KR20010113832A

KR20010113832A - ｇｎｄ 유전자의 증폭을 이용한 Ｌ-아미노산의 발효적생산 방법

Info

Publication number: KR20010113832A
Application number: KR1020017014821A
Authority: KR
Inventors: 두니카우엘케이; 맥코르맥애쉴링; 스테이플톤클리오나; 부키케빈; 멕켈베티나
Original assignee: 펠드만 마르틴 및 봅 후베르트; 데구사 아게; 추후제출; 내셔널 유니버시티 오브 아일랜드
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2001-12-28
Also published as: US20030119154A1; SK16542001A3; EP1179076B9; AU6431600A; DE60019280T2; KR100826815B1; US20040063181A1; CA2374265A1; ATE292687T1; MXPA01011643A; EP1179076A1; EP1179076B1; DE60019280D1; CN1350586A; ES2240135T3; WO2001071012A1; PL358912A1; BR0010817A

Abstract

본 발명은, a) 적어도 gnd 유전자가 증폭된, 목적하는 L-아미노산 생산-박테리아를 발효시키는 단계, b) 배지 또는 박테리아 세포내에서 L-아미노산을 농축시키는 단계, 및 c) 생산된 L-아미노산을 분리하는 단계를 수행함을 특징으로 하여, 코리네형 박테리아의 발효에 의해 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

ｇｎｄ 유전자의 증폭을 이용한 Ｌ-아미노산의 발효적 생산 방법{Process for the fermentative preparation of L-amino acids with amplification of the gnd gene}

본 발명은 적어도 gnd 유전자가 증폭되어진 코리네형 박테리아를 사용하여 L-아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이소루신 및 L-트립토판을 발효적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-아미노산은 동물의 사료, 사람의 의약 및 약제 산업에 사용된다.

아미노산이 코리네형 박테리아 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 의한 발효를 통해 생산될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 아미노산의 지대한 중요성 때문에, 생산 공정을 개선하기 위한 노력이 계속되고 있다. 생산 공정의 개선은, 발효 기술(예: 교반 및 산소 공급), 영양 배지의 조성(예: 발효 동안의 당의 농도), 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품 형태로의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 생산성에 관한 것이다.

돌연변이유발법, 선별법 및 돌연변이체 선별법을 사용하여 이들 미생물의 생산성을 개선시킬 수 있다. 이러한 방법에 의해, 항대사물질(예: 트레오닌 동족체 α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHV))에 대해 내성을 갖거나, 또는 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며, L-아미노산, 예를 들어, 트레오닌을 생산하는 균주가 수득된다.

L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 개량하기 위한 재조합 DNA 기술이 수년간 이용되어 왔다.

발명의 목적

본 발명자들이 이루고자 하는 목적은 코리네형 박테리아를 이용하여 L-아미노산을 발효적으로 생산하는 방법을 개선하는 것이다.

도 1은 플라스미드 pEC-T18mob2의 지도이다.

도 2는 플라스미드 pECgnd의 지도이다.

도 3은 플라스미드 pBGNA의 지도이다.

도 4는 플라스미드 pCR2.1poxBint의 지도이다.

언급된 염기쌍 수는 재현가능성의 관점에서 수득된 대략적 값이다.

사용된 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다:

도 1의 경우:

Tet: 테트라사이클린에 대한 내성 유전자

oriV: 이. 콜라이의 플라스미드-암호화된 복제 기점

RP4mob: 플라스미드를 이동시키기 위한 mob 영역

rep: 코리네박테리움 글루타미쿰 플라스미드 pGA1으로 부터의 플라스미드-암호화된 복제 기점

per: pGA1으로 부터의 복사체 수를 조절하기 위한 유전자

lacZ-알파: β-갈락토시다제 유전자의 lacZα 유전자 단편(N-말단)

도 2의 경우:

Tet: 테트라사이클린에 대한 내성 유전자

per: pGA1으로 부터의 복사체 수를 조절하기 위한 유전자

lacZ: pEC-T18mob2로 부터의 lacZα 유전자 단편의 클로닝 잔여물

gnd: 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 유전자

도 3의 경우:

LacP: 이. 콜라이 락토즈 오페론의 프로모터

CMV: 사이토메갈로바이러스의 프로모터

ColE1: 플라스미드 ColE1의 복제 기점

TkpolyA: 폴리아데닐화 부위

Kan r: 카나마이신 내성 유전자

SV40ori: 원숭이 바이러스 40의 복제 기점

gnd: 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 유전자

도 4의 경우:

ColE1 ori: 플라스미드 ColE1의 복제 기점

lacZ: lacZα 유전자 단편의 클로닝 잔여물

fl ori: 파아지 fl의 복제 기점

KmR: 카나마이신 내성

ApR: 앰피실린 내성

poxBint: poxB 유전자의 내부 단편

또한, 아래의 약어가 사용된다:

AccI: 제한효소 AccI의 절단 부위

BamHI: 제한효소 BamHI의 절단 부위

EcoRI: 제한효소 EcoRI의 절단 부위

HindIII: 제한효소 HindIII의 절단 부위

KpnI: 제한효소 KpnI의 절단 부위

PstI: 제한효소 PstI의 절단 부위

PvuI: 제한효소 PvuI의 절단 부위

SalI: 제한효소 SalI의 절단 부위

SacI: 제한효소 SacI의 절단 부위

SmaI: 제한효소 SmaI의 절단 부위

SphI: 제한효소 SphI의 절단 부위

XbaI: 제한효소 XbaI의 절단 부위

XhoI: 제한효소 XhoI의 절단 부위

L-아미노산은 사람의 의약 및 약제 산업, 식품 산업, 특히 동물의 사료에 사용된다. 따라서, 아미노산을 생산하기 위한 신규한 개선된 방법을 제공하는 것이 전반적 관심의 대상이다.

본 발명은, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 효소(EC 번호 1.1.1.44)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(gnd 유전자)가 증폭, 특히 과발현되어진 코리네형 박테리아를 사용하여, L-아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이소루신 및 L-트립토판을 발효적으로 생산하는 방법를 제공한다.

사용된 균주는 바람직하게는 gnd 유전자 증폭 전에 이미 L-아미노산을 생산한다.

바람직한 태양은 청구범위에 기재되어 있다.

이와 관련하여, "증폭"이란 용어는, 예를 들면, 유전자(들)의 복사체 수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 고활성의 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하거나, 임의로 이들 수단을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증강시키는 것을 의미한다.

본 발명이 제공하는 미생물은, 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 또는 셀룰로즈로부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산, 을 생산할 수 있다. 이러한 미생물의 대표적인 예는 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 속의 미생물이다. 코리네박테리움 속 중에서도, L-아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력이 당업자에게 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 특히 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종 중에서 적합한 균주로는, 예를 들면, 공지된 야생형 균주:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870,

코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,

브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067,

브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020; 및

이로부터 제조된 L-아미노산-생산 돌연변이체, 예를 들면,

L-트레오닌-생산 균주,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21649,

브레비박테리움 플라붐 BB69,

브레비박테리움 플라붐 DSM 5399,

브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-BP 269, 및

브레비박테리움 락토페르멘툼 TBB-10;

L-이소루신-생산 균주,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14309,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14310,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14311,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 15168, 및

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871;

L-트립토판-생산 균주,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21850 및

코리네박테리움 글루타미쿰 KY9218(pKW9901); 및

L-리신-생산 균주,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709,

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464,

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715,

코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1,

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 12866이 있다.

코리네형 박테리아는, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제(EC 번호 1.1.1.44)를 암호화하는 gnd 유전자가 과발현된 후, L-아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이소루신 및 L-트립토판을 개선된 방법으로 생산한다.

gnd 유전자는 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 효소를 암호화하며, 이는 6-포스포글루콘산을 리불로즈 5-포스페이트로 산화적 탈카복실화시키는 반응을 촉매화한다. gnd 유전자의 뉴클레오티드는 JP-A-9-224662에 개시되어 있다. 언급된 참조 문헌에 기술된 gnd 유전자는 처음으로 본 발명에서 사용된다. 유전 암호의 축퇴성의 결과로서 또는 중성 기능의 센스 돌연변이로 인해 생성되는 gnd 유전자의 대립유전자도 또한 사용될 수 있다.

증폭(예: 과발현)을 달성하기 위하여, 상응하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자 상류에 위치하는 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상류에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 또한, 유도성 프로모터를 사용하여, L-아미노산의 발효적 생성 과정 동안 발현을 증강시킬 수 있다. 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키기 위한 수단에 의해 마찬가지로 향상될 수 있다. 또한, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성을 증강시킬 수 있다. 유전자(들) 작제물은 다양한 수의 복사체로써 플라스미드내에 존재하거나, 또는 염색체내에 삽입되어 증폭될 수 있다. 또는, 목적 유전자의 과발현은 배지의 조성 및 배양 과정을 변화시킴으로써 성취될 수 있다.

당업자는 이와 관련된 지침을 특히 문헌[참조: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 명세서 EPS 0 472 869; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 국제특허출원 WO 96/15246; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993); 일본 특허 공개공보 JP-A-10-229891; 및 Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다.

예를 들면, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 플라스미드를 이용하여 과발현시킨다. 도 1에 도시된 이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2를 이에 이용한다. pEC-T18mob2의 EcoRI 절단 부위에 gnd 유전자가 삽입된 후, 도 2에 도시된 pECgnd가 형성된다.

코리네박테리움 글루타미쿰내에서 복제할 수 있는 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면 pEKEx1[참조 문헌: Eikmanns et al,, Gene 102:93-98 (1991)] 또는 pZ8-1(참조 문헌: EP-B- 0 375 889]를 동일한 방법으로 사용할 수 있다.

또한, L-아미노산의 생산에 있어서, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자의 증폭외에, 특정 생합성 경로, 해당과정, 보충대사, 펜토즈 포스페이트 경로 또는 아미노산 이송에 관한 하나 이상의 효소를 증폭시키는 것이 유리할 수 있다.

따라서, 예를 들면, 특히 L-트레오닌의 생산을 위해, 하기 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 특히 과발현시킬 수 있다:

· 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자[참조: Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)] 또는 "피드백 내성" 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^dr대립유전자[참조: Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)],

· 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Eikmanns (1992), et al., Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)],

· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(Paters-Wendisch et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)),

· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

· 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자(유럽 분자생물학 연구소(EMBL, Heidelberg, Germany)의 데이터뱅크의 수탁번호 제AB023377호),

· 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자(JP-A-9-09224661),

· 트레오닌 이송을 암호화하는 thrE 유전자(DE 199 41 478.5; DSM 12840),

· zwa1 유전자(DE 199 59 328.0; DSM 13115), 및

· 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자(DE: 199 41 478.5).

따라서, 예를 들면, 특히 L-리신의 생산을 위해, 하기 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 특히 과발현시킬 수 있다:

· 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(EP-B 0 197 335),

· 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자[참조: Kalinowski et al., (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324],

· 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

· 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

· 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자(JP-A-09-224661),

· 리신 이송을 암호화하는 lysE 유전자(DE-A-195 48 222),

· zwa1 유전자(DE 199 59 328.0; DSM 13115), 및

· 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자(DE: 199 47 791.4).

또한, L-아미노산의 생산을 위하여, gnd 유전자를 증폭시키는 것 이외에, 하기 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 감쇠시키는 것이 유리할 수 있다:

· 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자(DE 199 50 409.1, DSM13047),

· 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자(US 09/396,478; DSM12969),

· 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자(DE 199 51 975.7; DSM13114], 및

· zwa2 유전자(DE: 199 59 327.2; DSM 13113).

또한, L-아미노산의 생산에 있어서, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 과발현시키는 것외에, 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 유리할 수 있다[참조: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라 제조된 미생물을 회분 공정(회분 배양), 또는 유가 배양(유가 공정)이나 반복적 유가 공정(반복 공급 공정)에서 연속적 또는 불연속적으로 배양하여 L-아미노산을 생산할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약이 교과서[참조: Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik {Bioprocess Technology 1. Instruction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)}; Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen {Bioreactors and Peripheral Equipment (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)}]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방식으로 특정 미생물의 요구를 충족시켜야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 관한 내용은 논문집[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology" The American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 포함되어 있다. 당류와 탄수화물(예: 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈), 유지(예: 대두유,해바라기유, 땅콩유 및 코코낫유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(예: 아세트산)이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소를 함유하는 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 요소), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 질소원으로서 사용될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 이수소인산칼륨, 수소인산이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 인 공급원으로서 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속 염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유해야 한다. 최종적으로, 필수 성장 물질, 예를 들면, 아미노산 및 비타민이 위에서 언급된 물질에 추가하여 사용될 수 있다. 게다가, 적합한 전구체가 배양 배지에 가해질 수 있다. 상기 출발 물질은 상기 배지에 단일 배치 형태로 가해지거나, 또는 배양 중에 적당한 방식으로 공급될 수 있다.

배지의 pH를 조절하기 위하여, 염기성 화합물, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 또는 산 화합물, 예를 들면 인산 또는 황산을 적합한 방식으로 사용할 수 있다. 소포제, 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 발포 형성을 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들면, 항생제를 배지에 가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예: 공기)를 배지에 가할 수 있다. 배지의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다.L-아미노산의 최대 수율이 수득될 때까지, 배양을 계속한다. 이러한 목표는 통상적으로 10시간 내지 160시간내에 달성될 수 있다.

L-아미노산의 분석을, 음이온 교환 크로마토그래피 처리 후의 닌하이드린 유도화를 통해 수행[참조: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]하거나, 또는 역상 HPLC를 이용하여 수행한다[참조: Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174].

하기 미생물은 부다페스트 조약에 따라 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 기탁되었다:

ㆍ 에스케리키아 콜라이 K-12 DH5α/pEC-T18mob2 (수탁번호: DSM 13244).

하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명할 것이다. 사용된 분자생물학 기술, 예를 들면, 플라스미드 DNA 분리, 제한 효소 처리, 연결, 에스케리키아 콜라이의 표준 형질전환 등은(달리 명시하지 않는 한) 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratories, USA]에 기술되어 있다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 AS019의 유전자 라이브러리의 작제

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 AS019[참조: Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)]의 DNA 라이브러리를 ё Zap Express^TM시스템[참조: Short et al., (1988) Nucleic Acids Research 16: 7583-7600]를 사용하여 작제한다[참조: O'Donohue, M. (1997), The Clonoing and Molecular Analysis of Four Commom Aromatic Amino acid Biosynthetic Genes from corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway]. ё Zap Express^TM키트를 스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 92037 라 졸라 노쓰토레이 파인즈 로오드 11011 소재]으로 부터 구입하여, 제조자의 지침에 따라 사용한다. AS019-DNA를 제한효소 Sau3A로 분해하고, BamHI 처리되고 탈포스포릴화된 ё Zap Express^TM암즈(arms)에 연결시킨다.

실시예 2

gnd 유전자의 클로닝 및 서열분석

1. gnd 프로브의 작제

gnd 유전자 내부의 방사성 동위원소로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 상기한 AS019 ё Zap Express^TM라이브러리를 탐지한다. gnd 유전자 내부의 축퇴성(degenerate) PCR 프라이머를 사용하여, 올리고뉴클레오티드를 제조한다. gnd DNA 단편의 PCR 증폭을 위해 고안된 축퇴성 뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다:

gnd1: 5' ATG GTK CAC ACY GGY ATY GAR TA 3'

gnd2: 5' RGT CCA YTT RCC RGT RCC YTT 3'

(여기서, R=A+G 이고, Y=C+T 이고, K=T+G 이다)

생성된 PCR 산물의 대략적 크기는 약 252bp 이다.

최적 PCR 조건은 다음과 같이 정해진다:

35 사이클

1분 동안 94℃,

1분 동안 55℃,

30초 동안 72℃,

2.5 내지 3.5mM MgCl₂,

약 100 내지 150ng AS019 게놈성 DNA.

생성된 PCR 산물의 서열 분석을 통해, 당해 산물이 gnd 유전자의 내부 부분임이 확인된다. 서열 분석을 만능(universal) 정방향 및 역방향 프라이머, 및 Pharmacia Biotech(St. Albans, Herts, UK)회사제의 T7 서열분석 키트를 사용하여 수행한다. 당해 PCR 산물의 서열은 서열 1에 제시된다.

2. 클로닝

AS019 ё Zap Express^TM라이브러리의 스크리닝을 ё Zap Express^TM시스템 프로토콜(Stratagene: 미국 캘리포니아주 92037 라 졸라 노쓰 토레이 파인즈 로오드 11011 소재)에 따라 수행한다. 이어서, 서던 블롯 분석을 분리된 클론에 대해 수행한다. DNA의 서던 전달은, 막으로서 Nytran^TM을 사용하는 쉴라이쳐(Schleicher) 및 슈우엘(Schuell) 프로토콜 매뉴얼[참조: "Nytran, Modified Nylon-66 Membrane Filters" (March 1987), Schleicher and Schuell, Dassel, Germany]에 기술되어 있다. 상기한 바와 동일한 프라이머와 최적 PCR 조건을 사용하여, 생성된 이본쇄 DNA 단편을, Amersham Life Science로 부터의 Multiprime^TMDNA 표지화 키트(Amersham Pharmacia Biotech UK limited, LittleChalfont, Buckinghamshire, UK)를 제조자의 지침에 따라 사용하여, α-³²-P-dCTP로 방사선표지화한다. 예비하이브리드화, 하이브리드화, 및 세척 조건은 쉴라이쳐(Schleicher) 및 슈우엘(Schuell) 프로토콜 매뉴얼에 기재되어 있다. 방사선사진술을 AgFa Curix RPIL 필름을 사용하여, 샘부룩(Sambrook) 등의 편람에 개략화된 방법에 따라 수행한다. 이렇게 하여, 몇몇 gnd 클론을 동정한다. 플라스미드 DNA를 클론중 하나로 부터 분리하여, pBGNA(도 3)로 명명하고, 추가 분석을 위해 선택한다.

3. 서열 분석

생거(Snager) 디데옥시 쇄 종결법[참조: Snager et al., Proceeding of the National Academy of Science USA 74, 5463-5467 (1977)]을 사용하여, pBGNA의 클로닝된 삽입체의 서열을 분석한다. 당해 방법을, T7 서열분석 키트 및 α-³⁵S-dCTP [제조원: Pharmacia Biotech; St. Albans, Herts, UK]를 사용하여 적용한다. 샘플을, Pharmacia 클로닝 및 서열분석 지침 매뉴얼("T7 sequencing^TMKit", ref. XY-010-00-19, Pharmacia Biotech, 1994)에 따라, 50mA의 정전류하에, TBE 완충제중의 6% 폴리아크릴아미드/우레아 겔상에서 3 내지 8시간 동안 전기영동시킨다. 내부 gnd PCR 산물의 공지된 서열(서열 1)로 부터 고안된 내부 프라이머를 사용하여 서열 분석을 수행하여, gnd 유전자 서열을 전부 추론할 수 있다.

내부 프라이머의 서열은 다음과 같다:

내부 프라이머 1: 5' GGT GGA TGC TGA AAC CG 3'

내부 프라이머 2: 5' GCT GCA TGC CTG CTG CG 3'

내부 프라이머 3: 5' TTG TTG CTT ACG CAC AG 3'

내부 프라이머 4: 5' TCG TAG GAC TTT GCT GG 3'

이어서, 수득된 서열을 DNA Strider 프로그램 버젼 1.0[참조: Marck(1988), Nucleic Acids Research 16: 1829-1836]을 애플 매킨토시 컴퓨터상에서 이용하여, 분석한다. 이러한 프로그램은 제한부위 사용, 개방형 판독 프레임 분석, 및 코돈 사용 결정과 같은 분석을 가능케한다. 수득된 DNA 서열과 EMBL 및 Genbank 데이타베이스의 DNA 서열간의 조사를 BLAST 프로그램[참조: Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Research 25: 3389-3402]을 이용하여 달성한다. DNA 및 단백질 서열을, Clustal V 및 Clustal W 프로그램[참조: Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 237-244]을 이용하여 정렬시킨다.

이와같이 수득된 서열은 서열 2에 제시되어 있다. 수득된 뉴클레오티드 서열의 분석을 통해, gnd 유전자로서 명명된 1377개 염기쌍의 개방형 판독 프레임이 밝혀졌다. 이는 서열 3에 제시된 459개 아미노산의 단백질을 암호화한다.

실시예 3

셔틀 벡터 pEC-T18mob2의 작제

이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2를 종래의 기술에 따라 작제한다.

당해 벡터는, 복제 효과인자 per[참조: US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532(1997)]를 포함하는 플라스미드 pGA1의 복제 영역 rep; 플라스미드 pAG1[참조: US-A-5,158,891; NCBI(National Center for Biotechnology Information; Bethesda, MD, USA)의 유전자 라이브러리 제품, 수탁 번호 AF121000]의 테트라사이클린 내성-부여 tetA(Z) 유전자; 플라스미드 pMB1의 복제 영역 oriV[참조: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantiative Biology 43, 77-90 (1979)]; lac 프로모터와 다중 클로닝 부위(mcs)를 포함하는 lacZ 유전자 단편[참조: Norrander, Gene 26, 101-106 (1983)]; 및 플라스미드 RP4의 mob 영역[참조: Simon et al., Bio/Technology 1:784-791]을 포함한다.

이와같이 작제된 벡터로 이. 콜라이 균주 DH5α[Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985]를 형질전환시킨다. 이 형질전환 배치를, 5mg/l의 테트라사이클린이 보충된 LB 아가[Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 1988]상에 플레이팅하여, 플라스미드-수반 세포를 선별한다. 플라스미드 DNA를, QIAprep Spin Miniprep Kit[제조원: Qiagen]를 사용하여 형질전환체로 부터 분리하여, 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 제한분석한 후, 아가로즈 겔 전기영동(0.8%)을 수행하여 확인한다.

이러한 플라스미드는 pEC-T18mob2로 명명되며, 도 1에 도시되어 있다. 이는 에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC-T18mob2의 형태로국제기탁기관[DSMZ(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen) = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)]에 수탁번호 DSM 13244로서 기탁되었다.

실시예 4

이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2로의 gnd 유전자의클로닝

pBGNA를 주형으로서 사용하면서, PCR을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 전체 gnd 유전자를 포함하고 상류 및 하류 영역을 플랭킹하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 서열 2로 부터 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:

gnd 정방향 프라이머: 5' ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG 3'

gnd 역방향 프라이머: 5' CAC ACA GGA AAC AGA TAT GAC 3'

PCR 파라미터는 다음과 같다:

35 사이클

6분 동안 95℃,

1분 동안 94℃,

1분 동안 50℃,

45초 동안 72℃,

1mM MgCl₂,

주형으로서의 pBGNA-DNA 약 150 내지 200ng.

수득된 PCR 산물을, 숙주로서 이. 콜라이 JM109 균주[참조: Yanisch-Perron et al., Gene, 33: 103-119 (1985)]를 사용하여, 시판되는 pGEM-T 벡터(판매원: Promega Corp.; pGEM-T Easy Vector System 1, cat. no. A1360, Promega UK, Southampton, UK)내에 클로닝한다. 후속적으로, 완전한 gnd 유전자를 EcoRI 단편 상에서 pGEM T-벡터로부터 분리하고, 이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2(도 1)의 lacZ EcoRI 부위내로 클로닝하여 pECgnd(도 2)로 명명한다. AccI(Boehringer Mannheim GmbH, Germany)을 이용한 제한 효소 분석을 통해, pEC-T18mob2의 lacZα 유전자내의 gnd 유전자의 정확한 배향(즉, lac-프로모터 하류)이 밝혀졌다.

실시예 5

6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제가 증폭된 아미노산 생산자의 제조

실시예 3으로 부터의 플라스미드 pECgnd를 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5399 및 DSM 5714 균주내에서 문헌[참조: Tauch et al., FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)]의 전기천공 방법에 의해 전기천공시킨다. 균주 DSM 5399는 EP-B-0358940에 기술된 트레오닌 생산자이다. 균주 DSM 5714는 EP-B-0435132에 기술된 리신 생산자이다. 형질전환체의 선별을, 카나마이신 25mg/l가보충된 LB 아가[참조: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]상에 전기천공 배치를 플레이팅시켜 수행한다. 균주 DSM5399/pECgnd 및 DSM5714/pECgnd를 이러한 방법으로 제조한다.

실시예 6

트레오닌의 제조

실시예 5에서 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5399/pECgnd를 트레오닌의 생산에 적합한 영양 배지중에서 배양하고, 배양 상청액중의 트레오닌 함량을 측정한다.

이를 위하여, 먼저 당해 균주를 상응하는 항생제를 함유한 아가 플레이트(테트라사이클린 5mg/l를 함유한 뇌-심장 아가)에서 24시간 동안 33℃로 항온처리한다. 이러한 아가 플레이트로 부터 출발하여, 예비배양물을 시딩한다(100ml의 원추형 플라스크당 10ml). 뇌-심장 브로쓰(Merck, Darmstadt, Germany)를 예비배양물을 위한 배지로서 사용한다. 테트라사이클린(5ml/l)를 이러한 배지에 가한다. 예비배양물을 240rpm의 진탕기에서 24 시간 동안 33℃에서 항온처리한다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록, 상기 예비배양물로 부터 주 배양물을 시딩한다. MM-트레오닌 배지를 주 배양에 사용한다.

MM-트레오닌 배지 :

CSL 5g/l

MOPS 20g/l

글로코즈(별도로 오토클레이빙함) 50g/l

염:

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄* 7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂* 2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄* 7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄* H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴(멸균 여과) 0.3mg/ℓ

티아민 * HCl(멸균 여과) 0.2mg/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

암모니아수를 사용하여, CSL(옥수수 침지액), MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 및 염 용액의 pH를 7로 조정하고 오토클레이빙한다. 이어서, 멸균 기질과 비타민 용액, 및 무수-상태로 오토클레이빙한 CaCO₃를 가한다.

배플이 장착된 100ml의 원추형 플라스크당 10ml 용적에서 배양을 수행한다. 테트라사이클린(25mg/ℓ)을 가한다. 33℃ 및 80% 대기 습도하에 배양을 수행한다.

48시간 후, Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여,측정 파장 660nm에서 OD를 측정한다. 생성된 트레오닌의 양을, 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik; Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 이용한 포스트-컬럼 유도화에 의해 측정한다.

실험 결과는 표 1에 제시되어 있다.

균주	OD(660)	L-트레오닌(g/l)
DSM5399/pECgnd	11.9	1.29
DSM5399	11.8	0.33

실시예 7

리신의 제조

실시예 5에서 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5714/pECgnd를 리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양한 다음, 배양 상청액 중의 리신 함량을 측정한다.

이를 위하여, 먼저 당해 균주를 상응하는 항생제를 함유하는 아가 플레이트(테트라사이클린 5mg/ℓ을 함유하는 뇌-심장 아가) 상에서 24시간 동안 33℃로 항온처리한다. 이러한 아가 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩한다(100ml의 원추형 플라스크당 10ml 배지). 완전 배지 CgIII을 예비배양용 배지로서 사용한다.

Cg III 배지:

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-효모 추출물 10g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙함) 2%(w/v)

pH는 7.4로 조정한다.

테트라사이클린(5mg/ℓ)을 이에 가한다. 예비배양물을 240rpm으로 진탕기 에서 24시간 동안 33℃로 항온처리한다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.05가 되도록, 상기 예비배양물로부터 주 배양물을 시딩한다. MM 배지를 주 배양에 사용한다.

MM 배지:

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙함) 50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄

KH₂PO₄25g/ℓ

MgSO₄* 7H₂O 0.1g/ℓ

CaCl₂* 2H₂O 1.0g/ℓ

FeSO₄* 7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄* H₂O 10mg/ℓ

비오틴(멸균 여과) 0.3mg/ℓ

티아민 * HCl(멸균 여과) 0.2mg/ℓ

L-루신(멸균 여과) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

암모니아수를 사용하여, CSL, MOPS 및 염 용액의 pH를 7로 조정한 다음, 오토클레이빙한다. 이어서, 멸균 기질과 비타민 용액, 및 무수-상태로 오토클레이빙한 CaCO₃를 가한다.

배플이 장착된 100ml의 원추형 플라스크당 10ml 용적에서 배양을 수행한다. 테트라사이클린(5mg/ℓ)을 가한다. 33℃ 및 80% 대기 습도하에 배양을 수행한다.

48시간 후, Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여, 측정 파장 660nm에서 OD를 측정한다. 생성된 리신의 양을, 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik; Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 이용한 포스트-컬럼 유도화에 의해 측정한다.

실험 결과는 표 2에 제시되어 있다.

균주	OD(660)	리신 HCl
DSM5715/pECgnd	7.7	14.7
DSM5715	7.1	13.7

실시예 8

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 염색체 DNA를 문헌[참조: Tauch et al., 1995, Plasmid 33: 168-179]에 기술된 바와 같이 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Code no. 27-0913-02)으로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 소하(shrimp) 알칼리 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Code no. 1758250)로 탈포스포릴화시킨다. 코스미드 벡터 SuperCos1(구입원: Stratagene, La Jolla, USA, Product Description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code no. 251301)[참조: Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84, 2160-2164]의 DNA를 제한 효소 XbaI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02)로 절단하고, 마찬가지로 소하 알칼리 포스파타제로 탈포스포릴화시킨다. 이어서, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04)로 절단한다. 이러한 방식으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC 13032 DNA와 혼합하고, 당해 배치를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA ligase, Code no. 27-0870-04)로 처리한다. 이어서, 당해 연결 혼합물을 Gigapack II XL 패킹 추출물(Stratagene, La Jolla, USA, Product Description Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217)을 사용하여 파아지내에 충전시킨다. 이. 콜라이 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic AcidsResearch 16: 1563-1575]를 감염시키기 위해, 세포를 10mM MgSO₄에 침지시키고, 파아지 현탁액의 분액과 혼합한다. 코스미드 라이브러리의 감염 및 역가측정을 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하고, 세포를 100㎍/ℓ의 앰피실린을 함유하는 LB 아가[참조: Lennox, 1955, Virology, 1: 190] 상에 플레이팅한다. 밤새 37℃에서 항온처리한 후, 각각의 재조합체 클론을 선별한다.

실시예 9

poxB 유전자의 분리 및 서열분석

각 콜로니(실시예 8)의 코스미드 DNA를 제조업자의 지침에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Product No. 27-0913-02)로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 소하 알칼리 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250)로 탈포스포릴화시킨다. 겔 전기영동으로 분리한 후, 크기가 1500 내지 2000bp 범위내인 코스미드 단편을 QiaExII Gel 추출 키트(Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany)로 분리한다. 서열분석용 벡터 pZero-1(공급원: Invitrogen; Groningen, Holland, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01)의 DNA를 제한 효소BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product No. 27-0868-04)으로 절단한다. 서열분석용 벡터 pZero-1내로의 코스미드 단편의 연결을 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하는데, 이 경우 DNA 혼합물을 T4 리가제(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 배양한다. 이어서, 당해 연결 혼합물을 전기천공[참조: Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters 123: 343-7]에 의해 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[참조: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649]내에 도입하고, 제오신 50㎍/ℓ을 함유하는 LB 아가[참조: Lennox, 1955, Virology, 1: 190) 상에 플레이팅한다. 재조합체 클론의 플라스미드 제조는 Biorobot 9600(Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 수행한다. 서열 분석은 문헌[참조: Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄 종결법을 문헌[참조: Zimmermann et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 1067]에 기술된 바와 같이 변형시켜 수행한다. "RR dRhodamin 터미네이터 사이클 서열분석 키트"(구입원: PE Applied Biosystems; Product No. 403044, Weiterstadt, Germany)를 사용한다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열형성 반응의 분석을, "ABI Prism 377" 서열분석기(구입원: PE Applied Biosystems; Weiterstadt, Germany)를 사용하여 "Rotiphoresis NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드" 겔(29:1)(Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany)에서 수행한다.

이어서, 수득된 미처리 서열 데이터를 스타덴(Staden) 프로그램 패키지[참조: 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231] 버젼 97-0을 사용하여 처리한다. pZero1 유도체의 각각의 서열을 연속 콘티그(contig)로 어셈블링한다. 컴퓨터-지원된 암호화 영역 분석을 XNIP 프로그램[참조: Staden, 1986, Nucleic Acids Research. 14: 217-231]을 사용하여 수행한다. 추가 분석을, "국립 생명공학 정보 센터"(NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 비-중복성 데이터뱅크에 대해 "BLAST 서치 프로그램"[참조: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research. 25: 3389-3402]을 사용하여 수행한다.

수득된 뉴클레오티드 서열은 서열 4에 제시되어 있다. 당해 뉴클레오티드의 분석을 통해, poxB 유전자라 불리는 1737개 염기쌍의 개방형 판독 프레임이 밝혀졌다. poxB 유전자는 579개 아미노산의 폴리펩티드(서열 5)를 암호화한다.

실시예 10

poxB 유전자의 통합 돌연변이유발용 통합 벡터의 제조

균주 ATCC 13032로 부터, 염색체 DNA를 문헌[Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]의 방법에 의해 분리한다. 실시예 9로 부터 코리네박테리움 글루타미쿰에 대한 공지된 poxB 유전자의 서열을 기준으로 하여, 아래의 올리고뉴클레오티드를 중합효소 연쇄 반응을 위해 선택한다:

poxBint1:

5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3'

poxBint2:

5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'

제시된 프라이머를 MWG Biotech(Ebersberg, Germany)에 의해 합성하고, PCR 반응을, Pwo-중합효소[제조원: Boehringer]을 이용하여 문헌[Innis et al., PCR protocols. A guide to methods and application, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 중합효소 연쇄 반응을 이용하여, 크기가 약 0.9kb인 DNA 단편을 분리하는데, 이는 poxB 유전자의 내부 단편을 수반하고 서열 6에 제시되어 있다.

증폭된 DNA 단편을 TOPO TA 클로닝 키트[제조원: Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA, USA; 카달로그 번호 K4500-1]을 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO[참조: Mead et al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663]에 연결시킨다. 이어서, 이. 콜라이 Stamm DH5α를 연결 배치[Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985]를 사용하여 전기천공시킨다. 카나마이신 25mg/l이 보충된 LB 아가[Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 1989]상에 형질전환 배치를 플레이팅하여, 플라스미드-수반 세포를 선별한다. 플라스미드 DNA를, QIApre Spin Miniprep Kit[제조원 Qiagen]를 사용하여 형질전환체로 부터 분리하고, 제한효소 EcoRI으로 제한분석한 후, 아가로즈 겔 전기영동(0.8%)을 수행하여 확인한다. 이러한 플라스미드는 pCR2.1poxBint로 명명된다(도 4).

플라스미드 pCR2.1poxBint는 균주 에스체리키아 콜라이 DH5α/pCR2.1poxBint의 형태로 부다페스트 조약에 따라 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 국제기탁기관[DSMZ(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen) = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 수탁번호 DSM 13114로서 기탁되었다.

실시예 11

리신 생산자 DSM 5715에서 poxB 유전자의 통합 돌연변이유발법

실시예 10에 언급된 벡터 pCR2.1poxBint를 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715내에서 문헌[Tauch et al., FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)]의 전기천공 방법에 의해 전기천공시킨다. 균주 DSM 5715는 AEC-내성 리신 생산자이다. 벡터 pCR2.1poxBint는 DSM 5715내에서 독립적으로 복제할 수 없으며, DSM 5715의 염색체속에 통합된 경우에만 당해 세포내에서 유지될 수 있다. 염색체속으로 통합된 pCR2.1poxBint를 함유한 클론의 선별을, 카나마이신 15mg/l가 보충된 LB 아가[참조: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]상에 전기천공 배치를 플레이팅시켜 수행한다. 통합을 검출하기 위해, poxBint 단편을 문헌["Dig System Users Guide for Filter Hybridization" of Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)]의 방법에 의해 Dig 하이브리드화 키트[제조원: Boehringer]를 사용하여 하이브리드화시킨다. 잠재적 통합인자의 염색체 DNA를 문헌[Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]의 방법에 의해 분리하고, 각각의 경우에 제한효소 SalI, SacI 및 HindIII로 절단한다. 생성된 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 분리하고, Dig 하이브리드화 키트[제조원: Boehringer]를 사용하여 68℃에서 표지화시킨다. 실시예 9에 언급된 플라스미드 pCR2.1poxBint를 DSM 5175의 염색체내의 poxB 유전자에 삽입시킨다. 당해 균주를 DSM5715::pCR2.1poxBint로 명명한다.

실시예 12

리신의 제조에 있어서, gnd 유전자의 과발현과 동시에 poxB 유전자의 제거에 의한 효과

12.1 균주 DSM5715::pCR.2.1poxBint/pECgnd의 제조

균주 DSM5715::pCR.2.1poxBint를 문헌[Liebl et al., FEMS Microbiological Letters, 53:299-303 (1989)]의 전기천공 방법을 사용하여 플라스미드 pECgnd로 형질전환시킨다. 형질전환체의 선별을, 테트라사이클린 5mg/l 및 카나마이신 25mg/l가 보충된, 뇌-심장 주입 브로쓰 18.5g/l, 0.5M 소르비톨, 박토-트립톤 5g/l, 박토-효모 추출물 2.5g/l, NaCl 5g/l 및 박토-아가 18g/l를 포함하는 LBHIS 아가상에서 수행한다. 2일간 33℃에서 항온처리한다.

각각의 경우에, 플라스미드 DNA를 형질전환체로 부터 통상의 방법[참조: Peter-Wendisch et al.m 1998, Microbiology 144, 915-927]에 의해 분리하고, 제한 엔도뉴클리아제 AccI로 절단한 후, 이어서 당해 플라스미드를 아가로즈 겔 전기영동으로 확인한다. 이러한 방법으로 수득된 균주는 DSM5715::pCR.2.1poxBint/ pECgnd으로 명명된다.

12.2 L-리신의 제조

실시예 12.1에서 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715::pCR.2.1poxBint/pECgnd을 리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양한 다음, 배양 상청액 중의 리신 함량을 측정한다.

이를 위하여, 먼저 당해 균주를 상응하는 항생제를 함유하는 아가 플레이트(테트라사이클린 5mg/l 및 카나마이신 25mg/l을 함유하는 뇌-심장 아가)상에서 24시간 동안 33℃에서 항온처리한다. 비교 균주의 배양물을 항생제에 대한 이들의 내성에 따라 보충한다. 이러한 아가 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩한다(100ml의 원추형 플라스크당 10ml 배지). 완전 배지 CgIII을 예비배양용 배지로서 사용한다.

Cg III 배지:

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-효모 추출물 10g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙함) 2%(w/v)

pH는 7.4로 조정한다.

테트라마이신(5mg/l) 및 카나마이신(25mg/ℓ)을 이에 가한다. 예비배양물을240rpm의 진탕기에서 16시간 동안 33℃로 항온처리한다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록, 상기 예비배양물로부터 주 배양물을 시딩한다. MM 배지를 주 배양에 사용한다.

MM 배지:

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙함) 58g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄* 7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂* 2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄* 7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄* H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴(멸균 여과) 0.3mg/ℓ

티아민 * HCl(멸균 여과) 0.2mg/ℓ

L-루신(멸균 여과) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

배플이 장착된 100ml의 원추형 플라스크당 10ml 용적에서 배양을 수행한다. 테트라사이클린 5mg/l 및 카나마이신 25mg/ℓ을 가한다. 33℃ 및 80% 대기 습도하에 배양을 수행한다.

72시간 후, Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여, 측정 파장 660nm에서 OD를 측정한다. 생성된 리신의 양을, 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik; Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 이용한 포스트-컬럼 유도화에 의해 측정한다.

실험 결과는 표 3에 제시되어 있다.

균주	OD	L-리신HCl(g/ℓ)
DSM5715	10.8	16.0
DSM5715/pECgnd	7.6	16.5
DSM5715::pCR2.1poxBint	7.1	16.7
DSM5715::pCR2.1poxBint/pECgnd	7.2	17.1

Claims

a) 적어도 gnd 유전자가 증폭된, 목적하는 L-아미노산 생산-박테리아를 발효시키는 단계,

b) 배지 또는 박테리아 세포내에서 당해 L-아미노산을 농축시키는 단계, 및

c) 생산된 L-아미노산을 분리하는 단계를 수행함을 특징으로 하여, 코리네형 박테리아의 발효에 의해 L-아미노산을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 또 다른 유전자가 추가로 증폭된, 특히 과발현된 박테리아를 사용함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, L-트레오닌, L-리신, L-이소루신 또는 L-트립토판을 생산하는 코리네형 박테리아를 사용함을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, L-리신을 생산하는 코리네형 박테리아를 사용함을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,

5.1 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

5.2 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

5.3 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

5.4 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

5.5 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자,

5.6 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자,

5.7 리신 이송을 암호화하는 lysE 유전자,

5.8 zwa1 유전자, 및

5.9 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를, 특히 L-리신을 이미 생산하는 코리네형 미생물내에서 동시에 증폭, 특히 과발현시킴을 특징으로 하여, L- 리신을 발효적으로 생산하는 방법.
제2항에 있어서,

6.1 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자 또는 "피드백 내성" 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^dr대립유전자,

6.2 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

6.3 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

6.4 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자,

6.5 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자,

6.6 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자,

6.7 트레오닌 이송을 암호화하는 thrE 유전자,

6.8 zwa1 유전자, 및

6.9 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를, 특히 L-트레오닌을 이미 생산하는 코리네형 미생물내에서 동시에 증폭, 특히 과발현시킴을 특징으로 하여, L-트레오닌을 발효적으로 생산하는 방법.
제2항에 있어서,

7.1 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자,

7.2 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자,

7.3 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자, 및

7.4 zwa2 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠된 박테리아를 발효시킴을 특징으로 하여, L-아미노산, 특히 L-리신, 또는 L-트레오닌을 생산하는 방법.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 당해 유전자 또는 뉴클레오티드를 수반하는 플라스미드 벡터로 미생물을 형질전환시켜 이들 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 복사체 수를 증가시킴으로써, 증폭을 달성하는 방법.
도 1에 도시된, 이. 콜라이 K-12 DH5α중에 DSM 13244로 명명되어 기탁되는 플라스미드 벡터 pEC-T18mob2.
gnd 유전자를 추가로 함유하는, 제9항에 따른 플라스미드 벡터를 도입하여 형질전환된, 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 미생물.