DE60019280T2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren unter verwendung eines amplifizierten gnd-gens - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren unter verwendung eines amplifizierten gnd-gens Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin und L-Tryptophan, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen wenigstens das gnd-Gen amplifiziert wird.
  • Stand der Technik
  • L-Aminosäuren finden in der Tierernährung, in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie Verwendung.
  • Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Aufgrund ihrer großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellungsverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z.B Rühren und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z.B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch beispielsweise Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
  • Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Dabei werden Stämme erhalten, die resistent gegen Antimetabolite, wie z.B. das Threonin-Analog α-Amino-β-hydroxyvalerinsäure (AHV), oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die L-Aminosäuren produzieren, wie z.B. Threonin.
  • Seit einigen Jahren werden auch Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäuren-produzierenden Stämmen von Corynebacterium glutamicum angewendet.
  • Die WO 01/07626 beschreibt die Produktion von L-Aminosäuren, umfassend das Kultivieren einer veränderten Bakterienzelle (I) mit einer erhöhten Menge an NADPH (reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat) oder einer verringerten Menge an 6-Phosphoglucose-Isomerase(Pgi)-Enzymaktivität, im Vergleich zu einer unveränderten Bakterienzelle, wobei die L-Aminosäure-Ausbeuten von (I) höher sind als die Ausbeuten von der unveränderten Bakterienzelle.
  • In der EP-A-733712 wird die Produktivität der Produktion von Substanzen wie L-Aminosäuren, Antibiotika, Vitamine, Wachstumsfaktoren und physiologisch aktive Substanzen durch mikrobielle Fermentation verbessert, indem die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH) in den Mikrobenzellen verbessert wird. Dies kann durch Transformieren der Zellen erreicht werden, um die Enzymaktivität von Nicotinamid-Nucleotid-Transhydrogenase (NNT) in den Mikrobenzellen zu verbessern, um die Expression des NNT-Gens zu verbessern und um die Kopiezahl des NNT-Gens in den Zellen zu verbessern. Zu geeigneten Mikroorganismen gehören Stämme von Escherichia coli, Corynebacterium und Brevibacterium. ANWENDUNG – Das Verfahren ist für eine effizientere großtechnische Produktion von Substanzen geeignet, die in der pharmazeutischen, Nahrungsmittel-, Tierfuttermittelund chemischen Industrie zum Einsatz kommen, insbesondere L-Aminosäuren, Antibiotika, Vitamine, Wachstumsfaktoren und andere physiologisch aktive Substanzen.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Die Erfinder hatten die Aufgabe, verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • L-Aminosäuren finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Nahrungsmittelindustrie und insbesondere in der Tierernährung Verwendung. Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran, neue verbesserte Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren bereitzustellen.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin und L-Tryptophan, unter Verwendung von coryneformen Bakterien bereit, in denen die Nucleotidsequenz, die das Enzym 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (EC-Nr. 1.1.1.44) (gnd-Gen) kodiert, amplifiziert, insbesondere überexprimiert, wird.
  • Im Speziellen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation coryneformer Bakterien bereit, umfassend die Ausführung der folgenden Schritte:
    • a) Fermentieren der gewünschten L-Aminosäureproduzierenden Bakterien, in denen wenigstens das gnd-Gen amplifiziert und wenigstens das poxB-Gen attenuiert (abgeschwächt) wird,
    • b) Konzentrieren der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
    • c) Isolieren der produzierten L-Aminosäure.
  • Die verwendeten Stämme produzieren vorzugsweise bereits vor der Amplifikation des gnd-Gens L-Aminosäuren. Bevorzugte Ausgestaltungen sind in den Ansprüchen zu finden.
  • Der Begriff „Amplifikation" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem zum Beispiel die Kopiezahl des Gens oder der Gene erhöht, ein potenter Promotor oder ein Gen verwendet wird, das ein entsprechendes Enzym mit hoher Aktivität kodiert, und bei Bedarf diese Maßnahmen kombiniert werden.
  • Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerol und Ethanol herstellen. Sie sind Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
  • Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum, sind zum Beispiel die bekannten Wildtypstämme
    Corynebacterium glutamicum ATCC13032
    Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
    Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
    Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
    Brevibacterium flavum ATCC14067
    Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
    Brevibacterium divaricatum ATCC14020
    und daraus hergestellte L-Aminosäure-produzierende Mutanten, wie beispielsweise die L-Threonin-produzierenden Stämme
    Corynebacterium glutamicum ATCC21649
    Brevibacterium flavum BB69
    Brevibacterium flavum DSM5399
    Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269
    Brevibacterium lactofermentum TBB-10
    und wie beispielsweise die L-Isoleucin-produzierenden Stämme
    Corynebacterium glutamicum ATCC 14309
    Corynebacterium glutamicum ATCC 14310
    Corynebacterium glutamicum ATCC 14311
    Corynebacterium glutamicum ATCC 15168
    Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871
    und wie beispielsweise die L-Tryptophan-produzierenden Stämme
    Corynebacterium glutamicum ATCC21850
    Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901)
    und wie beispielsweise die L-Lysin-produzierenden Stämme
    Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
    Brevibacterium flavum FERM-P1708
    Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
    Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
    Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
    Corynebacterium glutamicum DSM5715
    Corynebacterium glutamicum DM58-1
    Corynebacterium glutamicum DSM12866.
  • Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin und L-Tryptophan, nach einer Überexpression des gnd-Gens, das die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (EC-Nr. 1.1.1.44) kodiert, und einer Abschwächung des poxB-Gens, das die Pyruvat-Oxidase kodiert, besser produzieren.
  • Das gnd-Gen kodiert das Enzym 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, das die oxydative Decarboxylierung von 6-Phosphogluconsäure zu Ribulose-5-Phospat katalysiert. Die Nucleotidsequenz des gnd-Gens ist in der JP-A-9-224662 offenbart. Das in der erwähnten Textquelle beschriebene gnd-Gen wird erfindungsgemäß zum ersten Mal verwendet. Ferner können Allele des gnd-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ergeben.
  • Zur Erzielung einer Amplifikation (z.B. Überexpression) wird die Kopiezahl der entsprechenden Gene erhöht, oder die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts des Strukturgens wird mutiert. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Laufe der fermentativen L-Aminosäure-Bildung zu steigern. Die Expression wird ebenfalls durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA verbessert. Ferner wird die Enzymaktivität auch durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins erhöht. Die Gene oder Genkonstrukte liegen entweder hier in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopiezahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann außerdem eine Überexpression der betreffenden Gene durch Verändern der Medienzusammensetzung und Kultivierungsmethode erreicht werden.
  • Anleitungen hierzu findet die fachkundige Person unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869 , im US-Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
  • 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase wurde zum Beispiel mit Hilfe eines Plasmids überexprimiert. Der in 1 dargestellte E. coli – C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-T18mob2 wurde für diesen Zweck verwendet. Nach dem Einbau des gnd-Gens in die EcoRI-Spaltstelle von pEC-T18mob2 wurde das in 2 dargestellte Plasmid pECgnd gebildet.
  • Andere Plasmidvektoren, die in C. glutamicum replizieren können, wie z.B. pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102:93–98 (1991)) oder pZ8-1 (EP-B-0 375 889) können in gleicher Weise verwendet werden.
  • Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, ein oder mehrere Enzym e) des speziellen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerose, des Pentosephosphatweges oder des Aminosäure-Exports neben der Amplifikation des gnd-Gens, das die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase kodiert, und der Abschwächung des poxB-Gens, das die Pyruvat-Oxidase kodiert, zu amplifieren.
  • So können beispielsweise insbesondere für die Herstellung von L-Threonin eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    • • dem hom-Gen, das Homoserindehydrogenase kodiert (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63–72 (1988)), oder dem homdr-Allel, das eine „feedbackresistente" Homoserindehydrogenase kodiert (Archer et al., Gene 107, 53–59 (1991),
    • • dem gap-Gen, das Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase kodiert (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174: 6076–6086 (1992)),
    • • dem pyc-Gen, das Pyruvatcarboxylase kodiert (Peters-Wendisch et al., Microbiology 144: 915–927 (1998)),
    • • dem mqo-Gen, das Malat:Chinon-Oxidoreductase kodiert (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
    • • dem tkt-Gen, das Transketolase kodiert (Beitrittsnummer AB023377 der Datenbank des Europäischen Laboratoriums für Molakularbiologie (EMBL, Heidelberg, Deutschland),
    • • dem zwf-Gen, das Glucose-6-phospatdehydrogenase kodiert (JP-A-09224661), und
    • • dem thrE-Gen, das Threoninexport kodiert ( DE 199 41 478.5 ; DSM 12840),
    gleichzeitig amplifiziert, insbesondere überexprimiert, werden.
  • So können beispielsweise insbesondere für die Herstellung von L-Lysin ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    • • dem dapA-Gen, das Dihydrodipicolinatsynthase kodiert (EP-B 0 197 335),
    • • dem lysC-Gen, das feedbackresistente Aspartatkinase kodiert (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224:317–329),
    • • dem gap-Gen, das Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase kodiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076–6068),
    • • dem pyc-Gen, das Pyruvatcarboxylase kodiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 179:6076–6086),
    • • dem tkt-Gen, das Transketolase kodiert (Beitrittsnummer AB023377 der Datenbank des Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (EMBL, Heidelberg, Deutschland)),
    • • dem zwf-Gen, das Glucose-6-phosphatdehydrogenase kodiert (JP-A-09224661), und
    • • dem lysE-Gen, das Lysinexport kodiert (DE-A-195 48 222),
    gleichzeitig amplifiziert, insbesondere überexprimiert, werden.
  • Des Weiteren kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, neben der Überexpression der 6-Phosphogluconatdehydrogenase und Abschwächung der Pyruvatoxidase unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).
  • Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder im Fed-batch(Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäure kultiviert werden. Eine Zusammenfassung bekannter Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) enthalten.
  • Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate, wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie z.B. Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie z.B. Essigsäure, verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff sowie anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wachstumssubstanzen wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorläufer zugesetzt werden. Die genannten Ausgangssubstanzen können in Form eines einzelnen Ansatzes zur Kultur gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugeführt werden.
  • Zur pH-Kontrolle können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Säureverbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Substanzen, wie z.B. Antibiotika, zugesetzt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie z.B. Luft, in die Kultur eingebracht. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 20°C und 45°C und vorzugsweise zwischen 25°C und 40°C. Die Kultivierung wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum von L-Aminosäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht.
  • Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch Umkehrphasen-HPLC stattfinden, wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:. 1167–1174) beschrieben.
  • Folgende Mikroorganismen wurden bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
    Escherichia coli K-12 DH5α/pEC-T18mob2 als DSM 13244
  • Die folgenden Figuren liegen bei:
  • 1: Karte des Plasmids pEC-T18mob2
  • 2: Karte des Plasmids pECgnd
  • 3: Karte des Plasmids pBGNA
  • 4: Karte des Plasmids pCR2.1poxBint
  • Bei den angegebenen Basenpaarzahlen handelt es sich um Zirkawerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhalten wurden.
  • Die verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:
  • 1:
    • Tet:
      Resistenzgen für Tetracyclin
      oriV:
      Plasmid-kodierter Replikationsstartpunkt von E. coli
      RP4mob:
      mob-Region zur Mobilisierung des Plasmids
      rep:
      Plasmid-kodierter Replikationsstartpunkt des C. glutamicum Plasmids pGA1
      per:
      Gen zur Kontrolle der Kopiezahl von pGA1
      lacZ-alpha:
      lacZα-Genfragment (N-Terminus) des R-Galactosidasegens
  • 2.
    • Tet:
      Resistenzgen für Tetracyclin
      rep:
      Plasmid-kodierter Replikationsstartpunkt des C. glutamicum Plasmids pGA1
      per:
      Gen zur Kontrolle der Kopiezahl von PGA1
      lacZ:
      Klonierungsrelikt des lacZα-Genfragments von pEC-T18mob2
      gnd:
      6-Phosphogluconatdehydrogenasegen
  • 3.
    • LacP:
      Promotor des E. coli Lactose-Operons
      CMV:
      Promotor von Zytomegalie-Virus
      ColE1:
      Replikationsstartpunkt des Plasmids ColE1
      TkpolyA:
      Polyadenylierungsort
      Kan r:
      Kanamycin-Resistenzgen
      SV40ori:
      Replikationsstartpunkt des Simian-Virus 40
      gnd:
      6-Phosphogluconatdehydrogenasegen
  • 4:
    • ColE1 ori:
      Replikationsstartpunkt des Plasmids ColE1
      lacZ:
      Klonierungsrelikt des lacZα-Genfragments
      fl ori:
      Replikationsstarktpunkt von Phage f1
      KmR:
      Kanamycin-Resistenz
      ApR:
      Ampicillin-Resistenz
      poxBint:
      internes Fragment des poxB-Gens
  • Ferner werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
    • AccI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms AccI
    BamHI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms BamHI
    EcoRI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
    HindIII:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms HindIII
    KpnI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms KpnI
    PstI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms PstI
    PvuI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms PvuI
    SalI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms SalI
    SacI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms SacI
    SmaI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms SmaI
    SphI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms SphI
    XbaI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms XbaI
    XhoI:
    Spaltstelle des Restriktionsenzyms XhoI
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die angewendeten Molekularbiologietechniken, z.B. Plasmid-DNA-Isolation, Restriktionsenzymbehandlung, Ligationen, Standardtransformationen von Escherichia coli usw., sind (sofern nicht anders angegeben) bei Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA) beschrieben.
  • 1. Beispiel
  • Konstruktion einer Genbank aus Corynebacterium glutamicum Stamm AS019
  • Eine DNA-Bank aus Corynebacterium glutamicum Stamm AS019 (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591–597 (1985)) wurde mit dem e Zap ExpressTM System (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research 16: 7583–7600) wie von O'Donohue beschrieben (O'Donohue, M. (1997). The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway) konstruiert. Ein ë Zap ExpressTM Kit wurde von Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037) erworben und nach Herstellerangaben eingesetzt. AS019-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A verdaut und mit BamHI-behandelten und dephosphorylierten ë Zap ExpressTM Armen ligiert.
  • 2. Beispiel
  • Klonierung und Sequenzierung des gnd-Gens
  • 1. Konstruktion einer gnd-Sonde
  • Ein radioaktiv markiertes Oligonucleotid innerhalb des gnd-Gens wurde zum Sondieren der oben beschriebenen AS019 ë Zap ExpressTM Bank verwendet. Das Oligonucleotid wurde mit degenerierten PCR-Primern innerhalb des gnd-Gens produziert. Die für die PCR-Amplifikation von gnd-DNA-Fragmenten bestimmten degenerierten Nucleotidprimer waren die Folgenden:
    gnd1: 5' ATG GTK CAC ACY GGY ATY GAR TA 3'
    gnd2: 5' RGT CCA YTT RCC RGT RCC YTT 3'
    wobei R = A + G; Y = C + T; K = T + G.
  • Die geschätzte Größe des resultierenden PCR-Produkts lag bei etwa 252 bp.
  • Optimale PCR-Bedingungen wurden wie folgt festgelegt:
    35 Zyklen
    94°C für 1 Minute
    55°C für 1 Minute
    72°C für 30 Sekunden
    2,5 – 3,5 mM MgCl2
    100 – 150 ng AS019 genomische DNA
  • Mit einer Sequenzanalyse des resultierenden PCR-Produkts wurde bestätigt, dass das Produkt ein interner Teil eines gnd-Gens war. Die Sequenzanalyse wurde mit den universellen Vorwärts- und Rückwärtsprimern und dem T7 Sequenzierungskit von Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, UK) durchgeführt. Die Sequenz des PCR-Produkts ist in der SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
  • 2. Klonierung
  • Die AS019 ë Zap ExpressTM Bank wurde gemäß dem ë Zap ExpressTM Systemprotokoll (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037) gescreent. Anschließend wurde eine Southern-Blot-Analyse an isolierten Klonen durchgeführt. Der Southern-Transfer von DNA erfolgte wie im Protokollhandbuch von Schleicher und Schnell beschrieben unter Verwendung von NytranTM als Membran („Nytran, Modified Nylon-66 Membrane Filters" (März 1987), Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland). Doppelsträngige DNA-Fragmente, die mit den gleichen Primern und optimalen PCR-Bedingungen wie oben beschrieben erzeugt wurden, wurden mit α-32P-dCTP unter Verwendung des MultiprimeTM DNA-Markierungskits von Amersham Life Science (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert. Die Vorhybridisierungs-, Hybridisierungs- und Waschbedingungen entsprachen den im Protokollhandbuch von Schleicher und Schuell beschriebenen. Eine Autoradiographie wurde gemäß dem im Handbuch von Sambrook et al. beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines AgFa Curix RPIL Films durchgeführt. Somit wurden verschiedene gnd-Klone identifiziert. Plasmid-DNA wurde von einem der Klone mit der Bezeichnung pBGNA (3) isoliert und zur weiteren Analyse ausgewählt.
  • 3. Sequenzierung
  • Die Sanger-Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463–5467 (1977)) wurde zum Sequenzieren des klonierten Inserts von pBGNA verwendet. Das Verfahren wurde mit dem T7 Sequenzierungskit und α-35S-dCTP von Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, UK) angewendet. Proben wurden 3–8 Stunden lang auf 6% Polyacrylamid/Harnstoff-Gelen in TBE-Puffer bei einem konstanten Strom von 50 mA gemäß Pharmacia Klonierungs- und Sequenzierungs-Instruktionshandbuch („T7 SequencingTM Kit", ref. XY-010-00-19, Pharmacia Biotech, 1994) der Elektrophorese unterworfen. Eine Sequenzanalyse wurde unter Verwendung von internen Primern durchgeführt, die von der bekannten Sequenz des internen gnd-PCR-Produkts (SEQ ID Nr. 1) konstruiert wurden, so dass die gesamte gnd-Gensequenz abgeleitet werden konnte.
  • Die Sequenzen der internen Primer waren wie folgt:
    Interner Primer 1: 5' GGT GGA TGC TGA AAC CG 3'
    Interner Primer 2: 5' GCT GCA TGC CTG CTG CG 3'
    Interner Primer 3: 5' TTG TTG CTT ACG CAC AG 3'
    Interner Primer 4: 5' TCG TAG GAC TTT GCT GG 3'
  • Die erhaltene Sequenz wurde dann mit dem Programm DNA-Strider (Marck (1988) Nucleic Acids Research 16: 1829–1836), Version 1.0, auf einem Apple Macintosh Computer analysiert. Dieses Programm ermöglichte Analysen wie die Restriktionsortnutzung, eine Analyse des offenen Leserasters und Codonnutzungsbestimmung. Suchen zwischen der erhaltenen DNA-Sequenz und solchen in EMBL und Genbank-Datenbanken erfolgten mit dem BLAST-Programm (Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Research 25: 3389–3402). DNA- und Proteinsequenzen wurden mit den Programmen Clustal V und Clustal W (Higgins und Sharp, 1988 Gene 73: 237–244) angeglichen.
  • Die so erhaltene Sequenz ist in der SEQ ID Nr. 2 dargestellt. Eine Analyse der erhaltenen Nucleotidsequenz brachte ein offenes Leseraster von 1377 Basenpaaren hervor, das gnd-Gen genannt wurde. Es kodiert ein Protein von 459 Aminosäuren, die in der SEQ ID Nr. 3 dargestellt sind.
  • 3. Beispiel
  • Herstellung des Shuttle-Vektors pEC-T18mob2
  • Der E. coli – C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-T18mob2 wurde gemäß dem Stand der Technik konstruiert.
  • Der Vektor enthält die Replikationsregion rep des Plasmids pGA1, einschließlich des Replikationseffektors per (US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525–1532 (1997)), das Tetracyclin-Resistenz verleihende tetA(Z) Gen des Plasmids pAG1 (US-A- 5,158,891; Genbankeintrag beim National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) mit Beitrittsnummer AF121000), die Replikationsregion oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77–90 (1979)), das lacZ-Genfragment, einschließlich des lac-Promotors und einer Mehrfachklonierungsstelle (mcs) (Norrander et al. Gene 26, 101–106 (1983)), und die mob-Region des Plasmids RP4 (Simon et al., (1983) Bio/Technology 1:784–791).
  • Der konstruierte Vektor wurde in den E. coli Stamm DH5α transformiert (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. 8d. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Eine Selektion nach plasmidtragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 1989), der mit 5 mg/l Tetracyclin angereichert worden war. Plasmid-DNA wurde von einem Transformanten mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und HindIII im Anschluss an eine Agarose-Gelelektrophorese (0,8 %) überprüft.
  • Das Plasmid wurde pEC-T18mob2 genannt; es ist in 1 dargestellt. Es ist in Form des Stammes Escherichia coli K-12 Stamm DH5α/pEC-T18mob2 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 13244 hinterlegt.
  • 4. Beispiel
  • Klonieren des gnd-Gens in den E. coli – C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-T18mob2
  • PCR wurde zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten, die das gesamte gnd-Gen von C. glutamicum enthielten und stromaufwärtige und stromabwärtige Regionen flankierten, unter Verwendung von pBGNA als Matrize angewendet. PCR-Reaktionen wurden mit Oligonucleotidprimern durchgeführt, die von der SEQ ID Nr. 2 konstruiert wurden. Die verwendeten Primer waren:
    gnd Vorw.-Primer: 5' ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG 3'
    gnd Rückw.-Primer: 5' CAC ACA GGA AAC AGA TAT GAC 3'
  • Die PCR-Parameter waren wie folgt:
    35 Zyklen
    95°C für 6 Minuten
    94°C für 1 Minute
    50°C für 1 Minute 72°C für 45 Sekunden
    1 mM MgCl2
    etwa 150–200 ng pBGNA-DNA als Matrize
  • Das erhaltene PCR-Produkt wurde in den von Promega Corp. erworbenen handelsüblichen pGEM-T Vektor (pGEM-T Easy Vector System 1, Kat.-Nr. A1360, Promega UK, Southampton) unter Verwendung des E. coli Stammes JM109 (Yanisch-Perron et al. Gene, 33: 103–119 (1985)) als Wirt kloniert. Das gesamte gnd-Gen wurde anschließend vom pGEM T-Vektor auf einem EcoRI-Fragment isoliert und in den lacZ EcoRI Ort des E. coli – C. glutamicum Shuttle-Vektors pEC-T18mob2 (1) kloniert und pECgnd genannt (2). Eine Restriktionsenzymanalyse mit AccI (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) deckte die korrekte Orientierung (d.h. stromabwärts des lac-Promotors) des gnd-Gens im lacZα-Gen von pEC-T18mob2 auf.
  • 5. Beispiel
  • Herstellung von Aminosäureproduzenten mit amplifizierter 6-Phosphogluconatdehydrogenase
  • Das Plasmid pECgnd aus dem 3. Beispiel wurde mit der Elektroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343–347 (1994)) in den Stämmen Corynebacterium glutamicum DSM 5399 und DSM 5714 elektroporiert. Der Stamm DSM 5399 ist ein Threonin-Produzent, der in der EP-B-0358940 beschrieben ist. Der Stamm DSM 5714 ist ein Lysin-Produzent der in der EP-B-0435132 beschrieben ist. Die Selektion von Transformanten erfolgte durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin angereichert worden war. Die Stämme DSM5399/pECgnd und DSM5714/pECgnd wurden in dieser Weise gebildet.
  • 6. Beispiel
  • Herstellung von Threonin
  • Der im 5. Beispiel erhaltene C. glutamicum Stamm DSM5399/pECgnd wurde in einem zur Produktion von Threonin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Threoningehalt wurde im Kulturüberstand bestimmt.
  • Dazu wurde der Stamm zunächst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetracyclin (5 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium in einem 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde Hirn-Herz-Nährlösung (Merck, Darmstadt, Deutschland) verwendet. Diesem Medium wurde Tetracyclin (5 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 24 Stunden lang bei 33°C mit 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM-Threonin verwendet. Medium MM-Threonin:
    CSL 5 g/l
    MOPS 20 g/l
    Glucose (getrennt autoklaviert) 50 g/l
    Salze:
    (NH4)2SO4) 25 g/l
    KH2PO4 0,1 g/l
    MgSO4·7 H2O 1,0 g/l
    CaCl2·2 H2O 10 mg/l
    FeSO4·7 H2O 10 mg/l
    MnSO4·H2O 5,0 mg/l
    Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/l
    Thiamin·HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/l
    CaCO3 25 g/l
  • CSL (Maisquellwasser), MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugegeben.
  • Die Kultivierung erfolgte in einem 10-ml-Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Tetracyclin (5 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80 % Luftfeuchtigkeit.
  • Nach 48 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Konzentration des gebildeten Threonins wurde mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
  • Tabelle 1 zeigt das Ergebnis des Versuchs.
  • Tabelle 1
    Figure 00220001
  • 7. Beispiel
  • Herstellung von Lysin
  • Der im 5. Beispiel erhaltene C. glutamicum Stamm DSM5714/pECgnd wurde in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt wurde im Kulturüberstand bestimmt.
  • Dazu wurde der Stamm zunächst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetracyclin (5 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium in einem 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Medium Cg III
    NaCl 2,5 g/l
    Bacto-Pepton 10 g/l
    Bacto-Yeast-Extract 10 g/l
    Glucose (getrennt autoklaviert) 2 % (w/v)
  • Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 eingestellt.
  • Diesem Medium wurde Tetracyclin (5 mg/l) zugegeben. Die Vorkultur wurde 24 Stunden lang bei 33°C mit 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,05 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet. Medium MM
    CSL (Maisquellwasser) 5 g/l
    MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) 20 g/l
    Glucose (getrennt autoklaviert) (NH4)2SO4) 50 g/l
    KH2PO4 25 g/l
    MgSO4·7 H2O 0,1 g/l
    CaCl2·2 H2O 1,0 g/l
    FeSO4·7 H2O 10 g/l
    MnSO4·H2O 10 mg/l
    Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/l
    Thiamin·HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/l
    L-Leucin (sterilfiltriert) 0,1 g/l
    CaCO3 25 g/l
  • CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugegeben.
  • Die Kultivierung erfolgte in einem 10-ml-Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Tetracyclin (5 mg/L) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80 % Luftfeuchtigkeit.
  • Nach 48 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge des gebildeten Lysins wurde mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
  • In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
  • Tabelle 2
    Figure 00240001
  • 8. Beispiel
  • Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
  • Chromosomale DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie von Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168–179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCosl (Wahl et al., (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84:2160–2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code-Nr. 251301), wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit alkalischer Shrimp-Phosphatase dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-09) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe von Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion des E. coli Stammes NM559 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37° wurden rekombinante Einzelklone selektiert.
  • 9. Beispiel
  • Isolierung und Sequenzierung des poxB-Gens
  • Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie (8. Beispiel) wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Nach einer Trennung durch Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Die DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, bezogen von Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenzierungsvektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 87:4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert. Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74:5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die Trennung durch Gelelektrophorese und Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgten in einem „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29:1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem „ABI Prism 377" Sequenzierungsgerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
  • Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend mit dem Staden-Progammpaket (1986, Nucleic Acids Research, 14:217–231) Version 97–0 verarbeitet. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützten Kodierregionanalysen erfolgten mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217–231). Weitere Analysen wurden mit dem „BLAST search program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389–3402) anhand der nichtredundanten Datenbank des „National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
  • Die resultierende Nucleotidsequenz ist in SEQ ID Nr. 4 dargestellt. Eine Analyse der Nucleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 1737 Basenpaaren, das als poxB-Gen bezeichnet wurde. Das poxB-Gen kodiert ein Polypeptid von 579 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 5).
  • 10. Beispiel
  • Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des poxB-Gens
  • Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 9 für C. glutamicum bekannten Sequenz des poxB-Gens wurden die folgenden Oligonucleotide für die Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt:
    poxBint1:
    5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3'
    poxBint2:
    5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'
  • Die dargestellten Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion wurde nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein etwa 0,9 kb großes DNA-Fragment isoliert, das ein internes Fragment des poxB-Gens trug und in der SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist.
  • Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning Kit von Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog-Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991) Bio/Technology 9:657–663) ligiert. Anschließend wurde der E. coli Stamm DH5α mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Bd. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion nach Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin angereichert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8 %) überprüft. Das Plasmid wurde pCR2.1poxBint genannt (4).
  • Das Plasmid pCR2.1poxBint wurde in Form des Stammes Escherichia coli DH5α/pCR2.1poxBint als DSM 13114 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.
  • 11. Beispiel
  • Integrationsmutagenese des poxB-Gens im Lysinproduzenten DSM 5715
  • Der im Beispiel 10 genannte Vektor pCR2.1poxBint wurde nach der Elektroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343–347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC-resistenten Lysin-Produzenten. Der Vektor pCR2.1poxBint kann in DSM5715 nicht selbstständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er sich ins Chromosom von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1poxBint erfolgte durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin angereichert worden war. Für den Nachweis der Integration wurde das poxBint-Fragment nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit von Boehringer markiert. Chromosomale DNA eines potenziellen Integranten wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen SalI, SacI und HindIII gespalten. Die entstehenden Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und mit dem Dig-Hybridisierungskit von Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel 9 genannte Plasmid pCR2.1poxBint war innerhalb des chromosomalen poxB-Gens ins Chromosom von DSM5715 inseriert worden. Der Stamm wurde als DSM5715::pCR2.1poxBint bezeichnet.
  • 12. Beispiel
  • Effekt der Überexpression des gnd-Gens bei gleichzeitiger Ausschaltung des poxB-Gens auf die Herstellung von Lysin
  • 12.1 Herstellung des Stamms DSM5715::pCR2.1poxBint/pECgnd
  • Der Stamm DSM5715::pCR2.1poxBint wurde mit dem Plasmid pECgnd unter Anwendung der von Liebl et al. beschriebenen Elektroporationsmethode (FEMS Microbiology Letters, 53:299–303 (1989)) transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, der 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionsnährlösung, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar umfasste und mit 5 mg/l Tetracyclin und 25 mg/l Kanamycin angereichert worden war. Die Inkubation fand 2 Tage lang bei 33°C statt. Plasmid-DNA wurde in jedem Fall von einem Transformanten durch konventionelle Methoden (Peters-Wendisch et al., 1998 Microbiology 144, 915–927) isoliert und mit Restriktionsendonuclease AccI gespalten, und das Plasmid wurde durch eine anschließende Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Der so erhaltene Stamm wurde DSM5715:pCR2.1poxBint/pECgnd genannt.
  • 12.2 Herstellung von L-Lysin
  • Der im Beispiel 12.1 erhaltene C. glutamicum Stamm DSM5715::pCR2.1poxBint wurde in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert, und der Lysin-Gehalt wurde im Kulturüberstand bestimmt.
  • Dazu wurden die Stämme zunächst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetracyclin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Die Kulturen der Vergleichsstämme wurden gemäß ihrer Antibiotikaresistenz angereichert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium in einem 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Medium Cg III
    NaCl 2,5 g/l
    Bacto-Pepton 10 g/l
    Bacto-Yeast-Extrakt 10 g/l
    Glucose (getrennt autoklaviert) 2 % (w/v)
  • Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 eingestellt.
  • Diesem wurde Tetracyclin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden lang bei 33°C mit 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet. Medium MM
    CSL (Maisquellwasser) 5 g/l
    MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) 20 g/l
    Glucose (getrennt autoklaviert) 58 g/l
    (NH4)2SO4 25 g/l
    KH2PO4 0,1 g/l
    MgO4·7 H2O 1,0 g/l
    CaCl2·2 H2O 10 mg/l
    FeSO4·7 H2O 10 mg/l
    MnSO4·H2O 5,0 mg/l
    Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/l
    Thiamin·HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/l
    L-Leucin (sterilfiltriert) 0,1 g/l
    CaCO3 25 g/l
  • CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugegeben.
  • Die Kultivierung erfolgte in einem 10-ml-Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurden Tetracyclin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80 % Luftfeuchtigkeit.
  • Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge des gebildeten Lysins wurde mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
  • Tabelle 3 zeigt das Ergebnis des Versuchs.
  • Tabelle 3
    Figure 00320001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001

Claims (8)

  1. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation von Coryneform-Bakterium, umfassend die Ausführung der folgenden Schritte: a) Fermentieren der gewünschten L-Aminosäureproduzierenden Bakterien, in denen wenigstens das gnd-Gen amplifiziert und wenigstens das poxB-Gen attenuiert wird, b) Konzentrieren der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und c) Isolieren der produzierten L-Aminosäure.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Bakterien, in denen weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure zusätzlich amplifiziert, insbesondere überexprimiert werden, verwendet werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Coryneform-Bakterien, die L-Threonin, L-Lysin, L-Isoleucin oder L-Tryptophan herstellen, verwendet werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem Coryneform-Bakterien, die L-Lysin herstellen, verwendet werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem Coryneform-Bakterien, die L-Threonin herstellen, verwendet werden.
  6. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin nach Anspruch 2, wobei in den Coryneform-Mikroorganismen, die insbesondere bereits L-Lysin produzieren, ein oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: 6.1 dem dapA-Gen, das Dihydrodipicolinatsynthase codiert, 6.2 dem lysC-Gen, das feedbackresistente Aspartatkinase codiert, 6.3 dem gap-Gen, das Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase codiert, 6.4 dem pyc-Gen, das Pyruvatcarboxylase codiert, 6.5 dem tkt-Gen, das Transketolase codiert, 6.6 dem zwf-Gen, das Glucose-6-phosphatdehydrogenase codiert, und 6.7 dem lysE-Gen, das Lysinexport codiert, gleichzeitig amplifiziert, insbesondere überexprimiert, wird oder werden.
  7. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin nach Anspruch 2, wobei in den Coryneform-Mikroorganismen, die insbesondere bereits L-Threonin produzieren, ein oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: 7.1 dem hom-Gen, das Homoserindehydrogenase codiert, oder dem homdr-Allel, das eine „feedbackresistente" Homoserindehydrogenase codiert, 7.2 dem gap-Gen, das Glyeraldehyd-3-phosphatdehydrogenase codiert, 7.3 dem pyc-Gen, das Pyruvatcarboxylase codiert, 7.4 dem mqo-Gen, das Malat:Chinon-Oxidoreductase codiert, 7.5 dem tkt-Gen, das Transketolase codiert, 7.6 dem zwf-Gen, das Glucose-6-phospatdehydrogenase codiert, und 7.7 dem thrE-Gen, das Threoninexport codiert, gleichzeitig amplifiziert, insbesondere überexprimiert, wird oder werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei zum Erzielen der Amplifizierung die Anzahl von Kopien der Gene oder Nucleotidsequenzen durch Transformation der Mikroorganismen mit Plasmidvektoren erhöht wird, die diese Gene oder Nucleotidsequenzen tragen.
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