgtgattt 120

tgatggccga tctggatgcc gctgtaaaag gacaaagtgg cgatcctgaa tttgccatcg 180

aatctgccgt gagaagagtt gcagagctgg cgaggcggta acgctgaacg gcggcgggta 240

agatatttga gcatgacaca atcagattta cccgatgatg ttcaggaatt ggtcactaag 300

atctttggac tggcacgtga tgggggagca gaatccgcag caaccctcgg tgcatatgtc 360

gacaacggcg ttgacgttaa cctgtccaac caagatggca acactttgct catgctcgca 420

gcatatgcag gacatgctga tgtcgtgcag gcgttgattg agcgtggcgc cgatgtggat 480

cgcgtgaaca accgcaatca gacgccgctg gcgggcgcga tctttaagaa ggaagaagcc 540

gtcattgagg cactgcttgc tggtggtgct gacccatacg ctggaactcc aactgctgtt 600

gataccgcca agatgtttgg ccgcgaggat ctcgtagctc gcttcgagtc ataggccggt 660

ggagtggacc gcttttggca ccctgattct gctcaatttg gtgggcagtt tatccccggg 720

gcctgatacc tttttcctcc tccgcttagc cacccgctcc agagcgcacg cgatcgctgg 780

cgtcgccggc atcgtcaccg gactcacggt gtgggtgacg ctgacggtcg tgggagcagc 840

ggcgctgctc accacttatc cgtcgattct cggaatcatc cagctcgtcg gcggcacgta 900

cctaagcttg ttgaaagcgg tagccatgtt ggacttcttg ttagcagcgt tgttgatgtg 960

gaagacaccc ttggttactg ccttgtccag tgcgcgggaa gcggtacgga gctgagcctg 1020

agctgcatcc ttgtcgcctg cttcaatcgc agcgttgaac ttgcggatct cggtgcggac 1080

tgcggagcga actgcctggt tacgcagacg agccttctcg ttggtcttgt tacgcttgat 1140

ctgagacttg atgtttgcca tcgcaaatac ctcttgaact ttctagttaa agttgtgtac 1200

aaacccatcg aggagtgttt ctcccgcagt tttaaataaa ctgcttggca taaagtgcaa 1260

cgaacccaag gtcctgtccg catgtcactg gaatgctcac atcaaagatg gacaacagcg 1320

ttcaagagta tcagtgatgt tgcccaatta ccaaataaat gttagaccca gttgaaatcg 1380

ttgcggaggc ggttggcgat acgctcaaag cgccccgggg ggacgactgt tccttggcgc 1440

cggataccca attcgggtac ctccagaacg cggtcgagtc gtacccaact ttggcgacct 1500

cgagggtccc agctgccaga tccaatgtcg atccagtctt catcagtgcg gtgctcgggg 1560

ttgcaggaaa tgagcagacc taaaatggcg tttcggtttc ttccaacaac aacgatggca 1620

cgtttacggg gtggttgctg ggggccatcg gctggtgccc aaatccacac tacttcaccg 1680

gggtctgttt gcccatccat atcaggcgca taaaagatca gccgtgccat tgattcggtc 1740

ggcatgacgg aaatttcagg cttttcatgc agcaaagaat gatcgttgct gggtttggat 1800

cctt 1804

<210> 5

<211> 1470

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）

<400> 5

atgttgagtt ttgcgaccct tcgtggccgc atttcaacag ttgacgctgc aaaagccgca 60

cctccgccat cgccactagc cccgattgat ctcactgacc atagtcaagt ggccggtgtg 120

atgaatttgg ctgcgagaat tggcgatatt ttgctttctt caggtacgtc aaatagtgac 180

accaaggtac aagttcgagc agtgacctct gcgtacggtt tgtactacac gcacgtggat 240

atcacgttga atacgatcac catcttcacc aacatcggtg tggagaggaa gatgccggtc 300

aacgtgtttc atgttgtagg caagttggac accaacttct ccaaactgtc tgaggttgac 360

cgtttgatcc gttccattca ggctggtgcg accccgcctg aggttgccga gaaaatcctg 420

gacgagttgg agcaatcccc tgcgtcttat ggtttccctg ttgcgttgct tggctgggca 480

atgatgggtg gtgctgttgc tgtgctgttg ggtggtggat ggcaggtttc cctaattgct 540

tttattaccg cgttcacgat cattgccacg acgtcatttt tgggaaagaa gggtttgcct 600

actttcttcc aaaatgttgt tggtggtttt attgccacgc tgcctgcatc gattgcttat 660

tctttggcgt tgcaatttgg tcttgagatc aaaccgagcc agatcatcgc atctggaatt 720

gttgtgctgt tggcaggttt gacactcgtg caatctctgc aggacggcat cacgggcgct 780

ccggtgacag caagtgcacg atttttcgaa acactcctgt ttaccggcgg cattgttgct 840

ggcgtgggtt tgggcattca gctttctgaa atcttgcatg tcatgttgcc tgccatggag 900

tccgctgcag cacctaatta ttcgtctaca ttcgcccgca ttatcgctgg tggcgtcacc 960

gcagcggcct tcgcagtggg ttgttacgcg gagtggtcct cggtgattat tgcggggctt 1020

actgcgctga tgggttctgc gttttattac ctcttcgttg tttatttagg ccccgtctct 1080

gccgctgcga ttgctgcaac agcagttggt ttcactggtg gtttgcttgc ccgtcgattc 1140

ttgattccac cgttgattgt ggcgattgcc ggcatcacac caatgcttcc aggtctagca 1200

atttaccgcg gaatgtacgc caccctgaat gatcaaacac tcatgggttt caccaacatt 1260

gcggttgctt tagccactgc ttcatcactt gccgctggcg tggttttggg tgagtggatt 1320

gcccgcaggc tacgtcgtcc accacgcttc aacccatacc gtgcatttac caaggcgaat 1380

gagttctcct tccaggagga agctgagcag aatcagcgcc ggcagagaaa acgtccaaag 1440

actaatcaga gattcggtaa taaaaggtaa 1470

<210> 6

<211> 1400

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggaatatc ccggagaacc ggtgaaccat tcaccgtcga tccaatgatg tgtatgaagc 60

ttgcagaggc tctcgacctt gatccagtag aggttttaag tgcagcgaaa gttcccgaat 120

ctgaatggcc aaatttttcg aagatcatct cccaaagtga ctatgtgaag catgtagaca 180

taacaagact gaccgtccgc cagcaagatc tagtcatcaa tctggtcaac gaatttaagg 240

agcttaattt gaacacgcca tatgaaaagt gactaatttc aacccaaacg ggagcctaag 300

tgaaatgaaa taatcccctc accaactggc gacattcaaa caccgtttca tttccaaaca 360

tcgagccaag ggaaaagaaa gcccctaagc cccgtgttat taaatggaga ctttttggag 420

acctcaagcc aaaaaggggc attttcatta agaaaatacc cctttgacct ggtgttattg 480

agctggagaa gagacttgaa ctctcaacct acgcattaca agtgcgttgc gctgccaatt 540

gcgccactcc agcaccgcag atgctgatga tcaacaacta cgaatacgta tcttagcgta 600

tgtgtacatc acaatggaat tcggggctag agtatctggt gaaccgtgca taaacgacct 660

gtgattggac tctttttcct tgcaaaatgt tttccagcgg aaatcaacct gcttaggcgt 720

ctttcgctta aatagcgtag aatatcgggt cgatcgcttt taaacactca ggaggatcct 780

tgccggccaa aatcacggac actcgtccca ccccagaatc ccttcacgct gttgaagagg 840

aaaccgcagc cggtgcccgc aggattgttg ccacctattc taaggacttc ttcgacggcg 900

tcactttgat gtgcatgctc ggcgttgaac ctcagggcct gcgttacacc aaggtcgctt 960

ctgaacacga ggaagctcag ccaaagaagg ctacaaagcg gactcgtaag gcaccagcta 1020

agaaggctgc tgctaagaaa acgaccaaga agaccactaa gaaaactact aaaaagacca 1080

ccgcaaagaa gaccacaaag aagtcttaag ccggatctta tatggatgat tccaatagct 1140

ttgtagttgt tgctaaccgt ctgccagtgg atatgactgt ccacccagat ggtagctata 1200

gcatctcccc cagccccggt ggccttgtca cggggctttc ccccgttctg gaacaacatc 1260

gtggatgttg ggtcggatgg cctggaactg tagatgttgc acccgaacca tttcgaacag 1320

atacgggtgt tttgctgcac cctgttgtcc tcactgcaag tgactatgaa ggcttctacg 1380

agggcttttc aaacgcaacg 1400

<210> 7

<211> 688

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaggaggaca accgtggagt ggaccgcttt tggcaccctg attctgctca atttggtggg 60

cagtttatcc ccggggcctg ataccttttt cctcctccgc ttagccaccc gctccagagc 120

gcacgcgatc gctggcgtcg ccggcatcgt caccggactc acggtgtggg tgacgctgac 180

ggtcgtggga gcagcggcgc tgctcaccac ttatccgtcg attctcggaa tcatccagct 240

cgtcggcggc acgtacctaa gcttcattgg gtacaagttg ctgcgctcgg cgtcgagaga 300

gcttatcgac gcccgccagt tccgtttcaa cgccgatgcc cgacctatcc cggatgcggt 360

agaagcactg ggaacccgca ctcaggtata tcgacaaggt ttggccacca acctgtcaaa 420

ccctaaagtt gtcatgtact tcgcggcaat tctggctccg ttgatgccag cgcacccatc 480

accggtgctg gcgttctcta tcatcgtggc gattttagtg cagacctttg ttaccttctc 540

tgctgtgtgc ctcattgtct ctacggagcg tgtgcgcaaa gcaatgctgc gtgcaggtcc 600

ctggtttgac ctgcttgctg gcgttgtctt cctcgttgtg ggtgtgactc tgctgtatga 660

aggcctgacc ggtttactcg ggtaataa 688

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与L-苏氨酸转运相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列7所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码L-苏氨酸转运相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与L-苏氨酸转运相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)至(c7)中的至少一种：

(c1)作为L-苏氨酸转运蛋白；

(c2)促进L-苏氨酸转运；

(c3)促进L-苏氨酸转运至微生物体外；

(c4)促进L-苏氨酸转运至细菌体外；

(c5)促进L-苏氨酸转运至谷氨酸棒杆菌体外；

(c6)促进L-苏氨酸转运至谷氨酸棒杆菌m-85菌体外；

(c7)生产L-苏氨酸。

6.一种重组微生物，是将权利要求2或3所述基因导入目的微生物得到的。

7.权利要求6所述重组微生物在生产L-苏氨酸中的应用。

8.一种生产L-苏氨酸的方法，包括如下步骤：发酵权利要求6所述重组微生物，从发酵上清中获得L-苏氨酸。

9.一种生产L-苏氨酸的试剂盒，包括权利要求6所述重组微生物。

10.一种重组菌，是将目的菌基因组中的编码权利要求1所述蛋白质的基因沉默，得到的重组菌。