CN1291651A - 编码thrE基因的新核苷酸序列和用棒状菌酶促生产L－苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及衍生自棒杆菌并在棒状微生物中可复制的优选为重组的DNA,其含有至少一个编码thrE基因的核苷酸序列。本发明还涉及生产L－苏氨酸的方法,其特征在于进行以下步骤:(a)发酵微生物,该微生物中至少thrE基因是扩增的(过表达的),该基因任选地与其它基因一起扩增(过表达),(b)富集培养基或微生物细胞中的L－苏氨酸,及(c)分离L－苏氨酸。

Description

编码thrE基因的新核苷酸序列和 用棒状菌酶促生产L-苏氨酸的方法
本发明涉及编码thrE基因的核苷酸序列，和用棒状菌经酶促反应生产L-苏氨酸的方法，其中棒状菌中thrE基因是扩增的。
L-苏氨酸用于动物饲料，人用药物及制药工业。
已知L-苏氨酸可通过棒状菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于L-苏氨酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵工程因素，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-苏氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA工程的方法也用于棒杆菌生产L-苏氨酸的菌株的改良，其通过扩增各个苏氨酸生物合成基因，并研究对L-苏氨酸生产的作用而进行改良。
本发明人目的在于为改良L-苏氨酸的酶促生产而提供新措施。
L-苏氨酸用于动物营养、人用药物及制药工业，因此提供生产L-苏氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
本发明提供了衍生自棒杆菌的优选地是重组的DNA，其在棒状微生物中可以复制，其至少含有以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3表示的编码thrE基因的核苷酸序列。
本发明还提供了根据权利要求1的可复制的DNA，其包括：
(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的，编码thrE基因的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并区内相应于(i)序列的至少一个序列，或
(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和／或任选地，
(iv)(i)中有功能的中义突变体。
本发明还提供了通过导入上述可复制的DNA转化的棒状微生物，尤其棒杆菌属。
本发明另外还提供了用棒状菌经酶促反应生产L-苏氨酸的方法，其使用尤其已生产L-苏氨酸的棒状菌，且其中编码thrE基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及如果需要组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-苏氨酸，此微生物可以是棒状菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是1后氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-苏氨酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是尤其已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
醋谷棒杆菌ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539
黄色短杆菌ATCC 14067
乳发酵短杆菌ATCC 13869和
扩展短杆菌ATCC 14020
和从中获得的生产L-苏氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌ATCC 21649
黄色短杆菌BB69
黄色短杆菌DSM 5399
乳发酵短杆菌FERM-BP 269
乳发酵短杆菌TBB-10
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的thrE基因，为了分离thrE基因，thrE基因缺陷的谷氨酸棒杆菌的突变体首先被产生。为此，将适当的起始菌株例如ATCC 14752或ATCC 13032进行诱变。
常规诱变法包括用化学物质例如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍处理，或UV照射，通常已知这种起始突变方法，并可参见于Miller(细菌遗传概要，E．coli及相关细菌的实验手册，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1992))，或美国细菌学会的“普通细菌学方法”手册，(华盛顿D．C．，美国，1981)。
其它诱变方法是转座子诱变，其中利用转座子在DNA序列中“跳跃”的性质，从而干扰或切断相关基因的功能。本领域技术人员已知棒状菌的转座子，例如，红霉素抗性转座子Tn5432(Tauch等，质粒(1995)33：168-179)和氯霉素抗性转座子Tn5546已从干燥棒杆菌菌株M82B中分离出。
另一种转座子是由Ankri等(细菌学杂志(1996)178：4412-4419)所述的，并用于本发明实施例的转座子Tn 5531。该转座子Tn5531含有aph3卡那霉素抗性基因，并可以例如质粒载体pCGL0040形式输送，见图1所示。转座子Tn 5531的核苷酸序列可免费得自国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国)，登记号U53587。
在已进行诱变，优选转座子诱变之后，对thrE基因缺陷突变体进行研究。thrE基因缺陷突变体通过以下事实被识别：其在基本培养基琼脂上良好生长，但在已补加含苏氨酸的寡肽，例如苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸三肽的基本培养基琼脂上生长不佳。
该突变体例如是菌株ATCC 14752△ilvAthrE：：Tn5531
以所述方式产生的菌株可用于分离和克隆thrE基因。
为此，可建立相应细菌的基因库。可根据通常已知的教材和手册建立基因库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因库是已由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的E．coli K-12菌株W3110的基因库。Bathe等(分子及普通遗传学，252：255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，84：2160-2164)，在E．coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因库。对本发明而言，在棒状菌，优选在谷氨酸棒杆菌中复制的载体是适用的。从现有技术中已知这种载体；例如质粒载体pZ1，由Menkel等(应用与环境微生物学(1989)64：549-554)所述。然后将以所述方式获得的基因库通过转化或电穿孔转入thrE基因缺陷的指示菌株中，且筛选具有在存在含苏氨酸寡肽的基本培养基琼脂上的生长能力的那些转化体。然后可将克隆的DNA片段进行序列分析。
当使用经Tn5531诱变产生的棒状菌突变体如菌株ATCC 14752△ilvAthrE：：Tn5531时，可将thrE：：Tn5531等位基因用包含于Tn5531中的卡那霉素抗性基因aph3直接克隆并分离。为此，使用已知克隆载体，例如pUC18(Norrander等，基因(1983)26：101-106和Yanisch-Perron等，基因(1985)33：103-119)。特别适于作克隆宿主是那些限制缺陷和重组缺陷的E．coli菌株，例如已由Grant等(Proceedings of the National Acad emy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)阐述的菌株DH5αmcr。在存在卡那霉素的情况下选择转化体。然后对所得转化体的质粒DNA进行测序。为此，可使用由Sanger等所述的双脱氧链终止法(Proceedings of the NationalAcadermy of Sciences of USA(1977)74：5463-5467)。从而获得Tn5531插入位点上游和下游的thrE基因序列。然后用可商购序列分析程序，例如用程序Lasergene(Biocomputing Software for Windows，DNASTAR，Modison，美国)或程序包HUSAR(Release 4．0，EMBL，Heidelerg，德国)分析和装配所得核苷酸序列。
以此方式可获得编码thrE基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO：1，是本发明的一部分，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得thrE基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO：2表示。
通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO：1的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是有义突变，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和／或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751-757(1987))O’Regan等(基因77：237-251．(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3：240-247(1994))，Hochuli等(生物／技术6：1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
用SEQ ID NO：1所示核苷酸序列可合成适当的引物，然后将这些引物通过PCR用于扩增各种棒状菌和菌株的thrE基因。本领域技术人员从例如以下手册中可发现对此的论述，Gait：寡核苷酸合成实用方法(IRL Press，Oxford，VK，1984)及Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heiddberg，德国，1994)。或者，可将SEQ ID NO：1或其部分的核苷酸序列用作探针，以搜索尤其棒状菌基因库中的thrE基因，本领域技术人员可从例如以下手册中发现对此的论述：由Boehringer Mannheim GmbH出版的“滤膜杂交的DIG系统使用说明”(Mannheim，德国，1993)，和Lieble等(国际系统细菌学杂志(1991))41：255-260)。然后将含有以此方式扩增的含thrE基因的DNA片段克隆并测序。
以SEQ ID NO：3表示的菌株ATCC 13032的thrE基因的DNA序列可以此方式获得，并是本发明的一部分，所得氨基酸序列以SEQID NO：4表示。
本发明还提供了分离thrE基因的方法，其特征在于获得thrE基因缺陷的作为指示菌株的突变体，优选棒状菌，其在存在含苏氨酸的寡肽的营养培养基上不生长，或仅微弱生长，并且
a)此thrE基因在建立基因库后被鉴别及分离，或
b)在选择转座子诱变的情况中，转座子优选呈对抗生素有抗性，且从而获得thrE基因。
本发明人从中发现，在thrE基因过表达后，棒状菌以改良方式生产L-苏氨酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在酶促L-苏氨酸生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白的分解也可提高酶促活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物／技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物／技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利申请EPSO472869，美国专利4，601，893，Schwarzer和Puhler(生物／技术9，84-87(1991))，Reinscheid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO 96／15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物学综述60：512-538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
利用其可过表达thrE基因的质粒例如是pZ1thrE(图2)，其包含于菌株DM368-2 pZ1thrE中。质粒pZ1thrE是基于质粒pZ1的谷氨酸棒杆菌-E．coli穿梭载体，其由Menkel等所述(应用与环境微生物学(1989)64：549-554)。其它可在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体如pEKExl(Eikmanns等，基因102：93-98(1991))或pZ8-1(EP-B-0375889)可以同样方式使用。
另外，除了新thrE基因之外，已知的苏氨酸生物合成途径的一或多种酶，或回补代谢的酶，或柠檬酸循环的酶的过表达，对L-苏氨酸的生产可以是有益的，例如以下基因可以同时过表达：
·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(Peoples等，分子微生物学2，63-72(1988))，或编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因(Archer等，基因107，53-59，(1991))，或
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)，或
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生化杂志254，395-403(1998))。
除thrE基因的过表达之外，排除非所需的二级反应例如苏氨酸脱氢酶反应，对L-苏氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds．)学术出版社，伦敦，英国，1982及Bell和Turner，生物化学杂志156，449-458(1976))。
根据本发明产生的微生物可连续培养或在分批方法(分批培养)，或在补料分批(补料法)或重复补料分批法(重复补料法)中分批培养以生产L-苏氨酸。已知的培养法由Chmiel(Bioprozesstechnik l．Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick／Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D．C．，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至L-苏氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-苏氨酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生化作用进行，或通过如Lindroth等(分析化学(1979)51：1167-1174)所述反相HPLC进行。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：
·黄色短杆菌菌株DM368-2 pZ1thrE，保藏号DSM 12840
·大肠杆菌菌株GM2929 pCGL0040，保藏号DSM 12839。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
根据Sambrook等(分子克隆实验手册(1989)，Cold SpringHarbacn Laboratory Press)所述，进行从E．coli中分离质粒DNA以及限制酶切，Klenow和碱性磷酸酶处理。除非特别提及，根据Chung等(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA(1989)86：2172-2175)所述进行E．coli的转化。
实施例1谷氨酸棒杆菌ATCC 14752的thrE基因的克隆与测序
1、转座子诱变和突变体选择
将谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 14752△ilvA用转座子Tn5531进行诱变，该转座子序列在国立生物技术信息中心(Bethesda，美国)的核苷酸数据库中存档，登记号U53587。用如Schafer等(基因(1994)145：69-73)所述的基因置换系统，将缺失掺入谷氨酸棒杆菌ATCC14752的ilvA基因中，为此，由Sahm等构建的失活载体pK19 mobsacB△ilvA(应用与环境微生物学(1999)65：1973-1979)用于缺失。将Stratagene(Heidelberg，德国)的甲基化酶缺陷的E．coli菌株SCS110(Jerpseth和Kretz，分子生物学策略6，22，(1993))首先用200ng载体pK19mobsacB△ilvA转化。通过在含50μg／ml卡那霉素的LB-琼脂平板上对卡那霉素的抗性鉴别转化体。从一个转化体中制备质粒pK19mobsacB△ilvA，然后将此失活质粒通过电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61：329-334)导入谷氨酸棒杆菌ATCC 14752中。通过在含15μg／ml卡那霉素的LBHIS-琼脂平板(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65：299-304)上对卡那霉素的抗性鉴别失活载体整合入基因组中的克隆。为选择载体切除，将卡那霉素抗性克隆铺板于含蔗糖的LBG-培养基(具有15g／L琼脂，2％葡萄糖和10％蔗糖的LB培养基)上。以此方式获得的菌落，在经过二次重组时已丧失载体(Jager等，细菌学杂志(1992)174：5462-5465)。通过在具有及不具有300mg／L L-异亮氨酸，具有及不具有50μg／ml卡那霉素的基本培养基平板(具有15g／L琼脂的CGXII培养基(Keihauer等，细菌学杂志(1993)175：5595-5603))上差异接种，分离了6个克隆，通过切除载体这些克隆对卡那霉素敏感并且是异亮氨酸营养缺陷的，其中只有不完全的ilvA-Gen(△ilvA等位基因)存在于基因组中。这些克隆之一命名为菌株ATCC 14752△ilvA，并用于转座子诱变。
含有装配的转座子Tn5531(Ankri等，细菌学杂志(1996)178：4412-4419)的质粒pCGL0040分离自甲基化酶缺陷的E．coli菌株GM2929 pCGL0040(E．coli GM 2929：Palmer等，基因(1994)143：1-12)。通过电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61：329-334)，用质粒pCGL0040转化谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 14752△ilvA。通过在含15μg／ml卡那霉素的LBHIS-琼脂平板上对卡那霉素的抗性鉴别转座子Tn5531整合入基因组中的克隆(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65：299-304)。以此方式获得2000个克隆，检查它们在存在苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸时生长的阻滞。为此目的，将所有克隆单独移至具有或不具有2mM苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸的CGXII基本培养基琼脂平板上。该培养基等同于由Keilhauer等所述(细菌学杂志(1993)175：5593-5603)CGXII培养基，但另外还含有25μg／ml卡那霉素，300mg／L L-异亮氨酸和15g／L琼脂。由Keilhauer等所述培养基的组分示于表1。
            表1 CGXII培养基的组成
    组分     浓度
    (NH4)2SO4     20g/L
    脲     5g/L
    KH2PO4     lg/L
    K2HPO4     lg/L
    MgSO4x7H2O     0.25g/L
    3-吗啉代丙烷磺酸     42g/L
    CaCl2     10mg/L
    FeSO4x7H2O     10mg/L
    MnSO4xH2O     10mg/L
    ZnSO4x7H2O     1mg/L
    CuSO4     0.2mg/L
    NiCl2x6H2O     0.02mg/L
    生物素     0.2mg/L
    葡萄糖     40g/L
    原儿茶酸     30mg/L
将琼脂平板在30℃培养，并在12，18和24小时后研究生长情况。获得的转座子突变体在不具有苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸时，与初始菌株谷氨酸棒杆菌ATCCl4752△ilvA相类似方式生长，但其在存在2mM苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸时呈阻滞生长。将此突变体命名为ATCCl4752／△ilvAthrE：：Tn5531。
2、ATCCl4752△ilvAthrE：：Tn553l中Tn5531的插入位点的克隆与测序
为克隆位于实施例1．1所述突变体中转座子Tn5531上游的插入位点，首先如Schwarzer等所述(生物／技术(1990)9：84-87)分离此突变体菌株染色体DNA，并将400ng染色体DNA用限制内切酶EcoRI切割。将完全限制性插入片段与来自Roche Diagnostics(Mannheim，德国)的同样用EcoRI线性化的载体pUC18(Norander等，基因(1983)26：101-106)连接。通过电穿孔(Dower等，核酸研究(1988)16：6127-6145)，将E．coli菌株DH5αmcr(Grant等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA(1990)87：4645-4649)用完全连接插入片段转化。其中转座子Tn 5531的插入位点克隆存在于载体pUC 18上的转化体，通过在含50μg／ml羧苄青霉素和25μg／ml的卡那霉素的LB-琼脂平板上对羧苄青霉素和卡那霉素的抗性而加以鉴别。从三个转化体中制备质粒，并通过限制分析确定克隆的插入片段的大小。通过Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA(1977)74：5463-5467)所述双脱氧链终止法，用约5．7kb的大插入片段确定一个质粒上插入位点的核苷酸序列。为此，起自下述寡核苷酸引物5’-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3’对2．2kb插入片段进行测序。
为鉴别位于转座子下游的插入位点，用限制内切酶XbaI切割突变体的染色体DNA，并与用XbaI线性化的载体pUC18连接。如上述进行进一步克隆。通过Sanger等(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA(1977)74：54635467)所述双脱氧链终止法，用约8．5kb大插入片段确定一个质粒上插入位点的核苷酸序列。为此，起自下面寡核苷酸引物5’-CGG TGC CTT ATC CATTCA GG-3’对0．65kb插入片段进行测序。
用程序包Lasergene(Biocomputing Software for Windows，DNASTAR，Madison，美国)对所得核苷酸序列进行分析与组装，此核苷酸序列再现为SEQ ID NO：1。此分析鉴别一个1467bp长的开放读框，相应基因被命名为thrE基因，相关基因产物含有489个氨基酸，并再现为SEQ ID NO：2。
实施例2来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的thrE基因的克隆与测序
将thrE基因在E．coli克隆载体pUC18(Norrander等，基因(1983)26：101-106，Roche Diagnostics，Mannheim，德国)中克隆。以两个阶段进行克隆。首先用衍生自SEQ ID NO：1的以下寡核苷酸引物，经PCR扩增谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的该基因。
ThrE-正向：5’-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3’
ThrE-反向：5’-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3’
在存在200μM脱氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)情况下，将PCR反应循环30次，每次在热循环仪(PTC-100，MJResearch，Inc．，华盛顿，美国)中的1μM相应寡核苷酸，100ng谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA，1／10体积的10倍反应缓冲液，和2．6单位热稳定Taq／Pwo-DNA聚合酶混合物(ExpandHigh Fidelity PCR System from Roche Diagnostics，Mannheim，德国)在以下条件进行反应：94℃ 30秒，58℃ 30秒，和72℃ 2分钟。
然后，根据生产者之说明，用SureClone连接试剂盒(Amersham，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，将约1．9kb大片段连入载体pUC18的SmaI切割位点。将E．coli菌株DH5αmcr(Grant等，Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA(1990)87：4645-4649)用完整连接插入片段转化。基于在含50μg／ml羧苄青霉素的LB琼脂平板上对羧苄青霉素的抗性，鉴别转化体。从8个转化体中制备质粒，并通过限制分析测试作为插入片段的1．9kbPCR片段的存在与否。所得重组质粒在后文命名为pUC 18thrE。
通过如Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA(1977)74：5463-5467)所述双脱氧链终止法，确定质粒pUC 18thrE中1．9kb PCR片段的核苷酸序列。为此，借助于以下来自Roche Diagnostics(Mannheim，德国)的引物，对pUC 18thrE的完整插入片段进行测序。
通用引物：5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’
反向引物：5’-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3’
此核苷酸序列再现为SEQ ID NO：3，用程序包Lasergene(Biocomputing Software for Windows，DNASTAR，Madison，美国)分析所包含的核苷酸序列。此分析鉴别出一个长1467bp的开放读框，称其为thrE基因。该基因编码489个氨基酸的多肽，记为SEQ IDNO：4。
实施例3 谷氨酸棒杆菌中thrE基因的表达
将实施例2中所述的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的thrE基因克隆，以在载体pZ1(Menkel等，应用与环境微生物学(1989)64：549-554)中表达。为此，用限制酶SacI和XbaI从质粒pUC 18thrE中切下含thrE基因的1881bp的大DNA片段。将此片段的5’和3’末端用Klenow酶处理。将所得DNA片段连接于预先用ScaI线性化及去磷酸化的载体pZ1 中。将E．coli菌株DH5αmcr(Grant等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA(1990)87：4645-4649)用完整连接插入片段转化。基于在含50μg／ml卡那霉素的LB琼脂平板上对卡那霉素的抗性而鉴别转化体。从2个转化体中制备质粒，并经限制分析检查作为插入片段的1881bpScaI／XbaI片段的存在。以此方式产生的重组质粒命名为pZ1thrE(图2)。
通过电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61：329-334)，将质粒pZ1和pZ1thrE掺入形成苏氨酸的菌株黄色短杆菌DM368-2中。该菌株由EP-B-0 385 940所述，且登记号DSM5399。基于其在含15μg／ml卡那霉素的LBHIS琼脂平板(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65：299-304)上对卡那霉素的抗性而鉴别转化体。以此方式获得菌株黄色短杆菌DM368-2和DM 368-2 pZ1thrE。
实施例5 用黄色短杆菌制备L-苏氨酸
为研究其形成苏氨酸的情况，将菌株黄色短杆菌DM368-2 pZ1和DM368-2 pZ1thrE在具有50μg／ml卡那霉素的100ml脑心浸液培养基(Difco Laboratories，Detroit，美国)中，在30℃预培养14小时。然后用0．9％(w／v)的氯化钠液将细胞冲洗一次，并将此悬浮液接种于60ml CgXII培养基，以使OD600(在600nm的光密度)是0．5。此培养基等同于由Keilhauer等所述(细菌学杂志(1993)175：5593-5603)的培养基，但另外含有50μg／ml卡那霉素。将二个菌株在30℃培养72小时。在0，24，48和72小时之后取样本，并将细胞迅速离心(在Biofuge Pico，来自Heraeus，Osterode，德国，13000RPM，5分钟)。
通过反相HPLC(Lindroth等，分析化学(1979)51：1167-1174)，对培养物上清液中胞外氨基酸浓度进行定量确定。使用配有荧光检测仪(G1321A)的HP1100系列(Hewlett-Packard，Waldbronn，德国)的HPLC装置；用HP-Chem-Station(Hewlett Packard)操作此系统及进行数据评估。在自动预备柱衍生化步骤中，将待分析的1μl氨基酸溶液与20μl邻苯二醛／2-巯基乙醇试剂(Pierce EuropeBV，Oud-Beijen Land，荷兰)混合。将所得发荧光的硫取代的异吲哚(Jones等，层析学杂志(1983)266：471-482)，在组合的预备柱(40×4mm Hypersil ODS5)和主柱(Hypersil ODS5，二柱均得自CS-Chromatographie Service GmbH，Langerwehe，德国)中，用具有升高的非极性相(甲醇)的梯度程序分离。极性洗脱液是乙酸钠(0．1M，pH7．2)；流速是0．8ml／分。在230nm的激发波长和在450nm的发射波长对衍生化的氨基酸进行荧光检测。通过与外标及作为另外的内标的天冬酰胺相对比，计算氨基酸浓度。
所得结果示于表2。
                    表2
菌株 L-苏氨酸(g/L)
0小时 24小时 48小时 72小时
DM368-2pZ1 0 0．46 1．27 1．50
DM368-2pZ1thrE 0 0．68 1．71 2．04
实施例 6载体pEC-T18mob2thrE的制备
1、构建pEC-T18mob2
根据现有技术构建E．coli谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。
此载体含有包括复制效应子per的质粒pGA1的复制区rep(US-A-5，175，108；Nesvera等，细菌学杂志179，1525-1532(1997))，质粒pAG1的赋予四环素抗性的tetA(Z)基因(US-A-5，158，891；国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国)的基因库登记，登记号AF 121000)，质粒pMB1的复制区oriV(Sutcliffe，ColdSpring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43，77-90(1979))，包括1ac启动子和多重克隆位点(mcs)的1acZα基因片段(Norrander等，基因26，101-106(1983))，和质粒RP4的mob区(Simon等，(1983)生物／技术1：784-791)。
将构建的载体转化入E．coli菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆实用指导，卷I．IRL-Press，Oxford，华盛顿DC，USA，1985)。通过将转化体成批铺板于已补加5mg／l四环素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，2nd版。冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，美国，1989)上，选择携带质粒的细胞。通过Qiagen的QIAprep SpinMiniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII限制消化，随后进行琼脂糖凝胶电泳(0．8％)检查。
该质粒称为pEC-T18mob2，并示于图3。
2、构建pEC-T18mob2thrE
将实施例2所述谷氨酸棒杆菌ATCC13032的thrE基因克隆，以在载体pEC-T18mob2中表达。为此，用限制酶SacI和XbaI从质粒pUC18thrE中切下含thrE基因的1881 bp大DNA片段。将所得DNA片段连于已预先用SacI和XbaI线性化及去磷酸化的载体pEC-T18 mob 2中。将E．coli菌株DH5αmcr(Grant等，Proceedings ofthe National Academy ofSciences of the USA(1990)87：4645-4649)，用整个连接混合转化。基于其在含5μg／ml四环素的LB琼脂平板上对四环素的抗性，鉴别转化体。从2个转化体中制备质粒，并经限制分析检查作为插入片段的1881bp ScaI／XbaI片段的存在，以此方式获得的重组质粒称为pEC-T18mob2thrE(图4)。
通过电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61：329-334)，将质粒pEC-T18mob2和pEC-T18mob2thrE导入生成苏氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株MH20-22B-DR17中(Reinscheid等，应用与环境微生物学(1994)60：126-132)。基于其在含15μg／ml卡那霉素和5μg／ml四环素的LBHIS琼脂平板(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65：299-304)上对四环素和卡那霉素的抗性鉴别转化体。以此方式获得谷氨酸棒杆菌菌株MH20-22B-DR17／pEC-T18mob2和MH20-22B-DR17／pEC-T18mob2thrE。
实施例7 用谷氨酸棒杆菌制备L-苏氨酸
为研究其生成苏氨酸的情况，将菌株谷氨酸棒杆菌MH20-22B-DR17／pEC-T18mob2和MH20-22B-DR17／pEC-T18mob2thrE，在含25μg／ml卡那霉素和5μg／ml四环素的100ml脑心浸液培养基(DifcoLaboratories，Detroit，美国)中，在30℃预培养14小时。然后用0．9％(w／v)NaCl液将细胞冲洗一次，并将此悬浮液接种于60ml CgXII培养基的，以使OD600(在600nm的光密度)为0．5，此培养基等同于由Keilhauer等(细菌学杂志(1993)175：5593-5603)所述的培养基，但另外含有25μg／ml卡那霉素和5μg／ml四环素。将二菌株在30℃培养72小时。在0，24，48和72小时之后取样本，并将细胞简短离心(在Biofuge pico离心机，Heraeus，Osterode德国。13000rpm，5分钟)
用反相HPLC(Lindroth等，分析化学(1979)51：1167-1174)，如实施例5中对黄色短杆菌所做的一样，对培养物上清液中胞外氨基酸浓度进行定量确定。通过与外标和作为另外内标的天冬酰胺相对比，计算氨基酸浓度，结果示于表3。
表3
菌株 L-苏氨酸(g/L)
0小时 24小时 48小时 72小时
MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2 0 3．14 5．82 5．78
MH20-22BDR17/pEC-T18mob2thrE 0 4．16 7．53 8．05
本发明包括如下附图：
图1：含转座子Tn5531的质粒pCGL0040图，转座子以未划影线的箭头表示。
图2：含thrE基因的质粒pZ1thrE图。
图3：质粒pEC-T18mob2图。
图4：含thrE基因的质粒pEC-T18mob2 thrE图。
长度数据应被认为是大约的。所采用的缩写和符号有如下含义：
·amp：氨苄青霉素抗性基因
·kan：卡那霉素抗性基因
·amp：氨苄青霉素抗性基因的3’部分
·oriBR322：质粒pBR322的复制区
·tet：四环素抗性基因
·oriV：E．coli的质粒编码的复制源点
·PR4mob：用于转移质粒的mob区
·rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点
·per：pGA1的控制拷贝数的基因
·LacZ-α：β-半乳糖苷酶的lacZα基因片段(N-末端)。
限制酶的缩写有如下含义
BamHI：来自Bacillus amyloliquefaciens的限制酶
BglII：来自Bacillus globigii的限制酶
EcoRI：来自E．coli的限制酶
EcoRV：来自E．coli的限制酶
HindIII：来自Haemophilus influenzae的限制酶
KpnI：来自Klebsiella pneumoniae的限制酶
PstI：来自Providencia stuartii的限制酶
PvuI：来自Proteus vulgaris的限制酶
SacI：来自Streptomyces achromogenes的限制酶
SalI：来自Streptomyces albus的限制酶
SmaI：来自Serratia marcescens的限制酶
XbaI：来自Xanthomonas badrii的限制酶
XhoI：来自Xanthomonas holcicola的限制酶
序列表<110> 德古萨-于尔斯股份公司于利希研究中心有限公司<120> 编码thrE基因的新核苷酸序列和用棒状菌酶促生产L-苏氨酸的方法<130> 990079 BT<140><141><160> 4<170> PatentIn Ver．2．1<210> 1<211> 2817<212> DNA<213> 谷氨酸棒杆菌 ATCC14752<220><221> CDS<222> (398)．．(1864)<223> thrE-Gen<400> 1aatgaaataa tcccctcacc aactggcgac attcaaacac cgtttcattt ccaaacatcg 60agccaaggga aaagaaagcc cctaagcccc gtgttattaa atggagactc tttggagacc 120tcaagccaaa aaggggcatt ttcattaaga aaatacccct ttgacctggt gttattgagc 180tggagaagag acttgaactc tcaacctacg cattacaagt gcgttgcgct gccaattgcg 240ccactccagc accgcagatg ctgatgatca acaactacga atacgtatct tagcgtatgt 300gtacatcaca atggaattcg gggctagagt atctggtgaa ccgtgcataa acgacctgtg 360attggactct ttttccttgc aaaatgtttt ccagcgg atg ttg agt ttt gcg acc  41Met Leu Ser Phe Ala Thr1               5ctt cgt ggc cgc att tca aca gtt gac gct gca aaa gcc gca cct ccg    463Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Pro10                  15                  20cca tcg cca cta gcc ccg att gat ctc act gac cat agt caa gtg gcc    511Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr Asp His Ser Gln Val Ala25                  30                  35ggt gtg atg aat ttg gct gcg aga att ggc gat att ttg ctt tct tca    559Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly Asp Ile Leu Leu Ser Ser40                  45                      50ggt acg tca aac agt gat acc aag gtg caa gtt cga gcg gtg acc tct   607Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln Val Arg Ala Val Thr Ser55                  60                  65                  70gcg tat ggc ctg tac tat acg cat gtg gat atc acg ttg aat acg atc    655Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp Ile Thr Leu Asn Thr Ile75                  80                  85acc atc ttc acc aac atc ggt gtg gag agg aag atg ccg gtc aac gtg    703Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg Lys Met Pro Val Asn Val90                  95                 100ttt cat gtt gtg ggc aag ttg gac acc aac ttc tcc aaa ctg tct gag    751Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Set Lys Leu Ser Glu105                 110                 115gtt gac cgt ttg atc cgt tcc att cag gct ggt gct acc ccg cct gag    799Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Pro Glu120                 125                 130gtt gcc gag aaa att ctg gac gag ttg gag caa tcg cct gcg tct tat   847Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu Gln Ser Pro Ala Ser Tyr135                 140                 145                 150ggt ttc cct gtt gcg ttg ctt ggc tgg gca atg atg ggt ggc gct gtt    895Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala Val155                 160                 165gct gtg ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att gct ttt att    943Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val Ser Leu Ile Ala Phe Ile170                 175                 180acc gcg ttc acg atc att gcc acg acg tca ttt ttg gga aag aag ggt   991Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys Gly185                 190                 195ttg cct act ttc ttc caa aat gtt gtt ggt ggt ttt att gcc acg ctg    1039Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly Gly Phe Ile Ala Thr Leu200                 205                 210cct gca tcg att gct tat tct ttg gcg ttg caa ttt ggt ctt gag atc    1087Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gln Phe Gly Leu Glu Ile215                 220                 225                 230aaa ccg agc cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca ggt    1135Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile Val Val Leu Leu Ala Gly235                 240                 245ttg aca ctt gtg caa tct ctg cag gac ggc atc acg ggc gct ccg gtg   1183Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly Ile Thr Gly Ala Pro Val250                 255                 260aca gca agt gca cga ttt ttt gaa aca ctc ctg ttt acc ggc ggc att    1231Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly Ile265                 270                 275gtt gct ggc gtg ggt ttg ggc att cag ctt tct gaa atc ttg cat gtc    1279Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu Ser Glu Ile Leu His Val280                 285                 290atg ttg cct gcc atg gag tcc gct gca gca cct aat tat tcg tct aca    1327Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser Thr295                 300                 305                 310ttc gcc cgc att atc gct ggt ggc gtc acc gca gcg gcc ttc gca gtg   1375Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala Val315                 320                 325ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act gcg    1423Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile Ile Ala Gly Leu Thr Ala330                 335                 340ctg atg ggt tct gcg ttt tat tac ctc ttc gtt gtt tat tta ggc ccc    1471Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe Val Val Tyr Leu Gly Pro345                 350                 355gtc tct gcc gct gcg att gct gca aca gca gtt ggt ttc act ggt ggt    1519Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly Gly360                 365                 370ttg ctt gcc cgt cga ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att gcc    1567Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro Leu Ile Val Ala Ile Ala375                 380                 385                 390ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac cgc gga atg tac    1615Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala Ile Tyr Arg Gly Met Tyr395                 400                 405gcc acc ttg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg gtt    1663Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn Ile Ala Val410                 415                 420gct tta gcc act gct tca tca ctt gcc gct ggc gtg gtt ttg ggt gag   1711Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly Glu425                 430             435tgg att gcc cgc agg cta cgt cgt cca cca cgc ttc aac cca tac cgt    1759Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr Arg440         445                         450gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa gct gag cag   1807Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gln Glu Glu Ala Glu Gln455                 460                 465                 470aat cag cgc cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat caa aga ttc ggt   1855Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gln Arg Phe Gly475                 480                  485aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgtctttcgc ttaaatagcg           1904Asn Lys Argtagaatatcg ggtcgatcgc ttttaaacac tcaggaggat ccttgccggc caaaatcacg 1964gacactcgtc ccaccccaga atcccttcac gctgttgaag aggaaaccgc agccggtgcc 2024cgcaggattg ttgccaccta ttctaaggac ttcttcgacg gcgtcacttt gatgtgcatg 2084ctcggcgttg aacctcaggg cctgcgttac accaaggtcg cttctgaaca cgaggaagct 2144cagccaaaga aggctacaaa gcggactcgt aaggcaccag ctaagaaggc tgctgctaag 2204aaaacgacca agaagaccac taagaaaact actaaaaaga ccaccgcaaa gaagaccaca 2264aagaagtctt aagccggatc ttatatggat gattccaata gctttgtagt tgttgctaac 2324cgtctgccag tggatatgac tgtccaccca gatggtagct atagcatctc ccccagcccc 2384ggtggccttg tcacggggct ttcccccgtt ctggaacaac atcgtggatg ttgggtcgga 2444tggcctggaa ctgtagatgt tgcacccgaa ccatttcgaa cagatacggg tgttttgctg 2504caccctgttg tcctcactgc aagtgactat gaaggcttct acgagggctt ttcaaacgca 2564acgctgtggc ctcttttcca cgatttgatt gttactccgg tgtacaacac cgattggtgg 2624catgcgtttc gggaagtaaa cctcaagttc gctgaagccg tgagccaagt ggcggcacac 2684ggtgccactg tgtgggtgca ggactatcag ctgttgctgg ttcctggcat tttgcgccag 2744atgcgccctg atttgaagat cggtttcttc ctccacattc ccttcccttc ccctgatctg 2804ttccgtcagc tgc                                                                  2817<210> 2<211> 489<212> PRT<213> 谷氨酸棒杆菌 ATCC14752<400> 2Met Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala1               5                  10                  15Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr20                  25                  30Asp His Ser Gln Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly35                  40                  45Asp Ile Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln50                  55                  60Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp65                  70                  75                  80Ile Thr Leu Asn Thr Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg85                  90                   95Lys Met Pro Val Asn Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn100                 105                 110Phe Ser Lys Leu Set Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala115                 120                 125Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu130                 135                 140Gln Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala145                 150                 155                 160Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val165                 170                 175Ser Leu Ile Ala Phe Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser180                 185                 190Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly195                 200                 205Gly Phe Ile Ala Thr Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu210                 215                  220Gln Phe Gly Leu Glu Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile225                 230                 235                 240Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly245                 250                 255Ile Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu260                 265                 270Leu Phe Thr Gly Gly Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu275                 280                 285Ser Glu Ile Leu His Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala290                 295                 300Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr305                 310                  315                320Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile325                 330                 335Ile Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe340                 345                 350Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala355                 360                 365Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro370                 375                 380Leu Ile Val Ala Ile Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala385                 390                 395                 400Ile Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly405                 410                 415Phe Thr Asn Ile Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala420                 425                         430Gly Val Val Leu Gly Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro435                 440                 445Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe450                 455                 460Gln Glu Glu Ala Glu Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys465                 470                 475                 480Thr Asn Gln Arg Phe Gly Asn Lys Arg485<210> 3<211&> 1909<212> DNA<213> 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032<220><221> CDS<222> (280)．．(1746)<223> thrE-Gen<400> 3agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccccc ctttgacctg gtgttattga 60gctggagaag agacttgaac tctcaaccta cgcattacaa gtgcgttgcg ctgccaattg 120cgccactcca gcaccgcaga tgctgatgat caacaactac gaatacgtat cttagcgtat 180gtgtacatca caatggaatt cggggctaga gtatctggtg aaccgtgcat aaacgacctg 240tgattggact ctttttcctt gcaaaatgtt ttccagcgg atg ttg agt ttt gcg     294Met Leu Ser Phe Ala1               5acc ctt cgt ggc cgc att tca aca gtt gac gct gca aaa gcc gca cct    342Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro10                   15                  20ccg cca tcg cca cta gcc ccg att gat ctc act gac cat agt caa gtg    390Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr Asp His Ser Gln Val25                  30                  35gcc ggt gtg atg aat ttg gct gcg aga att ggc gat att ttg ctt tct    438Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly Asp Ile Leu Leu Ser40                  45                  50tca ggt acg tca aat agt gac acc aag gta caa gtt cga gca gtg acc   486Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln Val Arg Ala Val Thr55                  60                  65tct gcg tac ggt ttg tac tac acg cac gtg gat atc acg ttg aat acg    534Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp Ile Thr Leu Asn Thr70                      75              80                  85atc acc atc ttc acc aac atc ggt gtg gag agg aag atg ccg gtc aac    582Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg Lys Met Pro Val Asn90                  95                 100gtg ttt cat gtt gta ggc aag ttg gac acc aac ttc tcc aaa ctg tct   630Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ser105                 110                 115gag gtt gac cgt ttg atc cgt tcc att cag gct ggt gcg acc ccg cct    678Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Pro120                 125                 130gag gtt gcc gag aaa atc ctg gac gag ttg gag caa tcc cct gcg tct    726Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu Gln Ser Pro Ala Ser135                 140                 145tat ggt ttc cct gtt gcg ttg ctt ggc tgg gca atg atg ggt ggt gct   774Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala150                 155                 160                 165gtt gct gtg ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att gct ttt   822Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val Ser Leu Ile Ala Phe170                 175                 180att acc gcg ttc acg atc att gcc acg acg tca ttt ttg gga aag aag    870Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys185                 190                 195ggt ttg cct act ttc ttc caa aat gtt gtt ggt ggt ttt att gcc acg    918Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly Gly Phe Ile Ala Thr200                 205                 210ctg cct gca tcg att gct tat tct ttg gcg ttg caa ttt ggt ctt gag   966Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gln Phe Gly Leu Glu215                 220                 225atc aaa ccg agc cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca    1014Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile Val Val Leu Leu Ala230                 235                 240                 245ggt ttg aca ctc gtg caa tct ctg cag gac ggc atc acg ggc gct ccg    1062Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly Ile Thr Gly Ala Pro250                 255                 260gtg aca gca agt gca cga ttt ttc gaa aca ctc ctg ttt acc ggc ggc    1110Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly265                 270                  275att gtt gct ggc gtg ggt ttg ggc att cag ctt tct gaa atc ttg cat    1158Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu Ser Glu Ile Leu His280                 285                 290gtc atg ttg cct gcc atg gag tcc gct gca gca cct aat tat tcg tct   1206Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser295                 300                 305aca ttc gcc cgc att atc gct ggt ggc gtc acc gca gcg gcc ttc gca    1254Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala310                 315                 320                 325gtg ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act    1302Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile Ile Ala Gly Leu Thr330                 335                 340gcg ctg atg ggt tct gcg ttt tat tac ctc ttc gtt gtt tat tta ggc   1350Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe Val Val Tyr Leu Gly345                 350                 355ccc gtc tct gcc gct gcg att gct gca aca gca gtt ggt ttc act ggt    1398Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly360                 365                 370ggt ttg ctt gcc cgt cga ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att    1446Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro Leu Ile Val Ala Ile375                 380                 385gcc ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac cgc gga atg   1494Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala Ile Tyr Arg Gly Met390                 395                 400                 405tac gcc acc ctg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg    1542Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn Ile Ala410                 415                 420gtt gct tta gcc act gct tca tca ctt gcc gct ggc gtg gtt ttg ggt    1590Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly425                 430                 435gag tgg att gcc cgc agg cta cgt cgt cca cca cgc ttc aac cca tac    1638Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr440                 445                 450cgt gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa gct gag   1686Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gln Glu Glu Ala Glu455                 460                 465cag aat cag cgc cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat cag aga ttc    1734Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gln Arg Phe470                 475                 480                 485ggt aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgtctttcgc ttaaatagcg        1786Gly Asn Lys Argtagaatatcg ggtcgatcgc ttttaaacac tcaggaggat ccttgccggc caaaatcacg 1846gacactcgtc ccaccccaga atcccttcac gctgttgaag aggaaaccgc agccggggta 1906ccg                                                                       1909<210> 4<211> 489<212> PRT<213> 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032<400> 4Met Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala1                5                  10                  15Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr20                  25                  30Asp His Ser Gln Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly35                  40                  45Asp Ile Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln50                  55                  60Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp65                  70                  75                  80Ile Thr Leu Asn Thr Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg85                  90                  95Lys Met Pro Val Asn Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn100                 105                 110Phe Ser Lys Leu Ser Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala115                 120                 125Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu130                 135                 140Gln Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala145                 150                 155                 160Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val165                 170                 175Ser Leu Ile Ala Phe Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser180                 185                 190Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly195                 200                 205Gly Phe Ile Ala Thr Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu210                 215                 220Gln Phe Gly Leu Glu Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile225                 230                 235                 240Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly245                 250                 255Ile Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu260                 265                 270Leu Phe Thr Gly Gly Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu275                 280                 285Ser Glu Ile Leu His Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala290                 295                 300Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr305                 310                 315                 320Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile325                 330                 335Ile Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe340                 345                 350Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala355                 360                 365Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro370                 375                 380Leu Ile Val Ala Ile Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala385                 390                 395                 400Ile Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly405                 410                 415Phe Thr Asn Ile Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala420                 425                 430Gly Val Val Leu Gly Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro435                 440                 445Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe450                 455                 460Gln Glu Glu Ala Glu Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys465                 470                 475                 480Thr Asn Gln Arg Phe Gly Asn Lys Arg485

Claims (15)

1、衍生自棒杆菌并在棒状微生物中可复制的优选为重组的DNA，其含有至少一个编码thrE基因的核苷酸序列。
2、权利要求1的可复制的DNA，具有
(i)编码thrE基因，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并区内相应于的(i)序列的至少一个序列，或
(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和／或任选地
(iv)(i)中有功能的中义突变。
3、衍生自权利要求1或2的核苷酸序列的蛋白质氨基酸序列，示于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4
4、通过导入权利要求1或2的一或多个可复制的DNA而转化的棒状微生物，尤其棒杆菌属。
5、谷氨酸棒杆菌DM368-2 pZ1thrE，以保藏号DSM 12840保藏。
6、经棒状菌发酵生产L-苏氨酸的方法，特征在于所用细菌中编码thrE基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
7、权利要求6的方法，特征在于所用细菌中苏氨酸生物合成途径的其它一或多个基因是扩增的。
8、权利要求6或7的方法，其特征在于使用经质粒载体转化的菌株，且此质粒载体携带编码thrE基因的核苷酸序列。
9、权利要求6或8的方法，其特征在于thrE基因在含有其它代谢物或抗代谢物抗性突变的微生物中是过表达的。
10、权利要求6～9任一项的方法，其特征在于为达到过表达，将微生物在改变的培养基中发酵，和／或改变发酵条件。
11、权利要求6～10任一项的方法，其特征在于所用的微生物中，降低苏氨酸生成的代谢途径至少被部分关闭。
12、权利要求6～11任一项的方法，其特征在于所用的微生物中，除thrE基因之外，苏氨酸生成的代谢途径的其它基因是单独或同时扩增的(过表达的)。
13、生产L-苏氨酸的方法，其特征在于进行以下步骤：
(a)将一或多条前述权利要求的微生物发酵，其中至少thrE基因是扩增的(过表达的)，其任选地与其它基因一起扩增(过表达)，
(b)富集培养基或微生物细胞中的L-苏氨酸，及
(c)分离L-苏氨酸。
14、前述一或多条权利要求的方法，其特征在于使用棒杆菌属微生物。
15、分离thrE基因的方法，其特征在于获得在存在含苏氨酸的寡肽的营养培养基上不生长或微弱生长的thrE基因缺陷的突变体，优选棒状菌，作为指示菌株，及
a)在建立基因库后鉴别并分离thrE基因，或
b)在选择转座子诱变情况中，转座子优选呈对抗生素有抗性，从而获得thrE基因。
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