MXPA01011643A - Proceso para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos con amplificacion del gen gnd. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso para la preparacion de L-aminoacidos mediante fermentacion de la bacteria corineforme, la cual comprende llevar a cabo los siguientes pasos: a) fermentacion de la bacteria que produce el L-aminoacido deseado en la cual, al menos, se amplifica el gen gnd, b) concentracion del L-aminoacido en el medio o en las celulas de la bacteria y c) aislamiento del L-aminoacido producido.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACIÓN FERMENTATIVA DE L-AMINOACIDOS CON AMPLIFICACIÓN DEL GEN GND DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un proceso para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, en particular L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-triptofano, usando la bacteria corineforme en la cual al menos, el gen gnd es amplificado.

Técnica Anterior Los L-aminoácidos son usados en la nutrición animal, en medicina humana y en la industria farmacéutica. Se sabe que los aminoácidos son preparados por la fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a su mayor importancia, el trabajo está siendo constantemente comprometido para mejorar los procesos de preparación. Los mejoramientos a los procesos pueden referirse a las medidas de fermentación, tal como por ejemplo, agitación y suministro de oxigeno, o la composición del medio nutriente, tal como por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o la elaboración de la forma del producto mediante por ejemplo, la cromatografía de intercambio REF: 134123 iónico, o las propiedades de rendimiento intrínseco del mismo microorganismo. Los métodos de mutagénesis, selección y selección mutante, se usan para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos. Las cepas las cuales son resistentes a los antimetabolitos, tal como por ejemplo el ácido a-amino-ß-hidroxivalérico {AHV) análogo de treonina, o son auxotróficas por los metabolitos de importancia regulatoria y producen L-aminoácidos, tal como por ejemplo treonina, se obtienen en esta manera. Los métodos de la técnica de ADN recombinante también han sido empleados por algunos años para el mejoramiento de cepas de Corynebacterium glutamicum, las cuales producen L-aminoácidos.

Objeto de la Invención Los inventores tienen el objeto de proporcionar procesos mejorados para la preparación fermentativa de L-aminoácidos con la bacteria corineforme.

Descripción de la invención Los L-aminoácidos son usados en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria de productos alimenticios y especialmente en la nutrición animal. Hay por lo tanto, un interés general en proporcionar nuevos procesos mejorados para la preparación de aminoácidos. La invención proporciona uno proceso para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, en particular L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-triptofano, usando la bacteria corineforme en la cual la secuencia de nucleótido, la cual codifica para la enzima 6-fosfogluconato deshidrogenasa (EC número 1.1.1.44) (gen gnd) es amplificada, en particular sobre expresada. Las cepas empleadas preferiblemente ya producen L-aminoácidos antes de la ampliación del gen gnd. Las modalidades preferidas se encuentran en las reivindicaciones . El término "amplificación" a este respecto, describe el incremento en la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo, el cual es codificado por el ADN correspondiente, por ejemplo incrementando el número de copias del gen o genes, que usan un promotor potente o que usan un gen el cual es codificado por una enzima correspondiente, que tiene una actividad alta, y opcionalmente combinando estas mediciones. Los microorganismos los cuales proporciona la presente invención, pueden preparar L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa o a partir de glicerol y etanol. Son representativos de la bacteria corineforme, en particular del género Corynebacterium. Del género Corynebacterium, pueden ser mencionadas en particular las especies Corynebacterium glutamicum, las cuales son conocidas entre los especialistas por su habilidad para producir L-aminoácidos . Las cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular de las especies Corynebacterium glutamicum, son, por ejemplo, las cepas de tipo silvestre conocidas. Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 - Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y mutantes que producen L-aminoácidos preparados a partir de estos, tal como, por ejemplo, las cepas que producen L-treonina Corynebacterium glutamicum ATCC21649 Brevibacterium flavum BB69 Brevibacterium flavum DS 5399 Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269 Brevibacterium lactofermentum TBB-10 y tal como, por ejemplo, las cepas que producen L-isoleucina Corynebacterium glutamicum ATCC 14309 Corynebacterium glutamicum ATCC 14310 Corynebacterium glutamicum ATCC 14311 Corynebacterium glutamicum ATCC 15168 Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 y tal como, por ejemplo, las cepas que producen L-triptofano Corynebacterium glutamicum ATCC21850 Corynebacterium glutamicum KY9218 (pK 9901) y tal como, por ejemplo, las cepas que producen L-lisina Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 - Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum DSM5715 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DSM12866. * . Se as encontrado que la bacteria corineforme produce L-aminoácidos, en particular L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-triptofano, de una manera mejorada después de la sobre-expresión del gen gnd el cual codifica para la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (EC número 1.1.1.44). El gen gnd que codifica para la enzima 6-fosfogluconato deshidrogenasa, el cual cataliza la descarboxilación oxidativa del ácido 6-fosfoglucónico a 5-fosfato de ribulosa. La secuencia de nucleótido del gen gnd es descrita en la JP-A-9-224662. El gen gnd descrito en el texto de referencia mencionado, se usa de acuerdo a la invención para la primera vez. Pueden además ser usados los alelos del gen gnd, los cuales resultan de la degeneración del código genético o debido a las mutaciones sentido de la función neutral. Para lograr una amplificación (por ejemplo, sobre-expresión) , se incrementa el número de copias de los genes correspondientes, o se mutan el promotor y la región de regulación o el sitio enlazante de la ribosoma corriente arriba del gen estructural. Los casetes de expresión los cuales son incorporados corriente arriba del gen estructural, actúan de la misma forma. Mediante promotores inducibles, es posible adicionalmente, incrementar la expresión en el curso de la formación del L-aminoácido fermentativo. La expresión es del mismo modo, mejorada por medidas para prolongar la vida del m-ARN. Además, la actividad enzimática es también incrementada, previniendo la degradación de la proteina enzimática. Los constructos del gen o genes están ya sea presentes aqui en los plásmidos con un número variante de copias, o se integran y amplifican en el cromosoma. Alternativamente, una sobre-expresión de los genes en cuestión pueden además, lograrse cambiando la composición del medio y el procedimiento de cultivo. Las instrucciones en este contexto, se pueden encontrar por el experto, inter alia, en Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1998)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Especificación de Patente Europea EPS 0 472 869, en la Patente Estadounidense 4,601,893 en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la especificación Laid-Open Japonesa JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology y Bioengineering 58, 191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de gética y biología molecular. Por medio del Ejemplo, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa fue sobre-expresada con la ayuda de un plásmido. El vector de introducción pEC-T18mob2 de E. coli-C. glutamicum mostrado en la Figura 1 se usó para esto. Después de la incorporación del gen gnd en el sitio de desdoblamiento EcoRI de pEC-Tl8mob2, se formó el plásmido pECgnd mostrado en la Figura 2. Otros vectores de plásmidos los cuales son capaces de replicación en la C. glutamicum, tal como por ejemplo, pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991) o pZ8-l (EP-B-0 375 889), pueden ser usados en la misma forma. Además, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, amplificar una o más enzimas de la trayectoria de la biosintesis particular, de glicólisis, de anaplerosis, de la trayectoria de fosfato pentosa o de la exportación de aminoácidos, además de la amplificación del gen gnd, el cual codifica para la 6-fosfogluconato deshidrogenasa . Asi, por ejemplo, en particular para la preparación de L-treonina, uno o más genes se seleccionan a partir del grupo que consiste de: • el gen hom el cual es codificado por homoserina deshidrogenasa (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) o el alelo homdr el cual es codificado por una homoserina deshidrogenasa de . "retroalimentación resistente" (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991), • el gen gap el cual es codificado por 3-fosfato deshidrogenasa de gliceraldehido (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 1974: 6076-6086 (1992)), • el gen pyc el cual es codificado por piruvato carboxilasa (Peters-Wendisch et al., Microbiology 144: 915-927 (1998) ) , • el 'gen mqo el cual es codificado por malato: oxireductasa de quinona (Molenaar et al., European Journal of Bichemistry 254, 395-403 (1998)), • el gen tkt el cual es codificado por transquetolasa (número de acceso AB023377 del banco de datos de Laboratorios de Biología Molecular Europeos (EMBL, Heidelberg, Alemania) ) , • el gen zwf el cual es codificado por el 6-fosfato deshidrogenasa (JP-A-09224661) , • el gen thrE el cual es codificado por la exportación de treonina (DE 199 41 478.5; DSM 12840), • el gen z al (DE 199 59 328.8; DSM 13115), • el gen eno el cual es codificado por enolasa (DE: 199 41 478.5) pueden ser amplificados, en particular sobre expresados, al mismo tiempo. Asi, por ejemplo, en particular para la preparación de L-lisina, uno o más genes se seleccionan del grupo que consiste de • el gen dapA el cual es codificado por dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335), • el gen lysC el cual es codificado por una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación (Kalinowski et al. (1990), Molecular and. General Genetics 224: 317-324), • el gen gap el cual es codificado por 3-fosfato deshidrogenasa de gliceraldehido (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086), • el gen pyc el cual es codificado por piruvato carboxilasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086, • el gen mqo el cual es codificado por malato-oxireductasa de quinona (Molennar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), • el gen tkt el cual es codificado por transquetolasa (número de acceso AB023377 del banco de datos de Laboratorios de Biología Molecular Europeos (EMBL, Heidelberg, Alemania) ) , • el gen zwf el cual es codificado por 6-fosfato deshidrogenasa (JP-A-09224661) , • el gen lysE el cual es codificado por la exportación de lisina (DE-A-195 48 222), • el gen z al (DE 199 59 328.0; DSM 13115), • el gen eno el cual es codificado por enolasa (DE 199 47 791.4) pueden ser amplificados, en particular sobre expresados, al mismo tiempo. > Además puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácido al mismo tiempo, atenuar uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste de • el gen pck el cual es codificado por piruvato carboxicinasa de fosfoenol (DE 199 50 409.1; DSM 13047), • el gen pgi el cual es codificado por 6-fosfato isomerasa de glucosa (US 09/396,478, DSM 12969), • el gen poxB el cual es codificado por piruvato oxidasa (DE 199 51 975.7; DSM 13114) , • el gen z a2 (DE: 199 59 327.2; DSM 13113) además a la amplificación del gen gnd. Además para la sobre expresión de la 6-fosfogluconato dehidrogenasa, puede sin embargo, ser ventajoso par la producción de L-aminoácidos, eliminar las reacciones colaterales indeseables (Nakayama: "Breending of Amino Acid Producing Micro-organism", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982) . Los microorganismos preparados de conformidad con la invención pueden ser cultivados continuamente o discontinuamente en los procesos de lotes (cultivo en lotes) , o en la alimentación de lotes (proceso de alimentación) , o proceso de alimentación de lotes repetidos (proceso de alimentación repetitiva) para el propósito de producción de L-aminoácido . Una resumen de métodos de cultivo conocidos se describen en el libro de texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de cultivo a ser usado debe sugerir los requerimientos de los microorganismos particulares de una manera adecuada. Las descripciones de los medios de cultivo para varios microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Los azúcares y carbohidratos, tal como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y grasa de coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmitico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tal como por ejemplo glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ,ejemplo ácido acético, pueden ser usados como la fuente de carbono. Esas substancias pueden ser usadas individualmente o como una mezcla. Los compuestos que contienen nitrógeno orgánico, tales como peptonas, extractos de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor extraído de maiz, harina de soya y urea, o compuestos inorgáni-cos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pueden ser usados como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógenos pueden ser usadas individualmente o como una mezcla. El fosfato dihidrógeno de potasio o fosfato hidrógeno dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio, pueden ser usadas como la fuente de fósforo. El medio de cultivo podria además comprender sales de metales, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, las cuales son necesarias para el crecimiento. Finalmente, las substancias esenciales del crecimiento, tales como los aminoácidos y vitaminas, pueden ser empleadas además de las substancias mencionadas anteriormente. Los precursores adecuados pueden sin embargo, ser agregados al medio de cultivo. Las substancias iniciadoras mencionadas pueden ser agregadas al cultivo en la forma de un único lote, o puede ser alimentadas durante el qultivo de una manera adecuada. Los compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco, o compuestos de ácidos, tal como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, pueden ser empleados de una manera adecuada para controlar el pH. Las antiespumas, tal como por ejemplo esteres de poliglicol de ácidos grasos, pueden ser empleadas para controlar el desarrollo de la espuma. Las substancias adecuadas que tienen una acción selectiva, por ejemplo antibióticos, pueden ser agregadas al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener las condiciones aeróbicas, oxigeno .o mezclas de gases que contienen oxigeno, tal como por ejemplo aire, se introducen en el cultivo. La temperatura del cultivo es usualmente de 20 °C a 45 °C, y preferiblemente de 25°C a 40°C. La cultivación se continúa hasta que se ha formado un máximo de L-aminoácidos. Este objetivo es usualmente alcanzado dentro de las 10 horas a 160 horas. El análisis de los L-aminoácidos pueden llevarse a cabo por cromatografía de intercambio de aniones con derivación de ninhidrina subsecuente, como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)), o puede tomar lugar por HPLC de fase inversa como se describe por Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:. 1167-1174) . Los siguientes microorganismos han sido depositados en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania) de conformidad con el Tratado de Budapest: Escherichia coli K-12 DH5a/pEC-T18mob2 como DSM 13244 Se adjuntan las siguientes figuras: • Figura 1: Mapa del plásmido pEC-T18mob2 Figura 2: Mapa del plásmido pECgnd • Figura 3: Mapa del plásmido pBGNA • Figura 4: Mapa del plásmido pCR2. IpoxBint Los números de pares base declarados, son valores aproximados obtenidos en el contexto de la reproductibilidad. Las abreviaciones usadas tienen los siguientes significados : Re Figura 1 : Tet: Gen resistente para la tetraciclina oriV: Origen de la replicación codificada del plásmido de E. coli RP4mob: región mob para la movilización del plásmido rep:' Origen de replicación del plásmido codificado de pGAl del plásmido de C. glutamicum per: Gen para controlar el número de copias de pGAl lacZ-alfa fragmento del gen lacZa (N-termino) del gen ß- galactosidasa Re Figura 2: Tet: gen resistente para la tetraciclina rep: Origen de replicación del plásmido codificado de pGAl del plásmido de C. glutamicum per: Gen para controlar el número de copias de pGAl lacZ Residuos de clonación del fragmento del gen lacza de pEC-T18mob2 gnd: Gen 6-fosfogluconato deshidrogenasa Re Figura 3 LacP: Promotor de operon de lactosa de E. coli CMV: Promotor de citomegalovirus ColEl: Origen de la replicación del plásmido ColEl TkpolyA: Sitio de poliadenilación Kan r : Gen resistente a la canamicina SV40ori: Origen de la replicación del virus 40 de Simio gnd: gen 6-fosfogluconato deshidrogenasa Re Figura 4 : ColEl ori: Origen de la replicación del plásmido ColEl lacZ.: Residuos de la clonación del fragmento del gen lacZa fl ori: Origen de replicación del fago fl KmR: Resistencia a la camicina ApR: Resistencia a la ampicilina poxBint: Fragmento interno al gen poxB Sin embargo, se han usado las siguientes abreviaciones : Accl Sitio de desdoblamiento de la enzima de restricción Accl BamHI : Sitio de desdoblamiento de la enzima de restricción BamHI EcoRI: Sitio de desdoblamiento de la enzima de restricción EcoRI HindIII Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción HindIII Kpnl: Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción Kpnl PstI: Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción PstI Pvul: Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción Pvul Salí: Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción Salí Sacl: Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción Sacl SamI Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción Smal Sphl Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción Sphl Xbal: Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción Xbal Xhol: Sitio de desdoblamiento de la enzima restricción Xhol Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustrarán además, esta invención. Las técnicas de biología molecular, por ejemplo aislamiento del ADN del plásmido, tratamiento de enzima de restricción, ligaciones, transformaciones estándares de Escherichia coli etc. usadas son, (a menos que se declare de otro .modo), descritas por Sambrook et al., (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA) .

Ejemplo 1 Construcción de una biblioteca de gen de la cepa de Corynebacterium glutamicum AS019 Se construyó una biblioteca de ADN de la cepa AS019 de Corynebacterium glutamicum (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)), usando un sistema é Zap Express™, (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600), como se describe por 0' Donohue (O'Donohue, M. (1997). -Clonación y Análisis Molecular para Cuatro Genes Biosintéticos de Aminoácidos Aromáticos Comunes a partir de Corynebacterium glutamicum. Ph. D. Thesis, National University of Ireland, Galway) . El equipo é Zap Express™, se adquirió de Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines, Rd., La Jolla, California 92037), y se usó de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se digirió AS19-ADN con la enzima de restricción Sau3A y se ligó a BamHI tratado y desfosforilado con, equipo é Zap Express™.

Ejemplo 2 Clonación y Secuenciamiento del gen gnd 1. Construcción de una sonda de gnd Se usó un radioetiquetador de oligonucleótido, interno al gen gnd a la sonda de la biblioteca AS019 é Zap Express™ descrita anteriormente. Se produjo el oligonucleótido usando cebadores internos PCR degenerados al gen gnd. Los cebadores de nucleótido degenerados designados para la amplificación PCR de los fragmentos de ADN fueron los siguientes: gndl: 5' ATG GTK CAC ACY GGY ATY GAR TA 3' gnd2: 5' RGT CCA YYT RCC RGT RCC YYT 3' con R=A+G; Y=C+T; K=T+G. El tamaño estimado del producto PCR resultante fue de aproximadamente 252 pares bases. Las condiciones de PCR óptimas se determinaron por ser como. siguen: 35 ciclos 94 °C por 1 minuto 55°C por 1 minuto 72°C por 30 segundos 2.5 - 3.5 mM MgCl2 100 - 150 ng AS019 de ADN genómico El análisis de secuencia del producto PCR resultante confirmado el producto para ser una porción interna del gen gnd. El análisis de secuencia se llevó a cabo usando los cebadores delantero e inverso universal, y el equipo de secuenciamiento T7 de Pharmacia Biotech, (St. Albans, Herts, UK) . La secuencia del producto PCR se muestra en la SEC IN No.1. 2. Clonación La selección de la biblioteca AS019 é Zap Express™ se llevó a cabo del protocolo del sistema é Zap Express™, (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037) . Se llevó a cabo entonces el análisis del manchado Southern, en clones aislados. La transferencia Southern del ADN fue como se describe en el manual de protocolos Schleicher y Schuell empleando Nytran™ como membrana ("Nytran, Modified Nylon-66 Membrane Filtres" (Marzo 1987), Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania). Los fragmentos de ADN de doble hebra, generados usando los mismos cebadores y condiciones PCR óptimas como se describe anteriormente, se radioetiquetaron con a-32P-dCTP usando el ) equipo de etiquetación de ADN Multiprime™ de Amersham Life Science (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) de conformidad a las instrucciones del fabricante. La prehibridización, la hibridización y las condiciones de lavado fueron como se describe en el manual de protocolos Schleicher y Schuell. Se llevo a cabo la autoradiografia de acuerdo al procedimiento resumido en la guia de Sambrook et al. usando película AGFA Curix RPIL. Asi varios clones de gnd se identificaron. El ADN del plásmido se aisló de uno de los clones, designado pBGNA (Figura 3) y seleccionado para análisis adicionales. 3. Secuenciamiento Se usó para la secuencia del inserto clonado de pBGNA, el método de terminación de cadena didesoxi de Sanger de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467 (1977) . El método se aplico usando el equipo de secuenciamiento T7 y a-35S-dCTP de Pharmacia Biotech (St. Abans, Herts, UK) . Las muestras se sometieron a electroforesis por 3-8 horas en geles de poliacrilamida al 6%/urea en amortiguador TBE a una corriente constante de 50 mA, de conformidad a las instrucciones del manual de secuenciamiento y clonación de Pharmacia ("t7 Sequencing™ Kit", ref .XY-010-00-19, Pharmacia Biotech, 1994) . Se llevó a cabo el análisis de secuencia usando cebadores internos, designados de la secuencia conocida del producto de la PCR del gnd interno (SEC ID No.l), dejando a la secuencia del gen gnd completa ser deducida. La secuencia de los cebadores internos es como sigue : Cebador interno 1: GGT GGA TGC TGA AAC CG Cebador Interno 2 GCT GCA TGC CTG CTG CG Cebador Interno 3 5' TTG. TTG CTT ACG CAC AG Cebador Interno 4: 5' TCG TAG GAC TTT GCT GG 3' La secuencia obtenida entonces se analizó usando el programa- Strider de ADN, (Marck, (1988). Nucleic Acids Research 16: 1829-1836), versión 1.0 en una computadora Apple Macintosh. Este programa es permitido para los análisis tales como el empleo del sitio de restricción, análisis de estructura lectora abierta y determinación del empleo de codón. Las búsquedas entre la secuencia de ADN obtenida y aquellas en las base de datos EMBL y Genbank, se lograron usando el programa BLAST, (Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402). Las secuencias de proteina y ADN se alinearon usando los programas Clustal V y Clustal W (Higgins y Sharp, 1988 Gene 73: 237-244). La secuencia asi obtenida es mostrada en la SEC ID No.2. El análisis de la secuencia de nucleótido obtenida reveló una estructura lectora abierta de 1377 pares bases, los cuales se designaron como el gen gnd. Codifica para una proteina de 459 aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 3: Ejemplo 3 Preparación de un vector de introducción pEC-T18mob2 El vector de integración pEC-T18mob2 de E. coli -C. glutamicum se construyó de conformidad a la técnica anterior. - El vector contiene la región de replicación rep del plásmido pGAl, que incluye la replicación del efector de per (US-A-5, 175, 108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), el gen tatA(Z) que imparte resistencia a la tetraciclina del plásmido pAGl (US-A- 5,158,891; entrada a la biblioteca del gen en el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD, USA) con número de acceso AF121000) , la región de replicación oriV del plásmido pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979) ) , el fragmento del gen lacZ que incluye el promotor lac y un sitio de clonación múltiple (mes) (Norrander et al. Gene 26, 101-106 (1983)) y la región mob del plásmido RP4 (Simón et al., (1983) Bio/Technology 1:784-791). El vector construido se transformó en la cepa DH5a de E. coli (Hanahan, In: DNA cloning. A Practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). La selección del las células que llevan el plásmido se hizo al colocar en placas el lote de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 1989), el cual ha sido suplementado con 5 mg/l de tetraciclina. El ADN del plásmido se aisló de un transformante con la ayuda del equipo QIAprep Spin Miniprep de Qiagen y se verificó por restricción con la enzima de restricción EcoRI y HindIII subsecuente a la electroforesis en gel de agarosa (0.8%). El plásmido se llamó pEC-T18mob2 y se muestra en la Figura 1. Es depositado en la forma de la cepa DH5a/pEC-T18mob2 de la cepa de Escherichia coli K-12 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunscheweig, Alemania) como DSM 13244.

Ejemplo 4 Clonación del gen gnd en el vector de integración pEC-T18mob2 de E. coli - C. glutamicum -La PCR se usó para amplificar fragmentos de ADN que contiene el gen gnd completo de C. glutamicum, regiones de flanqueo corriente arriba y corriente abajo, usando pBGNA como, plantilla. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando cebadores oligonucleotidos designados de la SEC ID No. 2. Los cebadores usados fueron: Cebador gnd delantero: 5' ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG 3' Cebador gnd inverso: 5' CAC ACÁ GGA AAC AGA TAT GAC 3' Los parámetros PCR fueron los siguientes: _ 35 ciclos 95°C por 6 minuto 94 °C por 1 minuto 50 °C por 1 minuto 72°C por 45 segundos .1 mM de MgCl2 aproximadamente 150-200 ng de pBGNA-ADN como plantilla . El producto de PCR obtenido fue clonado en un vector pGEM-T comercialmente disponible, adquirido de Promega Corp., (pGEM-T Easy Vector System 1, cat. No. A1360, Promega UK, Southampton) , usando la cepa E. coli JM109, (Yanish-Perron et al. Gene, 33: 103-119 (1985)), como un hospedero. El gen gnd * ompleto fue subsecuentemente aislado del vector T pGEM en un fragmento EcoRI y clonado en el sitio lacZ EcoRI del vector de integración pEC-T18mob2 de E. coli - C. glutamicum (Figura 1) , y designado pECgnd (Figura 2) . El análisis de la enzima de restricción con Accl (Boehringer Mannheim GMBH, Alemania) reveló la correcta orientación (es decir, el promotor lac corriente abajo) del gen gnd en el gen lacZcc de pEC-T18mob2.

Ejemplo 5 • Preparación de productores aminoácido con 6-fosfogluconato deshidrogenasa amplificada El plásmido pECgnd del Ejemplo 3 se sometió a electroforesis por el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) en las cepas de Corynebacterium glutamicum DSM 5399 y DSM 5714. La cepa de DSM 5399 es productora de treonina descrita en EP-B-0358940. La cepa de DSM 5714 es productora de lisina descrita en EP-B-0435132. La selección de transformantes se llevó a cabo por la colocación en placas del lote de electroporación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), el cual ha sido suplementado con 25 mg/l de canamicina. Las cepas de DSM5399/pECgnd y DSM5714/pECgnd se formaron de esta manera.

Ejemplo 6 Preparación de treonina La cepa C. glutamicum DSM5399/pECgnd obtenida en el Ejemplo 5, se cultivó en un medio nutriente adecuado para la producción de treonina y se determinó el contenido de treonina en el cultivo sobrenadante. Para esto, la cepa se incubó primero en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l) ) por 24 horas a 33°C.

Partiendo de este cultivo de placa de agar, un precultivo se sembró (medio de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml) . El caldo de cerebro-corazón (Merck, Darmstadt, Alemania) se usó como el medio para el precultivo. Se agregó tetraciclina (5 mg/l) a este medio. El precultivo se incubo por 24 horas a 33°C a 240 rpm en una maquina agitadora. Un cultivo principal se sembró a partir de este precultivo tal que el OD inicial (669 nm) del cultivo principal fue 0.1. El medio MM-treonina se usó para el cultivo principal. Medio MM-treonina CLS 5 g/1 MOPS 20 g/1 Glucosa (sometido a autoclave de manera separada) 50 g/1 Sales : (NH4)>2S04 25 g/1 KH2P04 0.1 g/1 MgS0 * 7 H20 1.0 g/1 CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS0 * 7 H20 10 mg/l MnS0 * H20 5.0 mg/l Biotina (estéril filtrada) 0.3 mg/l Tiamina * HCl (estéril filtrada) 0.2 mg/l CaC03 25 g/1 El CSL (alcohol extraído de maiz) , MOPS (ácido fónico) y la solución de sal se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso y se sometieron a autoclave. Entonces se agregaron el substrato estéril y las soluciones de vitamina, asi como también el CaC03 sometido a autoclave en el estado seco. Se llevo a cabo la cultivación en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con deflector. Se agregó tetraciclina (5 mg/l) . La cultivación se llevó a cabo a 33°C y a 80% de humedad atmosférica. Después de 48 horas, el OD se determinó a una medición de longitud de onda de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GMBH, Munich) . La concentración de treonina formada se determinó con un analizador de aminoácido desde un Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) , por cromatografía de intercambio iónico y derivación post-columna con detección de ninhidrina. El resultado del experimento se muestra en la Tabla 1. Tabla 1 Ejemplo 7 Preparación de lisina La cepa C. glutamicum DSM5714/pECgnd obtenida en el Ejemplo 5, se cultivó en un medio nutriente adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina en el cultivo sobrenadante. Para esto, la cepa se incubó primero en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l)) por 24 horas a 33°C. Partiendo de este cultivo de placa de agar, un precultivo se sembró (medio de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml) . Se usó el medio completo CglII como un medio para el precultivo. Medio Cg III NaCl 2.5 g/1 Bacto-Peptona 10 g/1 Bacto-Extracto de levadura 10 g/1 Glucosa (sometido a autoclave de manera separada) 2% (p/v) El pH fue llevado a 7.4. Se agregó a este medio tetraciclina (5 mg/l) . El precultivo fue incubado por 24 horas a 33°C a 240 rpm en una maquina agitadora. Un cultivo principal fue sembrado a partir de este precultivo tal que el OD inicial (660 nm) del cultivo principal fue 0.05. Se usó el medio MM para el cultivo principal. Medio MM CLS (licor extraído de maiz) 5 g/1 MOPS (ácido morfolinpropansulfónico) 20 g/1 Glucosa (sometido a autoclave de manera separada) 50 g/1 (NH )2S04 KH2P04 25 g/1 MgS04 * 7 H20 0.1 g/1 CaCl2 * 2 H20 1.0 g/1 FeS04 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 10 mg/l Biotina (estéril filtrada) 0.3 mg/l Tiamina * HCl (estéril filtrada) 0.2 mg/l L-leucina (estéril filtrada) 0.1 g/1 CaC03 25 g/1 El CSL, MOPS y la solución de sal se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso y se sometieron a autoclave. Entonces se agregaron el substrato estéril y las soluciones de vitamina, asi como también el CaC03 sometido a autoclave en el estado seco. Se llevo a cabo la cultivación en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con deflector. Se agregó tetraciclina (5 mg/l). La cultivación se llevó a cabo a 33°C y a 80% de humedad atmosférica. Después de 48 horas, el OD se determinó a una medición de longitud de onda de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La concentración de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácido desde un Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) , por cromatografía de intercambio iónico y derivación postcolumna con detección de ninhidrina. El resultado del experimento se muestra en la Tabla Tabla 2 Ejemplo 8 Preparación de una biblioteca de gen cósmido genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ADN cromosomal de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, se aisló como se describe por Tauch et al., (1995, Plasmid 33:168-179), y parcialmente se desdobló con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Sau3AI, Código no. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfosforilaron con fosfatasa alcalina de salmón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Código No. 1758250) . El ADN del vector cósmido SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla, USA, Descripción del Producto SuperCosl Equipo de Vector Cósmido, Código No. 251301) se desdobló con la enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Freburg, Alemania, Descripción del Producto Xbal, Código No. 27-0948-02) y del mismo modo, se desfosforiló con fosfatasa alcalina de salmón. El ADN cósmido entonces se desdobló con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHI, Código No. 274-0868-04) . El ADN cósmido tratado de esta manera se mezcló con el ADN ATCC13032 tratado y el lote se trató con ligasa de ADN T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Ligasa-ADN-T4, Código no. 27-0870-04) . La mezcla de ligación entonces se empacó en fagos con la ayuda de Extractos de Paquetes Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Descripción del Producto Extracto de Paquetes Gigapack II XL, Código No. 200217) . Para la infección de la cepa NM554 de E. coli (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) , las células entonces se recuperaron en 10 mM de MgS04, y se mezclaron con una alícuota de la suspensión del fago. La infección y la titulación de la biblioteca del cósmido se llevaron a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , las células se colocaron en placas en agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + ampicilina 100 µg/ml. Después de la incubación durante la noche a 37 °C, se seleccionaron los clones individuales recombinantes.

Ejemplo 9 Aislamiento y Secuenciamiento del gen poxB El ADN cósmido de una colonia individual (Ejemplo 8) . Se aisló con el Equipo Miniprep Spin de Qiaprep (Producto No. 27106, Quiagen, Hilden, Alemania), de conformidad con las instrucciones del fabricante y parcialmente se desdobló con la enzima de restricción Sau3AI, (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Sau3AI, Producto No. 27-0913-02) .Los fragmentos de ADN se desfosforilaron con fosfatasa alcalina de salmón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Producto No. 1758250). Después de la separación por electroforesis en gel, los fragmentos cósmidos en el rango de tamaño de 1500 hasta 2000 pb, se aislaron con el Equipo de Extracción en Gel de QuiaExII (Producto No. 20021, Quiagen, Hilden, Alemania) . El ADN del vector de secuenciamiento pZero-1, obtenido de Invitrogen (Groningen, Holanda, Descripción del Producto Zero del Equipo de Clonación Antecedente, Producto No. K2500-01) , se desdobló con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHI, Producto No. 27-0868-04). La ligación de los fragmentos cósmidos en el vector de secuenciamiento pZero-1 se llevó a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , la mezcla de ADN se incubó durante la noche con ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) . Esta Mezcla de ligación entonces se sometió a electroporación (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa DH5aMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) y se colocaron en placas en agar LB (Lennox, 1995, Virology, 1:190) con 50 µg/ml de zeocina. La preparación del plásmido de los clones recombinantes se llevó a cabo con Biorobot 9600 (Producto No. 900200, Quiagen, Hilden, Alemania) . El secuenciamiento se llevó a cabo por el método de detención de cadena didesoxi de Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) con modificaciones de conformidad con Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se usó el "Equipo de Secuenciamiento de Ciclo Terminador dRhodamina RR", de PE Applied Biosystems (Producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania) . La separación por electroforesis en gel y el análisis de la reacción de secuenciamiento, se llevaron a cabo en gel de "Rotiforesis NF Acrilamida/Bisacrilamida" (29:1) (Producto No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI Prisma 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Los datos de la secuencia sin elaborar obtenidos entonces, se procesaron usando un paquete de programa Staden (1986, Nucleic Acids, Research, 14:217-231) versión 97-0.

Las secuencias individuales de los derivados pZerol se ensamblaron en un contigo continuo. El análisis de la región codificante asistida por computadora se preparó con el Programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) . Los análisis adicionales se llevaron a cabo con el "programa de búsqueda BLAST" (Altshul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402), contra el banco de datos no redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) . La secuencia de nucleótido resultante se muestra en la SEC ID No.4. El análisis de la secuencia de nucleótido mostró una estructura lectora abierta de 1737 pares base, la cual se llamó la secuencia poxB. El gen poxB codifica a un polipéptido de 579 aminoácidos (SEC ID No.5).

Ejemplo 10 Preparación de un vector de integración para la mutagénesis de integración del gen poxB - De la cepa ATCC 13032, el ADN cromosomal se aisló por el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140:1817-1828 (1994)). Con base a la secuencia del gen poxB conocido por C. glutamicum del Ejemplo 9, se seleccionaron los siguientes oligonucleótidos por la reacción en cadena de la polimerasa: poxBintl :. 5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3' poxBint2 : 5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3' Los cebadores mostraron ser sintetizados por Biotech MWG (Ebersberg, Alemania) , y la reacción en PCR se llevó a cabo por el método PCR estándar de Innis et al. (Protocolos de PCR. Una guia para métodos y aplicaciones, 1990, Academic Press) con polimerasa Pwo de Boehringer. Con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, se aisló un fragmento de ADN aproximadamente 0.9 kb en tamaño, esto llevando a cabo un fragmento interno del gen poxB y siendo mostrado en la SEC ID No.6. El fragmento de ADN amplificado se ligó con el Equipo de clonación TOPO TA de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Número de Catálogo K4500-01) en el vector pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991) Bio/Technology 9:657-663) . La Stamm de E. coli DH5a se sometió entonces a electropsración con el lote de ligación (Hanahan, In: Clonación de ADN. Un procedimiento práctico. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) . La selección para las células que llevan los plásmido se hizo colocando en placas el lote de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2da. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) , el cual se ha suplementado con 25 mg/ml de canamicina. El ADN del plásmido se aisló de un transformante con la ayuda del Equipo Miniprep Spin de QIAprep de Quiagen y se verificó por restricción con la enzima de restricción EcoRI y electroforesis en gel de agarosa subsecuente (0.8%). El plásmido se llamó pCR2. IpoxBint (Figura 4). El plásmido pCR2. IpoxBint se ha depositado en la forma de cepa DH5a/pCR2. IpoxBint de Escherichia coli como DSM 13114 en Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ= Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania) , de conformidad con el Tratado de Budapest.

Ejemplo 11 Mutagénesis de integración del gen poxB en el DSM 5715 productor de lisina El vector pCR2. IpoxBint mencionado en el Ejemplo 10 se sometió a electroporación por el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715. La cepa DSM 5715 es un productor de lisina resistente a AEC. El vector pCR2. IpoxBint no puede replicarse independientemente en DSM5715 y es retenido en la célula solamente si se ha integrado en el cromosoma de DSM 5715. La selección de clones con pCR2. IpoxBint integrados dentro del cromosoma, se llevó a cabo colocando en placas el lote de electroporación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory Manual. 2da Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y), el cual se ha suplementado con 15 mg/l de canamicina. Para la detección de la integración, el fragmento poxBint se etiquetó con el equipo de hibridación Dig de Boehringer por el método de "La Guia de Usuarios del Sistema DIG para la Hibridación del filtro" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) . El ADN cromosomal de un integrante potencial se aisló por el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) y en cada caso se desdobló con las enzimas de restricción Salí, Sacl y HindIII.- Los fragmentos formados se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se hibridizaron a 68 °C con el equipo de hibridación DIG de Boehringer. El plásmido pCR2. IpoxBint mencionado en el Ejemplo 9 se ha insertado en el croptosoma de DSM57L5 dentro del gen poxB cromosomal. La cepa se llamó DSM5715 : :pCR2. IpoxBint .

Ejemplo 12 Efecto de la sobre-expresión del gen gnd con eliminación simultánea del gen poxB en la preparación de lisina. 12.1 Preparación de la cepa DSM5715: :pCR2. IpoxBint/pECgnd La cepa DSM5715 : :pCR2. IpoxBint se transformó con el plásmido pECgnd usando el método de electroporación descrito por Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989) ) . La selección de los transformantes tomó lugar en agar> LBHIS que comprende 18.5 g/1 de caldo de infusión de cerebro-corazón, 0.5 M de sorbitol, 5 g/1 de Bacto-triptona, 2.5 g/1 de Bacto-Extracto de Levadura, 5 g/1 de NaCl y 18 g/1 de Bacto-agar, el cual se ha suplementado con 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina. La incubación se llevó a cabo por 2 dias a 33 °C. - El ADN del plásmido se aisló en cada caso de un transformante por métodos convencionales (Peters-Wendish et al., 1998, Microbiology 144, 915-927), desdoblado con la endonucleasa de restricción Accl, y el plásmido se verificó por electroforesis en gel de agarosa subsecuente. La cepa obtenida en esta forma se llamó DSM5715: : pCR2. IpoxBint/pECgnd. 12. Preparación de L-lisina La cepa C. glutamicum DSM5715 : :pcR2. IpoxBint/pECgnd obtenida en el Ejemplo 12.1, se cultivó en un medio nutriente adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina el cultivo sobrenadante. Para esto, la cepa se incubó primero en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l) ) y canamicina (25 mg/l) ) por 24 horas a 33 °C. Los cultivos de las cepas de comparación se suplementaron de conformidad a su resistencia a los antibióticos. Partiendo de este cultivo de placa de agar, se sembró un precultivo (10 ml de medio en un matraz cónico de 100 ml) . El medio completo CglII se usó como el medio para el precultivo. Medio CglII NaCl 2.5 g/1 Bacto-Peptona 10 g/1 Bacto-Extracto de Levadura 10 g/1 Glucosa (sometida a autoclave separadamente) 2% (p/v) El pH se llevó a pH 7.4 La tetraciclina (5 mg/l) y canamicina (25 mg/l) se agregaron a esta. El precultivo se incubó por 16 horas a 33 °C a 240 rpm en una maquina sacudidora. Se sembró un cultivo principal de este precultivo, de manera tal que el OD inicial (660nm) del cultivo principal fue 0.1. El medio MM se usó para el cultivo principal. Medio MM CLS (licor extraído de maiz) 5 g/i MOPS (ácido morfolinopropansulfónico) 20 g/i Glucosa (sometido a autoclave de manera separada) 58 g/i (NH4),2S0 25 g/i KH2P0 0. i g/i MgS04 * 7 H20 1. 0 g/l CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS04 * 7 H20 10 mg/l MnS0 * H20 5. 0 mg/l Biotina {estéril filtrada) 0. 3 mg/l Tiamina * HCl (estéril filtrada) 0. 2 mg/l L-leucina (estéril filtrada) 0. 1 mg/l CaC03 25 g/i El CSL, MOPS y la solución de sal se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso y se sometieron a autoclave. Entonces se agregaron el substrato estéril -y las soluciones de vitamina, asi como también el CaC03 sometido a autoclave en el estado seco. Se llevo a cabo la cultivación en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con deflector. Se agregó tetraciclina (5 mg/l) y canamicina (25 mg/l) . La cultivación se llevó a cabo a 33 °C y a 80% de humedad atmosférica. Después de 72 horas, el OD se determinó a una medición de longitud de onda de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GMBH, Munich) . La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácido desde un Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) , por cromatografía de intercambio iónico y derivación postcolumna con detección de ninhidrina. El resultado del experimento se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3 10 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. 15 • 20 LISTADO DE SECUENCIA <110> National University of Ireland. Galway Degußsa-Hü s AG <120> Proceso para la preparación fermentativa de L-aminoácidos con amplificación del gen gnd <130> 990229 BT <140> <141> <160> 6 <170> Pa entln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 252 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicu <400> 1 atggtccaca acggcatcga gtacgccgac atgcaggtca tcggcgaggc ataccacctt 60 ctgecctaeg cagcaggcat gcagccagct gaaatcgctg aggttttcaa ggaatggaac 120 gcaggcgacc tggattccta cctcatcgaa atcaccgcag aggttctctc ccaggtggat 180 gctgaaaccg gcaagccact aatcgacgtc atcgttgacg ctgcaggtca gaagggcacc 240 ggcaagtgga ct 252 <210> 2 <211> 2335 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicuia <220> <221> CDS <222> (474) ..(1850) <223> gnd <400> 2 ttgttcggcc acgatgacac cggagctcac agcagaaatg aagtcggtgt tgttgttgat 60 gccgacgacc atttttccag gggcggaaat catgctggcg actgatccag tggattcggc 120 gatggcggcg tagacaccac cgttgaccaa gcccaccact tgcaggtgct tggatgccac 160 gtgaagttcg ctgaccaccc ggccgggctc gatggtggtg tagcgcagcc ccagattgcg 240 gtcgaggcca taattggcgt tgttgagtgc ttcaagttcg tctgtggtta aagctctggt 300 ggcggcaagt tctgcaagcg aaagcagatc ttggggttga tcatcgcggg aagtcataat 360 taattactct agtcggccta aaatggttgg attttcacct cctgtgacct ggtaaaatcg 420 ccactacccc caaatggtca caccttttag gccgattttg ctgacaccgg gct atg 476 Met 1 ccg tca agt acg atc aat aac atg act aat gga gat aat etc gca cag 524 Pro Ser Ser Thr lie Asn Asp Met Thr Asn Gly Aep Asn Leu Ala Gln . - '•" 5 10 15 ate ggc gtt gta ggc cta gca gta atg ggc tca aac etc gcc cgc aac 572 He Gly Val Val Gly Leu Ala Val Met Gly Ser Asn Leu Ala Arg Asn 20 25 30 ttc gcc cgc aac ggc aac act gtc gct gtc tac aac cgc age act gac 620 Phe Ala Arg Asn Gly Asn Thr Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr Asp 35 40 45 aaa acc gac aag etc atc gcc gat cae ggc tec gaa ggc aac ttc atc 668 Lys Thr Asp Lys Leu He Ala Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe He 50 55 60 65 cct tet gca acc gtc gaa gag ttc gta gca tec ctg gaa aag cea cgc 716 Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro Arg 70 75 80 cgc gec atc atc atg gtt cag gct ggt aac gcc acc gac gca gtc 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atc 1100 Val Lys Met Val His Asn Gly He Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val He 195 200 205 ggc gag gca tac cae ctt ctg ccc tac gca gca ggc atg cag cea gct 1148 Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu Pro Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro Ala 210 215 220 225 gaa ate gct gag gtt ttc aag gaa tgg aac gca ggc gac ctg gat tec 1196 Glu He Ala Glu Val Phe Lys Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp Ser 230 235 240 tac etc atc gaa atc acc gca gag gtt etc tec cag gtg gat gct gaa 1244 Tyr Leu He Glu He Thr Ala Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala Glu 245 250 255 acc ggc aag cea cta atc gac gtc atc gtt gac gct gca ggt cag aag 1292 Thr Gly Lys Pro Leu He Asp Val He Val Asp Ala Ala Gly Gln Lys 260 265 270 ggc acc ggc aag tgg act gtc aag gct gct ctt gat ctg ggt att gct 1340 Gly Thr Gly Lys Trp Thr Val Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly He Ala -275 280 285 acc acc ggc atc ggc gaa cgt gtt ttc gca cgt gca etc tec ggc gca 1388 Thr Thr Gly He Gly Glu Arg Val Phe Ala Arg Ala Leu Ser Gly Ala 290 295 300 305 acc age cag cgc gct gc gca cag ggc aac cta cct gca ggt gtc etc 1436 Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val Leu 310 315 320 acc gat etg gaa gca ctt ggc gtg gac aag gca cag ttc gtc gaa gga 1484 Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Lys Ala Gln Phe Val Glu Gly 325 330 335 ctt cgc cgt gca ctg tac gca tec aag ctt gtt gct tac gca cag ggc 1532 Leu Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln Gly 340 345 350 ttc gac gag atc aag gct ggc tec gac gag aac aac tgg gac gtt gac 1580 Phe Asp Glu He Lys Ala Gly Ser Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val Asp 355 360 365 cct cgc gac etc gct acc atc tgg cgc ggc ggc tgc atc att cgc gct 1628 Pro Arg Asp Leu Ala Thr He Trp Arg Gly Gly Cys He He Arg Ala 370 375- 380 385 aag ttc etc aac cgc atc gtc gaa gca tac gat gca aac gct gaa ctt 1676 Lys Phe Leu Asn Arg He Val Glu Ala Tyr .Asp Ala Asn Ala Glu Leu 390 395 400 gag tec ctg ctg etc gat cct tac ttc aag age gag etc ggc gac etc 4724 Glu Ser Leu -Leu Leu Asp Pro Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp Leu 405 410 415 ate gat tca tgg cgt cgc gtg att gtc acc gcc acc cag ctt ggc ctg 1772 He Asp Ser Trp Arg Arg Val He Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly Leu 420 425 430 cea atc cea gtg ttc gct tec tec ctg tec tac tac gac age ctg cgt 1820 Pro He Pro Val Phe Ala Ser Ser Leu Ser Tyr Tyr Ásp Ser Leu Arg 435 440 445 gca gag cgt ctg cea gca gcc ctg atc cae tagtgtcgac ctgcaggcgc 1870 Ala Glu Arg Leu Pro Ala Ala Leu He His 450 455 gegageteca gcttttgttc cctttagtga gggttaattt egagettggc gtaatcaagg 1930 tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccaeacaa tatacgagcc 1990 ggaagtataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac agtaattgcg 2050 gctagcggat ctgacggttc actaaaccag ctctgcttat atagaectec caccgtacac 2110 gcctaccgcc catttgcgtc aatggggcgg agttgttacg acattttgga aagtcccgtt 2170 gattttggtg ccaaaacaaa ctcccattga egtcaatggg gtggagaett ggaaatcccc 2230 gtgagtcaaa ccgctatcca cgcccattga tgtactgcca aaaccgcatc accatggtaa 2290 tagcgatgac taatacgtag atgtactgcc aagtaggaaa gtccc 2335 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> Corynebaeterluin glutamicum <400> 3 Met Pro Ser Ser Thr He Asn Asn Met Thr Asn Gly Asp Asn Leu Ala 1 5 10 15 Gln He Gly Val Val Gly Leu Ala Val Met Gly Ser Asn Leu Ala Arg 20 25 30 Asn Phe Ala Arg Asn Gly Asn Thr Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Asp Lys Thr Asp Lys Leu He Ala Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe 50 55 60 He Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro 65 70 75 80 Arg Arg Ala He He Met Val Gln Ala Gly Asn Ala Thr Asp Ala Val 85 90 95 He Asn Gln Leu Ala Asp Ala Met ?sp Glu Gly Asp He He He Asp 100 105 110 Gly Gly Asn Ala Leu Tyr' Thr Asp Thr He Arg Arg Glu Lys Glu He 115 120 125 Ser Ala Arg Gly Leu His Phe Val Gly Ala Gly He Ser Gly Gly Glu -130 135 140 Glu Gly Ala Leu Asn Gly Pro Ser He Met Pro Gly Gly Pro Ala Lys 145 150 155 160 Ser Tyr Glu Ser Leu Gly Pro Leu Leu Glu Ser He Ala Ala Asn Val 165 170 175 Asp Gly Thr Pro Cys Val Thr His He Gly Pro Asp Gly Ala Gly His 180 185 190 Phe Val Lys Met Val His Asn Gly He Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val 195 200 205 He Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu Pro Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro 210 215 220 Ala Glu He Ala Glu Val Phe Lys Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp 225 230 235 240 Ser Tyr Leu He Glu He Thr Ala Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala 245 250 255 Glu Thr Gly Lys Pro Leu He Asp Val He Val Asp Ala Ala Gly Gln 260 265 270 Lys Gly Thr Gly Lys Trp Thr Val Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly He 275 280 285 Ala Thr Thr Gly He Gly Glu Arg Val Phß Ala Arg Ala Leu Ser Gly 290 295 300 Ala Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val 305 310 315 320 Leu Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Lys Ala Gln Phe Val Glu 325 330 335 Gly Leu Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln 340 345 350 Gly Phe Asp Glu He Lys Ala Gly Ser Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val 355 360 365 Asp Pro Arg Asp Leu Ala Thr He Trp Arg Gly Gly Cys He He Arg 370 375 380 Ala Lys Phe Leu Asn Arg He Val Glu Ala Tyr Asp Ala Asn Ala Glu 385 390 395 400 Leu Glu Ser Leu Leu Leu Asp Pro Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp 405 410 415 Leu He Asp Ser Trp Arg Arg Val He Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly 420 425 430 Leu Pro He Pro Val Phe Ala Ser Ser Leu Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu 435 440 445 Arg Ala Glu Arg Leu Pro Ala Ala Leu He His 450 455 <210> 4 <211> 2160 <212> ADN <213> Corynebacteriu-a glutamicujn <220> <221> CDS <222> (327).. (2063) 223> poxB <400> 4 ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggceagtttt 60 cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt 120 ttggtttega cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa teccaaaagt 180 gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg 240 aagcgtggca acaactggaa tttaagagea caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac 300 aatagecata acgttgagga gttcag atg gca cae age tac gca gaa caá tta 353 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu 1 5 att gac act ttg gaa gct caá ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg 401 He Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg He Tyr Gly Leu Val 10 15 20 25 ggt gac age ctt aat ccg ate gtg gát gct gtc cgc caá tca gat att 449 Gly Asp Ser Leu Asn Pro He Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp He 30 35 40 gag tgg gtg cae gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt 497 Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phß Ala Ala Gly 45 50 55 gcg gaa tcg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tet tgt 545 Ala Glu Ser Leu He Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys 60 65 70 ggt ect gga aac acá cae ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga 593 Gly Pro Gly -Asn Thr His Leu He Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg 75 80 85 aat ggt gcg aag gtg ttg gcc atc gct age eat att ccg agt gcc cag 641 Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala He Ala Ser His He Pro Ser Ala Gln 90 95 100 105 att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag 689 He Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu He Leu Phe Lys 110 115 120 gaa tgc tet ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa 737 Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Mßt Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu 125 130 135 cgc att ttg cat cae gcg att cag tec acc atg gcg ggt aaa ggt gtg 785 Arg He Leu His His Ala He G n Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val 140 145 150 tcg gtg gta gtg att cct ggt gat atc gct aag gaa gac gca ggt gac 833 Ser Val Val Val He Pro Gly Asp He Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp 155 -.60 165 ggt act tat tec aat tec act att tet tet ggc act cct gtg gtg ttc 881 Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr He Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe 170 175 180 185 ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct 929 Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala He Asn Asn Ala 190 195 200 aag tet gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg 977 Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala 205 210 215 cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg 1025 Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys He Lys Ser Pro He Gly His Ala 220 225 230 ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc 1073 Leu Gly Gly Lys Gln Tyr He Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly 235 240 245 atg tet ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tec aat gag 1121 Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu 250 255 260 265 gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tet gat ttc 1169 Ala Asp Leu Leu He Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe 270 275 280 ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cae att 1217 Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp He Asn Gly Ala His He 285 290 295 ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg aec ggt gat gtt gct gca 1265 Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala 300 305 310 acá atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa acá gat cgt tec 1313 Thr He Glu Asn He Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser 315 320 325 ttc ctt gat cgg atg etc aag gca cae gag cgt aag ttg age tcg gtg 1361 Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val 330 335 340 345 gta gag acg tac acá cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cae cct 1409 Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro He His Pro 350 355 360 gaa tac gtt gcc tet att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg 1457 Glu Tyr Val Ala Ser He Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val 365 370 37S ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc 1505 Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr He 380 385 390 gag aat ccg gag gga acg. cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cae ggc 1553 Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly 395 400 405 ,acg atg gct aat gcg ttg ect cat gcg att ggt gcg caá agt gtt gat 1601 Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala -He Gly Ala Gln Ser Val Asp 410 415 ' 420 425 cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg 1649 Arg Asn Arg Gln Val He Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met 430 435 440 ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cae caá ctt ccg ctg aag 1697 Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys 445 450 455 gct gtg gtg ttt aac aac agt tet ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg 1745 Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val . Lys Leu Glu Met 460 465 470 etc gtg gag gga cag cea gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat 1793 Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn 475 480 485 ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc 1841 Phe Ala Glu He Ala Ala Ala Ala Gly He Lys Ser Val Arg He Thr 490 495 500 505 gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gea tat cct 1889 Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Al-a Glu Ala Leu Ala Tyr Pro 510 515 520 gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc 1937 Gly Pro Val Leu He Asp He Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser He 525 530 535 cea cea acc atc acg tgg gaa cag gtc acg gga ttc age aag gcg gcc 1985 Pro Pro Thr He Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala 540 545 550 acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc 2033 Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met He Asp Leu Ala 555 560 565 cgt tcg aac ata agg aat att ect act cea tgatgattga tacacctgct 2083 Arg Ser Asn He Arg ?sn He Pro Thr Pro 570 575 gttetcattg accgcgagcg cttaactgec aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143 gcccatgaga ttgccct 2160 <210> 5 <211> 579 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicu-n <400> 5 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu He Asp Thr Leu Glu Ala Gln 1 5 10 15 Gly Val Lys Arg He Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro He 20 25 30 Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp He Glu Trp Val His Val Arg ?sn 35 40 45 Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu He Thr Gly 50 55 60 Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu 65 70 75 60 He Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala 85 90 95 He Ala Ser His He Pro Ser Ala Gln He Gly Ser Thr Phe Phe Gln 100 105 110 Glu Thr His Pro Glu He Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu 115 120 125 Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg He Leu His His Ala He 130 135 140 Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val He Pro Gly 145 155 155 160 Asp He Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr 165 170 175 He Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala 180 185 190 Ala Leu Val Glu Ala He Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys 195 200 205 Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala G n Val Leu Glu Leu Ala Glu 210 215 220 Lys He Lys Ser Pro He Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr He 225 230 235 240 Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr 245 250 255 Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu He Leu Leu 260 265 270 Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala 275 280 285 Gln Val Asp He Asn Gly Ala His He Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys 290 295 300 Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr He Glu Asn He Leu Pro 305 310 315 320 His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Sex Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys 325 330 335 Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn 340 345 350 Val Glu Lys His Val Pro He Sis Pro Glu Tyr Val Ala Ser He Leu 355 360 365 Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met 370 375 380 Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr He Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg 385 390 395 400 ?sp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro 405 410 415 His Ala He Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val He Ala 420 425 430 Met Cys Gly ?sp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr 435 440 445 Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser 450 455 460 Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu He Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Gly He Lys Ser Val Arg He Thr Asp Pro Lys Lyß Val Arg Glu 500 505 510 G n Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu He Asp He 515 520 525 Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser He Pro Pro Thr He Thr Trp Glu 530 535 540 Gln Val Met Gly Phe Ser Lyß Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly 545 5S0 555 560 Gly Val Gly Ala Met He Asp Leu Ala Arg Ser Asn He Arg Asn He 565 570 575 Pro Thr Pro <210> 6 <211> 875 <212> ADN <213> Corynebacteriu gluta-nicu-n <400> 6 tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc 60 accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac 120 gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg 180 gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg 240 ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt 300 10 aaatcaecga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt 360 gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg 420 gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac 480 gttgcccagg tgga atcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg 540 gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca 600 gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagtt?ag ctcggtggta 660 gagaegtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct 720 attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat 780 gtgtggcatg cgaggtacat cgagaa ccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc 840 cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc 875 15 • 20

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para la preparación de L-aminoácidos por fermentación de la bacteria corineforme, caracterizado porque comprende, llevar a cabo los siguientes pasos: a) fermentación de la bacteria que produce L- aminoácidos deseado en la cual al menos, se amplifica el gen gnd, b) concentración de L-aminoácido en el medio o en las células de la bacteria y c) aislamiento del L-aminoácido producido.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea la bacteria en la cual los genes adicionales de la trayectoria de la biosíntesis del L-aminoácido deseado son adicionalmente amplificados, en particular sobre-expresados.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se usa la bacteria corineforme la cual prepara L-treonina, L-lisina, L-isoleucina o L-triptofano.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque se usa la b-acteria corineforme la cual prepara L-lisina.

5. Un proceso para la preparación fermentativa de L-lisina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque en " los microorganismos corineformes en los cuáles en particular ya se produce L-lisina, uno o más genes se seleccionan del grupo que consiste de _ 5.1 el gen dapA el cual es codificado por dihidrodipicolinato sintasa, 5.2 el gen lysC el cual es codificado por una aspartato cinasá resistente a la retroalimentación, 5.3 el gen gap el cual es codificado por 3-fosfato deshidrogenasa de glicerolaldehido, 5.4 el gen pyc el cual es codificado por piruvato carboxilasa, 5.5 el gen tkt el cual es codificado por transquetolasa 5.6 el gen zwf el cual es codificado por 6-fosfato deshidrogenasa de glucosa, 5.7 el gen lysE el cual es codificado por la exportación de lisina, 5.8 el gen z al, 5.9 el gen eno el cual es codificado por enolasa, es o son amplificados, en particular sobre-expresados al mismo tiempo.

6. Un Proceso para la preparación fermentativa L-treonina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque en los microorganismos corineformes los cuales en particular ya 'producen L-treonina, uno o más genes se seleccionan del grupo que consiste de 6.1 el gen hom el cual es codificado por homoserma deshidrogenasa, o el alelo homdr el cual es codificado por una homoserina deshidrogenasa de * retroalimentación resistente" , 6.2 el gen gap el cual es codificado por 3-fosfato deshidrogenasa de glicerolaldehido, > 6.3 el gen pyc el ' cual es codificado por piruvato carboxilasa, 6.4 el gen mqo el cual es codificado por malato : oxireductasa de quinona, 6.5 el gen tkt el cual es codificado por transquetolasa, 6.6 el gen zwf el cual es codificado por 6-fosfato deshidrogenasa de glucosa/ , f 6.7 el gen thrE el cual es codificado por la exportación de -• - treonina, el gen 2-wal»' **• 6.9 el gen eno el cual es codificado por enolasa es o son amplificados, en particular sobre expresados, al mismo tiempo.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado para la preparación de L-aminoácidos, en particular L-lisina o L-'treonina, bacteria en la cual uno o más genes se seleccionan del grupo que consiste de, 7,1 el gen pck el cual es codificado por piruvato carboxicinasa de fosfoenol, 7.2 el gen pgi el cual es codificado por 6-fosfato isomerasa de glucosa, 7.3 el gen poxB el cual es codificado por piruvato oxidasa, 7.4 el gen z a2, > es o estén atenuados al' mismo tiempo, son fermentados.

8. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque para lograr la amplificación, el número de copias de los genes o secuencias de nucleótidos se incrementa por la transformación de los microorganismos con vectores plásmidos los cuales llevan estos genes o secuencias de nucleótidos.

9. El vector plásmido pEC-T18mob2 depositado bajo la designación DSM13244 en E. coli K-12 DH5a, mostrado en la figura 1.

10. Un microorganismo copneforme, en particular del género Corynebacterium, caracterizado porque se transforma por la introducción del vector plásmido de conformidad con la reivindicación 9, el cual adicionalmente contiene el gen gnd.