CN1461346A - 编码menE基因的核苷酸序列 - Google Patents

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CN1461346A
CN1461346A CN01816032A CN01816032A CN1461346A CN 1461346 A CN1461346 A CN 1461346A CN 01816032 A CN01816032 A CN 01816032A CN 01816032 A CN01816032 A CN 01816032A CN 1461346 A CN1461346 A CN 1461346A
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克劳斯·胡特马赫尔
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Abstract

本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的多核苷酸序列：a)与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包含a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。本发明还涉及发酵棒状细菌生产L－氨基酸的方法，所述棒状细菌中至少编码O－琥珀酰苯甲酸CoA连接酶的menE基因是被弱化的。本发明还涉及包含本发明序列的多核苷酸作为杂交探针的应用。

Description

编码menE基因的核苷酸序列
本发明提供了来自棒状细菌(coryneform bacteria)的编码menE基因的核苷酸序列，和通过弱化menE基因发酵生产氨基酸的方法。
现有技术
L-氨基酸特别是赖氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或重要的调节代谢物缺陷的并产生氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产L-氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因及评价对氨基酸生产的作用而实现。
发明目的
本发明人目的在于为改良氨基酸的发酵生产而提供新措施。
发明概述
以下提及的L-氨基酸或者氨基酸是指一或多种氨基酸，包括其盐，选自L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸和L-精氨酸。L-赖氨酸是特别优选的。
当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅指碱，还包括其盐，例如赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了来自棒状细菌的一种分离的多核苷酸，其包含编码menE基因的多核苷酸序列，其选自如下一组：
a)与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)包含a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸，
所述多肽优选具有O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶的活性。
本发明还提供了上述多核苷酸，其优选包括能复制的DNA，包含
(i)SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或
(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，
(iv)(i)中的中性功能的有义突变。
本发明还提供了
一种多核苷酸，尤其是DNA，其能复制并包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，
一种多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，
一种含有本发明多核苷酸一部分的载体，但为所述序列的至少15个连续的核苷酸，
以及其中menE基因被弱化的棒状细菌，尤其是通过插入或缺失而弱化。
本发明还提供了多核苷酸，其基本上包含一多核苷酸序列，其可通过用具有相应于SEQ ID NO：1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交棒状细菌的相应的基因文库，并分离所述的多核苷酸序列来筛选获得，所述的文库包括所述的完整基因或其部分。
发明的详细描述
包含本发明序列的多核苷酸适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶的全长核酸或多核苷酸或基因，或分离与menE基因具有高度序列相似性的那些核酸或多核苷酸或基因。它们还适于掺入所谓的“阵列”，“微阵列”或“DNA芯片”中，以检测及确定相应的多核苷酸。
包含本发明序列的多核苷酸还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸包含至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。具有至少100，150，200，250或300个核苷酸的寡核苷酸任选地也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
本发明的多核苷酸包括SEQ ID NO：1的多核苷酸或从中制备的片段，也包括与SEQ ID NO：1的多核苷酸或从中制备的片段具有至少70％-80％，优选至少81％-85％，特别优选具有至少86％-90％，及更特别优选至少91％，93％，95％，97％或99％相同性的那些多核苷酸。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽，特别是具有O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO：2的多肽具有至少70％-80％，优选至少81％-85％，特别优选至少91％，93％，95％，97％或99％相同性并具有所述生物学活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸的方法，在该棒状细菌中编码menE基因的核苷酸序列被弱化，尤其是被消除或低水平表达，所述经发酵生产的氨基酸选自L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸和L-精氨酸。
文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的降低或抑制，例如通过用弱启动子或编码低活性相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)，及如果需要组合使用这些方法。
通过弱化措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质的活性或浓度的0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸。此微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌种的菌株，是例如已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
醋谷棒杆菌ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539
黄色短杆菌ATCC 14067
乳发酵短杆菌ATCC 13869和
扩展短杆菌ATCC 14020
和从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株。
本发明人已经分离谷氨酸棒杆菌的编码O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶(EC 6.2.1.26)的新menE基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的menE基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社，1989)。-非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的大肠杆菌K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252：255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，美国科学院院报84：2160-2164)，在大肠杆菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。
Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。
为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19：259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，例如由Grant等阐述的菌株DH5αmcr(美国科学院院报87(1990)，4645-4649)。借助于粘粒或其它λ载体克隆的长DNA片段然后可亚克隆，并随后用适于DNA测序的通用载体测序，测序方法如Sanger等所述(美国科学院院报74：5463-5467，1977)。
获得的DNA序列然后可用已知的算法或序列分析程序进行研究，然后与公共数据库中的序列进行比较。所述算法或序列分析程序例如Staden程序(核酸研究14，217-132(1986))，Marck程序(核酸研究16，1829-1836(1988))，或Butler的GCG程序(生化分析方法39，74-97(1998))。
已经发现了编码menE的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQID NO：1，是本发明的一部分。用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得menE基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO：2表示。
通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO：1的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。保守氨基酸置换，如在蛋白质中将甘氨酸置换为丙氨酸或将天冬氨酸置换为谷氨酸，这种交换还已知是“有义突变”，其不引起蛋白质活性的根本改变，即是中性功能的。另外已知蛋白质的N或C末端上的变化基本不损伤甚至能稳定其功能。这方面信息可参见于Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751-757(1987))，O’Regan等(基因77：237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3：240-247(1994))，Hochuli等(生物/技术6：1321-1325(1988))，及已知的遗传学和分子生物学教科书。以相应方式得自SEQ ID NO：2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的一部分杂交的DNA序列是本发明的一部分。最后，通过聚合酶链反应(PCR)，使用得自SEQ ID NO：1的引物制备的DNA序列是本发明的一部分。这种寡核苷酸的长度典型地具有至少15个核苷酸。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41：255-260)。所述杂交是在严格条件下发生的，也就是说只形成这样的杂交体，其中探针和靶序列(即用所述探针处理的多核苷酸)是至少70％相同的。已知杂交的严格性，包括洗涤步骤，是通过改变缓冲液组分，温度和盐浓度影响或确定的。所述杂交反应优选是在与洗涤步骤相比相对较低的严格条件下进行的(杂交体杂交指导，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如，在温度为50℃-68℃的5×SSC缓冲液，可以用于杂交反应。探针也可以与这样的多核苷酸杂交，所述多核苷酸与所述探针的序列相同性低于70％。这种杂交体的稳定较差，而且在严格杂交条件下会通过洗涤而除去。这可以例如通过将温度设定为大约50℃-68℃，将盐浓度降至2×SSC及任选地随后降至0.5％×SSC而实现(用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(宝灵格公司，德国曼海姆，1995)。任选地可以将盐浓度降至0.1×SSC。与所用探针的序列例如有至少70％或至少80％或至少90％-95％相同性的多核苷酸片段，可以通过将杂交温度逐步从50℃提高至68℃而分离，每步提高大约1-2℃。关于杂交的其它指导可来自市售的所谓的试剂盒形式(例如来自Roche Diagnostics GmbH的DIG Easy Hyb，德国曼海姆，目录号No：1603558)。
借助于聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导可参见于Gait所著手册寡核苷酸合成实用方法(LRL出版社，英国牛津，1984)，及Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在menE基因弱化后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸。
为获得弱化，可降低或消除menE基因的表达或酶蛋白的催化活性。两种措施可任选地组合。
可通过合适控制培养或遗传修饰(突变)用于基因表达的信号结构而实现降低基因表达。用于基因表达的信号结构例如是阻遏基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可在如下文献中发现此方面的信息，例如专利申请WO96/15246，Boyd和Murphy(细菌学杂志170：5949(1988))，Voskuil和Chambliss(核酸研究26：3548(1998))，Jensen & Hammer(生物技术和生物工程58：191(1998))，Patek等(微生物学142：1297(1996))，Vasicova等(细菌学杂志181：6188(1999))以及已知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，或Winnacker的教科书(基因和克隆，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)。
导致酶蛋白催化活性的变化或降低的突变是现有技术中已知的，可提及的例子如Qiu和Goodman的论文(生物化学杂志272：8611-8617(1997))，Sugimoto等(生物科学生物技术和生物化学61：1760-1762(1997))以及Mockel(谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶：酶的变构调节和结构，Berichte des Forschungszentmms Julichs，Jul-2906，ISSN09442952，Julich，德国，1994)。综述可参见遗传学和分子生物学的已知教科书，如Hagemann的教科书(″AllgemeineGenetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
可以考虑的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸交换对酶活性的影响，突变已知分为错义突变或无义突变。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变，其结果是插入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。缺失多个密码子典型地导致酶活性的完全丧失。产生此类突变的指导属于现有技术并可在遗传学和分子生物学的已知教科书中找到，如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann的教科书(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart.1986)。
突变谷氨酸棒杆菌基因的常用方法是Schwarzer和Puhler所述的“基因破坏”和“基因置换”方法(生物/技术9，84-87(1991))。
在基因破坏方法中，将相应基因编码区的中心部分克隆入一个质粒载体中，所述载体可在一种宿主(典型地是大肠杆菌)中复制，但在谷氨酸棒杆菌中不复制。适当的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，细菌学杂志174：5462-65(1992))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269：32678-84；美国专利5487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物学杂志234：534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173：4510-4516)。然后通过接合或转化，将含有所述基因编码区的中心部分的质粒载体转移进所需的谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如Schafer等所述(应用和环境微生物学60：756-759(1994))。转化方法例如Thierbach等(应用微生物学和生物技术29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))及Tauch等(FEMS微生物学通信123，343-347(1994))。在通过“交换”事件而同源重组后，所述基因的编码区被载体序列中断，获得两个不完整的等位基因，一个缺失3’末端，一个缺失5’末端。这个方法例如已经由Fitzpatrick使用(应用微生物学和生物技术42，575-580)，以消除谷氨酸棒杆菌的recA基因。
在“基因置换”方法中，在相应的基因中的突变，例如缺失，插入或碱基置换，是在体外建立的。然后将制备的等位基因克隆入在谷氨酸棒杆菌中不能复制的载体中，然后通过转化或接合将其移至所希望的谷氨酸棒杆菌宿主中。在通过实现整合的第一次“交换”和实现在靶基因和靶序列中的切除的适当的第二次“交换”而同源重组后，掺入了突变或等位基因。这个方法例如已经由Peters-Wendisch等使用(微生物学144，915-927(1998))，以通过缺失消除谷氨酸棒杆菌的pyc基因。
以此方式可在merE基因中进行缺失，插入或碱基置换。
另外，除了menE基因的弱化之外，特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环，戊糖磷酸循环，氨基酸输出及任选地调节蛋白的一或多种酶的扩增特别是过表达，对L-氨基酸的生产可以是有益的。
术语“增强”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，使用强启动子或使用编码高活性相应酶(蛋白质)的基因或等位基因，及任选地组合使用这些措施。
通过增强措施，尤其通过过表达，相应蛋白质的活性或浓度基于起始微生物一般提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％。
因此，例如为生产L-氨基酸，除了弱化menE基因之外，同时可以增强尤其过表达选自以下的一或多个基因：
·编码编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-198 31 609)
·编码苹果酸：：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生化杂志254，395-403(1998))，
·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(登记号No：P26512；EP-B-0387527；EP-A-0699759；WO 00/63388)，
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，
·编码高丝氨酸脱氢酶的bom基因(EP-A 0131171)，
·编码苏氨酸脱水酶的ilvA基因(Mockel等，细菌学杂志(1992)8065-8072))，或编码“反馈抗性”苏氨酸脱水酶的ilvA(Fbr)等位基因(Mockel等，(1994)细菌学杂志13：833-842)，
·编码乙酰羟酸合酶的ilvBN基因(EP-B 0356739)，
·编码二羟酸脱水酶的ilvD基因(Sahm和Eggeling(1999)，应用和环境微生物学65：1973-1979)，
·编码Zwal蛋白的zwal基因(DE：19959328.0，DSM 13115)。
除了弱化menE基因之外，同时弱化选自以下的一或多个基因，尤其是降低其表达，对氨基酸的生产是有益的：
·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，
·编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE：1995 1975.7，DSM13114)，
·编码Zwa2蛋白的zwa2基因(DE：19959327.2，DSM 13113)。
除menE基因的弱化之外，抑制非所需的二级反应对氨基酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
本发明还提供了根据本发明制备的微生物，其可在分批方法，或在补料分批法或重复补料分批法中连续培养或分批培养以生产L-氨基酸。已知的培养法由Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Bnmswick/Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-氨基酸的分析方法是现有技术中已知的。分析可经如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析，随后茚三酮衍生化作用进行，或通过反相HPLC，如Lindroth等(分析化学(1979)51：1167-1174)所述。
本发明的方法用于发酵生产氨基酸。
以下微生物根据布达佩斯条约，作为纯培养物于2001年2月23日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：
·大肠杆菌菌株Top10/pCR2.1menEint，保藏号DSM 14080。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
从大肠杆菌中分离质粒DNA，所有限制方法，Klenow和碱性磷酸酶处理，均是通过Sambrook等所述方法进行的(分子克隆实验指导，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，美国)。大肠杆菌的转化方法也见于该指导所述。
常用的营养培养基如LB或TY培养基的组分，也见于Sambrook所著指导所述。
实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文库
如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA并用限制性内切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA片段去磷酸化。得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编号251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)，美国科学院院报84：2160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编号27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。
粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编号27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编号27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编号200217)包装进噬菌体中。
为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4中并与一等份噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2menE基因的分离和测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离一个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。
得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123：343-7)进大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant，1990，美国科学院院报87：4645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。
重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmeermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29：1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
得到的原始序列资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14：217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231)制备的计算机辅助编码区分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。对该核苷酸序列的分析显示-1131碱基对的开放读框，其被称为menE基因。menE基因编码376个氨基酸的多肽。
实施例3用于menE基因的整合诱变的整合载体的制备
用Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))，从菌株ATCC 13032中分离染色体DNA。基于实施例2已知的谷氨酸棒杆菌的menE基因的序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应(见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)：
menE-int1：
5′-CTC ACT CCG TTG AAT TTG G-3′
menE-int2：
5′-CAG GTG CAT TTC TGT AGC C-3′。
所述引物由MWG生物技术公司(Ebersberg，德国)合成，根据Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法和应用指南，1990，学术出版社)用来自宝灵格曼海姆公司(德国，产品描述Taq DNA聚合酶，产品号1 146 165)的Taq聚合酶进行PCR反应。借助于PCR反应，引物可以使大小为520bp的menE基因的一个内部片段得以扩增。将以此方式扩增的产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳测试。
用来自Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carsbad，CA，USA；目录号K4500-01)将扩增的DNA片段连接进载体pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)生物/技术9：657-663)中。
将这一连接混合物电穿孔进大肠杆菌菌株TOP10中(Hanahan，DNA克隆实用方法，卷I，IRL出版社，Oxford，华盛顿特区，美国，1985)。通过将转化混合物在补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上铺板，选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。用来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化子中分离质粒DNA，用限制酶EcoRI限制消化并琼脂糖凝胶电泳(0.8％)而证实。质粒命名为pCR2.1menEint，并示于图1。
实施例4menE基因在菌株DSM 5715中的整合诱变
用Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信123：343-347(1994))，将实施例3中的载体pCR2.1menEint电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 5715中。菌株DSM 5715是AEC抗性赖氨酸生产菌。载体pCR2.1menEint在谷氨酸棒杆菌DSM 5715中不能独立复制，只有在其整合进DSM 5715的染色体中后才能在细胞中保持。通过将电穿孔混合物在补加15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)上铺板，选择携带整合进染色体的pCR2.1menEint的克隆。
用来自宝灵格公司的Dig杂交试剂盒，根据宝灵格曼海姆有限公司的“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)的方法标记menEint片段，以检测整合。用Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))从潜在整合子中分离染色体DNA，并分别用限制酶EcoRI和PstI切割。经琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并用来自宝灵格公司的Dig杂交试剂盒在68℃杂交。实施例3中的质粒pCR2.1menEint已插入DSM5715的染色体中的染色体menE基因内。该菌株命名为DSM5715：：pCR2.1menEint。
实施例5赖氨酸的生产
将实施例4中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715：：pCR2.1menEint，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
CgIII培养基
NaCl                    2.5g/l
细菌培养用肽胨          10g/l
细菌培养用酵母膏        10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)    2％(w/v)
将pH调节为7.4。
向此培养基中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。以此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始光密度(OD，660nm)是0.1。培养基MM用作主培养基。
培养基MM：
CSL(米浆)                5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)       20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)     50g/l
盐：
(NH4)2SO4             25g/l
KH2PO4                 0.1g/l
MgSO4·7H2O            1.0g/l
CaCl2·2H2O            10mg/l
FeSO4·7H2O            10mg/l
MnSO4·H2O             5.0mg/
生物素(过滤灭菌)          0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)     0.2mg/l
亮氨酸(过滤灭菌)          0.1g/l
CaCO3                      25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek1000(Beckmann仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸的量。
所得结果示于表1。
表1
菌株   OD(660nm) 赖氨酸HClg/L
DSM 5715     8.2     12.64
DSM 5715：：pCR2.1menEint     9.2     14.89
附图简述：
图1：质粒pCR2.1menEint图。
图中所采用的缩写和符号有如下含义：
KmR：卡那霉素抗性
EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点
PstI：限制酶PstI的酶切位点
menEint：menE基因的内部片段
ColE1：质粒ColE1的复制起点
          序列表<110>德古萨股份公司<120>编码menE基因的核苷酸序列<130>000551 BT<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1570<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220><221>CDS<222>(230)..(1357)<223>menE基因<400>1ttcgttgcca tagacatgct cttcgcagca ctgtttgcgc acgtctcctc cggcatcttt  60gtcaccaaca atggttggga actcaccggc gcaatcggcg ctggcgcgct gcttctcatc  120gcagttggcg caggtgcatg gagcatcgac ggggttctgg caaaacgcaa ggcctaaatc  180tagcgccaca aCtccgaatt ctgaaccatc ggcactagaa tctcggaat atg aat act  238
                                                  Met Asn Thr
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             40                  45                  50cga gtt ggc ctc gcc atc gat cct tcg atc gct ttg gtg atg gcc act    430Arg Val Gly Leu Ala Ile Asp Pro Ser Ile Ala Leu Val Met Ala Thr
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            120                 125                 130agc aca ggt ttt cac att gac gct ttc gca ggc gcc gcg gca gaa ctg    670Ser Thr Gly Phe His Ile Asp Ala Phe Ala Gly Ala Ala Ala Glu Leu
        135                 140                 145aaa aat acc ggc gac cgc gtc tat aca tcc ttg act cca atg cag tta    718Lys Asn Thr Gly Asp Arg Val Tyr Thr Ser Leu Thr Pro Met Gln Leu
    150                 155                 160ctt aaa gca atg gac tcc ttg caa ggc att gaa gcc ctg aaa ctt ttt    766Leu Lys Ala Met Asp Ser Leu Gln Gly Ile Glu Ala Leu Lys Leu Phe
165                 170                175gat gtc att ctt gtt ggc ggt gct gca ttg tct aag cag gcc cga att    814Asp Val Ile Leu Val Gly Gly Ala Ala Leu Ser Lys Gln Ala Arg Ile180                 185                 190                 195tct gcg gag cag cta gac atc aac att gtc acc acc tac ggc tcc tca    862Ser Ala Glu Gln Leu Asp Ile Asn Ile Val Thr Thr Tyr Gly Ser Ser
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    230                 235                 240gcg cag ggc tac aga aat gca cct gaa cat ccg gat ttc gcc aac gag    1006Ala Gln Gly Tyr Arg Asn Ala Pro Glu His Pro Asp Phe Ala Asn Glu
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    310                 315                 320att gtg gcc gcg tac tcc gga tcg atc agt ccg tct gaa gtt att gaa    1246Ile Val Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Ile Ser Pro Ser Glu Val Ile Glu
325                 330                 335ggc ctc gac gat cta cct cgt tgg cag ctt ccc aaa cgg ctg aag cat    1294Gly Leu Asp Asp Leu Pro Arg Trp Gln Leu Pro Lys Arg Leu Lys His340                 345                 350                 355ctg gaa tct ttg ccc agc att ggt cct gga aaa gct gat cga cgt gct    1342Leu Glu Ser Leu Pro Ser Ile Gly Pro Gly Lys Ala Asp Arg Arg Ala
            360                 365                 370atc gcg aag ctg ttt tagtcttcat tcttgctggc tgcaactagt tttgccacat    1397Ile Ala Lys Leu Phe
        375cttcatcggt gtacactttg gcgatctgct catcatttcc acccatgagg gtgttgccaa  1457caactagtgc tcccacttgg gtggtgggca cgacagcgaa gtgtcggggc tgagcgtaga  1517cctggcgaat agggtgatca gagcgcagtg cgcaggcatg cagccatacg tca         1570<210>2<211>376<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>2Met Asn Thr Arg Val Leu Glu Ala Leu Pro Val Asp Leu Ala Asp Pro1               5                  10                  15Thr Ala Ile Leu Gly Asp Leu Glu Asp Ala Ile Ser Gly Lys Lys Thr
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130                 135                 140Ala Glu Leu Lys Asn Thr Gly Asp Arg Val Tyr Thr Ser Leu Thr Pro145                 150                 155                 160Met Gln Leu Leu Lys Ala Met Asp Ser Leu Gln Gly Ile Glu Ala Leu
            165                 170                 175Lys Leu Phe Asp Val Ile Leu Val Gly Gly Ala Ala Leu Ser Lys Gln
        180                 185                 190Ala Arg Ile Ser Ala Glu Gln Leu Asp Ile Asn Ile Val Thr Thr Tyr
    195                 200                 205Gly Ser Ser Glu Thr Ser Gly Gly Cys Val Tyr Asp Gly Lys Pro Ile
210                 215                 220Pro Gly Ala Lys Val Arg Ile Ser Asp Glu Arg Ile Glu Leu Gly Gly225                 230                 235                 240Pro Met Ile Ala Gln Gly Tyr Arg Asn Ala Pro Glu His Pro Asp Phe
            245                 250                 255Ala Asn Glu Gly Trp Phe Thr Thr Ser Asp Ser Gly Glu Leu His Asp
        260                 265                 270Gly Ile Leu Thr Val Thr Gly Arg Val Asp Thr Val Ile Asp Ser Gly
    275                 280                 285Gly Leu Lys Leu His Pro Glu Val Leu Glu Arg Ala Ile Ala Asp Ile
290                 295                 300Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Val Val Gly Ile Pro Asp Pro Arg Leu305                 310                 315                 320Gly Gln Ala Ile Val Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Ile Ser Pro Ser Glu
            325                 330                 335Val Ile Glu Gly Leu Asp Asp Leu Pro Arg Trp Gln Leu Pro Lys Arg
        340                 345                 350Leu Lys His Leu Glu Ser Leu Pro Ser Ile Gly Pro Gly Lys Ala Asp
    355                 360                 365Arg Arg Ala Ile Ala Lys Leu Phe
370                 375<210>3<211>19<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220><223>引物menE-intl<400>3ctcactccgt tgaatttgg                                               19<210>4<211>19<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220><223>引物menE-int2<400>4caggtgcatt tctgtagcc                                                19

Claims (20)

1、一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含编码menE基因的多核苷酸序列，其选自如下一组：
a)与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)包含a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸，
所述多肽优选具有O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶活性。
2、权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是在棒杆菌中能复制的优选重组的DNA。
3、权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
4、权利要求2的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
5、权利要求2的能复制的DNA，包含
(i)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并范围相应于(i)序列的至少一个序列，或
(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(iv)(i)中的中性功能的有义突变。
6、权利要求5的能复制的DNA，其中杂交是在相应于最大2×SSC的严格条件下进行的。
7、权利要求1的多核苷酸序列，其编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。
8、一种棒状细菌，其中menE基因被弱化，尤其是被消除。
9、整合载体pCR2.1menEint，其
9.1携带大小为520bp的merE基因的一个内部片段，
9.2其限制图谱如图1所示，及
9.3其以大肠杆菌菌株Top10/pCR2.1menEint的形式保藏于德意志微生物保藏中心，保藏号DSM 14080。
10、发酵生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，其包括进行以下步骤：
(a)发酵产生所需氨基酸的棒状细菌，该细菌中至少menE基因或编码其的核苷酸序列被弱化，特别是被消除；
(b)富集培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及
(c)分离L-氨基酸。
11、权利要求10的方法，其中使用如下细菌，该细菌中所需L-氨基酸生物合成途径的其它基因额外被增强。
12、权利要求10的方法，其中使用如下细菌，该细菌中降低所需L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分消除。
13、权利要求10的方法，其中编码menE基因的多核苷酸的表达被弱化，尤其被消除。
14、权利要求10的方法，其中所述多核苷酸menE编码的多肽(酶蛋白)的催化活性被降低。
15、权利要求10的方法，其中为制备L-氨基酸，发酵如下的棒状细菌，该细菌中选自如下一组的一或多个基因同时被增强或过表达：
15.1编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
15.2编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
15.3编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因，
15.4编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因，
15.5编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，
15.6编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
15.7编码苹果酸-醌氧化还原酶的mqo基因，
15.8编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，
15.9编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因，
15.10编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因，
15.11编码苏氨酸脱水酶的ilvA基因，或编码“反馈抗性”苏氨酸脱水酶的ilvA(Fbr)等位基因，
15.12编码乙酰羟酸合酶的ilvBN基因，
15.13编码二羟酸脱水酶的ilvD基因，
15.14编码Zwal蛋白的zwal基因。
16、权利要求10的方法，其中为制备L-氨基酸，发酵如下的棒状细菌，该细菌中选自以下一组的一或多个基因被同时弱化：
16.1编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，
16.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，
16.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，
16.4编码Zwa2蛋白的zwa2基因。
17、一种棒状细菌，其含有携带权利要求1的多核苷酸的部分的载体，但携带所述序列的至少15个连续核苷酸。
18、前述一或多个权利要求的方法，其中使用的是谷氨酸棒杆菌菌种的微生物。
19、一种揭示RNA，cDNA和DNA以分离编码O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶或与menE基因具有高度序列相似性的核酸或多核苷酸或基因的方法，包括使用权利要求1，2，3或4中的多核苷酸序列作为杂交探针。
20、权利要求19的方法，其中使用阵列，微阵列或DNA芯片。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA01013123A (es) 1999-06-25 2002-06-21 Basf Ag Genes de corynebacterium glutamicum que codifican proteinas de via metabolica.
DE19951975A1 (de) * 1999-10-28 2001-05-03 Degussa Neue für das poxB-Gen codierende Nuleotidsequenzen
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104350156A (zh) * 2012-03-27 2015-02-11 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于重组蛋白质的改进的收获操作
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