ES2240135T3 - Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos con ampliaficacion del gen gnd. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos con ampliaficacion del gen gnd.Info
- Publication number
- ES2240135T3 ES2240135T3 ES00951336T ES00951336T ES2240135T3 ES 2240135 T3 ES2240135 T3 ES 2240135T3 ES 00951336 T ES00951336 T ES 00951336T ES 00951336 T ES00951336 T ES 00951336T ES 2240135 T3 ES2240135 T3 ES 2240135T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- baselineskip
- gene encoding
- lysine
- threonine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos por fermentación de bacterias corineformes, que comprende llevar a cabo las siguientes etapas: a) fermentación de las bacterias productoras de L- aminoácidos deseadas, en las que al menos el gen gnd está amplificado, y al menos el gen poxB está atenuado, b) concentración del L-aminoácido en el medio o en las células de las bacterias, y c) aislamiento del L-aminoácido producido.
Description
Procedimiento para la preparación fermentativa de
L-aminoácidos con amplificación del gen gnd.
La invención se refiere a un procedimiento para
la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en
particular de L-lisina, L-treonina,
L-isoleucina y L-triptófano,
utilizando bacterias corineformes en las que al menos el gen gnd
está amplificado.
Los L-aminoácidos se utilizan en
nutrición animal, en medicina humana y en la industria
farmacéutica.
Se sabe que los aminoácidos se preparan por
fermentación a partir de cepas de bacterias corineformes, en
particular Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran
importancia, constantemente se emprenden nuevos trabajos para
mejorar los procedimientos de preparación. Las mejoras del
procedimiento pueden estar relacionadas con las medidas de
fermentación, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o con
la composición de medio de nutrientes tales como, por ejemplo, la
concentración de azúcar durante la fermentación, o con el
procesamiento hasta la forma del producto, por ejemplo, por
cromatografía de intercambio de iones, o con las propiedades
intrínsecas de rendimiento del propio microorganismo.
Se utilizan métodos de mutagénesis, selección y
selección de mutantes para mejorar las propiedades de rendimiento de
estos microorganismos. De esta forma se obtienen cepas que son
resistentes a antimetabolitos tales como, por ejemplo, el ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxi-valérico
(AHV) análogo a la treonina, o que son auxotróficos para metabolitos
de importancia en la regulación y que producen
L-aminoácidos tales como, por ejemplo, treonina.
Asimismo, se han empleado durante algunos años
métodos de la técnica de ADN recombinante para mejorar las cepas de
Corynebacterium glutamicum que producen
L-aminoácidos.
El documento WO 01/07626 describe la producción
de L-aminoácidos, que comprende cultivar una célula
bacteriana alterada (I), que contiene una cantidad aumentada de
NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido), o una
cantidad reducida de actividad enzimática de
6-fosfoglucosa isomerasa (Pgi), en comparación con
una célula bacteriana inalterada, en donde los rendimientos de
L-aminoácido a partir de (I) son mayores que los
obtenidos de células bacterianas inalteradas.
En el documento
EP-A-733712, se mejora la
productividad de la producción de sustancias tales como
L-aminoácidos, antibióticos, vitaminas, factores de
crecimiento, y sustancias fisiológicamente activas por fermentación
microbiana, mejorando la producción de nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato reducido (NADPH) en las células microbianas.
Esto se puede llevar a cabo transformando las células para mejorar
la actividad enzimática de la nicotinamida nucleótido
transhidrogenasa (NNT) en las células microbianas, para mejorar la
expresión del gen NNT, y mejorar el número de copias del gen NNT en
las células. Microorganismos adecuados incluyen cepas de
Escherichia coli, Corynebacterium y
Brevibacterium.
El método se puede usar para una producción a
gran escala más eficaz de sustancias empleadas en las industrias
farmacéutica, alimentaria, de piensos animales y en la industria
química, especialmente L-aminoácidos, antibióticos,
vitaminas, factores de crecimiento y otras sustancias
fisiológicamente activas.
Los inventores tuvieron como objeto proporcionar
procedimientos mejorados para la preparación por fermentación de
L-aminoácidos con bacterias corineformes.
Los L-aminoácidos se utilizan en
medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria
alimentaria y, en especial, en la nutrición animal. Existe, por
consiguiente, un interés general en proporcionar nuevos
procedimientos mejorados para la preparación de aminoácidos.
La invención ofrece un procedimiento para la
preparación por fermentación de L-aminoácidos, en
particular de
L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-triptófano, utilizando bacterias corineformes en las que la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima 6-fosfogluconato deshidrogenasa (número de CE 1.1.1.44) (gen gnd) está amplificada y, en especial, muestra una sobre-expresión.
L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-triptófano, utilizando bacterias corineformes en las que la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima 6-fosfogluconato deshidrogenasa (número de CE 1.1.1.44) (gen gnd) está amplificada y, en especial, muestra una sobre-expresión.
De manera específica, la invención proporciona un
procedimiento para la preparación de L-aminoácidos
por fermentación de bacterias corineformes, que comprende llevar a
cabo las siguientes etapas:
\newpage
- a)
- fermentación de las bacterias productoras del L-aminoácido deseado, en las que al menos el gen gnd está amplificado, y al menos el gen poxB está atenuado;
- b)
- concentración del L-aminoácido en el medio o en las células de las bacterias, y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido producido.
Las cepas empleadas preferentemente producen ya
L-aminoácidos antes de la amplificación del gen
gnd.
En las reivindicaciones se encontrarán las
realizaciones preferidas.
El término "amplificación", en este
contexto, describe el incremento de la actividad intracelular de una
o más enzimas en un microorganismo, que están codificadas por el
correspondiente ADN, aumentando, por ejemplo, el número de copias
del o de los genes, utilizando un promotor potente, o empleando un
gen que codifica una enzima correspondiente que posee una elevada
actividad y, de modo opcional, combinando estas medidas.
Los microorganismos ofrecidos en la presente
invención pueden preparar L-aminoácidos a partir de
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón,
celulosa, o a partir de glicerol y etanol. Son representantes de
bacterias corineformes, en particular del género
Corynebacterium. Del género Corynebacterium cabe
citar, en particular, la especie Corynebacterium glutamicum,
que es conocida entre los expertos por su capacidad para producir
L-aminoácidos.
Cepas apropiadas del género
Corynebacterium, en especial de la especie Corynebacterium
glutamicum, son, por ejemplo, las cepas de tipo salvaje
conocidas
- Corynebacterium glutamicum ATCC13032
- Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
- Corynebacterium acetoacidophilus ATCC13870
- Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
- Brevibacterium flavum ATCC14067
- Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
- Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y mutantes de las mismas,
productoras de L-aminoácidos, tales como, por
ejemplo, las cepas productoras de
L-treonina
- Corynebacterium glutamicum ATCC21649
- Brevibacterium flavum BB69
- Brevibacterium flavum DSM5399
- Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269
- Brevibacterium lactofermentum TBB-10
y tales como, por ejemplo, las
cepas productoras de
L-isoleucina
- Corynebacterium glutamicum ATCC 14309
- Corynebacterium glutamicum ATCC 14310
- Corynebacterium glutamicum ATCC 14311
- Corynebacterium glutamicum ATCC 15168
- Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871
y tales como, por ejemplo, las
cepas productoras de
L-triptófano
- Corynebacterium glutamicum ATCC 21850
- Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901)
y tales como, por ejemplo, las
cepas productoras de
L-lisina
- Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
- Brevibacterium flavum FERM-P 1708
- Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
- Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
- Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
- Corynebacterium glutamicum DSM5715
- Corynebacterium glutamicum DM58-1
- Corynebacterium glutamicum DSM12866.
Se ha encontrado que las bacterias corineformes
producen L-aminoácidos, en particular
L-lisina, L-treonina,
L-isoleucina y L-triptófano, de manera mejorada tras la sobre-expresión del gen gnd, que codifica la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (número de CE 1.1.1.44), y la atenuación del gen poxB, que codifica la piruvato oxidasa.
L-isoleucina y L-triptófano, de manera mejorada tras la sobre-expresión del gen gnd, que codifica la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (número de CE 1.1.1.44), y la atenuación del gen poxB, que codifica la piruvato oxidasa.
El gen gnd codifica la enzima
6-fosfogluconato deshidrogenasa, que cataliza la
descarboxilación oxidativa del ácido
6-fosfoglucónico en ribulosa
5-fosfato. La secuencia de nucleótidos del gen gnd
se describe en el documento
JP-A-9-224662. El
gen gnd descrito en la referencia del texto mencionado se utiliza
según la invención por primera vez. Los alelos resultantes del gen
gnd se presentan aquí en plasmidios con un número variable de
copias, o están integrados y amplificados en el cromosoma. De manera
alternativa, se puede lograr, adicionalmente, una
sobre-expresión de los genes en cuestión modificando
la composición de los medios y el procedimiento de cultivo.
El experto puede encontrar instrucciones, en este
contexto, entre otros, en Martin et al.
(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero
et al. (Gene 138, 35-41 (1994)),
Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6,
428-430 (1988)),
Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Memoria de la Patente Europea EPS 0 472 869, en la Patente de EE.UU. 4.601.893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la Memoria Japonesa Abierta al Público JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), y en libros de texto de genética y biología molecular conocidos.
Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Memoria de la Patente Europea EPS 0 472 869, en la Patente de EE.UU. 4.601.893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la Memoria Japonesa Abierta al Público JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), y en libros de texto de genética y biología molecular conocidos.
A modo de ejemplo, se
sobre-expresó 6-fosfogluconato
deshidrogenasa con la ayuda de un plasmidio. Para ello se utilizó en
vector lanzadera pEC-T18mob2 de E. coli - C.
glutamicum. Tras la incorporación del gen gnd en el sitio de
escisión de pEC-T18mob2 se formó el plasmidio pECgnd
que se muestra en la Figura 2.
Se pueden utilizar, de la misma forma, otros
vectores plasmídicos capaces de replicación en C. glutamicum,
tales como, por ejemplo, pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene
102:93-98 (1991)), o pZ8-1
(documento EP-B-0 375 889).
Adicionalmente, para la producción de
L-aminoácidos puede resultar ventajoso amplificar
una o múltiples enzimas de la vía de biosíntesis particular, de
glicólisis, de anaplerosis, de la vía de la pentosa fosfato, o de la
exportación de aminoácidos, además de la amplificación del gen gnd
que codifica la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, y
la atenuación del gen pox B, que codifica la piruvato oxidasa.
De esta forma, por ejemplo, en particular para la
preparación de L-treonina, se pueden amplificar,
especialmente sobre-expresar, simultáneamente uno o
múltiples genes seleccionados del grupo consistente en
- \bullet
- el gen hom, que codifica la homoserina deshidrogenasa (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)), o el alelo hom^{dr}, que codifica una homoserina deshidrogenasa "resistente a la retroalimentación" (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991),
- \bullet
- el gen gap, que codifica la glicero-aldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)),
- \bullet
- el gen pyc, que codifica la piruvato carboxilasa (Peters-Wendish et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)),
- \bullet
- el gen mqo, que codifica la malato:quinona óxido-reductasa (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- \bullet
- el gen tkt, que codifica la transcetolasa (número de acceso AB023377 del banco de datos de European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania)),
- \bullet
- el gen zwf, que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (documento JP-A-09224661),
- \bullet
- el gen yhrE, que codifica la exportación de treonina (documento DE 199 41 478.5; DSM 12840).
De esta forma, por ejemplo, en particular para la
preparación de L-lisina, se pueden amplificar,
especialmente sobre-expresar, simultáneamente uno o
múltiples genes seleccionados del grupo consistente en
- \bullet
- el gen dapA, que codifica la dihidrodipicolinato sintasa (documento EP-B 0 197 335),
- \bullet
- el gen lysC, que codifica una aspartato quinasa resistente a la retroalimentación (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324),
- \bullet
- el gen gap, que codifica la glicero-aldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- \bullet
- el gen pyc, que codifica la piruvato carboxilasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- \bullet
- el gen tkt, que codifica la transcetolasa (número de acceso AB023377 del banco de datos de European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania),
- \bullet
- el gen zwf, que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (documento JP-A-09224661).
- \bullet
- el gen lysE, que codifica la exportación de lisina (documento DE-A-195 48 222).
Además de la sobre-expresión de
la 6-fosfogluconato deshidrogenasa y de la
atenuación de la piruvato oxidasa, para la producción de
L-aminoácidos puede resultar ventajoso,
adicionalmente, eliminar reacciones secundarias indeseables
(Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Micro-Organisms", en: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (compiladores),
Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos preparados según la invención
se pueden cultivar de forma continua o discontinua en el
procedimiento discontinuo (cultivo discontinuo), o en el
procedimiento de lote continuo (procedimiento de alimentación) o de
lote continuo repetido (procedimiento de alimentación repetida),
para la producción de L-aminoácidos. En el libro de
texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1.
Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, 1991)), o en el libro de texto de Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/
Wiesbaden, 1994), se describen resúmenes de métodos de cultivo conocidos.
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/
Wiesbaden, 1994), se describen resúmenes de métodos de cultivo conocidos.
Los medios de cultivo a utilizar deben satisfacer
los requisitos del microorganismo particular de manera adecuada. En
el manual "Manual of Methods for General Bacteriology",
de la Sociedad de EE.UU. de Bacteriología (Washington D.C., EE.UU.,
1981) aparecen descripciones de medios de cultivo para diversos
microorganismos. Azúcares e hidratos de carbono tales como, por
ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
almidón y celulosa, aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite
de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de
cacahuete, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico,
ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, por
ejemplo, glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como, por
ejemplo, ácido acético, se pueden utilizar como fuentes de carbono.
Estas sustancias se pueden utilizar de forma individual, o como
mezclas. Compuestos que contienen nitrógeno orgánico tales como
peptonas, extractos de levadura, extracto de carne, extracto de
malta, maíz fermen-
tado...
tado...
Compuestos básicos tales como hidróxido sódico,
hidróxido de potasio, amoniaco, o compuestos ácidos tales como ácido
fosfórico o ácido sulfúrico, se pueden emplear de manera adecuada
para controlar el pH. Se pueden utilizar antiespumantes tales como,
por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos, para controlar
el desarrollo de espuma. Se pueden agregar al medio sustancias
adecuadas, dotadas de una acción selectiva, por ejemplo,
antibióticos, para mantener la estabilidad de los plasmidios. Para
mantener las condiciones aeróbicas, se introducen en el cultivo
oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno tales como, por
ejemplo, aire. La temperatura del cultivo es habitualmente de 20ºC a
45ºC y, preferentemente, de 25ºC a 40ºC. El cultivo se continúa
hasta que se haya formado una cantidad máxima de
L-aminoácidos. Este objetivo se alcanza,
normalmente, en el plazo de 10 a 160
horas.
horas.
El análisis de los L-aminoácidos
se puede llevar a cabo por cromatografía de intercambio de aniones,
con subsiguiente derivatización de ninhidrina, como se describe en
Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30 (1958),
1190), o puede tener lugar por HPLC de fase inversa, como se
describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry
(1979), 51: 1167-1174).
Se ha depositado el siguiente microorganismo en
la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ =
Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares,
Braunschweig, Alemania), de acuerdo con el Tratado de Budapest:
Escherichia coli K-12
DH5\alpha/pEC-T18mob2, como DSM 13244.
Se adjuntan las siguientes Figuras:
\bullet Figura 1: mapa del plasmidio
pEC-T18mob2
\bullet Figura 2: mapa del plasmidio pECgnd
\bullet Figura 3: mapa del plasmidio pBGNA
\bullet Figura 4: mapa del plasmidio pCR2.
1poxBint.
Los números de pares de bases declarados son
valores aproximados, obtenidos en el contexto de la
reproducibilidad.
Las abreviaturas utilizadas tienen los siguientes
significados:
\vskip1.000000\baselineskip
En relación con la Figura 1:
- Tet:
- Gen de resistencia a la tetraciclina
- oriV:
- origen de replicación, codificado por plasmidio, de E. coli
- RP4mob:
- región mob para la movilización del plasmidio
- rep:
- origen de replicación, codificado por plasmidio, del plasmidio pGA1 de C. glutamicum
- per:
- gen para controlar el número de copias desde pGA1
- lacZ-alfa:
- fragmento del gen lacZ\alpha (extremo N) del gen de \beta-galactosidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
En relación con la Figura 2:
- Tet:
- Gen de resistencia a la tetraciclina
- rep:
- origen de replicación, codificado por plasmidio, del plasmidio pGA1 de C. glutamicum
- per:
- gen para controlar el número de copias desde pGA1
- lacZ:
- relicto de clonación del fragmento de gen lacZ\alpha de pEC-T18mob2
- gnd:
- gen de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
En relación con la Figura 3:
- LacP:
- Promotor del operón lactosa de E. coli
- CMV:
- promotor del citomegalovirus
- ColE1:
- origen de replicación del plasmidio ColE1
- TkpolyA:
- sitio de poliadenilación
- Kan r:
- gen de resistencia a la kanamicina
- SV40ori:
- origen de replicación del virus 40 de Simio
- gnd:
- gen de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa
\vskip1.000000\baselineskip
En relación con la Figura 4:
- ColE1 ori:
- Origen de replicación del plasmidio ColE1
- lacZ:
- relicto de clonación del fragmento de gen lacZ\alpha
- fl ori:
- origen de replicación del fago f1
- KmR:
- resistencia a kanamicina
- ApR:
- resistencia a ampicilina
- poxBint:
- fragmento interno del gen poxB.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, se han utilizado las siguientes
abreviaturas:
- AccI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción AccI
- BamHI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción BamHI
- EcoRI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción EcoRI
- HindIII:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción HindIII
- KpnI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción KpnI
- PstI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción PstI
- PvuI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción PvuI
- SalI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción SalI
- SacI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción SacI
- SmaI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción SmaI
- SphI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción SphI
- XbaI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción XbaI
- XhoI:
- Sitio de escisión del la enzima de restricción XhoI
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes Ejemplos ilustrarán adicionalmente
esta invención. Las técnicas de biología molecular, por ejemplo,
aislamiento de ADN de plasmidios, tratamiento con enzimas de
restricción, ligaduras, transformaciones estándares de
Escherichia coli, etc., utilizadas, se describen (a menos que
se indique lo contrario) en Sambrook et al. (Molecular
Cloning. A Laboratory Manual (1989). Cold Spring Harbour
Laboratories, EE.UU.).
Se construyó una genoteca de ADN de
Corynebacterium glutamicum cepa AS019 (Yoshiyama et
al., Journal of Bacteriology 162, 591-597
(1985)), utilizando el sistema ë Zap Express® (Short et al.
(1988) Nucleic Acids Research 16: 7583-7600),
como se describe en O'Donohue (O'Donohue, M. (1997). The Cloning
and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid
Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Tesis
Doctoral Ph., Universidad Nacional de Irlanda, Galway). El kit ë Zap
Express® se adquirió en Stratagene (Stratagene, 1101 North Torrey
Pines Rd., La Jolla, California 92037), y se utilizó de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. El ADN de AS019 se digirió con la
enzima de restricción Sau3A y se ligó a las ramas de ë Zap Express®
tratadas con BamHI y defosforiladas.
Se utilizó un oligonucleótido marcado
radiactivamente, interno para el gen gnd, para sondear la genoteca
AS019 ë Zap Express® anteriormente descrita. El oligonucleótido se
creó utilizando cebadores de PCR degenerados, internos para el gen
gnd. Los cebadores de nucleótidos degenerados diseñados para la
amplificación de PCR de fragmentos de ADN de gnd fueron los
siguientes:
- gnd1: 5' ATG GTK CAC ACY GGY ATY GAR TA 3'
- gnd2: 5' RGT CCA YTT RCC RGT RCC YTT 3'
siendo R = A+G; Y = C+T; K =
T+G.
El tamaño estimado del producto de PCR resultante
fue de aproximadamente 252 pb.
Se determinó que las condiciones óptimas de PCR
fueron las siguientes:
- 35 ciclos
- 94ºC durante 1 minuto
- 55ºC durante 1 minuto
- 72ºC durante 30 segundos
- MgCl_{2} 2,5 - 3,5 mM
- 100 - 150 ng de ADN genómico de AS019
El análisis de secuencia del producto de PCR
resultante confirmó que el producto fue una porción interna del gen
gnd. El análisis de secuencia se llevó a cabo empleando los
cebadores universales directos e inversos, y el kit de secuenciación
T7 de Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, Reino Unido). La
secuencia del producto de PCR se muestra en la SEQ ID No. 1.
El análisis de la genoteca de AS019 ë Zap
Express® se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del sistema ë
Zap Express® (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla,
California 92037). A continuación, se llevó a cabo un análisis de
transferencia de Southern en los clones aislados. La transferencia
de Southern de ADN fue como se describe en el manual de los
protocolos de Schleicher y Schuell, empleando Nytran® como membrana
("Nytran, Modified Nylon-66 Membrane
Filtres" (marzo, 1987), Schleicher y Schuell, Dassel,
Alemania). Se marcaron radiactivamente con
\alpha-^{32}P-dCTP fragmentos de
ADN de doble cadena, generados utilizando los mismos cebadores y
condiciones óptimas de PCR que se han descrito anteriormente,
utilizando el kit de marcado de ADN Multiprime® de Amersham Life
Science (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited, Little Chalfont,
Buckinghamshire, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las condiciones de pre-hibridación,
hibridación y lavado fueron como las que se describen en el manual
de protocolos de Schleicher y Schuell. La autorradiografía se llevó
a cabo de acuerdo con el procedimiento establecido en el manual de
Sambrook et al., utilizando película AgFa Curix RPIL. De esta
forma, se identificaron numerosos clones de gnd. Se aisló el ADN de
plasmidio de uno de estos clones, designado pBGNA (Figura 3),
seleccionándolo para análisis posteriores.
Se utilizó el método de terminación de cadena
dideoxi de Sanger, de Sanger et al. (Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467
(1977)) para secuenciar el inserto clonado de pBGNA. El método se
aplicó utilizando el kit de secuenciación T7 y el
\alpha-^{35}S-dCTP de Pharmacia
Biotech (St. Albans, Herts, Reino Unido). Las muestras se sometieron
a electroforesis durante 3-8 horas sobre geles de
poliacrilamida/urea al 6% en tampón TBE, a una corriente constante
de 50 mA, según el manual de instrucciones para clonación y
secuenciación de Pharmacia ("T7 Sequencing® Kit", ref.
XY-010-00-19,
Pharmacia Biotech, 1994). El análisis de secuencias se llevó a cabo
empleando cebadores internos diseñados a partir de la secuencia
conocida del producto de PCR de gnd interno (SEQ ID No. 1),
permitiendo deducir la secuencia completa del gen gnd.
Las secuencias de los cebadores internos fueron
las siguientes:
- cebador interno 1: 5' GGT GGA TGC TGA AAC CG 3'
- cebador interno 2: 5' GCT GCA TGC CTG CTG CG 3'
- cebador interno 3: 5' TTG TTG CTT ACG CAC AG 3'
- cebador interno 4: 5' TCG TAG GAC TTT GCT GG 3'
A continuación, la secuencia obtenida se analizó
utilizando el programa DNA Strider (Marck (1988), Nucleic Acids
Research 16: 1829-1836), versión 1,0 en un
ordenador Apple Macintosh. Este programa permitió la realización de
análisis tales como uso de sitios de restricción, análisis de marcos
de lectura abierta y determinación del uso de codones. Las
investigaciones entre la secuencia de ADN obtenida y las de las
bases de datos de EMBL y Genbank se efectuaron usando el programa
BLAST (Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Research
25: 3389-3402). Las secuencias de ADN y proteínas se
alinearon empleando los programas Clustal V y Clustal W (Higgins y
Sharp, 1988, Gene 73:237-244).
La secuencia obtenida de esta manera se muestra
en SEQ ID No. 2. El análisis de la secuencia de nucleótidos obtenida
reveló un marco de lectura abierta de 1377 pares de bases, que se
designó gen gnd. Codifica una proteína de 459 aminoácidos que se
muestra en SEQ ID No. 3.
El vector lanzadera pEC-T18mob2
de E. coli - C. glutamicum se construyó según la técnica
anterior.
El vector contiene la región de replicación rep
del plasmidio pGA1, incluido el efector de replicación per
(documento US-A-5.175.108; Nesvera
et al., Journal of Bacteriology 179,
1525-1532 (1997)), el gen tetA(Z) del
plasmidio pAG1, que imparte resistencia a la tetraciclina (documento
US-A-5.158.891; registro en la
genoteca en el National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, EE.UU.), con número de acceso AF121000), la región de
replicación oriV del plasmidio pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring
Harbor Symposium on Quantitative Biology 43,
77-90 (1979)), el fragmento del gen lacZ, incluido
el promotor lac y un sitio de clonación múltiple (mcs) (Norrander
et al., Gene 26, 101-106 (1983)), y la
región mob del plasmidio RP4 (Simon et al., (1983),
Bio/Technology 1:784-791).
El vector construido se transformó en la cepa
DH5\alpha de E. coli (Hanahan, en: DNA Cloning. A
practical approach. Vol. I. IRL Press, Oxford, Washington D.C.,
EE.UU., 1985). La selección de células portadoras del plasmidio se
efectuó sembrando en placas el lote de transformación sobre agar LB
(Sambrook et al., Molecular cloning: a Laboratory
Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y., EE.UU., 1989), suplementado con 5 mg/l de
tetraciclina. Se aisló el ADN plasmídico de un transformante con la
ayuda del QIAprep Spin Minoprep Kit de Qiagen, y se comprobó la
restricción con la enzima de restricción EcoRI y HindIII y
subsiguiente electroforesis sobre gel de agarosa (al 0,8%).
El plasmidio se denominó
pEC-T18mob2, y se muestra en la Figura 1. Se
encuentra depositado en forma de la cepa Escherichia coli
K-12, cepa DH5\alpha/pEC-T18mob2
en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ =
Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares,
Braunschweig, Alemania) como DSM 13244.
Se utilizó PCR para amplificar los fragmentos de
ADN que contienen el gen gnd en su totalidad de C.
glutamicum, y las regiones de flanqueo corriente arriba y
corriente abajo, utilizando pBGNA como modelo. Las reacciones de PCR
se llevaron a cabo utilizando cebadores oligonucleótidos diseñados
de la SEQ ID No. 2. Los cebadores utilizados fueron:
- cebador directo gnd: 5' ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG 3'
- cebador inverso gnd: 5' CAC ACA GGA AAC AGA TAT GAC 3'
Los parámetros de PCR fueron los siguientes:
- 35 ciclos
- 95ºC durante 6 minutos
- 94ºC durante 1 minuto
- 50ºC durante 1 minuto
- 72ºC durante 45 segundos
- MgCl_{2} 1 mM
- aprox. 150-200 ng de ADN de pBGNA como modelo.
El producto de PCR obtenido se clonó en el vector
pGEM-T disponible en el comercio, adquirido de
Promega Corp. (pGEM-T Easy Vector System 1, nº de
catálogo A1360, Promega UK, Southampton), utilizando como huésped la
cepa JM109 de E. coli (Yanish-Perron et
al., Gene 33: 103-119 (1985)).
Seguidamente, se aisló todo el gen gnd del vector
pGEM-T sobre un fragmento EcoRI, y se clonó en el
sitio lacZ de EcoRI del vector lanzadera pEC-T18mob2
de E. coli - C. glutamicum (Figura 1), y se designó como
pECgnd (Figura 2). El análisis con enzimas de restricción con AccI
(Boehringer Mannheim GmbH, Alemania) reveló la orientación correcta
(es decir, corriente abajo del promotor lac) del gen gnd en el gen
lacZ de pEC-T18mob2.
Se electroporó el plasmidio pECgnd del Ejemplo 3
mediante el método de electroporación de Tauch et al.
(FEMS Microbiological Letters, 123:343-347
(1994)) en las cepas Corynebacterium glutamicum DSM 5399 y
DSM 5714. La cepa DSM 5399 es un productor de treonina descrito en
el documento EP-B-0358940. La cepa
DSM 5714 es un productor de lisina descrito en el documento
EP-B-0435132. La selección de
transformantes se llevó a cabo sembrando en placas el lote de
electroporación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular
cloning: a Laboratory Manual. 2ª edición. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), suplementado con
25 ml/l de kanamicina. Las cepas DSM5399/pECgnd y DSM5714/pECgnd se
formaron de esta manera.
La cepa de C. glutamicum DSM5399/pECgnd
obtenida en el Ejemplo 5 se cultivó en un medio de nutrientes
adecuado para la producción de treonina, y se determinó el contenido
en treonina en el sobrenadante del cultivo.
Para esto, la cepa se incubó inicialmente sobre
una placa de agar con el correspondiente antibiótico (agar de
cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l) durante 24
horas a 33ºC. A partir de este cultivo en placa de agar, se sembró
un pre-cultivo (10 ml de medio en un matraz cónico
de 100 ml). Se utilizó caldo de cerebro-corazón
(Merck, Darmstadt, Alemania) como medio para el
pre-cultivo. Se agregó tetraciclina (5 mg/l) a este
medio. El pre-cultivo se incubó durante 24 horas a
33ºC a 240 rpm sobre una máquina de agitación. Se sembró un cultivo
principal a partir de este pre-cultivo, de modo que
la D.O. inicial (660 nm) del cultivo principal fue 0,1. Se utilizó
el medio MM-treonina para el cultivo principal.
| CSL | 5 g/l |
| MOPS | 20 g/l |
| Glucosa (sometida a autoclave por separado) | 50 g/l |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 25 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 0,1 g/l |
| MgSO_{4} * 7 H_{2}O | 1,0 g/l |
| CaCl_{2} * 2 H_{2}O | 10 mg/l |
| FeSO_{4} * 7 H_{2}O | 10 mg/l |
| MnSO_{4} * H_{2}O | 5,0 mg/l |
| Biotina (filtrada a esterilización) | 0,3 mg/l |
| Tiamina * HCl (filtrada a esterilización) | 0,2 mg/l |
| CaCO_{3} | 25 g/l |
El CSL (licor de maíz fermentado), MOPS (ácido
morfolino-propanosulfónico) y la solución salina se
llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso, y se trataron en autoclave. Se
agregaron, entonces, el sustrato estéril y las soluciones de
vitaminas, así como el CaCO_{3}, que se trató en autoclave en
estado seco.
El cultivo se lleva a cabo en un volumen de 10 ml
en un matraz cónico de 100 ml con baffles. Se agregó tetraciclina (5
mg/l). El cultivo se llevó a cabo a 33ºC y una humedad atmosférica
de 80%.
Después de 48 horas, se determinó la DO con una
longitud de onda de medición de 660 nm, con un dispositivo Biomek
1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). Se determinó la
concentración de treonina formada por medio de un analizador de
aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo,
Alemania), por cromatografía de intercambio de iones y
derivatización de post-columna con detección de
ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 1.
| Cepa | DO (660) | L-treonina g/l |
| DSM5399/pECgnd | 11,9 | 1,29 |
| DSM5399 | 11,8 | 0,33 |
La cepa de C. glutamicum DSM5714/pECgnd,
obtenida en el Ejemplo 5, se cultivó en un medio de nutrientes
adecuado para la producción de lisina, y se determinó el contenido
en lisina en el sobrenadante del cultivo.
Para esto, la cepa se incubó inicialmente sobre
una placa de agar con el correspondiente antibiótico (agar de
cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l)) durante
24 horas a 33ºC. A partir de este cultivo en placa de agar, se
sembró un pre-cultivo (10 ml de medio en un matraz
cónico de 100 ml). Como medio para el pre-cultivo se
utilizó el medio CgIII completo.
| Medio Gluconato de Cg III | |
| NaCl | 2,5 g/l |
| Bacto-peptona | 10 g/l |
| Bacto-extracto de levadura | 10 g/l |
| Glucosa (tratada en autoclave por separado) | 2% (peso/volumen) |
El pH se llevó a pH 7,4.
Se agregó tetraciclina (5 mg/l) a este medio. El
pre-cultivo se incubó durante 24 horas a 33ºC a 240
rpm, sobre una máquina de agitación. A partir de este
pre-cultivo se sembró un cultivo principal, de
manera que la DO inicial (660 nm) del cultivo principal fue de 0,05.
Se utilizó medio MM para el cultivo principal.
| CSL (licor de maíz fermentado) | 5 g/l |
| MOPS (ácido morfolino-propanosulfónico) | 20 g/l |
| Glucosa (tratada en autoclave por separado) | 50 g/l |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | |
| KH_{2}PO_{4} | 25 g/l |
| MgSO_{4} * 7 H_{2}O | 0,1 g/l |
| CaCl_{2} * 2 H_{2}O | 1,0 g/l |
| FeSO_{4} * 7 H_{2}O | 10 mg/l |
| MnSO_{4} * H_{2}O | 10 mg/l |
| Biotina (filtrada a esterilización) | 0,3 mg/l |
| Tiamina * HCl (filtrada a esterilización) | 0,2 mg/l |
| L-Leucina (filtrada a esterilización) | 0,1 g/l |
| CaCO_{3} | 25 g/l |
El CSL, MOPS y la solución salina se llevaron a
pH 7 con amoniaco acuoso, y se trataron en autoclave. Se agregaron,
entonces, el sustrato estéril y las soluciones de vitaminas, así
como el CaCO_{3}, que se trató en autoclave en estado seco.
El cultivo se lleva a cabo en un volumen de 10 ml
en un matraz cónico de 100 ml con baffles. Se agregó tetraciclina (5
mg/l). El cultivo se llevó a cabo a 33ºC y una humedad atmosférica
de 80%.
Después de 48 horas, se determinó la DO con una
longitud de onda de medición de 660 nm, con un dispositivo Biomek
1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). Se determinó la cantidad
de lisina formada por medio de un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania), por
cromatografía de intercambio de iones y derivatización de
post-columna con detección de ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 2.
| Cepa | DO (660) | Lisina HCl g/l |
| DSM5715/pECgnd | 7,7 | 14,7 |
| DSM5715 | 7,1 | 13,7 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ADN cromosómico de Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032 de la forma descrita por Tauch et
al. (1995, Plasmid 33:168-179), y se
escindió parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham
Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción de Producto Sau3AI,
Código nº 27-0913-02). Los
fragmentos de ADN se defosforilaron con fosfatasa alcalina de gamba
(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción de
Producto SAP, Código nº 1758250). El ADN del vector cosmídico
SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 84:2160-2164), obtenido
de Stratagene (La Jolla, EE.UU., Descripción del Producto SuperCos1
Cosmid Vector Kit, Código nº 251301), se escindió con la enzima de
restricción XbaI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania,
Descripción del Producto XbaI, Código nº
27-0948-02), y se defosforiló
igualmente con fosfatasa alcalina de gamba. El ADN cosmídico se
escindió, entonces, con la enzima de restricción BamHI (Amersham
Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción del Producto BamHI,
Código nº 27-0868-04). El ADN
cosmídico tratado de esta manera se mezcló con el ADN de ATCC13032
tratado, y el lote se trató con T4 ADN-ligasa
(Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción del Producto
T4-ADN-ligasa, Código nº
27-0870-04). A continuación, la
mezcla de ligadura se incorporó en fagos con la ayuda de Gigapack II
XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, EE.UU., Descripción del
Producto Gigapack II XL Packing Extract, código nº 200217). Para la
infección de la cepa NM554 de E. coli (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575),
las células se recogieron en MgSO_{4} 10 mM y se mezclaron con una
parte alícuota de la suspensión de fagos. La infección y titulación
de la genoteca cosmídica se llevaron a cabo de la forma descrita por
Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor), sembrándose las células sobre agar
LB (Lennox, 1955, Virology 1:190) + 100 \mug/ml de
ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37ºC, se
seleccionaron clones individuales recombinantes.
El ADN cosmídico de una colonia individual
(Ejemplo 8) se aisló con el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Producto nº
27106, Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones
del fabricante, y se escindió parcialmente con la enzima de
restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania,
Descripción del Producto Sau3AI, Producto nº
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
se defosforilaron con fosfatasa alcalina de gamba (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP,
Producto nº 1758250). Tras la separación por electroforesis sobre
gel, se aislaron los fragmentos cosmídicos en un intervalo de tamaño
de 1500 a 2000 pb, con ayuda del QiaExII Gel Extraction Kit
(Producto nº 20021, Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN del vector de
secuenciación pZero-1, obtenido de Invitrogen
(Groningen, Holanda, Descripción del Producto Zero Background
Cloning Kit, Producto nº K2500-01), se escindió con
la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Friburgo,
Alemania, Descripción del Producto BamHI, Producto nº
27-0868-04). La ligadura de los
fragmentos cosmídicos en el vector de secuenciación
pZero-1 se llevó a cabo de la forma descrita por
Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor), incubando la mezcla de AND durante
la noche con T4 ligasa (Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania).
Seguidamente, esta mezcla de ligadura se sometió a electroporación
(Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters,
123:343-347), en la cepa DH5\alphaMCR de E.
coli (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 87:4645-4649), y se sembró sobre
placas de agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190), con 50
\mug/ml de zeocina. La preparación del plasmidio de los clones
recombinantes se llevó a cabo con Biorobot 9600 (Producto nº 900200,
Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación se llevó a cabo por el
método de detención de la cadena de dideoxi de Sanger et al.
(1977, Proceedings of The National Academy of Sciences USA,
74:5463-5467), con modificaciones según Zimmermann
et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se
utilizó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE
Applied Biosystems (Producto nº 403044, Weiterstadt, Alemania). La
separación por electroforesis sobre gel y el análisis de la reacción
de secuenciación se llevaron a cabo en un gel "Rotiphoresis NF
Acrylamide/Bisacrylamide" (29:1) (Producto nº A124.1, Roth,
Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI Prism 377" de PE
Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania).
A continuación, los datos de secuencia brutos
obtenidos se procesaron usando el paquete de programa Staden (1986,
Nucleic Acids Research, 14:217-231), versión
97.0. Se ensamblaron las secuencias individuales de los derivados de
pZero1 para formar un cóntigo continuo. El análisis computadorizado
de la región de codificación se preparó con el programa XNIP
(Staden, 1986, Nucleic Acids Research,
14:217-231). Se llevaron a cabo análisis adicionales
con el "BLAST search program" (Altschul et al., 1997,
Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) frente
al banco de datos no redundante del "National Center for
Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.).
A partir de la cepa ATCC 13032, se aisló ADN
cromosómico según el método de Eikmanns et al.
(Microbiology 140:1817-1828 (1994)). Sobre la
base de la secuencia del gen poxB, conocida para C.
glutamicum del Ejemplo 9, se seleccionaron los siguientes
oligonucleótidos para la reacción en cadena de la polimerasa:
poxBint1:
- 5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3'
poxBint2:
- 5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'
Los cebadores mostrados se sintetizaron por MWG
Biotech (Ebersberg, Alemania), y la reacción de PCR se llevó a cabo
de acuerdo con el método estándar de PCR de Innis et al. (PCR
Protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic
Press), con Pwo-Polymerase de Boehringer. Con ayuda
de la reacción en cadena de la polimerasa, se aisló un fragmento de
ADN de aprox. 0,9 kb de tamaño, portador de un fragmento interno del
gen poxB, que se muestra en la SEQ ID No. 6.
El fragmento de ADN amplificado se ligó con el
TOPO TA Cloning Kit de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, EE.UU.;
nº de Catálogo K4500-01) en el vector
pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991)
Bio/Technology 9:657-663). A continuación, la
cepa DH5\alpha de E. coli se sometió a electroporación con
el lote de ligadura (Hanahan, en: DNA Cloning. A practical
approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington
DC, EE.UU., 1985). La selección de células portadoras de plasmidios
se levó a cabo sembrando en placa el lote de transformación sobre
agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y., 1989), suplementado con 25 mg/l de kanamicina.
Se aisló el ADN plasmídico del transformante con la ayuda del
QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen, y se comprobó mediante
restricción con la enzima de restricción EcoRI y subsiguiente
electroforesis sobre gel de agarosa (al 0,8%). El plasmidio se
denominó pCR2.1poxBint (Figura 4).
El plasmidio pCR2.1poxBint ha sido depositado en
forma de la cepa de Escherichia coli
DH5\alpha/pCR2.1poxBint como DSM 13114 en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkuturen (DSMZ = Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania), de
acuerdo con el Tratado de Budapest.
El vector pCR2.1poxBint mencionado en el Ejemplo
10 se electroporó por el método de electroporación de
Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715. La cepa DSM 5715 es un productor de lisina resistente a AEC. El vector pCR2.1poxBint no puede replicar de manera independiente en DSM 5715 y permanece retenido en la célula sólo si está integrado en el cromosoma de DSM 5715. La selección de clones con pCR2.1poxBint integrado en el cromosoma se llevó a cabo sembrando en placa el lote de electroporación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), suplementado con 15 mg/l de kanamicina. Para la detección de la integración, se marcó el fragmento poxBint con el kit de hibridación Dig, de Boehringer, mediante el método de "The Dig System Users Guide for Filter Hibridization", de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993).
Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715. La cepa DSM 5715 es un productor de lisina resistente a AEC. El vector pCR2.1poxBint no puede replicar de manera independiente en DSM 5715 y permanece retenido en la célula sólo si está integrado en el cromosoma de DSM 5715. La selección de clones con pCR2.1poxBint integrado en el cromosoma se llevó a cabo sembrando en placa el lote de electroporación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), suplementado con 15 mg/l de kanamicina. Para la detección de la integración, se marcó el fragmento poxBint con el kit de hibridación Dig, de Boehringer, mediante el método de "The Dig System Users Guide for Filter Hibridization", de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993).
Se aisló el ADN cromosómico de un integrante
potencial por el método de Eikmanns et al. (Microbiology
140:
1817-1828 (1994)) y, en cada caso, se escindió con la enzima de restricción SaII, SacI y HindIII. Se separaron los fragmentos formados por electroforesis sobre gel de agarosa y se hibridaron a 68ºC con el kit de hibridación Dig de Boehringer. Se había insertado el plasmidio pCR2.1poxBint, mencionado en el Ejemplo 9, en el cromosoma de DSM 5715, en el interior del gen poxB cromosómico. La cepa se denominó DSM5715::pCR2.1poxBint.
1817-1828 (1994)) y, en cada caso, se escindió con la enzima de restricción SaII, SacI y HindIII. Se separaron los fragmentos formados por electroforesis sobre gel de agarosa y se hibridaron a 68ºC con el kit de hibridación Dig de Boehringer. Se había insertado el plasmidio pCR2.1poxBint, mencionado en el Ejemplo 9, en el cromosoma de DSM 5715, en el interior del gen poxB cromosómico. La cepa se denominó DSM5715::pCR2.1poxBint.
Se transformó la cepa DSM5715::pCR2.1poxBint con
el plasmidio pECgnd utilizando el método de electroporación descrito
por Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters,
53:299-303 (1981)). La selección de transformantes
se llevó a cabo sobre agar LBHIS que comprendió 18,5 g/l de caldo de
infusión de cerebro-corazón, sorbitol 0,5 M, 5 g/l
de Bacto-triptona, 2,5 g/l de
Bacto-extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l
de Bacto-agar, suplementado con 5 mg/l de
tetraciclina y 25 mg/l de kanamicina. La incubación se efectuó
durante 2 días a 33ºC. El ADN plasmídico se aisló en cada caso de un
transformante por métodos convencionales
(Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology 144, 915-927), se escindió con
la endonucleasa de restricción AccI, y el plasmidio se comprobó por
subsiguiente electroforesis sobre gel de agarosa. La cepa obtenida
de esta forma se llamó DSM5715:pCR2.1poxBint/pECgnd.
La cepa DSM5715:pCR2.1poxBint/pECgnd de C.
glutamicum, obtenida en el Ejemplo 12.1, se cultivó en un medio
de nutrientes adecuado para la producción de lisina, y se determinó
el contenido en lisina en el sobrenadante del cultivo.
Para esto, la cepa se incubó inicialmente en una
placa de agar con el correspondiente antibiótico (agar de
cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l) y
kanamicina (25 mg/l), durante 24 horas a 33ºC. Los cultivos de las
cepas de comparación se suplementaron de acuerdo con su resistencia
a los antibióticos. A partir de este cultivo en placa de agar, se
sembró un pre-cultivo (10 ml de medio en un matraz
cónico de 100 ml). Se utilizó el medio CgIII completo como medio
para el pre-cultivo.
| NaCl | 2,5 g/l |
| Bacto-peptona | 10 g/l |
| Bacto-extracto de levadura | 10 g/l |
| Glucosa (tratada en autoclave por separado) | 2% (peso/volumen) |
El pH se llevó a pH 7,4.
Se agregaron tetraciclina (5 mg/l( y kanamicina
(25 mg/l) a este medio. El pre-cultivo se incubó
durante 16 horas a 33ºC, a 240 rpm sobre una máquina de agitación.
Se sembró un cultivo principal a partir de este
pre-cultivo, de manera que la DO inicial (660 nm)
del cultivo principal fue de 0,1. Para este cultivo principal se
utilizó medio MM.
| CSL (licor de maíz fermentado) | 5 g/l |
| MOPS (ácido morfolino-propanosulfónico) | 20 g/l |
| Glucosa (tratada en autoclave por separado) | 58 g/l |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 25 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 0,1 g/l |
| MgSO_{4} * 7 H_{2}O | 1,0 g/l |
| CaCl_{2} * 2 H_{2}O | 10 mg/l |
| FeSO_{4} * 7 H_{2}O | 10 mg/l |
| MnSO_{4} * H_{2}O | 5,0 mg/l |
| Biotina (filtrada a esterilización) | 0,3 mg/l |
| Tiamina * HCl (filtrada a esterilización) | 0,2 mg/l |
| L-Leucina (filtrada a esterilización) | 0,1 g/l |
| CaCO_{3} | 25 g/l |
El CSL, MOPS y la solución salina se llevaron a
pH 7 con amoniaco acuoso, y se trataron en autoclave. Se agregaron,
entonces, el sustrato estéril y las soluciones de vitaminas, así
como el CaCO_{3}, que se trató en autoclave en estado seco.
El cultivo se lleva a cabo en un volumen de 10 ml
en un matraz cónico de 100 ml con baffles. Se agregó tetraciclina (5
mg/l) y kanamicina (25 mg/l). El cultivo se llevó a cabo a 33ºC y
una humedad atmosférica de 80%.
\newpage
Después de 72 horas, se determinó la DO con una
longitud de onda de medición de 660 nm, con un dispositivo Biomek
1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). Se determinó la cantidad
de lisina formada por medio de un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania), por
cromatografía de intercambio de iones y derivatización de
post-columna con detección de ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 3.
| Cepa | DO (660) | Lisina HCl g/l |
| DSM5715 | 10,8 | 16,0 |
| DSM5715/pECgnd | 7,6 | 16,5 |
| DSM5715::pCR2.1poxBint | 7,1 | 16,7 |
| DSM5715::pCR2.1poxBint/pECgnd | 7,2 | 17,1 |
<110> Universidad Nacional de Irlanda,
Galway
\hskip1cmDegussa-Hüls AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la preparación por
fermentación de L-aminoácidos utilizando bacterias
corineformes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 990229 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (474)..(1850)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gnd
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2160
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (327)..(2063)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> poxB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 875
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Procedimiento para la preparación de
L-aminoácidos por fermentación de bacterias
corineformes, que comprende llevar a cabo las siguientes etapas:
- a)
- fermentación de las bacterias productoras de L-aminoácidos deseadas, en las que al menos el gen gnd está amplificado, y al menos el gen poxB está atenuado,
- b)
- concentración del L-aminoácido en el medio o en las células de las bacterias, y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido producido.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se utilizan bacterias en las que se amplifican, en
particular, sobre-expresan, genes adicionales de la
vía de biosíntesis del L-aminoácido deseado.
3. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se utilizan bacterias corineformes que producen
L-treonina, L-lisina,
L-isoleucina, o L-triptófano.
4. El procedimiento según la reivindicación 3, en
el que se utilizan bacterias corineformes que producen
L-lisina.
5. El procedimiento según la reivindicación 3, en
el que se utilizan bacterias corineformes que producen
L-treonina.
6. Un procedimiento para la preparación por
fermentación de L-lisina según la reivindicación 2,
en el que en los microorganismos corineformes que, en particular, ya
producen L-lisina se amplifican, en particular,
sobre-expresan, simultáneamente uno o múltiples
genes del grupo consistente en
- 6.1
- el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato sintasa,
- 6.2
- el gen lysC que codifica una aspartato quinasa resistente a la retroalimentación,
- 6.3
- el gen gap que codifica gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa,
- 6.4
- el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa,
- 6.5
- el gen tkt que codifica transcetolasa,
- 6.6
- el gen zwf que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y
- 6.7
- el gen lysE que codifica la exportación de lisina.
7. Un procedimiento para la preparación por
fermentación de L-treonina según la reivindicación
2, en el que en los microorganismos corineformes que, en particular,
ya producen L-treonina se amplifican, en particular,
sobre-expresan, simultáneamente uno o múltiples
genes del grupo consistente en
- 7.1
- el gen hom que codifica la homoserina deshidrogenasa, o el alelo hom^{dr} que codifica una homoserina deshidrogenasa "resistente a la retroalimentación",
- 7.2
- el gen gap que codifica gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa,
- 7.3
- el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa,
- 7.4
- el gen mqo que codifica la malato:quinona óxido-reductasa,
- 7.5
- el gen tkt que codifica transcetolasa,
- 7.6
- el gen zwf que codifica glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y
- 7.7
- el gen thrE que codifica la exportación de treonina.
8. El procedimiento según las reivindicaciones 2
a 7, en el que para lograr la amplificación, se incrementa el número
de copias de los genes o de las secuencias de nucleótidos, mediante
la transformación de los microorganismos con vectores plasmídicos
portadores de estos genes o secuencias de nucleótidos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US531265 | 1990-05-31 | ||
| US53126500A | 2000-03-20 | 2000-03-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2240135T3 true ES2240135T3 (es) | 2005-10-16 |
Family
ID=24116938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00951336T Expired - Lifetime ES2240135T3 (es) | 2000-03-20 | 2000-07-05 | Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos con ampliaficacion del gen gnd. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030119154A1 (es) |
| EP (1) | EP1179076B9 (es) |
| KR (1) | KR100826815B1 (es) |
| CN (1) | CN1350586A (es) |
| AT (1) | ATE292687T1 (es) |
| AU (1) | AU6431600A (es) |
| BR (1) | BR0010817A (es) |
| CA (1) | CA2374265A1 (es) |
| DE (1) | DE60019280T2 (es) |
| ES (1) | ES2240135T3 (es) |
| MX (1) | MXPA01011643A (es) |
| PL (1) | PL358912A1 (es) |
| SK (1) | SK16542001A3 (es) |
| WO (1) | WO2001071012A1 (es) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036797A2 (en) * | 2000-11-04 | 2002-05-10 | Degussa Ag | Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| US20030017554A1 (en) * | 2000-11-15 | 2003-01-23 | Mechthild Rieping | Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| DE10210527A1 (de) | 2002-03-09 | 2003-09-18 | Degussa | Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| JP5572279B2 (ja) * | 2004-05-20 | 2014-08-13 | 味の素株式会社 | コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法 |
| DE102005032426A1 (de) | 2004-12-18 | 2006-06-22 | Degussa Ag | Allele des gnd-Gens aus coryneformen Bakterien |
| US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
| KR101335853B1 (ko) | 2011-12-01 | 2013-12-02 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법 |
| CN105602966B (zh) * | 2016-01-08 | 2019-03-15 | 广西大学 | 一种编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因及其应用 |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| CN114729339B (zh) * | 2021-01-29 | 2023-01-03 | Cj第一制糖株式会社 | 新真菌硫酮还原酶变体及使用其生产l-赖氨酸的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2165546B (en) * | 1984-08-21 | 1989-05-17 | Asahi Chemical Ind | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
| GB2223754B (en) * | 1988-09-12 | 1992-07-22 | Degussa | Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase |
| DE3943117A1 (de) * | 1989-12-27 | 1991-07-04 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| DE4027453A1 (de) * | 1990-08-30 | 1992-03-05 | Degussa | Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren |
| ATE210728T1 (de) * | 1993-10-28 | 2001-12-15 | Ajinomoto Kk | Herstellungsverfahren einer substanz |
| JPH09224662A (ja) * | 1996-02-23 | 1997-09-02 | Mitsubishi Chem Corp | ６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ |
| DE60030400T2 (de) * | 1999-07-09 | 2007-09-13 | Degussa Gmbh | Für den opac-gen kodierende nukleotidsequenzen |
| JP4841093B2 (ja) * | 1999-07-23 | 2011-12-21 | アーカー−ダニエルズ−ミッドランド カンパニー | 細胞性ｎａｄｐｈの増加によるｌ−アミノ酸の生成方法 |
-
2000
- 2000-07-05 CA CA002374265A patent/CA2374265A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-05 AT AT00951336T patent/ATE292687T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-07-05 SK SK1654-2001A patent/SK16542001A3/sk unknown
- 2000-07-05 WO PCT/EP2000/006299 patent/WO2001071012A1/en active IP Right Grant
- 2000-07-05 ES ES00951336T patent/ES2240135T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 MX MXPA01011643A patent/MXPA01011643A/es unknown
- 2000-07-05 KR KR1020017014821A patent/KR100826815B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-07-05 CN CN00807548A patent/CN1350586A/zh active Pending
- 2000-07-05 PL PL00358912A patent/PL358912A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-07-05 BR BR0010817-0A patent/BR0010817A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-07-05 DE DE60019280T patent/DE60019280T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 EP EP00951336A patent/EP1179076B9/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 AU AU64316/00A patent/AU6431600A/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-02-20 US US10/078,167 patent/US20030119154A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-10-17 US US10/686,736 patent/US20040063181A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030119154A1 (en) | 2003-06-26 |
| SK16542001A3 (sk) | 2002-07-02 |
| EP1179076B9 (en) | 2005-11-30 |
| AU6431600A (en) | 2001-10-03 |
| DE60019280T2 (de) | 2006-05-11 |
| KR100826815B1 (ko) | 2008-05-02 |
| US20040063181A1 (en) | 2004-04-01 |
| CA2374265A1 (en) | 2001-09-27 |
| ATE292687T1 (de) | 2005-04-15 |
| MXPA01011643A (es) | 2003-02-27 |
| EP1179076A1 (en) | 2002-02-13 |
| EP1179076B1 (en) | 2005-04-06 |
| DE60019280D1 (de) | 2005-05-12 |
| KR20010113832A (ko) | 2001-12-28 |
| CN1350586A (zh) | 2002-05-22 |
| WO2001071012A1 (en) | 2001-09-27 |
| PL358912A1 (en) | 2004-08-23 |
| BR0010817A (pt) | 2002-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20050196848A1 (en) | Process for the fermentative production of L-amino acids by attenuation of the poxB gene | |
| US20060014259A9 (en) | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| KR20010062279A (ko) | ｚｗａ2 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| US6921651B2 (en) | Process for the preparation of amino acids by using coryneform bacteria with attenuated 1-phosphofructokinase activity | |
| EP1179073B1 (en) | Process for the fermentative preparation of l-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| ES2240135T3 (es) | Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos con ampliaficacion del gen gnd. | |
| KR20010050840A (ko) | ｅｎｏ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| ES2344248T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen dapc, y procedimiento para la preparacion de l-lisina. | |
| US20050112733A1 (en) | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| EP1179084B1 (en) | Process for the fermentative preparation of l-amino acids with amplification of the tkt gene | |
| US20030109014A1 (en) | Process for the fermentative preparation of L-amino acids with amplification of the tkt gene | |
| EP1709166A1 (en) | Process for the preparation of l-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| US7029904B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the dep34 gene | |
| US7101690B2 (en) | Attenuated CCPA1 modified bacterial cell and its use for the preparation of L-amino acids | |
| WO2002038788A2 (en) | Process for the fermentative preparation of l-amino acids using coryneform bacteria | |
| US20020002275A1 (en) | Novel nucleotide sequences encoding the gpm gene | |
| ES2254463T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen csta de corynebacterium glutamicum. |