ES2203384T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican el gen thre y procedimiento para la preparacion fermentativa de l-treonina con bacterias corineformes. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos que codifican el gen thre y procedimiento para la preparacion fermentativa de l-treonina con bacterias corineformes.Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Abstract
ADN recombinante, replicable en microorganismos corineformes con el origen Corynebacterium, que contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el gen thrE, elegido del grupo: (i) secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 3 que codifican el gen thrE o (ii) al menos una secuencia que corresponde a las secuencias (i) dentro del margen de la degeneración del código genético o (iii) secuencias de nucleótidos con mutaciones silenciosas de función neutra en (i).
Description
Secuencia de nucleótidos que codifican el gen
thrE y procedimiento para la preparación fementativa del
L-treonina con bacterias corineformes.
La invención trata de secuencias de nucleótidos
que codifican el gen thrE y de procedimientos para la preparación
fermentativa de L-treonina utilizándose bacterias
corineformes, en las que se refuerza el gen thrE.
La L-treonina se aplica en la
alimentación animal, en la medicina humana y en la industria
farmacéutica.
Es conocido que la L-treonina
puede prepararse mediante la fermentación de cepas de bacterias
corineformes, en particular del Corynebacterium glutamicum.
Por su gran importancia se está trabajando continuamente en la
mejora de los procedimientos de preparación. Las mejoras del
procedimiento pueden referirse a medidas respecto a las técnicas de
fermentación como, por ejemplo, agitación y alimentación de oxígeno,
o a la composición de los medios nutritivos como, por ejemplo, la
concentración de azúcar durante la fermentación, o al tratamiento
para obtener la forma del producto, por ejemplo mediante
cromatografía de intercambio de iones, o a las propiedades
intrínsecas del rendimiento del propio microorganismo.
Para la mejora de las propiedades del rendimiento
de estos microorganismos se usan métodos para la mutagénesis,
selección y selección de mutantes. De esta forma se obtienen cepas
que son resistentes a antimetabolitos tales como, por ejemplo, el
análogo de treonina, el ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV) o cepas que son auxótrofas para aminoácidos significantes
para la regulación y que producen L-treonina.
Desde hace algunos años se usan también métodos
de la técnica de ADN recombinante para la mejora de cepas de
Corynebacterium que producen L-treonina
amplificándose determinados genes de biosíntesis de treonina y
estudiándose el efecto en la producción de la
L-treonina.
El objetivo de los inventores era proporcionar
nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de
L-treonina.
L-treonina.
La L-treonina se aplica en la
alimentación animal, en la medicina humana y en la industria
farmacéutica. Por lo tanto, existe un interés general en
proporcionar nuevos procedimientos mejorados para la preparación de
L-treonina.
El objeto de la invención es un ADN recombinante,
replicable en microorganismos corineformes, con el origen
Corynebacterium, que contiene al menos la secuencia de
nucleótidos que codifica el gen thrE, representado en la secuencia
identificada SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 3.
También es objeto de la invención un ADN
replicable según la reivindicación 1 con:
- (i)
- las secuencias de nucleótidos representadas en SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 3, O
- (ii)
- al menos una secuencia que corresponde a las secuencias (i) dentro del margen de la degeneración del código genético o
- (iii)
- al menos una secuencia que hibrida con las secuencias complementarias a las secuencias (i) o (ii) y/o, dado el caso,
- (iv)
- mutaciones silenciosas de función neutra en (i).
La invención trata también de microorganismos
corineformes, en particular del género Corynebacterium,
transformados por la introducción del ADN replicable indicado.
Finalmente, la invención trata de un
procedimiento para la preparación fermentativa de
L-treonina usándose bacterias corineformes, que en
particular ya producen L-treonina y en las que se
refuerzan, en particular se sobreexpresan, la(s)
secuencia(s) de nucleótidos que codifican el gen thrE.
En este contexto, el concepto "reforzar"
describe el aumento de la actividad intracelular de una o varias
enzimas en un microorganismo que son codificadas por el ADN
correspondiente aumentándose, por ejemplo, el número de copias del
gen o de los genes, usándose un promotor fuerte o un gen que
codifica una enzima correspondiente con una actividad elevada y
combinándose, dado el caso, estas medidas.
\newpage
Los microorganismos de los que trata la presente
invención pueden producir L-treonina a partir de
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón,
celulosa o a partir de glicerina y etanol. Puede tratarse de
representantes de bacterias corineformes, en particular del género
Corynebacterium. Del género Corynebacterium hay que
indicar en particular el tipo Corynebacterium glutamicum,
conocido por los expertos por su capacidad de producir
L-aminoácidos.
Cepas adecuadas del género
Corynebacterium, en particular del tipo Corynebacterium
glutamicum, son en particular las cepas conocidas del tipo
silvestre
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y las mutantes o cepas que producen
L-treonina preparadas a partir de ellas como, por
ejemplo,
Corynebacterium glutamicum ATCC21649
Brevibacterium flavum BB69
Brevibacterium flavum DSM5399
Brevibacterium lactofermentum
FERM-BP 269
Brevibacterium lactofermentum
TBB-10.
Los inventores consiguieren aislar el gen thrE de
Corynebacterium glutamicum. Para el aislamiento del gen thrE
se prepara en primer lugar una mutante defectuosa en el gen thrE de
C. glutamicum. Para ello, una cepa de partida adecuada como,
por ejemplo, ATCC14752 o ATCC13032 se somete a un procedimiento de
mutagénesis.
Los procedimientos clásicos de mutagénesis son el
tratamiento con sustancias químicas como, por ejemplo,
N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina
o irradiación ultravioleta. Los procedimientos de este tipo para la
inducción de una mutación son generalmente conocidos y pueden
consultarse, entre otros, en Miller (A Short Course in Bacterial
Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1992)) o en el manual "Manual of Methods for General
Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington
D.C., EE.UU., 1981).
Otro procedimiento de mutagénesis es el método de
la mutagénesis con transposón, en el que se aprovecha la propiedad
de un transposón de "saltar" a secuencias de ADN y perturbar o
desactivar de esta forma la función del gen correspondiente. Entre
los expertos se conocen los transposones de bacterias corineformes.
De la cepa Corynebacterium xerosis M82B se aisló, por
ejemplo, el transposón de resistencia a la eritromicina Tn5432
(Tauch et al., Plasmid (1995) 33: 168-179) y el
transposón de la resistencia a cloroamfenicol Tn5546.
Otro transposón es el transposón Tn5531, que se
describe en Ankri et al. (Journal of Bacteriology (1996) 178:
4412-4419) y que se ha usado a título de ejemplo en
el desarrollo de la presente invención. El transposón Tn5531
contiene el gen de resistencia a la canamicina aph3 y puede
administrarse en forma del vector plásmido pCGL0040, que está
representado en la figura 1. La secuencia de nucleótidos del
transposón Tn5531 está libremente disponible bajo el número de
acceso (accession number) U53587 en el National Center for
Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.).
Después de haberse realizado la mutagénesis,
preferiblemente la mutagénesis con transposón, se busca una mutante
defectuosa en el gen thrE. Una mutante defectuosa en el gen thrE se
detecta porque muestra un buen crecimiento en agar mínimo mostrando,
por el contrario, un mal crecimiento en agar mínimo suplementado
con oligopéptidos que contienen treonina como, por ejemplo, el
tripéptido
treonilo-treonilo-treonina.
Un ejemplo para una mutante de este tipo es la
cepa ATCC1475\DeltailvAthrE::Tn5531.
Una cepa preparada de la forma descrita puede
usarse para el aislamiento y la clonación del gen thrE.
Para ello puede crearse un banco de genes de la
bacteria en cuestión. La creación de bancos de genes está descrita
en compendios y manuales generalmente conocidos. Como ejemplo
pueden indicarse el compendio de Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einführung in die Gentechnologie (editorial Chemie, Weinheim,
Alemania, 1990) o el manual de Sambrook et hal.: Molecular Cloning,
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un
banco de genes muy conocido es el de la cepa E. coli
K-12 W3110, que fue creada por Kohara et al. (Cell
50, 495 - 508 (1987)) en vectores \lambda. Bathe et al.
(Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996)
describen un banco de genes de C. glutamicum ATCC13032, que
se creó con ayuda del vector cósmido SuperCos I (Wahl et al., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences EE.UU.,
84:2160-2164) en la cepa E. coli
K-12 NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids
Research 16:1563-1575). Para la presente invención
son adecuados aquellos vectores que replican en bacterias
corineformes, preferiblemente en Corynebacterium glutamicum.
Los vectores de este tipo son conocidos por el estado de la
técnica; como ejemplo puede indicarse el vector plásmido pZ1, que
está descrito en Mengel et al. (Applied and Environmental
Microbiology (1989) 64: 549-554). El banco de genes
obtenido de la forma descrita se hace pasar a continuación mediante
transformación o electroporación a la cepa indicadora defectuosa en
el gen thrE buscándose aquellos transformantes que tienen la
capacidad de crecer en agar mínimo, en presencia de oligopéptidos
que contienen treonina. A continuación, el fragmento clonado de ADN
puede someterse a un análisis secuencial.
Al usarse una mutante generada por una
mutagénesis Tn5531 de una bacteria corineforme como, por ejemplo, la
cepa ATCC14752\DeltailvAthrE::Tn5531, el
thrE::Tn5531-ale1o puede clonarse y aislarse
directamente, aprovechándose el gen de resistencia a la canamicina
aph3 contenido en el mismo. Para ello se utilizan vectores de
clonación conocidos como, por ejemplo, pUC18 (Norrander et al., Gene
(1983) 26: 101-106 y Yanisch-Perron
et al., Gene (1985) 33: 103-119). Como anfitriones
de clonación son especialmente adecuadas las cepas de E.
coli que tienen defectos de restricción y de recombinación. Un
ejemplo es la cepa DH5\alphamcr, que fue descrita por Grant et
al. (Proceedings of the National Academy of Sciences EE.UU. 87
(1990) 4645-4649). La selección en transformantes se
realiza en presencia de canamicina. A continuación, se secuencia el
ADN plásmido de los transformantes obtenidos. Para ello puede
usarse el método de interrupción de cadena didesoxi descrito por
Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America EE.UU. (1977) 74:
5463-5467). Según este método se obtienen secuencias
del gen thrE corriente arriba y corriente abajo del sitio de
inserción de Tn5531. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se
analizan y reúnen a continuación con programas de análisis
secuenciales disponibles en el comercio como, por ejemplo, el
paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for Windows,
DNASTAR, Madison, EE.UU.) o el paquete de programas HUSAR (Release
4.0, EMBL, Heidelberg, Alemania).
De esta forma se obtuvo la nueva secuencia de ADN
que codifica el gen thrE de C. glutamicum, que es parte de
la presente invención como SEQ ID Nº 1. Además, con ayuda de los
métodos arriba descritos, se dedujo de la secuencia de ADN obtenida
la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente. En la
SEQ ID Nº 2 está representada la secuencia resultante de aminoácidos
del producto génico thrE.
Secuencias de ADN codificantes, que resultan de
la SEQ ID Nº 1 por el estado de degeneración del código genético,
también forman parte de la invención. Asimismo forman parte de la
invención las secuencias de ADN que hibridan con la SEQ ID Nº 1 o
con partes de la SEQ ID Nº 1. Entre los expertos se conocen, además,
intercambios conservadores de aminoácidos como, por ejemplo, el
intercambio de glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido
glutámico en proteínas como "mutaciones silenciosas" (sense
mutations), que no conducen a un cambio esencial de la actividad de
la proteína, es decir, que son de función neutra. Además, es
conocido que cambios en la terminación N y/o C de una proteína no
perjudican esencialmente la función de ésta, pudiendo incluso
conllevar una estabilización de la misma. El experto podrá leer
informaciones al respecto, entre otros, en
Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology
169:751-757 (1987)), en O'Regan et al. (Gene
77:237-251 (1989)), en Sahin-Toth et
al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en Hochuli
et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) y en
compendios conocidos de la genética y la biología molecular. Las
secuencias de aminoácidos que resultan de forma correspondiente de
la SEQ ID Nº 2 también forman parte de la invención.
Aprovechándose la secuencia de nucleótidos
representada en la SEQ ID Nº 1, pueden sintetizarse cebadores
adecuados, usándose los mismos posteriormente con ayuda de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los genes
thrE de distintas bacterias corineformes y cepas. El experto
encontrará instrucciones para ello, entre otros, por ejemplo en el
manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach
(IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en Newton und Graham: PCR
(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994). Como
alternativa, pueden usarse la secuencia de nucleótidos representada
en la SEQ ID Nº 1 o partes de ella como sonda para la búsqueda de
genes thrE en bancos de genes, en particular de bacterias
corineformes. El experto encontrará instrucciones para ello, entre
otros, por ejemplo en el manual "The DIG System Users Guide for
Filter Hybridization" de la compañía Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal
of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). A
continuación, los fragmentos de ADN que contienen gen thrE
amplificados de esta forma se someten a la clonación y a la
secuenciación.
De esta forma se obtuvo la secuencia de ADN
representada en la SEQ ID Nº 3 del gen thrE de la cepa ATCC 13032,
que también forma parte de la presente invención. En la SEQ ID Nº 4
está representada la secuencia de aminoácidos resultante.
También es objeto de la invención un
procedimiento para el aislamiento del gen thrE, caracterizado
porque como cepas indicadoras se obtienen mutantes defectuosas en
el gen thrE, preferiblemente bacterias corineformes, que no crecen
en un medio nutritivo que contiene un oligopéptido que contiene
treonina o que sólo crecen muy poco en éste y
- a)
- se identifica y aísla el gen thrE después de la creación de un banco de genes o,
- b)
- en el caso de la mutagénesis con transposón, se selecciona el transposón que presenta preferiblemente una resistencia a un antibiótico obteniéndose de esta forma el gen thrE.
Los inventores averiguaron que las bacterias
corineformes producen mejor L-treonina después de
una sobreexpresión del gen thrE.
Para conseguir una sobreexpresión, puede
aumentarse el número de copias de los genes correspondientes o
puede mutarse la región de promotor y regulación o el sitio de
unión al ribosoma, que se encuentra corriente arriba respecto al gen
estructural. De la misma forma actúan casetes de expresión, que se
incorporan corriente arriba del gen estructural. Mediante
promotores inducibles existe, además, la posibilidad de aumentar la
expresión en el transcurso de la producción fermentativa de
L-treonina. Mediante medidas para la prolongación
de la vida útil del mARN también puede mejorarse la expresión. Si
se impide la desintegración de la proteína enzimática, también puede
aumentarse la actividad enzimática. Los genes o las construcciones
génicas pueden estar presentes en plásmidos con un número variable
de copias o pueden estar integrados y amplificados en el cromosoma.
Como alternativa, una sobreexpresión de los genes correspondientes
puede conseguirse también mediante la alteración de la composición
de los medios y el control del cultivo.
El experto encontrará instrucciones al repecho,
entre otros, en Martin et al. (Bio/Technology 5,
137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138,
35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga
(Bio/Technology 6, 428-430 (1988), en Eikmanns et
al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la patente europea
EPS 0 472 869, en la patente estadounidense 4,601,893, en Schwarzer
und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en
Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,
126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud
de patente WO 96/15424, en Malumbres et al. (Gene 134, 15 - 24
(1993)), en la publicación de patente japonesa abierta a consulta
por el público
JP-A-10-229891, en
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological
Reviews 60:512-538 (1996) y en compendios conocidos
de la genética y de la biología molecular.
Un ejemplo de un plásmido con ayuda del cual
puede sobreexpresarse el gen thrE es el pZ1thrE (figura 2), que
está contenido en la cepa DM368-2 pZ1thrE. El
plásmido pZ1thrE es un vector pendular C. glutamicum - E.
coli basado en el plásmido pZ1 que está descrito en Menkel et
al. (Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:
549-554). Pueden usarse de la misma forma también
otros vectores plásmido replicables en C. glutamicum como,
por ejemplo, pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102:93-98
(1991)) o pZ8-1
(EP-B-0 375 889).
Además, para la producción de
L-treonina puede ser ventajoso sobreexpresar además
del nuevo gen thrE una o varias enzimas de la vía de biosíntesis
conocida de treonina o enzimas del metabolismo anaplerótico o
enzimas del ciclo del ácido cítrico. Pueden sobreexpresarse, por
ejemplo:
- \bullet
- al mismo tiempo el gen hom que codifica homoserina deshidrogenasa (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988) o el alelo hom^{dr} que codifica una homoserina deshidrogenasa resistente a la retroacción (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)) o
- \bullet
- al mismo tiempo el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa (documento DE-A-19 831 609) o
- \bullet
- al mismo tiempo el gen mqo que codifica malato:quinona oxidoreductasa (Molenaar et al., European Journal o Biochemistry 254, 395 - 403 (1998)).
Además, aparte de la sobreexpresión del gen thrE,
para la producción de L-treonina puede ser ventajoso
suprimir reacciones secundarias indeseadas como, por ejemplo,
treonina deshidrogenasa (Nakayama: "Breeding of Amino Acid
Producing Micro-organisms", en: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic
Press, Londres, Reino Unido, 1982 y Bell und Turner, Biochemical
Journal 156, 449-458 (1976)).
Para la producción de L-treonina,
los microorganismos preparados según la invención pueden cultivarse
de forma continua o discontinua en procedimientos batch (cultivo
por lotes) o en procedimientos fed batch (procedimiento de
alimentación) o repeatead fed batch (procedimientos de alimentación
repetitiva). Un resumen de métodos de cultivo conocidos está
descrito en el compendio de Chemie 1 (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik (editorial Gustav Fischer,
Stuttgart, 1991)) o en el compendio de Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden,
1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe cumplir
adecuadamente los requisitos de las cepas en cuestión.
Descripciones de medios de cultivo de distintos microorganismos
están contenidos en el manual "Manual of Methods for General
Bacteriology" de la American Society for Bacteriology
(Washington D.C., EE.UU., 1981). Como fuente de carbonos pueden
usarse azúcares e hidratos de carbono tales como, por ejemplo,
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y
celulosa, aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja,
aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos
grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y
ácido linólico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerina y
etanol y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético.
Estas sustancias pueden usarse individualmente o como mezcla. Como
fuente de nitrógeno pueden usarse compuestos que contienen nitrógeno
orgánico tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de
carne, extracto de malta, agua en el que se ha hinchado maíz,
harina de semillas de soja y urea o compuestos inorgánicos tales
como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio,
carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno
pueden usarse individualmente o como mezcla. Como fuente de fósforo
pueden usarse ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o
hidrogenofosfato dipotásico o las sales correspondientes que
contienen sodio. El medio de cultivo debe contener, además, sales
de metales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de
hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, además
de las sustancias arriba indicadas pueden usarse adicionalmente
sustancias de crecimiento esenciales, como aminoácidos y vitaminas.
Al medio de cultivo pueden añadirse también etapas previas
adecuadas. Las sustancias indicadas a emplear pueden añadirse al
cultivo en forma de una mezcla única o pueden alimentarse de forma
adecuada durante la cultivación.
Para el control del valor pH del cultivo se usan
de forma adecuada compuestos básicos tales como hidróxido de sodio,
hidróxido de potasio, amoniaco o hidróxido amónico o compuestos
ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el
control de la formación de espuma pueden usarse antiespumantes tales
como, por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para el
mantenimiento de la estabilidad de plásmidos pueden añadirse al
medio sustancias adecuados con un efecto selectivo, por ejemplo
antibióticos. Para mantener las condiciones aerobias, se introducen
en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno
como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo se sitúa
normalmente entre 20ºC y 45ºC y preferiblemente entre 25ºC y 40ºC.
El cultivo se mantiene hasta que se haya formado un máximo de
L-treonina. Este objetivo se consigue normalmente
en un plazo de 10 horas a 160 horas.
El análisis de L-treonina puede
realizarse mediante cromatografía de intercambio de aniones con
posterior derivatización de ninhidrina, de la forma en la que está
descrito en Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
o puede realizarse mediante HPLC de fase inversa, como está
descrito en Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:
1167-1174).
Los siguientes microorganismos se depositaron en
la Deutsche Sammlung fü Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Alemania) (= Colección Alemana para Microorganismos y
Cultivos de Células) según el contrato de Budapest:
\bulletBrevibacterium flavum cepa
DM368-2 pZlthrE como DSM 12840
\bulletEschericia coli cepa
GM2929pCGL0040 como DSM 12839
A continuación, la presente invención se
explicará más detalladamente con ayuda de ejemplos de
realización.
El aislamiento de ADN plásmido de Escherichia
coli, así como todas las técnicas para la restricción,
tratamiento con el fragmento Klenow y fosfatasa alcalina se
realizaron según Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory
manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Si no se
describe otro procedimiento, la transformación de Escherichia
coli se realizó según Chung et al. (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America EE.UU. (1989)
86; 2172-2175).
La cepa Corynebacterium glutamicum
ATCC14752\DeltailvA fue sometida a una mutagénesis con el
transposón Tn5531, cuya secuencia está depositada bajo el número de
acceso (accession number) 053587 en la base de datos de nucleótidos
del National Center for Biotechnology Information (Bethesda,
EE.UU.). La integración de una deleción en el gen ilvA de
Corynebacterium glutamicum ATCC14752 fue realizada con el
sistema para el intercambio de genes descrito en Schäfer et al.
(Gene (1994) 145: 69-73). Para la deleción, se usó
el vector de inactivación pK19mobsacB\DeltailvA construido por
Sahm et al. (Applied and Environmental Microbiology (1999) 54:
1973-1979). En primer lugar se transformó la cepa
Escherichia coli SCS110 con defecto de metilasa (Jerpseth und
Kretz, STRATEGIES in molecular biology 6, 22, (1993)) de la
compañía Stratagene (Heidelberg, Alemania) con 200 ng del vector
pK19mobsacB\DeltailvA. Los transformantes se identificaron con
ayuda de su resistencia a la canamicina en placas de agar LB que
contenían 50 \mug/ml de canamicina. De uno de los transformantes
se preparó el plásmido pK19mobsacB\DeltailvA. Mediante
electroporación (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989)
61: 329-334) se incorporó este plásmido de
inactivación posteriormente en la cepa Corynebacterium
glutamicum ATCC14752. Los clones en los que el vector de
inactivación estaba presente de forma integrada en el genoma se
identificaron con ayuda de su resistencia a la canamicina en placas
de agar LBHIS que contenían 15 \mug/ml de canamicina (Liebl et
al., FEMS Microbiolgy Letters (1989) 65: 299-304).
Para seleccionar respecto a la excisión del vector, se colocaron
clones resistentes a la canamicina en placas con medio LBG que
contenía sacarosa (medio LB con 15 g/l de agar, un 2% de glucosa y
un 10% de sacarosa). Se obtuvieron colonias que habían vuelto a
perder el vector por un segundo evento de recombinación (Jäger et
al.; Journal of Bacteriology (1992) 174;:
5462-5465). Mediante inoculación en placas de medio
mínimo (medio CGXII con 15 g/l de agar (Keilhauer et al., Journal
of Bacteriology (1993) 175; 5595-5603) con y sin 300
mg/l de L-isoleucina o con y sin 50 \mug/ml de
canamicina se aislaron seis clones que, por la excisión del vector,
fueron sensibles a la canamicina y auxótrofos a la isoleucina y en
los que ahora estaba presente el gen ilvA incompleto
(\DeltailvA-alelo) en el genoma. Uno de estos
clones fue denominado cepa ATCC14752\DeltailvA y se usó para la
mutagénesis con transposón.
De la cepa E. coli GM2929pCGL0040 con
defecto de metilasa (E. coli GM2929: Palmer et al., Gene
(1994) 143: 1-12) se aisló el plásmido pCGL0040, que
contiene el transposón Tn5531 compuesto (Ankri et al., Journal of
Bacteriology (1996) 178: 4412-4419). La cepa
Corynebacterium glutamicum ATCC14752\DeltailvA fue
transformada mediante electroporación (Haynes et al., FEMS
Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) con el
plásmido pCGL0040. Los clones en los que el transposón Tn5531 estaba
integrado en el genoma se identificaron con ayuda de su resistencia
a la canamicina en placas de agar LBHIS que contenían 15 \mug/ml
de canamicina (Liebl et al., FEMS Microbiolgy Letters (1989) 65:
299-304). De esta forma se obtuvieron 2000 clones,
en los que se comprobó si había un crecimiento retardado en
presencia de
treonilo-treonilo-treonina. Para
ello, se transfirieron todos los clones individualmente a placas de
agar de medio mínimo CGXII con y sin 2 mm de
treonilo-treonilo-treonina. El medio
fue idéntico al medio CGXII descrito en Keilhauer et al. (Journal
of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), aunque
contenía adicionalmente 25 \mug/ml de canamicina, 300 mg/l de
L-isoleucina y 15 g/l de agar. La composición del
medio descrito por Keilhauer et al. se indica en la tabla 1.
| Componente | Concentración |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 20 g/l |
| Urea | 5 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 1 g/l |
| K_{2}HPO_{4} | 1 g/l |
| MgSO_{4} x 7 H_{2}O | 0,25 g/l |
| Ácido 3-morfolinopropanosulfónico | 42 g/l |
| CaCl_{2} | 10 mg/l |
| FeSO_{4} x 7 H_{2}O | 10 mg/l |
| MnSO_{4} x H_{2}O | 10 mg/l |
| ZnSO_{4} x 7 H_{2}O | 1 mg/l |
| CuSO_{4} | 0,2 mg/l |
| NiCl_{2} x 6 H_{2}O | 0,02 mg/l |
| Biotina | 0,2 mg/l |
| Glucosa | 40 g/l |
| Ácido protocatéquico | 30 mg /l |
Las placas de agar se incubaron a 30ºC y el
crecimiento se examinó después de 12, 18 y 24 horas. Se obtuvo una
mutante de transposón, que sin
treonilo-treonilo-treonina creció de
forma comparable con la cepa de partida Corynebacterium
glutamicum ATCC14752\DeltailvA, aunque en presencia de 2 mm de
treonilo-treonilo-treonina mostró
un crecimiento retardado. Fue denominada
ATCC14752\DeltailvAthrE::Tn5531.
Para clonar el sitio de inserción del transposón
Tn5531 dispuesto corriente arriba en la mutante descrita en el
ejemplo 1.1, se aisló en primer lugar el ADN cromosomal de esta
cepa mutante de la forma descrita en Schwarzer et al.
(Bio/Technology (1990) 9: 84-87) y 400 ng de ello
se cortó con la endonucleasa de restricción EcoRI. La mezcla de
restricción completa se ligó en el vector pUC18 también linealizado
con EcoRI (Norander et al., Gene (1983) 26:
101-106) de la compañía Roche Diagnostics (Mannheim,
Alemania). Con toda la mezcla de ligación, la cepa E. coli
DH5\alphamcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America EE.UU. (1990) 87:
4645-4649) se transformó mediante electroporación
(Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16:
6127-6145). Los transformantes, en los que los
sitios de inserción del transposón Tn5531 estaban presentes de
forma clonada en el vector pUC18, se identificaron con ayuda de su
resistencia a la carbenicilina y la canamicina en placas de agar LB
que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina y 25 \mug/ml de
canamicina. A partir de tres de los transformantes se prepararon
los plásmidos y se determinaron los tamaños del inserto clonado
mediante análisis de restricción. La secuencia de nucleótidos del
sitio de inserción en uno de los plásmidos con un inserto de un
tamaño de aprox. 5,7 kb se determinó según el método de
interrupción de cadena didesoxi de Sanger et al. (Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America
EE.UU. (1977) 74: 5463-5467). Para ello se
secuenciaron 2,2 kb del inserto partiendo del siguiente cebador de
oligonucleótido: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA
GG-3'.
Para la identificación del sitio de inserción
dispuesto corriente abajo del transposón, el ADN cromosomal de la
mutante se cortó con la endonucleasa de restricción XbaI y se ligó
en el vector pUC18 linealizado con XbI. La posterior clonación se
realizó de la forma descrita anteriormente. La secuencia de
nucleótidos del sitio de inserción en uno de los plásmidos con un
inserto de un tamaño de aprox. 8,5 kb se determinó según el método
de interrupción de cadena didesoxi de Sanger et al. (Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America
EE.UU. (1977) 74: 5463-5467). Para ello se
secuenciaron 0,65 kb del inserto partiendo del siguiente cebador de
oligonucleótido: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA
GG-3'.
Las secuencias de nucleótidos obtenidas se
analizaron y reunieron con el paquete de programas Lasergene
(Biocomputing Software for Windows, DNASTAR; Madison, EE.UU.). Esta
secuencia de nucléotidos se representó como SEQ ID Nº 1. Del
análisis resultó la identificación de una trama de lectura abierta
de una longitud de 1467 bp. El gen correspondiente fue denominado
gen thrE. El producto génico correspondiente incluye 489
aminoácidos y se representa como SEQ ID Nº 2.
El gen thrE fue clonado en el vector de clonación
E. coli pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26:
101-106, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La
clonación se realizó en dos pasos. En primer lugar se amplificó el
gen de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 mediante una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante los siguientes
cebadores de oligonucléotido derivados de la SEQ ID Nº 1.
thrE-forward:
5'-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT
G-3'
thrE-reverse:
5'-CGG CTG CGG TTT CCT
CTT-3'
La reacción PCR fue realizada en 30 ciclos en
presencia de 200 \mum de trifosfatos de desoxinucleótido (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), 1 \mum del oligonucleótido correspondiente,
respectivamente, 100 ng de ADN cromosomal de Corynebacterium
glutamicum ATCC13032, 10 veces 1/10 del volumen de tampón de
reacción y 2,6 unidades de una mezcla
Taq/Pwo-ADN-polimerasa resistente al
calor (Expand High Fidelity PCR System de la compañía Roche
Diagnostics, Mannheim, Alemania) en un termociclador
(PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, EE.UU.) en
las siguientes condiciones: 94ºC durante 30 segundos, 58ºC durante
30 segundos y 72ºC durante 2 minutos.
A continuación, el fragmento amplificado, de un
tamaño aproximado de 1,9 kb, fue ligado con ayuda del SureClone
Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) según
las indicaciones del fabricante en el interface SmaI del vector
pUC18. La cepa E. coli DH5\alphamcr fue transformada con
toda la mezcla de ligación (Grant et al., Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America EE.UU.
(1990) 87: 4645-4649). Los transformantes se
identificaron con ayuda de su resistencia a la carbenicilina en
placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina. Los
plásmidos se prepararon a partir de 8 de los transformantes y
mediante un análisis de restricción se comprobó la presencia del
fragmento de PCR de 1,9 kb como inserto. En lo sucesivo, el
plásmido recombinante así formado será denominado pUC18thrE.
La secuencia de nucleótidos del fragmento de PCR
de 1,9 kb en el plásmido pUC18thrE se determinó según el método de
interrupción de cadena didesoxi de Sanger et al. (Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America
EE.UU. (1977) 74: 5463-5467). Para ello, se
secuenció el inserto completo de pUC18thrE con ayuda de los
siguientes cebadores de la compañía Roche Diagnostics (Mannheim,
Alemania).
Cebador universal:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA
GT-3'
Cebador inverso:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT
G-3'
La secuencia de nucleótidos está representada
como SEQ ID Nº 3. La secuencia de nucleótidos obtenida se analizó
con el paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for
Windows, DNASTAR; Madison, EE.UU.). Del análisis resultó la
identificación de una trama de lectura abierta de una longitud de
1467 bp, que fue denominada gen thrE. Este codifica un polipéptido
de 489 aminoácidos, que está representado como SEQ ID Nº 4.
El gen thrE de Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 descrito bajo el ejemplo 2 fue clonado para la expresión
en el vector pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental
Microbiology (1989) 64: 549-554). Para ello, se
recortó del plásmido pUC18thrE con las enzimas de restricción SacI
y XbaI un fragmento de ADN de un tamaño de 1881 bp, que contenía el
gen thrE. Los extremos 5' y 3' de este fragmento se trataron con la
enzima Klenow. El fragmento de ADN resultante fue ligado en el
vector pZ1 linealizado previamente con ScaI y desfosforilado. La
cepa E. coli DH5\alphamcr (Grant et al., Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America
EE.UU. (1990) 87: 4645-4649) fue transformado con
toda la mezcla de ligación. Los transformantes se identificaron con
ayuda de su resistencia a la canamicina en placas de agar LB que
contienen 50 \mug/ml de canamicina. Los plásmidos se prepararon de
2 transformantes y mediante el análisis de restricción se comprobó
la existencia del fragmento de ScaI/XbaI de 1881 bp como inserto.
El plásmido recombinante formado de esta forma fue denominado
pZ1thrE (figura 2).
Mediante electroporación (Haynes et al., FEMS
Microbiology Letters (1989) 61: 329-334), los
plásmidos pZ1 y pZ1thrE se incorporaron en la cepa Brevibacterium
flavum DM368-2 que produce treonina. La cepa
DM368-2 está descrita en el documento
EP-B-0 385 940 y está depositada
como DSM5399. Los transformantes se identificaron con ayuda de su
resistencia a la canamicina en placas de agar LBHIS que contenían 15
\mug/ml de canamicina (Liebl et al., FEMS Microbiolgy Letters
(1989) 65: 299-304). De esta forma se obtuvieron
las cepas Brevibacterium flavum DM368-2 pZ1 y
DM368-2 pZ1thrE.
Las cepas B. Flavum
DM368-2 pZ1 y DM368-2 pZ1thrE se
cultivaron previamente durante 14 horas a 30ºC en 100 ml de medio de
Brain Heart Infusion con 50 \mug/ml de canamicina (Difco
Laboratories, Detroit, EE.UU.) para estudiar su formación de
treonina. A continuación, las células se lavaron una vez con 0,9%
(w/v) de solución de cloruro sódico, inoculándose con esta
suspensión 60 ml de medio de CgXII, respectivamente, de tal forma
que la DO_{600} (densidad óptica a 600 nm) era de 0,5. El medio
fue idéntico con el medio descrito en Keilhauer et al. (Journal of
Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), aunque contenía
adicionalmente 50 \mug/ml de canamicina. La cultivación de las dos
cepas se realizó a 30ºC durante un tiempo de 72 horas. Después de 0,
24, 48, 72 horas se tomaron muestras, respectivamente, y las células
se separaron mediante centrifugado breve (5 minutos a 13000
revoluciones por minuto con una Biofuge pico de la compañía Heraeus,
Osterode, Alemania).
La determinación cuantitativa de las
concentraciones extracelulares de aminoácidos de la parte superior
del cultivo se realizó mediante HPLC de fase inversa (Lindroth et
al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174). Se
utilizó un equipo HPLC de la serie HP1100
(Hewlett-Packard, Waldbronn, Alemania) con detector
de fluorescencia (G1321A) conectado; el control del sistema y la
valoración de los da+tos se realizó con una estación
HP-Chem (Hewlett-Packard). 1 \mul
de la solución de aminoácidos a analizar fue mezclada en una
derivatización pre-columna automática con 20 \mul
de reactivo prefabricado de aldehído
orto-ftálico/2-mercaptoetanol
(Pierce Europe BV, Oud-Beijerland, Países Bajos).
Los isoindoles fluorescentes, tiosustituidos que se forman durante
este proceso (Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266:
471-482) fueron separados mediante una
pre-columna combinada (40x4 mm Hypersil ODS 5) y una
columna principal (Hypersil ODS 5, ambas columnas de la compañía
CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe,
Alemania) con un programa de gradientes con una fase cada vez más
homopolar (metanol). Como eluyente polar se usó acetato sódico (0,1
molar, pH 7,2); el coeficiente de flujo era de 0,8 ml por minuto. La
detección de fluorescencia de los aminoácidos derivatizados se
realizó a una longitud de ondas de excitación de 230 nm y una
longitud de ondas de emisión de 450 nm. Las concentraciones de
aminoácidos se calcularon mediante una comparación con un patrón
externo y asparraguina como patrón interno adicional.
Los resultados figuran en la tabla 2.
| Cepa | L-treonina (g/l) | |||
| 0 horas | 24 horas | 48 horas | 72 horas | |
| DM368-2 pZ1 | 0 | 0,46 | 1,27 | 1,50 |
| DM368-2 pZ1thrE | 0 | 0,68 | 1,71 | 2,04 |
Se adjuntas las siguientes figuras:
El vector shuttle pEC-T18mob2 de
E. coli – C. glutamicum fue construido según el estado
de la técnica.
El vector contiene la región de replicación rep
del plásmido pGA1, incluido el efector de replicación per (documento
US-A-5,175,108; Nesvera et al.,
Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), el
gen tetA(Z) que induce a resistencia a la tetraciclina del
plásmido pAG1 (documento US-A- 5,158,891; entrada en
el banco de genes en el National Center for Biotechnology
Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.) con el número de acceso
(accession number) AP121000, la región de replicación oriV del
plásmido pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on
Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), el fragmento
del gen 1acZ\alpha, incluido el promotor 1ac y un sitio de
clonación múltiple (multiple cloning site, mcs) (Norrander et al.,
Gene 26, 101-106 (1983)) y la región mob del
plásmido RP4 (Simon et al., (1983) Bio/Technology
1:784-791).
El vector construido fue transformado en la cepa
E. coli DH5\alpha (Hanahan, In: DNA Cloning. A practical
approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC,
EE.UU., 1985). La selección de células que portan plásmidos se
realizó colocándose la mezcla de transformación en en placas de agar
LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual.
2^{nd} Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N. Y., EE.UU., 1989), en el que se había introducido 5 mg/l
de tetraciclina. El ADN plásmido fue aislado de un transformante con
ayuda del QIAprep Spin Miniprep Kit de la compañía Quiagen y se
comprobó mediante restricción con la enzima de restricción EcoRI y
HindIII y una electroforesis en gel de agarosa (0,8%) posterior.
El plásmido fue denominado
pEC-T18mob2 y está representado en la figura 3.
El gen thrE de Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 descrito en el ejemplo 2 se clonó para la expresión en el
vector pEC-T18mob2. Para ello, se recortó del
plásmido pUC18thrE con las enzimas de restricción SacI y XbaI un
fragmento de ADN de un tamaño de 1881 bp, que contenía el gen thrE.
El fragmento de ADN resultante fue ligado en el vector
pEC-T18mob2 linealizado previamente con ScaI y XbaI
y desfosforilado. La cepa E. coli DH5\alphamcr (Grant et
al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America EE.UU. (1990) 87: 4645-4649) fue
transformado con toda la mezcla de ligación. Los transformantes se
identificaron con ayuda de su resistencia a la tetraciclina en
placas de agar LB que contenían 5 \mug/ml de tetraciclina Los
plásmidos se prepararon de 2 transformantes y mediante el análisis
de restricción se comprobó la existencia del fragmento de ScaI/XbaI
de 1881 bp como inserto. El plásmido recombinante formado de esta
forma fue denominado pEC-T18mob2thrE (figura 4).
Mediante electroporación (Haynes et al., FEMS
Microbiology Letters (1989) 61: 329-334), los
plásmidos pEC-T18mob2 y
pEC-T18mob2thrE se incorporaron en la cepa
Corynebacterium glutamicum
MH20-22B-DR17 que produce treonina
(Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology (1994)
60: 126-132). Los transformantes se identificaron
con ayuda de su resistencia a la tetraciclina y a la canamicina en
placas de agar LBHIS que contenían 15 \mug/ml de canamicina y 5
\mug/ml de tetraciclina (Liebl et al., FEMS Microbiolgy Letters
(1989) 65: 299-304). De esta forma se obtuvieron las
cepas Corynebacterium glutamicum
MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2\cdot
y
MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2thrE.
Las cepas C. glutamicum
MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2
y
MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2thrE
se cultivaron previamente durante 14 horas a 30ºC en 100 ml de medio
de Brain Heart Infusion con 25 \mug/ml de canamicina y 5 \mug/ml
de tetraciclina (Difco Laboratories, Detroit, EE.UU.) para estudiar
su formación de treonina. A continuación, las células se lavaron una
vez con 0,9% (w/v) de solución de cloruro sódico, inoculándose con
esta suspensión 60 ml de medio de CgXII, respectivamente, de tal
forma que la DO_{600} (densidad óptica a 600 nm) era de 0,5. El
medio fue idéntico con el medio descrito en Keilhauer et al.
(Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603),
aunque contenía adicionalmente 25 \mug/ml de canamicina y 5
\mug/ml de tetraciclina. La cultivación de las dos cepas se
realizó a 30ºC durante un tiempo de 72 horas. Después de 0, 24, 48,
72 horas se tomaron muestras, respectivamente, y las células se
separaron mediante centrifugado breve (5 minutos a 13000
revoluciones por minuto con una Biofuge pico de la compañía Heraeus,
Osterode, Alemania).
La determinación cuantitativa de las
concentraciones extracelulares de aminoácidos de la parte superior
del cultivo se realizó como ya se describió en el ejemplo 5 para
Brevibacterium flavum mediante HPLC de fase inversa (Lindroth
et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).
Las concentraciones de aminoácidos se calcularon mediante una
comparación con un patrón externo y asparraguina como patrón interno
adicional.
Los resultados figuran en la tabla 3.
| Cepa | L-treonina (g/l) | |||
| 0 horas | 24 horas | 48 horas | 72 horas | |
| MH20-22B-DR17/ | 0 | 3,42 | 5,82 | 5,78 |
| pEC-T18mob2 | ||||
| H20-22B-DR17/ | 0 | 4,16 | 7,53 | 8,05 |
| pEC-T18mob2thrE |
Se adjuntan las siguientes figuras:
\bullet Figura 1: Mapa del plásmido pCGL0040
que contiene el transposón Tn5531. El transposón está marcado como
flecha no sombreada.
\bullet Figura 2: Mapa del plásmido pZ1thrE que
contiene el gen thrE.
\bullet Figura 3: Mapa del plásmido
pEC-T18mob2.
\bullet Figura 4: Mapa del plásmido
pEC-T18mob2thrE que contiene el gen thrE.
Las indicaciones de longitud deben entenderse
como indicaciones aproximadas. Las abreviaturas y denominaciones
utilizadas tienen el siguiente significado, respectivamente:
- \bullet
- Amp: Gen de resistencia a la ampicilina
- \bullet
- Kan: Gen de resistencia a la canamicina
- \bullet
- `amp: Parte 3' del gen de resistencia a la ampicilina
- \bullet
- oriBR322: región de replicación del plásmido pBR322
- \bullet
- Tet: Gen de resistencia a la tetraciclina
- \bullet
- oriV: Origen de replicación de E. coli codificado por plásmido
- \bullet
- RP4mob: Región mob para la movilización del plásmido
- \bullet
- rep: Origen de replicación de C. glutamicum plásmido pGA1 codificado por plásmido
- \bullet
- per: Gen para el control del número de copias de pGA1
- \bullet
- 1acZ-alpha: fragmento del gen 1acZ\alpha (terminación N) del gen de \beta-galactosidasa
\newpage
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el siguiente significado:
- \bullet
- BamHI: Endonucleasa de restricción de Bacillus amyloliquefaciens
- \bullet
- BglII: Endonucleasa de restricción de Bacillus globigii
- \bullet
- EcoRI: Endonucleasa de restricción de Escherichia coli
- \bullet
- EcoRV: Endonucleasa de restricción de Escherichia coli
- \bullet
- HindIII: Endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
- \bullet
- KpnI: Endonucleasa de restricción de Klebsiella pneumoniae
- \bullet
- PstI: Endonucleasa de restricción de Providencia stuartii
- \bullet
- PvuI: Endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris
- \bullet
- SacI: Endonucleasa de restricción de Streptomyces achromogenes
- \bullet
- SalI: Endonucleasa de restricción de Streptomyces albus
- \bullet
- SmaI: Endonucleasa de restricción de Serratia marcescens
- \bullet
- XbaI: Endonucleasa de restricción de Xanthomonas badrii
- \bullet
- XhoI: Endonucleasa de restricción de Xanthomonas holcicola
Claims (20)
1. ADN recombinante, replicable en
microorganismos corineformes con el origen Corynebacterium,
que contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el
gen thrE, elegido del grupo:
- (i)
- secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 3 que codifican el gen thrE o
- (ii)
- al menos una secuencia que corresponde a las secuencias (i) dentro del margen de la degeneración del código genético o
- (iii)
- secuencias de nucleótidos con mutaciones silenciosas de función neutra en (i).
2. Secuencia de aminoácidos de la proteína
derivada de las secuencias de nucleótidos según la reivindicación
1, representada en la SEQ ID Nº 2 y la SEQ ID Nº 4.
3. Microorganismos corineformes que producen
treonina, en particular del género Corynebacterium,
transformados por la introducción de uno o varios de los ADN
replicables según la reivindicación 1.
4. Bacterias corineformes que producen treonina,
en particular del género Corynebacterium, en las que la
actividad intracelular de la enzima thrE representada en la SEQ ID
Nº 2 y 4 es mayor, estando presente, en particular, la secuencia de
nucléotidos que codifica el gen thrE o que lo porta, representada en
la SEQ ID Nº 1 y 3, de forma sobreexpresada.
5. Bacterias corineformes que producen treonina
según la reivindicación 4, caracterizadas porque la región
codificante del gen thrE representada en la SEQ ID Nº 1 y 3
- a)
- contiene mutaciones silenciosas de función neutra o
- b)
- contiene al menos una secuencia que corresponde a las secuencias indicadas dentro del margen de la degeneración del código genético.
6. Bacterias corineformes que producen treonina,
en particular del género Corynebacterium, transformadas por
la introducción de una o varias de las secuencias de nucleótidos
replicables, elegidos del grupo SEQ ID Nº 1 posición 398 a 1864, SEQ
ID Nº 1, SEQ ID Nº 3 posición 280 a 1746 y SEQ ID Nº 3.
7. Corynebacterium glutamicum
DM368-2 pZ1thrE, depositado bajo el número DSM
12840.
8. Procedimiento para la preparación de
L-treonina mediante la fermentación de bacterias
corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias en
las que se aumenta la actividad intracelular de la enzima thrE
representada en la SEQ ID Nº 2 y 4, en particular, en las que se
sobreexpresa la secuencia de nucleótidos que codifica el gen thrE o
que lo porta, representada en la SEQ ID Nº 1 y 3.
9. Procedimiento para la preparación de
L-treonina mediante la fermentación de bacterias
corineformes, en las que se aumenta la actividad intracelular de la
enzima thrE representada en la SEQ ID Nº 4, en particular, en las
que se sobreexpresa la secuencia de nucleótidos que codifica el gen
thrE o que lo porta, contenida en el plásmido pZlthrE y depositada
en Corynebacterium glutamicum DSM12840.
10. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque se utilizan bacterias en las que la
región codificante del gen thrE representada en la SEQ ID Nº 1 y
3
- c)
- contiene mutaciones silenciosas de función neutra o
- d)
- contiene una secuencia que corresponde a las secuencias indicadas dentro del margen de la degeneración del código genético.
11. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a
10, caracterizado porque se utiliza una cepa transformada
con un vector plásmido y el vector plásmido porta la secuencia de
nucleótidos que codifica el gen thrE representada en la SEQ ID Nº 1
y 3.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque se utilizan cepas transformadas
- a)
- con el vector plásmido pZ1thrE, depositado en Corynebacterium glutamicum DSM12840 representado en la figura 2 o
- b)
- con el vector plásmido pEC-T18mob2thrE representado en la figura 4.
13. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a
12, caracterizado porque se sobreexpresa al mismo tiempo el
gen hom que codifica homoserina deshidrogenasa.
14. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a
12, caracterizado porque se sobreexpresa al mismo tiempo un
alelo hom^{dr} que codifica homoserina deshidrogenasa resistente
a la retroacción.
15. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a
12, caracterizado porque se sobreexpresa al mismo tiempo el
gen pyc que codifica piruvato carboxilasa.
16. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a
12, caracterizado porque se sobreexpresa al mismo tiempo el
gen mqo que codifica
malato-quinona:oxidoreductasa.
17. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a
16, caracterizado porque se desactiva al mismo tiempo el gen
que codifica treonina deshidrogenasa.
18. Procedimiento para la preparación
fermentativa de L-treonina según una o varias de
las reivindicaciones precedentes, caracterizado por los
pasos:
- a)
- fermentación de las bacterias que producen L-treonina según las reivindicaciones 3 a 7,
- b)
- enriquecimiento de la L-treonina en el medio o en las células de las bacterias y
- c)
- aislamiento de la L-treonina producida.
19. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a
18, caracterizado porque se utilizan bacterias del género
Corynebacterium que ya producen
L-treonina.
20. Procedimiento para el aislamiento del gen
thrE representado en las SEQ ID Nº 1 y 3, caracterizado
porque como cepas indicadoras se obtienen mutantes defectuosas en el
gen indicado, preferiblemente bacterias corineformes, que no crecen
en un medio nutritivo que contiene un oligopéptido que contiene
treonina o que sólo crecen muy poco en éste y
- a)
- se identifica y aísla el gen thrE después de la creación de un banco de genes o,
- b)
- en el caso de la mutagénesis con transposón, se selecciona el transposón que presenta preferiblemente una resistencia a un antibiótico obteniéndose de esta forma el gen indicado.
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