CN1350586A - 经扩增gnd基因发酵制备L－氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过发酵棒状细菌制备L－氨基酸的方法,包括进行以下步骤:a)发酵产生所需L－氨基酸的细菌,该细菌中至少gnd基因是扩增的,b)浓缩培养基或细菌细胞中的L－氨基酸,及c)分离产生的L－氨基酸。

Description

经扩增gnd基因发酵制备L-氨基酸的方法
本发明涉及用棒状细菌经发酵制备L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-色氨酸的方法，在所述棒状细菌中至少gnd基因是扩增的。
现有技术
L-氨基酸用于动物营养，人用药及制药工业。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良生产L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
发明目的
本发明目的是提供新的用棒状细菌经发酵制备L-氨基酸的改良方法。
发明描述
L-氨基酸用于人用药物及制药工业，食品工业，特别是动物营养。因此提供生产氨基酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
本发明提供了用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-色氨酸的方法，在该棒状细菌中编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC1.1.1.44)(gnd基因)的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
使用的菌株优选在gnd基因扩增之前已生产L-氨基酸。
优选的实施方案见于权利要求书。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或使用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属，在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
以下已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
醋谷棒杆菌ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539
黄色短杆菌ATCC 14067
乳发酵短杆菌ATCC 13869
扩展短杆菌ATCC 14020和从中获得的生产L-氨基酸的突变体，如生产L-苏氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC21649
黄色短杆菌BB69
黄色短杆菌DSM5399
乳发酵短杆菌FERM-BP 269
乳发酵短杆菌TBB-10以及，如生产L-异亮氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC14309
谷氨酸棒杆菌ATCC14310
谷氨酸棒杆菌ATCC14311
谷氨酸棒杆菌ATCC15168
产氨棒杆菌ATCC6871以及，如生产L-色氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC21850
谷氨酸棒杆菌KY9218(pKW9901)以及，如生产L-赖氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709
黄色短杆菌FERM-P 1708
乳发酵短杆菌FERM-P 1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P6464
谷氨酸棒杆菌DSM5715
谷氨酸棒杆菌DSM58-1
谷氨酸棒杆菌DSM12866是棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌合适菌株的实例。
已发现在编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC1.1.1.44)的gnd基因过表达之后，棒杆菌以改良方式生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-色氨酸。
编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，其催化6-磷酸葡糖酸氧化脱羧为5-磷酸核酮糖。gnd基因的核苷酸序列揭示于JP-A-9-224662。本发明首次应用了在提及的参考文献中阐述的gnd基因。得自遗传密码简并或由于中性功能的有义突变导致的gnd基因的等位基因也可使用。
为获得扩增(如过表达)，例如可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-氨基酸发酵生产期间增加表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改善表达。另外，通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))，Reischeid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998))，及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，6-磷酸葡糖酸脱氢酶借助于质粒被过表达。为此使用图1所示的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。在将gnd基因掺入pEC-T18mob2的EcoRI切割位点之后，形成图2所示的质粒pECgnd。
能在谷氨酸棒杆菌中复制的其它质粒载体如pEKExl(Eikmarms等，基因102：93-98(1991))，或pZ8-1(EP-B-0375889)也可以同样方式使用。
另外，除编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因之外，特定生物合成途径，糖酵解，添补反应，戊糖磷酸途径或氨基酸输出的一或多种酶的过表达，对L-氨基酸的生产可以是有益的。
因此，例如选自以下一组的一或多个基因可被同时扩增尤其是过表达以生产L-苏氨酸：
·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(Peoples等，分子微生物学2，63-72(1988))，或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因(Archer等，基因107，53-59(1991))，
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物学144：915-927(1998))，
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254，395-403)
·编码转酮酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国)的数据库，登记号AB023377)
·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)
·编码苏氨酸输出的thrE基因(DE 199 41 478.5；DSM12840)
·zwa1基因(DE 199 59 328.0；DSM13115)
·编码烯醇酶的eno基因(DE：19941478.5)。
因此，例如选自以下一组的一或多个基因可被同时扩增尤其是过表达以生产L-赖氨酸：
·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，
·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遗传学224：317-324)，
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254，395-403)，
·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)，
·编码转酮酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国)的数据库，登记号AB023377)，
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，
·zwa1基因(DE 199 59 328.0，DSM13115)，
·编码烯醇酶的eno基因(DE：19941478.5)。
除扩增gnd基因之外，同时弱化选自以下一组的一或多个基因对L-氨基酸的生产也可以是有益的：
·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，
·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)，
·zwa 2基因(DE19959327.2，DSM13113)。
除过表达6-磷酸葡糖酸脱氢酶之外，消除非所需的副反应对L-氨基酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或非连续地通过分批法，补料分批法或重复补料发批法培养，以生产L-氨基酸。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C..USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性，氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
L-氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经过如Spackman等(分析化学30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用进行，或通过如Lindroth等(分析化学(1979)51：1167-1174)所述反向HPLC进行。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：
大肠杆菌K-12 DH5α/pEC-T18mob2，保藏号DSM13244。
本发明包括以下附图：
图1：质粒pEC-T18mob2图。
图2：质粒pECgnd图。
图3：质粒pBGNA图。
图4：质粒pCR2.1poxBint图。
碱基对数目是根据再现性获得的大约值。
图中所采用的缩写有如下含义：图1：
Tet：四环素抗性基因
oriV：大肠杆菌的质粒编码的复制源点
RP4mob：转移质粒的mob区域
rep：来自谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点
per：pGA1的控制拷贝数的基因
lacZ-alpha：β-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)图2：
Tet：四环素抗性基因
rep：来自谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点
per：pGA1的控制拷贝数的基因
lacZ：来自pEC-T18mob2的lacZα基因片段的克隆残存片段
gnd：6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因图3：
lacP：大肠杆菌乳糖操纵子的启动子
CMV：巨细胞病毒的启动子
ColE1：质粒ColE1的复制源点
TkpolyA：聚腺苷酸化位点
Kan r：卡那霉素抗性基因
SV40ori：猴病毒40的复制源点
gnd：6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因图4：
ColE1 ori：质粒ColE1的复制源点
lacZ：lacZα基因片段的克隆残存片段
fl ori：噬菌体fl的复制源点
KmR：卡那霉素抗性
ApR：氨苄青霉素抗性
poxBint：poxB基因的内部片段另外，使用以下缩写：
AccI：限制酶AccI的酶切位点
BamHI：限制酶BamHI的酶切位点
EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点
HindIII：限制酶HindIII的酶切位点
KpnI：限制酶KpnI的酶切位点
PstI：限制酶PstI的酶切位点
PvuI：限制酶PvuI的酶切位点
SalI：限制酶SalI的酶切位点
SacI：限制酶SacI的酶切位点
SmaI：限制酶SmaI的酶切位点
SphI：限制酶SphI的酶切位点
XbaI：限制酶XabI的酶切位点
XhoI：限制酶XhoI的酶切位点
实施例
以下实施例进一步举例说明了本发明。所使用的分子生物学技术如质粒DNA分离，限制酶处理，连接，大肠杆菌的标准转化等方法，除非特别说明，均如Sambrook等所述进行(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室，美国)。实施例1：谷氨酸棒杆菌菌株AS019基因文库的构建
用ёZap ExpressTM系统(Short等，(1988)核酸研究，16：7583-7600)构建了谷氨酸棒杆菌菌株AS019(Yoshihama等，细菌生物学杂志162，591-597(1985))的DNA文库，如O′Donohue所述(O′Donohue，M.(1997)，谷氨酸棒杆菌四种常见芳香族氨基酸生物合成基因的克隆与分子分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway)。ёZap ExpressTM系统试剂盒购自Stratagene(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，LaJolla，California 92037)并按说明书使用。AS019-DNA用限制性内切酶Sau3A消化后连接到用BamHI消化并去磷酸化的ёZap ExpressTM臂上。实施例2：gnd基因的克隆和测序1.构建gnd探针
用gnd基因内部的放射标记的寡核苷酸探查上述AS019ёZapExpressTM文库。用gnd基因内部的简并PCR引物产生所述寡核苷酸。设计用于PCR扩增gnd DNA片段的简并核苷酸引物如下：
gndl：5’ATG GTK CAC ACY GGY ATY GAR TA 3’
gnd2：5’RGT CCA YTT RCC RGT RCC YTT 3’其中R＝A+G；Y＝C+T；K＝T+G。
估计所得PCR产物的大小大约为252bp。
最佳PCR条件确定如下：
    35次循环
    94℃ 1分钟
    55℃ 1分钟
    72℃ 30秒
    2.5-3.5mM MgCl2
    100-150ng AS019基因组DNA
对所得PCR产物进行测序分析证实此产物是gnd基因的内部部分。用通用的正向和反向引物，和Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，UK)的T7测序试剂盒测序。PCR产物的序列示于SEQ ID NO：1。2.克隆
根据ёZap ExpressTM系统方案筛选AS019ёZap ExpressTM文库(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，Califomia 92037)。然后对分离的克隆进行Southem印迹分析。如Schleicher和Schuell方法手册所述，将NytranTM(“Nytran，修饰的尼龙-66滤膜”(1987年3月)，Schleicher和Schuell，Dassbl，德国)作为膜进行DNA的Southern转移。将使用上述相同引物和最佳PCR条件产生的双链DNA片段，用Amersham生命科学公司的MultiprimeTM DNA标记试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech UK Limited，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)，根据说明书用α-32p-dCTP放射标记。预杂交，杂交和冲洗条件如Schleicher和Schuell方法手册所述。根据Sambrook等所述方法，用AgFa Curix RPIL胶片进行放射自显影。由此鉴别一些gnd克隆。从称为pBGNA(图3)的一个克隆分离质粒DNA，并选择其进行进一步分析。3.测序
通过Sanger等的Sanger双脱氧链终止法(美国科学院院报74，5463-5467(1977))，对pBGNA中克隆的插入体进行测序。用PharmaciaBiotech公司的T7测序试剂盒和α-32P-dCTP(St.Albans，Herts，UK)进行此方法。根据Pharmacia克隆和测序指导手册(“T7SequencingTM试剂盒”，ref.XY-010-00-19，Pharmacia Biotech，1994)，将样品在TBE缓冲液中于6％聚丙烯酰胺/尿素凝胶上，以恒定的50mA进行电泳3-8小时。用自内部gnd PCR产物的已知序列(SEQ ID NO：1)设计的内部引物测序，以推导全部gnd基因序列。
内部引物的序列如下：内部引物1：5’GGT GGA TGC TGA AAC CG 3’内部引物2：5’GCT GCA TGC CTG CTG CG 3’内部引物3：5’TTG TTG CTT ACG CAC AG 3’内部引物4：5’TCG TAG GAC TTT GCT GG 3’
所得的序列在苹果麦金托什机计算上用DNA Strider程序1.0版(Marck，(1998).核酸研究16：1829-1836)进行分析。这一程序可以进行限制性位点使用、开放读框分析和密码子使用分析。使用BLAST程序(Altschul等，(1997)核酸研究，25：3389-3402)在所得DNA序列和EMBL和Genbank中的序列之间进行查询。DNA和蛋白质序列比较使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1998基因73：237-244)。
所得的序列如SEQ ID NO：2所示。核苷酸序列分析揭示一1377个碱基对的开放读框，命名为gnd基因，其编码一个459个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO：3所示。实施例3：穿梭载体pEC-T18mob2的制备
根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。
此载体含有质粒pGA1的包括复制效应子per的复制区rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，细菌学杂志179，1525-1532(1997))，质粒pAG1的四环素抗性基因tetA(Z)(USA-5158891；国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的基因文库，登记号AF121000)，质粒pMB1(Sutcliffe，关于定量生物学的冷泉港讨论会43，77-90(1979))的复制起点oriV，包括lac启动子及多克隆位点(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))的lacZα基因片段，和质粒RP4(Simon等，(1983)生物/技术1：784-791)的mob区域。
将此构建的载体转化入大肠杆菌菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，华盛顿，美国)。通过将转化混合物铺板于补加5mg/l四环素的LB平板(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制备试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII限制，及随后经琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。
此质粒称为pEC-T18mob2并示于图1。其以大肠杆菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德国)，保藏号DSM 13244。实施例4：大肠杆菌-谷氨酸穿梭载体pEC-T18mob2中gnd基因的克隆
用pBGNA作模板，经PCR扩增含有谷氨酸棒杆菌的全长gnd基因和两侧上游和下游区域的DNA片段。用设计自SEQ ID NO：2的寡核苷酸引物进行PCR反应。所用引物是：
gnd正向引物：5’ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG 3’
gnd反向引物：5’CAC ACA GGA AAC AGA TAT GAC 3’
PCR参数如下：
35次循环 95℃ 6分钟
         94℃ 1分钟
         50℃ 1分钟
         72℃ 45秒
         1mM MgCl2
         大约150-200ng pBGNA-DNA作模板。
将所得PCR产物克隆入购自Promega公司的pGEM-T载体(pGEM-T Easy Vector System 1，目录号A1360，Promega UK，Southampton)中，用大肠杆菌菌株JM109(Yanisch-Perron等，基因33：103-119(1985))作宿主。全长gnd基因随后分离自pGEM-T载体的EcoRI片段，并克隆入大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2的lacZ EcoRI位点(图1)，并称之为pECgnd(图2)。用AccI(Boehringer Mannheim GmbH，德国)进行的限制酶分析显示pEC-T18mob2的lacZα基因中gnd基因的正确方向(即在lac启动子下游)。实施例5：制备具有扩增的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的氨基酸生产菌株
通过Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信，123：343-347(1994))，将实施例3的质粒pECgnd电穿孔入谷氨酸棒杆菌菌株DSM5399和DSM5714中。DSM5399菌株是生产苏氨酸的菌株，见于EP-B-0358940所述。DSM5714菌株是生产赖氨酸的菌株，见于EP-B-0435132所述。将电穿孔混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上选择转化体，所用LB琼脂已补加25mg/l卡那霉素。以此方式形成菌株DSM5399/pECgnd和DSM5714/pECgnd。
实施例6：制备苏氨酸
将实施例5中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5399/pECgnd，在适于生产苏氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中苏氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是脑心浸液(Merck，Darmstadt，德国)。向此培养基中加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM-苏氨酸用作主培养物。
培养基MM-苏氨酸：
CSL                    5g/l
MOPS                   20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)   50g/l
(NH4)2SO4          25g/l
KH2PO4              0.1g/l
MgSO4·7H2O               1.0g/l
CaCl2·2H2O               10mg/l
FeSO4·7H2O               10mg/l
MnSO4·H2O                5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)              0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)       0.2mg/l
CaCO3                        25g/l
用氨水将CSL(玉米浆)，MOPS(吗啉代丙磺酸)和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
48小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定苏氨酸生成量。
实验结果示于表1。
表1
菌株  OD(660)   L-苏氨酸(g/l)
DSM5399/pECgnd  11.9   1.29
DSM5399  11.8   0.33
实施例7：制备赖氨酸
将实施例5中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5714/pECgnd，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII
NaCl                    2.5g/l
Bacto-肽胨               10g/l
Bacto-酵母膏             10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)     2％(w/v)pH调节为7.4。
加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.05。培养基MM用作主培养物。
培养基MM：
CSL(玉米浆)                   5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)            20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)          50g/l
(NH4)2SO4                 25g/l
KH2PO4                      0.1g/l
MgSO4·7H2O                1.0g/l
CaCl2·2H2O                10mg/l
FeSO4·7H2O                10mg/l
MnSO4·H2O                 5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)               0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)        0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)             0.1g/l
CaCO3                         25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
48小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表2。
菌株  OD(660)   赖氨酸HCl(g/l)
DSM5714/pECgnd  7.7   14.7
DSM5714  7.1   13.7
实施例8：制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒文库
如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等，(1987)美国科学院院报84：2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI编码27-0948-02)酶切，并也用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的内切酶BamHI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)，将细菌置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox.1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。实施例9：poxB基因的分离与测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离单个菌落的粘粒DNA(实施例8)，并用限制性内切酶Sau 3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AJ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酶酶(Roche分子生物化学，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。经凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。将得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biobech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报87：4645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”(产品号403044，Weiterstadt，德国)，在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29：1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中，进行凝胶电泳分离和序列分析。
所得原始序列数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14：217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231)进行计算机辅助编码区分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行进-步分析。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，对该核苷酸序列的分析显示一1737碱基对的开放读框，其被称为poxB基因，poxB基因编码579个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：5)。实施例10：制备整合载体以整合诱变poxB基因
从菌株ATCC13032中，通过Eikmanns等所述方法(微生物学140：1817-1828(1994))分离染色体DNA。基于从实施例9中已知的谷氨酸棒杆菌的poxB基因序列，选择以下寡核苷酸进行聚合酶链反应：
poxBint1：5’TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3’
poxBint2：5’GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3’
所示引物是通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成的，通过Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法指导和应用，1990，Academic出版社)，用Boehringer的Pwo-聚合酶进行PCR反应。借助于聚合酶链反应，分离大约0.9kb的DNA片段，其携带poxB基因的内部片段，并如SEQ ID NO：6所示。
将扩增的DNA片段用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA，美国；Catalogue Number K4500-01)，连接在载体pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)，生物/技术9：657-663)中。然后将连接混合物电穿孔入大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，华盛顿DC，美国，1985)。将转化混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞，所用LB琼脂已补加25mg/ml卡那霉素。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制备试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制酶EcoRI限制及随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。此质粒称为pCR2.1poxBint(图4)。
质粒pCR2.1poxBint以大肠杆菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式，根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心，DSMZ；Braunschweig，德国)，保藏号DSM13114。实施例11：在赖氨酸生产菌DSM5715中整合诱变poxB基因
将实施例10中所述的载体pCR2.1poxBint，通过Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信，123：343-347(1994))，电穿孔入谷氨酸棒杆菌DSM5715中。菌株DSM5715是一种AEC抗性赖氨酸生产菌。载体pCR2.1poxBint在DSM5715中不能独立复制，并只有已整合入DSM5715的染色体中时，才在细胞中保留。通过将电穿孔混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择具有整合入染色体的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB琼脂已补加15mg/l卡那霉素。为检测整合情况，将poxBint片段用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒，通过Boehringer Mannheim GmbH的“进行滤膜杂交的DIG系统使用指导”(Mannheim，德国，1993)进行标记。潜在整合子的染色体DNA是通过Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))分离的，并分别用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，并在68℃用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒杂交。实施例9中所述的质粒pCR2.1poxBint已插入DSM5715的染色体中的染色体poxB基因内。此菌株称为DSM5715∷pCR2.1poxBint。实施例12：过表达gnd基因同时消除poxB基因对赖氨酸制备的作用12.1制备菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd
通过Libel等所述电穿孔方法(FEMS微生物学通信，53：299-303(1989))，将菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用质粒pECgnd转化。在含有18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/lBacto-胰化蛋白胨，2.5g/lBacto-酵母膏，5g/lNaCl，和18g/lBacto-琼脂，并补加5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂上，选择转化体。在33℃温育2天。
通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144，915-927)从转化体中分离质粒DNA，用限制性内切酶AccI酶切，并通过随后的琼脂糖凝胶电泳检测此质粒。以此方式获得的菌株称为DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd。12.2制备L-赖氨酸
将实施例12.1中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素和25mg/l的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII
NaCl                     2.5g/l
Bacto-肽胨                     10g/l
Bacto-酵母膏                   10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)           2％(w/v)pH调节为7.4。
加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MM：
CSL(玉米浆)                       5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)                20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)              58g/l
NH4)2SO4                      25g/l
KH2PO4                          0.1g/l
MgSO4·7H2O                    1.0g/l
CaCl2·2H2O                    10mg/l
FeSO4·7H2O                    10mg/l
MnSO4·H2O                     5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)                   0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)            0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)                 0.1g/l
CaCO3                             25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表3。
表3
菌株  OD 赖氨酸HCl(g/l)
DSM5715  10.8   16.0
DSM5715/pECgnd  7.6   16.5
DSM5715∷pCR2.1poxBint  7.1   16.7
DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd  7.2   17.1
序列表<110>国立爱尔兰大学戈尔韦分校
 德古萨-于尔斯股份公司<120>用棒状细菌发酵制备L-氨基酸的方法<130>990229 BT<140><141><160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>252<212>DNA<2l3>谷氨酸棒杆菌<400>1atggtccaca acggcatcga gtacgccgac atgcaggtca tcggcgaggc ataccacctt 60ctgccctacg cagcaggcat gcagccagct gaaatcgctg aggttttcaa ggaatggaac 120gcaggcgacc tggattccta cctcatcgaa atcaccgcag aggttctctc ccaggtggat 180gctgaaaccg gcaagccact aatcgacgtc atcgttgacg ctgcaggtca gaagggcacc 240ggcaagtgga ct                                                     252<210>2<211>2335<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(474)..(1850)<223>gnd<400>2ttgttcggcc acgatgacac cggagctcac agcagaaatg aagtcggtgt tgttgttgat 60gccgacgacc atttttccag gggcggaaat catgctggcg actgatccag tggattcggc 120gatggcggcg tagacaccac cgttgaccaa gcccaccact tgcaggtgct tggatgccac 180gtgaagttcg ctgaccaccc ggccgggctc gatggtggtg tagcgcagcc ccagattgcg 240gtcgaggcca taattggcgt tgttgagtgc ttcaagttcg tctgtggtta aagctctggt 300ggcggcaagt tctgcaagcg aaagcagatc ttggggttga tcatcgcggg aagtcataat 360taattactct agtcggccta aaatggttgg attttcacct cctgtgacct ggtaaaatcg 420ccactacccc caaatggtca caccttttag gccgattttg ctgacaccgg gct atg    476
                                                       Met
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     20                  25                  30ttc gcc cgc aac ggc aac act gtc gct gtc tac aac cgc agc act gac   620Phe Ala Arg Asn Gly Asn Thr Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr Asp
 35                  40                  45aaa acc gac aag ctc atc gcc gat cac ggc tcc gaa ggc aac ttc atc   668Lys Thr Asp Lys Leu Ile Ala Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe Ile50                  55                  60                  65cct tct gca acc gtc gaa gag ttc gta gca tcc ctg gaa aag cca cgc   716Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro Arg
             70                  75                  80cgc gcc atc atc atg gtt cag gct ggt aac gcc acc gac gca gtc atc   764Arg Ala Ile Ile Met Val Gln Ala Gly Asn Ala Thr Asp Ala Val Ile
         85                  90                  95aac cag ctg gca gat gcc atg gac gaa ggc gac atc atc atc gac ggc   812Asn Gln Leu Ala Asp Ala Met Asp Glu Gly Asp Ile Ile Ile Asp Gly
     100                105                 110ggc aac gcc ctc tac acc gac acc att cgt cgc gag aag gaa atc tcc   860Gly Asn Ala Leu Tyr Thr Asp Thr Ile Arg Arg Glu Lys Glu Ile Ser
115                 120                 125gca cgc ggt ctc cac ttc gtc ggt gct ggt atc tcc ggc ggc gaa gaa   908Ala Arg Gly Leu His Phe Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Gly Glu Glu130                 135                 140                 145ggc gca ctc aac ggc cca tcc atc atg cct ggt ggc cca gca aag tcc   956Gly Ala Leu Asn Gly Pro Ser Ile Met Pro Gly Gly Pro Ala Lys Ser
            150                 155                 160tac gag tcc ctc gga cca ctg ctt gag tcc atc gct gcc aac gtt gac   1004Tyr Glu Ser Leu Gly Pro Leu Leu Glu Ser Ile Ala Ala Asn Val Asp
        165                 170                 175ggc acc cca tgt gtc acc cac atc ggc cca gac ggc gcc ggc cac ttc   1052Gly Thr Pro Cys Val Thr His Ile Gly Pro Asp Gly Ala Gly His Phe
    180                 185                 190gtc aag atg gtc cac aac ggc atc gag tac gcc gac atg cag gtc atc   1100Val Lys Met Val His Asn Gly Ile Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val Ile
195                 200                 205ggc gag gca tac cac ctt ctg ccc tac gca gca ggc atg cag cca gct   1148Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu Pro Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro Ala210                 215                 220                 225gaa atc gct gag gtt ttc aag gaa tgg aac gca ggc gac ctg gat tcc   1196Glu Ile Ala Glu Val Phe Lys Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp Ser
            230                 235                 240tac ctc atc gaa atc acc gca gag gtt ctc tcc cag gtg gat gct gaa   1244Tyr Leu Ile Glu Ile Thr Ala Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala Glu
        245                 250                 255acc ggc aag cca cta atc gac gtc atc gtt gac gct gca ggt cag aag   1292Thr Gly Lys Pro Leu Ile Asp Val Ile Val Asp Ala Ala Gly Gln Lys
    260                 265                 270ggc acc ggc aag tgg act gtc aag gct gct ctt gat ctg ggt att gct   1340Gly Thr Gly Lys Trp Thr Val Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly Ile Ala
275                 280                 285acc acc ggc atc ggc gaa cgt gtt ttc gca cgt gca ctc tcc ggc gca   1388Thr Thr Gly Ile Gly Glu Arg Val Phe Ala Arg Ala Leu Ser Gly Ala290                 295                 300                 305acc agc cag cgc gct gca gca cag ggc aac cta cct gca ggt gtc ctc   1436Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val Leu
            310                 315                 320acc gat ctg gaa gca ctt ggc gtg gac aag gca cag ttc gtc gaa gga   1484Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Lys Ala Gln Phe Val Glu Gly
        325                 330                 335ctt cgc cgt gca ctg tac gca tcc aag ctt gtt gct tac gca cag ggc   1532Leu Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln Gly
    340                 345                 350ttc gac gag atc aag gct ggc tcc gac gag aac aac tgg gac gtt gac   1580Phe Asp Glu Ile Lys Ala Gly Sar Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val Asp
355                 360                 365cct cgc gac ctc gct acc atc tgg cgc ggc ggc tgc atc att cgc gct   1628Pro Arg Asp Leu Ala Thr Ile Trp Arg Gly Gly Cys Ile Ile Arg Ala370                 375                 380                 385aag ttc ctc aac cgc atc gtc gaa gca tac gat gca aac gct gaa ctt   1676Lys Phe Leu Asn Arg Ile Val Glu Ala Tyr Asp Ala Asn Ala Glu Leu
            390                 395                 400gag tcc ctg ctg ctc gat cct tac ttc aag agc gag ctc ggc gac ctc   1724Glu Ser Leu Leu Leu Asp Pro Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp Leu
        405                 410                 415atc gat tca tgg cgt cgc gtg att gtc acc gcc acc cag ctt ggc ctg   1772Ile Asp Ser Trp Arg Arg Val Ile Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly Leu
    420                 425                 430cca atc cca gtg ttc gct tcc tcc ctg tcc tac tac gac agc ctg cgt   1820Pro Ile Pro Val Phe Ala Ser Ser Leu Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu Arg
435                 440                 445gca gag cgt ctg cca gca gcc ctg atc cac tagtgtcgac ctgcaggcgc     1870Ala Glu Arg Leu Pro Ala Ala Leu Ile His450                 455gcgagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattt cgagcttggc gtaatcaagg 1930tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa tatacgagcc 1990ggaagtataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac agtaattgcg 2050gctagcggat ctgacggttc actaaaccag ctctgcttat atagacctcc caccgtacac 2110gcctaccgcc catttgcgtc aatggggcgg agttgttacg acattttgga aagtcccgtt 2170gattttggtg ccaaaacaaa ctcccattga cgtcaatggg gtggagactt ggaaatcccc 2230gtgagtcaaa ccgctatcca cgcccattga tgtactgcca aaaccgcatc accatggtaa 2290tagcgatgac taatacgtag atgtactgcc aagtaggaaa gtccc<210>3<211>459<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>3Met Pro Ser Ser Thr Ile Asn Asn Met Thr Asn Gly Asp Asn Leu Ala1               5                  10                  15Gln Ile Gly Val Val Gly Leu Ala Val Met Gly Ser Asn Leu Ala Arg
             20              25                  30Asn Phe Ala Arg Asn Gly Asn Thr Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr
     35                  40                  45Asp Lys Thr Asp Lys Leu Ile Ala Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe
 50                  55                  60Ile Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro65                  70                  75                  80Arg Arg Ala Ile Ile Met Val Gln Ala Gly Asn Ala Thr Asp Ala Val
             85                  90                  95Ile Asn Gln Leu Ala Asp Ala Met Asp Glu Gly Asp Ile Ile Ile Asp
        100                 105                 110Gly Gly Asn Ala Leu Tyr Thr Asp Thr Ile Arg Arg Glu Lys Glu Ile
    115                 120                 125Ser Ala Arg Gly Leu His Phe Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Gly Glu
130                 135                 140Glu Gly Ala Leu Asn Gly Pro Ser Ile Met Pro Gly Gly Pro Ala Lys145                 150                 155                 160Ser Tyr Glu Ser Leu Gly Pro Leu Leu Glu Ser Ile Ala Ala Asn Val
            165                 170                 175Asp Gly Thr Pro Cys Val Thr His Ile Gly Pro Asp Gly Ala Gly His
        180                 185                 190Phe Val Lys Met Val His Asn Gly Ile Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val
    195                 200                 205Ile Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu Pro Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro
210                 215                 220Ala Glu Ile Ala Glu Val Phe Lys Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp225                 230                 235                 240Ser Tyr Leu Ile Glu Ile Thr Ala Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala
            245                 250                 255Glu Thr Gly Lys Pro Leu Ile Asp Val Ile Val Asp Ala Ala Gly Gln
        260                 265                 270Lys Gly Thr Gly Lys Trp Thr Val Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly Ile
    275                 280                 285Ala Thr Thr Gly Ile Gly Glu Arg Val Phe Ala Arg Ala Leu Ser Gly
290                 295                 300Ala Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val305                 310                 315                 320Leu Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Lya Ala Gln Phe Val Glu
            325                 330                 335Gly Leu Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln
        340                 345                 350Gly Phe Asp Glu Ile Lys Ala Gly Ser Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val
    355                 360                 365Asp Pro Arg Asp Leu Ala Thr Ile Trp Arg Gly Gly Cys Ile Ile Arg
370                 375                 380Ala Lys Phe Leu Asn Arg Ile Val Glu Ala Tyr Asp Ala Asn Ala Glu385                 390                 395                 400Leu Glu Ser Leu Leu Leu Asp Pro Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp
            405                 410                 415Leu Ile Asp Ser Trp Arg Arg Val Ile Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly
        420                 425                 430Leu Pro Ile Pro Val Phe Ala Ser Ser Leu Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu
    435                 440             445Arg Ala Glu Arg Leu Pro Ala Ala Leu Ile His
450                 455<210>4<21l>2160<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><22l>CDS<222>(327)..(2063)<223>poxB<400>4ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt 120ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt 180gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg 240aagcgtggca acaactggaa tttaagagca caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac 300aatagccata acgttgagga gttcag atg gca cac agc tac gca gaa caa tta  353
                         Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu
                           1               5att gac act ttg gaa gct caa ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg   401Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val10                  15                  20                  25ggt gac agc ctt aat ccg atc gtg gat gct gtc cgc caa tca gat att   449Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile
             30                  35                  40gag tgg gtg cac gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt   497Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly
         45                  50                  55gcg gaa tcg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tct tgt   545Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys
     60                  65                  70ggt cct gga aac aca cac ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga   593Gly Pro Gly Asn Thr His Leu Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg
 75                  80                  85aat ggt gcg aag gtg ttg gcc atc gct agc cat att ccg agt gcc cag   641Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln90                  95                 l00                 l05att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag   689Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys
            110                 115                 120gaa tgc tct ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa   737Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu
        125                 130                 135cgc att ttg cat cac gcg att cag tcc acc atg ggt ggt aaa ggt gtg   785Arg Ile Leu Ris His Ala Ile Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val
    140                 145                 150tcg gtg gta gtg att cct ggt gat atc gct aag gaa gac gca ggt gac   833Ser Val Val Val Ile Pro Gly Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp
155                 160                 165ggt act tat tcc aat tcc act att tct tct ggc act cct gtg gtg ttc   881Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe170                 175                 180                 185ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct   929Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala
            190                 195                 200aag tct gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg   977Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala
        205                 210                 215cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg   1025Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala
    220                 225                 230ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc   1073Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly
235                 240                 245atg tct ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tcc aat gag   1121Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu250                 255                 260                 265gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tct gat ttc   1169Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe
            270                 275                 280ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att   1217Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile
        285                 290                 295ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca   1265Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala
    300                 305                 310aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc   1313Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser
315                 320                 325ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg agc tcg gtg   1361Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val330                 335                 340                 345gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct   1409Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro
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    380                 385                 390gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc   1553Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly
395                 400                 405acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat   1601Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp410                 415                 420                 425cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg   1649Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met
            430                 435                 440ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag   1697Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys
        445                 450                 455gct gtg gtg ttt aac aac agt tct ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg   1745Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met
    460                 465                 470ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat   1793Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn
475                 480                 485ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc   1841Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr490                 495                 500                 505gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gca tat cct   1889Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro
            510                 515                 520gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc   1937Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile
        525                 530                 535cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc agc aag gcg gcc   1985Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala
    540                 545                 550acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc   2033Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala
555                 560                 565cgt tcg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct     2083Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro570                 575gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143gcccatgaga ttgccct                                                2160<210>5<211>579<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>5Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile ASp Thr Leu Glu Ala Gln1               5                  10                  15Gly Val Lya Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile
         20                  25                  30Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn
     35                  40                  45Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly
 50                  55                  60Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu65                  70                  75                  80Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala
             85                  90                  95Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln
        100                 105                 110Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lye Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu
    115                 120                 125Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile
130                 135                 140Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly145                 150                 155                 160Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr
            165                 170                 175Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala
        180                 185                 190Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys
    195                 200                 205Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu
210                 215                 220Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile225                 230                 235                 240Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr
            245                 250                 255Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu
        260                 265                 270Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala
    275                 280                 285Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys
290                 295                 300Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro305                 310                 315                 320His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys
            325                 330                 335Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn
        340                 345                 350Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu
    355                 360                 365Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met
370                 375                 380Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg385                 390                 395                 400Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro
            405                 410                 415His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala
        420                 425                 430Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr
    435                 440                 445Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser
450                 455                 460Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu465                 470                 475                 480Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala
            485                 490                 495Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu
        500                 505                 510Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile
    515                 520                 525Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu
530                 535                 540Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly545                 550                 555                 560Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile
            565                 570                 575Pro Thr Pro<210>6<211>875<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<400>6tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc 60accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac 120gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg 180gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg 240ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt 300aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt 360gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg 420gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac 480gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg 540gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca 600gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta 660gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct 720attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat 780gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc 840cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc                            875

Claims (10)

1.一种通过发酵棒状细菌制备L-氨基酸的方法，包括进行以下步骤：
a)发酵产生所需L-氨基酸的细菌，该细菌中至少gnd基因是扩
  增的，
b)浓缩培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及
c)分离产生的L-氨基酸。
2.权利要求1的方法，其中使用的细菌中，所需L-氨基酸的生物合成途径的其它基因也被扩增，尤其是过表达。
3.权利要求1的方法，其中使用制备L-苏氨酸，L-赖氨酸，L-异亮氨酸或L-色氨酸的棒状细菌。
4.权利要求3的方法，其中使用制备L-赖氨酸的的棒状细菌。
5.如权利要求2发酵制备L-赖氨酸的方法，其中在尤其已经产生L-赖氨酸的棒状微生物中，选自以下一组的一或多个基因被同时扩增、特别是过表达：
5.1编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
5.2编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，
5.3编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
5.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
5.5编码转酮酶的tkt基因，
5.6编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，
5.7编码赖氨酸输出的lysE基因，
5.8zwal基因，
5.9编码烯醇化酶的eno基因。
6.如权利要求2发酵制备L-苏氨酸的方法，其中在尤其已经产生L-苏氨酸的棒状微生物中，选自以下一组的一或多个基因被同时扩增、尤其是过表达：
6.1编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因，
6.2编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
6.3编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
6.4编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因，
6.5编码转酮酶的tkt基因
6.6编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，
6.7编码苏氨酸输出的thrE基因，
6.8zwal基因，
6.9编码烯醇化酶的eno基因。
7.权利要求2的方法，其中为制备L-氨基酸尤其L-赖氨酸或L-苏氨酸，发酵这样的细菌，该细菌中选自以下一组的一或多个基因被同时弱化：
7.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，
7.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，
7.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，
7.4zwa2基因。
8.权利要求2-6任一项的方法，其中为实现扩增，所述基因或核苷酸序列的拷贝数，通过用携带这些基因或核苷酸序列的质粒载体转化微生物而提高。
9.图1所示的质粒载体pEC-T18mob2，其以在大肠杆菌K-12DH5α中的形式保藏，保藏号DSM 13244。
10.一种通过导入权利要求9的质粒载体而转化的棒状微生物，尤其棒杆菌属，所述载体另外还含有gnd基因。
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