CN1317050A - 编码tal基因的核苷酸序列 - Google Patents

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CN1317050A CN00801335A CN00801335A CN1317050A CN 1317050 A CN1317050 A CN 1317050A CN 00801335 A CN00801335 A CN 00801335A CN 00801335 A CN00801335 A CN 00801335A CN 1317050 A CN1317050 A CN 1317050A
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Abstract

本发明涉及来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的多核苷酸序列：a)与编码包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包含a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及制备L一氨基酸的方法，其包括如下步骤，a)发酵产生所需的L－氨基酸的细菌，该细菌中tal基因是扩增的，b)在培养基或细菌细胞中浓缩所需产物，及c)分离L－氨基酸。

Description

编码tal基因的核苷酸序列
本发明提供了编码tal基因的核苷酸序列，和用具有扩增的tal基因的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸的方法。
现有技术
氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的调节代谢物营养缺陷的并产生L-氨基酸如L-赖氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。此方面的综述文章见Kinoshita(＂谷氨酸细菌＂，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，BenjaminCummings，英国伦敦，1985,115-142),Hilliger(生物技术2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技术的关键回顾15,73-103(1995))和Sahm等(纽约科学协会年报782,25-39(1996))。
戊糖磷酸循环对于棒状细菌生物合成以及氨基酸特别是L-赖氨酸生产的重要性是使得专家们努力的原因。
因此，Oishi和Aida(农业和生物化学29,83-89(1965))已报道了产氨短杆菌的“己糖单磷酸逃避(shunt)”。Sugimoto和Shio(农业和生物化学51,101-108(1987))报道了黄色短杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的调节。Sugimoto和Shio(农业和生物化学51,1257-1263(1987))报道了黄色短杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的调节。
发明目的
本发明人目的在于为改良氨基酸尤其是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸的发酵生产而提供新措施。
发明描述
氨基酸、尤其是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养，因此提供生产氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提到L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅是指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)包含a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选为能复制的DNA，包含
(ⅰ)选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，
(ⅳ)(ⅰ)中中性功能有义突变。
本发明还提供了
权利要求4的多核苷酸，包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，
权利要求5的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的多肽，
含有权利要求1的多核苷酸序列的载体，
以及作为宿主细胞的含有载体的棒状细菌。
本发明还提供了基本上包含一多核苷酸序列的多核苷酸，其可通过用含有相应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸或其片段的序列的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包含具有相应于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的所述多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码Tal蛋白的全长cDNA，以及分离与tal基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码转醛酶的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽，特别是具有转醛酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽至少80％、特别是至少90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸的方法，在该棒状细菌中编码tal基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性的增加，例如通过增加一或多个基因的拷贝数，通过用强启动子或编码具有升高的活性的相应酶的基因或等位基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸。此微生物可以是棒状细菌尤其是棒杆菌属的代表菌。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
醋谷棒杆菌ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
黄色短杆菌ATCC14067
乳发酵短杆菌ATCC13869和
扩展短杆菌ATCC14020
和从中获得的生产L-赖氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌FERM-P1709
黄色短杆菌FERM-P1708
乳发酵短杆菌FERM-P1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P6464
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
谷氨酸棒杆菌DSM5715
谷氨酸棒杆菌DM58-1
谷氨酸棒杆菌DSM12866
和从中获得的生产L-苏氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌ATCC21649
黄色短杆菌BB69
黄色短杆菌DSM5399
乳发酵短杆菌FERM-BP269
乳发酵短杆菌TBB-10
和从中获得的生产L-异亮氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌ATCC14309
谷氨酸棒杆菌ATCC14310
谷氨酸棒杆菌ATCC14311
谷氨酸棒杆菌ATCC15168
产氨棒杆菌ATCC6871
和从中获得的生产L-色氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌ATCC21850和
谷氨酸棒杆菌KY9218(pKW9901)。
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码转醛酶(EC2.2.1.2)的新tal基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的tal基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie,Weinheim,德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50,495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252:255-265,1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987,Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA,84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3),317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。O＇Donohue(来自谷氨酸棒杆菌的4个常见芳香族氨基酸生物合成基因的克隆和分子分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway,1997)描述了用Short等(核酸研究16:7583)描述的λZap表达系统克隆谷氨酸棒杆菌的基因。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25,807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19:259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报74:5463-5467,1977)所述。
获得的DNA序列随后可用已知的算法或序列分析程序研究，如Staden的程序(核酸研究14,217-232(1986)),Butler的GCG程序(生物化学分析方法39,74-97(1998)),Pearson和Lipman的FASTA算法(美国科学院院报85,2444-2448(1988))或Altschul的BLAST算法(自然遗传学6,119-129(1994))，并与公共数据库中的存在的序列比较。核苷酸序列的公共数据库是例如欧洲分子生物学实验室(EMBL，德国海德堡)的数据库，或国家生物工程信息中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)的数据库。
本发明提供了含有编码tal基因的DNA区段的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列，所得tal基因产物的氨基酸序列如SEQID NO:2和SEQ ID NO:4所示。
以上述方式产生的基因文库可通过用已知序列如zwf基因(JP-A-09224661)的核苷酸探针杂交而进一步研究。在杂交反应中呈阳性的克隆的克隆的DNA随之测序以一方面给出所用探针的已知核苷酸序列，另一方面给出相邻的新DNA序列。
通过遗传密码的简并性由SEQ ID NO:3产生的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，蛋白质中的保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169:751-757(1987))O’Regan等(基因77:237-251.(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3:240-247(1994)),Hochuli等(生物/技术6:1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列也是本发明的一部分。
类似地，与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。最后，用产生自SEQ ID NO:3的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41:255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在tal基因过表达后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-氨基酸发酵生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白的分解也可提高酶促活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5,137-146(1987)),Guerrero等(基因138,35-41(1994)),Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988)),Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893,Schwarzer和Puhler(生物/技术9,84-87(1991)),Reinscheid等(应用及环境微生物学60,126-132(1994)),LaBarre等(细菌学杂志175,1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246,Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891,Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998)),Makrides(微生物学综述60:512-538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的tal基因可借助于质粒过表达。
合适的质粒是在棒状细菌中复制的质粒。各种已知的质粒载体，如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64:549-554),pEKExl(Eikmanns等，基因102:93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107:69-74(1991))是基于隐蔽质粒pHM1519,pBL1或pGA1。其它质粒载体如基于pCG4(US-A4,489,160)，或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学通信66,119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的质粒载体可以同样方式使用。
其他合适的质粒载体是那些可通过整合进染色体而进行基因扩增的质粒载体，例如，由Reinscheid等(应用及环境微生物学60:126-132(1994))所述的用于复制或扩增hom-thrB操纵子的质粒载体。在这一方法中，将完整基因克隆进能在宿主(典型地是大肠杆菌)中复制而在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。可考虑的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1,784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145,69-73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison,WI,USA),pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269:32678-84；US-A 5,487,993),pCRBlunt(Invitrogen,Groningen，荷兰；Bemard等，分子生物学杂志，234:534-541(1993)),pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173:4510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，基因41:337-342)。含有待扩增基因的质粒载体然后可经接合或转化转移进希望的谷氨酸棒杆菌菌株。接合方法例如如Schafer等(应用及环境微生物学60,756-759(1994))所述。转化方法例如如Thierbach等(应用微生物学及细菌学29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技术7,1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通信123,343-347(1994))所述。经“交换”事件而同源重组后，得到的菌株含有至少两个拷贝的所需基因。
有助于进行整合扩增过程的质粒载体的例子是pSUZ1，如图1所示。质粒pSUZ1由Spratt等所述的大肠杆菌载体pBGS8(基因41:337-342(1986))组成，其中掺入了tal基因。
另外，不仅是tal基因，而且特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、戊糖磷酸途径或氨基酸输出的一或多种酶的扩增或过表达，对氨基酸的生产可以是有益的。
因此，为生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸，例如可同时过表达一或多种选自如下一组的基因：
·编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，
·编码抗反馈天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等(1990)，分子和普通遗传学224:317-324)
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)，
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254,395-403(1998))，
·编码酮基转移酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，德国海德堡)数据库的登录号AB023377)，
·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(JP-A-9-224662)，
·编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-9-224661)，
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)，
·zwa1基因(DE19959328.0；DSM13115)，或
·编码烯醇化酶的eno基因(DE19947791.4)，
·devB基因，
·opcA基因。
因此，为生产L-苏氨酸，例如可同时过表达一或多种选自如下一组的基因：
·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(Peoples等，分子微生物学2,63-72(1988))或编码“抗反馈”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因(Archer等，基因107,53-59(1991))，
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)，
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254,395-403(1998))，
·编码酮基转移酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，德国海德堡)数据库的登录号AB023377)，
·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(JP-A-9-224662)，
·编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-9-224661)，
·编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因(DE19941478.5；DSM12840)，
·zwa1基因(DE19959328.0；DSM13115)，或
·编码烯醇化酶的eno基因(DE19947791.4)，
·devB基因，
·opcA基因(DSM13264)。
对于氨基酸的生产，除了扩增tal基因外，还有利的是同时弱化
·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1,DSM13047)和/或
·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396,478,DSM12969)，或
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7；DSM13114)，或
·zwa2基因(DE19959327.2；DSM13113)。
除tal基因的过表达之外，消除非所需的副反应对氨基酸特别是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或用分批方法(分批培养)，补料分批方法(补料方法)或重复补料分批方法(重复补料方法)培养以生产L-氨基酸。已知的培养法由Chmiel所著教材(生物方法技术1．生物方法技术导论(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)，或由Storhas所著教材(生物反应器和外围设备(ViewegVerlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.,USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中。起始物质可以单批形式或在培养期间以适当方式补入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30,(1958),1190)所述茚三酮衍生化作用进行。
下述微生物已根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)：
大肠杆菌JM109/pSUZ1，保藏号DSM13263。
SEQ ID NO:1还含有新的devB基因。本发明方法用于发酵制备氨基酸。
本发明包括如下附图：
图1：质粒pSUZ1图。
图中所采用的缩写有如下含义：
lacZ:lacZα基因片段的区段
kanr：卡那霉素抗性
tal:tal基因
ori：质粒pBGS8的复制起点
BclⅠ：限制酶BclⅠ的酶切位点
EcoRⅠ：限制酶EcoRⅠ的酶切位点
HindⅢ：限制酶HindⅢ的酶切位点
PstⅠ：限制酶PstⅠ的酶切位点
SacⅠ：限制酶SacⅠ的酶切位点
实施例
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。所用分子生物学技术例如质粒DNA分离、限制酶处理、连接、大肠杆菌的标准转化等(除非另有说明)如Sambrook等(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室，美国)所述。
实施例1从谷氨酸棒杆菌ATCC13032制备基因组粘粒基因文库
来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA如Tauch等(1995，质粒33:168-179)所述分离，并用限制酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。DNA片段用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)去磷酸化。得自Stratagene(La Jolla,USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)，美国科学院院报84:2160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述XbaⅠ，编码27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA连接酶(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用GigapackⅡ XL包装提取物(Stratagene,La Jolla,USA，产品描述GigapackⅡ XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 tal基因的分离和测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106,Qiagen,Hilden，德国)根据厂商指导分离一个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021,Qiagen,Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物学通信，123:343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990,美国科学院院报87:4645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200,Qiagen,Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74:5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044,Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphoresis NF”丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶(29∶1)(产品号A124.1,Roth,Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)进行计算机辅助编码区分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI,Bethesda,MD,USA)的非冗余数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示。
实施例3 tal基因的克隆
用PCR扩增含有谷氨酸棒杆菌ATCC13032的完整tal基因和两侧的上游和下游区的DNA片段。用从实施例1和2确定的序列设计的寡核苷酸引物进行PCR反应。根据Heery和Dunican(应用和环境微生物学59:791-799(1993))所述从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离基因组DNA并用作模板。所用tal引物为：正向引物：5＇GGT ACA AAG GGT CTT AAG 3＇反向引物：5＇GAT TTC ATG TCG CCG TTA 3＇PCR参数如下：
35个循环
95℃3分钟
94℃1分钟
47℃1分钟
72℃45秒
2.5mM MgCl2
约150-200ng DNA模板。
获得的PCR产物克隆进购自Promega公司的市售pGEM-T载体(pGEM-T Easy Vector System 1，目录号A1360，Promega UK，Southampton)，用大肠杆菌JM109(Yanisch-Perron等，基因33:103-119(1985))作为宿主。随后，完整tal基因作为EcoRⅠ片段从pGEMT-载体分离并克隆进大肠杆菌载体pBGS8的lacZα EcoRⅠ位点(Spratt等，基因41(2-3):337-342(1986))。所用限制酶得自宝灵格曼海姆英国有限公司(Bell Lane,Lewes East Sussex BN7 1LG UK)并根据厂商指导应用。然后用这一连接混合物转化大肠杆菌JM109，并在补加1mM异丙基硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，0.02％5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃半乳糖苷(XGAL)和50mg/l卡那霉素的Luria琼脂上选择电转化子。琼脂平板在37℃保温12小时。从一个转化子分离质粒DNA，用EcoRⅠ进行限制酶分析鉴定，这一新构建体命名为pSUZ1。
实施例4制备菌株谷氨酸棒杆菌DSM5715::pSUZ1
根据Liebl等(FEMS微生物学通信53:299-303(1989))所述电穿孔方法，用质粒pSUZ1转化菌株DSM5715。在补加25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂上进行转化子的选择，LBHIS琼脂包含18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/lNaCl和18g/l Bacto-琼脂。在33℃保温2天。
由于载体pSUZ1不能在菌株DSM5715中复制，所以仅显示由pSUZ1的整合赋予的卡那霉素抗性的克隆能生长。
获得的整合菌株称为DSM5715::pSUZ1。
实施例5生产L-赖氨酸
实施例4中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pSUZ1在适于生产L-赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的L-赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgⅢ。
培养基CgⅢ：
NaCl                    2.5g/l
Bacto-肽胨              10g/l
Bacto-酵母膏            10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)    2％(w/v)
pH调至pH7.4。
向培养基中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.1。培养基MM用作主培养物。培养基MM：CSL(玉米浆)           5g/lMOPS(吗啉代丙磺酸)    20g/l葡萄糖(单独高压灭菌)  50g/l(NH4)2SO4         25g/lKH2PO4             0.1g/lMgSO4·7H2O        1.0g/lCaCl2·2H2O        10mg/lFeSO4·7H2O        10mg/lMnSO4·H2O         5.0mg/l生物素(过滤灭菌)      0.3mg/l硫胺素.HCl(过滤灭菌)  0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌)    0.1g/lCaCO3               25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
24和48小时后，用Biomek(Beckman仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
所得结果示于表1。
表1
菌株 时间(小时) 赖氨酸-HClg/L
 DSM5715     24     8.1
 DSM5715::pSUZ1     24     8.6
 DSM5715     48     14.7
 DSM5715::pSUZ1     48     15.4
             原始表格(为递交)-2000年7月3日03:06:22PM打印
 0-10-1-1 PCT/RO/134(EASY)表关于保藏微生物或其他生物材料的说明(PCT细则13之二)使用如右栏程序制备 PCT-EASY版本2.90(2000年3月8日更新)
 0-2 国际申请号
 0-3 申请人或代理人文档号 990228 BT
 11-11-2 如下说明涉及的保藏微生物或其他生物材料见说明书页行 185-10
 1-31-3-11-3-21-3-31-3-4 保藏事项保藏单位名称保藏单位地址保藏日期保藏编号 德意志微生物保藏中心德国不伦瑞克2000年1月26日DSMZ 13263
 1-4 补充说明 无
 1-5 本说明是为下列指定国作的 所有指定国
 1-6 单独提供说明下列说明将随后向国际局提供 无
                                        由受理局填写
 0-4 本页已经和国际申请一起收到(是或否) 是
 0-4-1 受权官员
                                        由国际局填写
 0-5 国际局收到本页日期
 0-5-1 受权官员
序列表<110>国立爱尔兰大学，戈尔韦
 德古萨-于尔斯股份公司<120>编码tal基因的核苷酸序列<130>990228BT<140><141><160>4<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>6995<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(2471)..(3550)<223>tal-Gen<400>1cacatttgaa ccacagttgg ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg 60acgggtcaga ttaagcaaag actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaacca 120attaacctaa gtcgtagatc tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc 180ccggtttaac ccaggaagga ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca 240ctgtacgcaa ttacccctct gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc 300gtgtcctcgc tgcagacgct gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga 360gcctggctcc ccttgcatac accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca 420ccaactgggc aggccgtgac cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt 480acatccagct ttacttgggt ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca 540cctgggattc cttgacccca ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca 600ccactggccc tcttggccag ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc 660gtgagcgtgg cctattcgac ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca 720tctacgtcat tgcttctgat ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca 780tcgctggcac ccagcagctg ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca 840tcgaagacaa cactgagatc gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg 900gctggcagac cattgaggtt gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg 960ctgaggctaa gaaggacacc aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct 1020tcccagctcc aactatgatg aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg 1080aggttgcagc aaccaagact gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg 1140atgaggttat cgctcacacc cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag aaggctgcat 1200ggcaggtcaa gttcgatgag tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc 1260gcctgaactc ccgtgagctt ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag 1320atgagaaggg cgtcgcaact cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga 1380cccttcctga gctgtggggc ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca 1440agggctcccc ttccttcggc cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt 1500acggccgtaa cctgcacttc ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca 1560tttccctcca cggtggcacc cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca 1620tgcgtcctgc agttcgtctt gcagctctca tggagaccga cgcttactac gtctggaccc 1680acgactccat cggtctgggc gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg 1740cactgcgcgc catcccaggt ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc 1800aggcttgggc tgcagcactt gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc 1860agaacgttcc tgttctggaa ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg 1920gctacgtcct ggttgagggt tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct 1980ccgaggttca gcttgcagtt aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc 2040gcgttgtttc cgttccttgc atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt 2100ccgttctgcc tgcagctgtg accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt 2160ggtaccgctt cttgggcacc cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg 2220cggattacca gaccctgttt gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg 2280ccaaggactc cattaacggt taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat 2340gattctccgg aattttattg ccccgggttg ttgttgttaa tcggtacaaa gggtcttaag 2400cacatccctt acttgcctgc tctccttgag cacagttcaa gaacaattct tttaaggaaa 2460atttagtttc atg tct cac att gat gat ctt gca cag ctc ggc act tcc    2509
       Met Ser His Ile Asp Asp Leu Ala Gln Leu Gly Thr Ser
         1               5                  10act tgg ctc gac gac ctc tcc cgc gag cgc att act tcc ggc aat ctc   2557Thr Trp Leu Asp Asp Leu Ser Arg Glu Arg Ile Thr Ser Gly Asn Leu
 15                  20                  25agc cag gtt att gag gaa aag tct gta gtc ggt gtc acc acc aac cca   2605Ser Gln Val Ile Glu Glu Lys Ser Val Val Gly Val Thr Thr Asn Pro30                  35                  40                  45gct att ttc gca gca gca atg tcc aag ggc gat tcc tac gac gct cag   2653Ala Ile Phe Ala Ala Ala Met Ser Lys Gly Asp Ser Tyr Asp Ala Gln
             50                  55                  60atc gca gag ctc aag gcc gct ggc gca tct gtt gac cag gct gtt tac   2701Ile Ala Glu Leu Lys Ala Ala Gly Ala Ser Val Asp Gln Ala Val Tyr
         65                  70                  75gcc atg agc atc gac gac gtt cgc aat gct tgt gat ctg ttc acc ggc   2749Ala Met Ser Ile Asp Asp Val Arg Asn Ala Cys Asp Leu Phe Thr Gly
     80                  85                  90atc ttc gag tcc tcc aac ggc tac gac ggc cgc gtg tcc atc gag gtt   2797Ile Phe Glu Ser Ser Asn Gly Tyr Asp Gly Arg Val Ser Ile Glu Val
 95                 100                 105gac cca cgt atc tct gct gac cgc gac gca acc ctg gct cag gcc aag   2845Asp Pro Arg Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ala Thr Leu Ala Gln Ala Lys110                 115                 120                 125gag ctg tgg gca aag gtt gat cgt cca aac gtc atg atc aag atc cct   2893Glu Leu Trp Ala Lys Val Asp Arg Pro Asn Val Met Ile Lys Ile Pro
            130                 135                 140gca acc cca ggt tct ttg cca gca atc acc gac gct ttg gct gag ggc   2941Ala Thr Pro Gly Ser Leu Pro Ala Ile Thr Asp Ala Leu Ala Glu Gly
        145                 150                 155atc agc gtt aac gtc acc ttg atc ttc tcc gtt gct cgc tac cgc gag   2989Ile Ser Val Asn Val Thr Leu Ile Phe Ser Val Ala Arg Tyr Arg Glu
    160                 165                 170gtc atc gct gcg ttc atc gag ggc atc aag cag gct gct gca aac ggc   3037Val Ile Ala Ala Phe Ile Glu Gly Ile Lys Gln Ala Ala Ala Asn Gly
175                 180                 185cac gac gtc tcc gag atc cac tct gtg gct tcc ttc ttc gtc tcc cgc   3085His Asp Val Ser Lys Ile His Ser Val Ala Ser Phe Phe Val Ser Arg190                 195                 200                 205gtc gac gtt gag atc gac aag cgc ctc gag gca atc gga tcc gat gag   3133Val Asp Val Glu Ile Asp Lys Arg Leu Glu Ala Ile Gly Ser Asp Glu
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        225                 230                 235tac gct gtg tac aag gag ctt ttc gac gcc gcc gag ctg cct gaa ggt   3229Tyr Ala Val Tyr Lys Glu Leu Phe Asp Ala Ala Glu Leu Pro Glu Gly
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255                 260                 265gcg tac gct gca act ctt tac gtt tcc gag ctg gct ggt cca aac acc   3325Ala Tyr Ala Ala Thr Leu Tyr Val Ser Glu Leu Ala Gly Pro Asn Thr270                 275                 280                 285gtc aac acc atg cca gaa ggc acc atc gac gcg gtt ctg gag cag ggc   3373Val Asn Thr Met Pro Glu Gly Thr Ile Asp Ala Val Leu Glu Gln Gly
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210                 215                 220Leu Arg Gly Lys Ala Gly Val Ala Asn Ala Gln Arg Ala Tyr Ala Val225                 230                 235                 240Tyr Lys Glu Leu Phe Asp Ala Ala Glu Leu Pro Glu Gly Ala Asn Thr
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290                 295                 300Gly Asp Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala Val Phe Ser305                 310                 315                 320Gln Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe Gln Val Leu
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         20                  25                  30att gag gaa aag tct gta gtc ggt gtc acc acc aac cca gct att ttc   144Ile Glu Glu Lys Ser Val Val Gly Val Thr Thr Asn Pro Ala Ile Phe
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 50                  55                  60ctc aag gcc gct ggc gca tct gtt gac cag gct gtt tac gcc atg agc   240Leu Lys Ala Ala Gly Ala Ser Val Asp Gln Ala Val Tyr Ala Met Ser65                  70                  75                  80atc gac gac gtt cgc aat gct tgt gat ctg ttc acc ggc atc ttc gag   288Ile Asp Asp Val Arg Asn Ala Cys Asp Leu Phe Thr Gly Ile Phe Glu
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    195                 200                 205Glu Ile Asp Lys Arg Leu Glu Ala Ile Gly Ser Asp Glu Ala Leu Ala
210                 215                 220Leu Arg Gly Lys Ala Gly Val Ala A6n Ala Gln Arg Ala Tyr Ala Val225                 230                 235                 240Tyr Lys Glu Leu Phe Asp Ala Ala Glu Leu Pro Glu Gly Ala Asn Thr
            245                 250                 255Gln Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Val Lys Asn Pro Ala Tyr Ala
        260                 265                 270Ala Thr Leu Tyr Val Ser Glu Leu Ala Gly Pro Asn Thr Val Asn Thr
    275                 280                 285Met Pro Glu Gly Thr Ile Asp Ala Val Leu Glu Gln Gly Asn Leu His
290                 295                 300Gly Asp Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala Val Phe Ser305                 310                 315                 320Gln Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe Gln Val Leu
            325                 330                 335Glu Thr Glu Gly Val Asp Lys Phe Val Ala Ser Trp Ser Glu Leu Leu
        340                 345                 350Glu Ser Met Glu Ala Arg Leu Lys
    355                 360

Claims (16)

1、来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的至少一个多核苷酸序列：
a)与编码包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)包含a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
2、权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选地是重组的DNA，并额外含有编码基因tkt,zwf,opcA和devB的至少一个核苷酸序列。
3、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4、权利要求1的多核苷酸，包含如SEQ ID NO:3所示的一个核苷酸序列。
5、权利要求2的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的多肽。
6、权利要求2的可复制的DNA，包含
(ⅰ)如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于的(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(ⅳ)(ⅰ)中中性功能的有义突变。
7、作为宿主细胞的棒状细菌，其含有携带权利要求1的多核苷酸的载体。
8、制备L-氨基酸的方法，其中进行以下步骤：
(a)发酵产生所需的L-氨基酸的细菌，该细菌中至少tal基因及任选地tkt基因、zwf基因、devB基因或opcA基因中的一或多个基因是同时扩增的，
(b)在培养基或细菌细胞中积累所需产物，及
(c)分离所需的L-氨基酸。
9、权利要求8的方法，特征在于使用如此的细菌，该细菌中所需的L-氨基酸生物合成途径的其他基因是额外扩增的。
10、权利要求8的方法，其中使用如此的细菌，该细菌中降低所需的L-氨基酸形成的代谢途径至少被部分消除。
11、权利要求8-12任一项的方法，其中使用产生L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸或L-色氨酸的棒状细菌。
12、权利要求8的发酵制备L-氨基酸特别是赖氨酸方法，其中在特别是已产生L-氨基酸的所述棒状微生物中，选自如下一组的一或多个基因同时扩增或过表达：
12.1编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
12.2编码抗反馈天冬氨酸激酶的lysC基因，
12.3编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
12.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
12.5编码苹果酸-醌氧化还原酶的mqo基因，
12.6编码酮基转移酶的tkt基因，
12.7编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，
12.8编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，
12.9编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因，
12.10zwa1基因，
12.11编码烯醇化酶的eno基因，
12.12opcA基因。
13、权利要求8的发酵制备L-苏氨酸方法，其中在特别是已产生L-苏氨酸的棒状微生物中，选自如下一组的一或多个基因同时扩增或过表达：
13.1编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因或编码“抗反馈”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因，
13.2编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
13.3编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
13.4编码苹果酸-醌氧化还原酶的mqo基因，
13.5编码酮基转移酶的tkt基因，
13.6编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，
13.7编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，
13.8编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因，
13.9 zwa1基因，
13.10编码烯醇化酶的eno基因，
13.11opcA基因。
14、权利要求10的方法，其中为制备L-氨基酸，特别是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸或L-色氨酸，发酵如此的细菌，该细菌中选自如下一组的一或多个基因同时弱化：
14.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，
14.2编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，
14.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，或
14.4zwa2基因。
15、权利要求1的多核苷酸序列作为杂交探针分离编码tal基因产物的cDNA的应用。
16、权利要求1的多核苷酸序列作为杂交探针分离与tal基因的序列具有高度相似性的cDNA或基因的应用。
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